CN1478537A - 抗癌镇痛的中药组合物、其制备方法和它在制备治疗抗癌产品和镇痛药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种中药组合物，它是以灵芝、冬凌草、延胡索、黄芩、防己、三七和甘草为原料制成的。其制备方法包括混合提取和目的物提取，以多糖、内酯、生物碱、黄酮和皂甙，或以灵芝糖肽、黄芩甙、冬凌草甲素、延胡索素、汉防己碱、甘草素、异甘草素和三七皂甙为提取的有效成分。该中药组合物能有效地抗癌镇痛，具有副作用小，有效率高，使用方便，质量可控的特点，可作为癌症患者的调理、治疗产品或作为晚期原发性和转移性癌痛的镇痛药。
Description
(1)技术领域
本发明涉及一种抗癌镇痛的中药组合物，该组合物的制备方法，和该组合物在制备治疗抗癌产品和镇痛药物中的应用。
(2)背景技术
***是有效的镇痛药，能有效地帮助中晚期的癌症病人镇痛，但其副作用，特别是成瘾性方面的副作用使其不利于长期使用，人们一直致力于找寻***的替代药。癌症治疗是医学界普遍关注与重点攻关的项目。西药有其局限性，他把人体单纯地视为一种物质，并不断地解剖成单体，因而对疾病的治疗缺乏全身调整的观念。且合成药具有较明显的毒副作用，易给患者产生药源性痛苦，人们很需要能提高自身免疫功能，抑制肿瘤细胞，毒副作用小，疗效显著的天然药物。本发明产品体现了中医药扶正祛邪，标本兼治的特点。
(3)发明内容
本发明的一个目的是提供一种疗效好、副作用少的抗癌镇痛的中药组合物；
本发明的另一个目的是提供所述中药组合物的制备方法；
本发明的再一个目的是提供所述的中药组合物在制备治疗抗癌产品和镇痛药物中的应用。
本发明的这些目的是通过下列构思实现的：一种抗癌镇痛的中药组合物，其特征在于，它是由下述重量配比的原料制成的药剂：
灵芝 3-4
冬凌草 1.5-2.5
延胡索 1-2
黄芩 1-2
防己 1-2
三七 0.5-1.5
甘草 0.5-1.5
最佳的原料重量配比为：灵芝∶冬凌草∶延胡索∶黄芩∶防己∶三七∶甘草＝3∶1.8∶1.8∶1.5∶1.2∶0.9∶0.9。
所述黄芩的最佳产地是四川，最佳采集时间是秋季；所述冬凌草的最佳产地是河南，最佳采集时间是五月；灵芝是通过培育/发酵得到的，可采用上海农科所出品的灵芝；甘草的最佳产地是甘肃，最佳采集时间是秋季；三七的最佳产地是云南，最佳采集时间是秋季；延胡索的最佳产地是浙江，最佳采集时间是夏季；(粉)防己的最佳产地是浙江，最佳采集时间是秋季。
本发明也涉及所述中药组合物的制备方法，包括混合提取制备方法或目的物提取制备方法，所述的混合提取制备方法包括：
1)准备原料：
将灵芝、冬凌草、延胡索、黄芩、防己、三七、甘草以重量比为3-4∶1.5-2.5∶1-2∶1-2∶1-2∶0.5-1.5∶0.5-1.5的比例进行混合，将所述的混合物分成5等份；
2)提取生物碱：
i)将步骤1)得到的一份中药混合物用0.1％盐酸乙醇液渗滤或分次浸滤，得到酸性乙醇提取液；
ii)减压浓缩得到浓缩物；
iii)酸性水(pH＝4-5)洗涤，在一个实施方案中，优选地使该酸性水液冷冻过夜，过滤，得到残渣，残渣用酸性水(pH＝4-5)洗涤，得到酸性水液；
iv)向步骤iii)中得到的酸性水液中加氨水沉淀，过滤得到总生物碱沉淀；或者
a)向步骤iii)中得到的酸性水液中加稀酸至pH＝2，用氯仿萃取，得到氯仿层和水层；蒸发氯仿层中的氯仿，得到弱生物碱；
b)所述的水层加碱至pH＝6-7，用氯仿提取，得到水层和氯仿层，蒸发氯仿层中的氯仿，得到强生物碱；
c)上述b)得到的水层用碱调节到pH10，然后用丁醇提取，蒸发丁醇层中的丁醇，得到水溶性的生物碱；
d)合并上述a)、b)和c)得到的生物碱，得到总生物碱；
3)提取多糖：
将步骤1)得到的一份中药混合物用95-100℃的热水提取，弃去残渣，滤液放置12小时后，向上清液中加入浓度50％以上的乙醇，离心得到多糖沉淀；
4)提取内酯：
将步骤1)得到的一份中药混合物用***回流，除去色素，回收***，得到总内酯；
5)提取皂甙：
将步骤1)得到的一份中药混合物用石油醚回流，蒸发石油醚得到脱脂粗粉，用90-95％乙醇提取，减压浓缩得到浓缩液；
a)浓缩液依次用氯仿、乙醇提取，减压回收氯仿、乙醇，得到总甙粗品；或者
b)浓缩液用丁醇提取，减压回收丁醇，得到皂甙粗品；
6)提取黄酮：
向步骤1)得到的一份中药混合物加70-80％乙醇浸渍，减压回收乙醇液中的乙醇，残留物用水溶解，过滤，得到水液；用乙酸乙酯提取水液，减压浓缩乙酸乙酯液，得到总黄酮；
将步骤2)-6)提取得到的生物碱、多糖、内酯、皂甙、黄酮混合，得到所述的中药组合物。
所述的目的物提取制备方法包括：
1)提取黄芩甙：
i)向上述黄芩组分中加入10-15倍(体积)量水煎煮1-2小时，过滤；
ii)用酸将滤液调到pH1-2，在80-90℃下保持30-40分钟，离心沉淀；沉淀物加水搅拌均匀，加碱将pH调节到中性，再加入3-5倍(体积)量的乙醇，过滤；
iii)向滤液中加酸将pH调节到1-2，搅拌，在80-90℃下保持30-40分钟，过滤；
iv)所得的沉淀物分别用水、50％乙醇洗涤，再用95％乙醇洗涤或重结晶，得到黄芩甙；
2)提取三七皂甙：
i)用浓度在50％以下的甲醇提取三七根部粗粉中的可溶成分，减压浓缩甲醇提取液，向残留物中加入3-5倍(体积)量水；
ii)水溶液用***提取，水层再用正丁醇萃取，减压蒸干，经硅胶柱层析，用CHCl3-MeOH-H2O比65∶35∶10洗脱得到三七皂甙；
3)提取冬凌草甲素
用***提取冬凌草叶干粉，弃去残渣，回收***液中的***，得到绿褐色残留物；用甲醇溶解残留物，脱色得到澄明甲醇液，减压浓缩后室温放置过夜，过滤，甲醇母液蒸干，研细；用***洗脱，结晶；
4)提取延胡索素：
a)冷浸法：延胡索粉末用14％氨水湿润，加入***∶氯仿∶乙醇为25∶8∶0.5的混合溶剂浸泡过夜，过滤；蒸干滤液得到所述的延胡索素；或者
b)i)95％乙醇提取法：延胡索粉末用浓氨水湿润，向索氏提取器中加入所述的延胡索粉末和95％乙醇，回流提取；
ii)蒸干醇提取液，残留物加1％盐酸搅拌，过滤；
iii)用1％盐酸洗涤沉淀物，过滤；
iv)合并ii)和iii)得到的滤液，加氨水调节pH至9-10，氯仿萃取；
v)蒸发氯仿层中的氯仿，得到所述的延胡索素；
5)提取汉防己碱：
防己粗粉用0.6％硫酸浸泡4次，酸水浸出液用石灰乳调节到pH＝10，过滤；
沉淀在60℃下干燥，粉碎成细颗粒状，得到防己砂；
用冷苯浸泡6次，每次5-6小时；
回收苯液中的苯，干燥残留物；
向残留物中加入20倍体积量的丙酮使其溶解，加热到55℃，回收丙酮至原体积的1/4，放置，冷却，过滤，得到结晶；
向结晶中加入5-6倍体积量苯及活性碳，室温放置30分钟，过滤；
回收苯液中的苯，并用20倍体积量的乙醇重结晶，得到汉防己碱；
6)提取甘草素、异甘草素
甘草用3-4倍(体积)量的90-95％乙醇提取，乙醇液经石油醚萃取，水层拌入硅胶，用MeOH-H2O 7∶3洗脱，浓缩洗脱液，得到残留物；
向残留物中加水至完全溶解，向水溶液中加乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用5％Na2CO3水液萃取，用稀酸将碳酸钠水液调节到pH5-6，再用乙酸乙酯萃取，干燥乙酸乙酯液，经聚酰胺柱分离，用10-90％乙醇水溶液梯度洗脱得到甘草素和异甘草素；
7)使包含灵芝糖肽和灵芝β-D葡聚糖的灵芝多糖与上述步骤1)-6)提取得到的活性成分混合得到所述的中药组合物。
所述的灵芝糖肽和灵芝β-D葡聚糖也可用下述方法提取得到：
I.a)灵芝子实体去杂质后粉碎，加水8-10倍浸泡24小时，加热到95-100℃下搅拌8-10小时；
b)过滤，优选的是离心或板框分离提取液与药渣，得到滤液和药渣；
c)向药渣中加水3-4倍进行浸提，优选的是在95-100℃下搅拌8小时；重复步骤b)和c)，
II.a)将灵芝发酵液(含有菌球)加热到95-100℃，搅拌4小时；
b)过滤，优选的是离心或板框分离提取液与菌球；
c)向含菌球的药渣中加水3-4倍(体积)，提取2小时，过滤，分离提取液和药渣，
d)合并I.b)，c)和II.c)中的滤液，浓缩至原体积的1/8-1/10，加入食用酒精(3-5倍)，至酒精达到70％左右，静置醇析24小时，用离心机分离沉淀物，回收酒精，干燥沉淀物。或者，
对灵芝子实体进行索氏提取，用乙酸乙酯提取4小时，抽滤，得到的残渣再进行索氏提取，用丙酮提取4小时，抽滤，所得的残渣用90％乙醇浸泡24小时，离心，抽滤；残渣用0.2摩尔/升磷酸缓冲液(PBS，pH＝7.0)在80℃下提取三次，4小时/次，抽滤，弃去残渣，缓冲液去除蛋白质，离心，将所得的上层液透析，优选的是清水透析7天，蒸馏水透析3天；
向非透析液中加入大量丙酮，出现沉淀，弃去上清液，沉淀用丙酮洗涤6次，得到所需产品的粉状固体。
本发明中药组合物的制备方法进一步还包括步骤8)：
a)将所述的步骤1)-7)得到的活性成分粉碎至≤200微米细粉；
b)粉碎，干燥无漏籽/海枣籽(PHOENIX DACTYLIFERA L)或酸石榴籽/矮石榴籽(PUNICA GRANAT-UN L)，用8倍体积量的无水乙醇提取，优选的是提取三次，合并滤液，减压浓缩，用乙炔化钾处理，得到粉末，
c)将a)、b)所得的物质以100-200∶1的重量比混合。
在本发明的一个实施方案中，将上述步骤c)得到的混合物装入胶囊。
本发明的产品能配制成多种剂型，优选的是配制成胶囊剂型进行口服，所述的赋形剂和配制技术是药剂学领域中公知的，本技术领域的技术人员可根据相应的文献和现有技术中的工艺配制得到上述制剂。
(4)附图说明
图1显示癌症病人服用淀粉(对照)、DHE(***类制剂)和本发明中药组合物后癌痛对生活质量相关指标的影响程度。
图2是淀粉(对照)、DHE(***类制剂)和本发明中药组合物等不同药物最佳癌痛缓解后的疼痛积分评估图。
图3显示了淀粉(对照)、DHE(***类制剂)和本发明中药组合物等不同药物作用后24小时内癌痛缓解程度的评估。
图4是淀粉、DHE(***类制剂)和本发明组合物作用后24小时内平均抗癌痛程度的评估。
图5显示了本发明中药组合物对癌细胞的杀伤作用。图5a显示了给药前人肝癌细胞的状态；图5b显示，给予本发明中药组合物后12小时人肝癌细胞变性；图5c显示，给药后24小时人肝癌细胞被破坏。
图6显示本发组合物对胃癌组织中cAMP含量的影响。
(5)具体实施方式
下面通过实施例进一步阐述本发明。
实施例1
按下述配比称取原料(千克)
灵芝 3 冬凌草 1.8
延胡索 1.8 黄芩 1.5 防己 1.2
三七 0.9 甘草 0.9
混合上述原料，研磨成中药粗粉，将所述的粗粉分成五等份供下列1)-5)个提取步骤使用；
1)提取生物碱：
i)将上述得到的一份中药粗粉用0.1％盐酸乙醇(95％)液渗滤或分次浸滤，得到酸性乙醇提取液；
ii)减压浓缩得到浓缩物；
iii)酸性水(pH＝4-5)洗涤，在一个实施方案中，优选地使该酸性水液冷冻过夜，过滤，得到残渣，残渣用酸性水(pH＝4-5)洗涤，得到酸性水液；
iv)向步骤iii)中得到的酸性水液中加氨水沉淀，过滤得到总生物碱沉淀；或者
a)向步骤iii)中得到的酸性水液中加稀盐酸至pH＝2，用氯仿萃取，得到氯仿层和水层；蒸发氯仿层中的氯仿，得到弱生物碱的残渣；
b)所述的水层加碱至pH＝6，用氯仿提取，得到水层和氯仿层，蒸发氯仿层中的氯仿，得到强生物碱的残渣；
c)上述b)得到的水层用氢氧化钠溶液调节到pH10，然后用丁醇提取，蒸发丁醇层中的丁醇，得到水溶性的生物碱；
回收上述的氯仿、丁醇，供提取步骤循环使用。使所述的生物碱残渣低温干燥，结晶。
2)提取多糖：
用95℃的热水提取上述得到的中药粗粉达2小时，弃去残渣，滤液放置12小时后，向上清液中加入浓度60％的乙醇，离心得到多糖沉淀；
所述的多糖沉淀用***精制。
3)提取内酯：
将上述得到的中药粗粉用***回流，通过聚酰胺柱除色素，回收***，得到总内酯；
4)提取皂甙：
将上述得到的中药粗粉用石油醚回流，蒸发石油醚得到脱脂粗粉，用95％乙醇提取，减压浓缩得到浓缩液；
a)浓缩液依次用氯仿、乙醇提取，减压回收氯仿、乙醇，得到皂甙粗品；或者
b)浓缩液用丁醇提取，得到丁醇层，减压回收丁醇，得到皂甙粗品。
5)提取黄酮：
a)向上述得到的一份中药粗粉中加70％乙醇浸渍，减压回收乙醇液中的乙醇，残留物用水溶解，过滤，得到水液；用乙酸乙酯提取水液，减压浓缩乙酸乙酯液，得到总黄酮。
将步骤1)-5)提取得到的生物碱、多糖、内酯、皂甙和黄酮混合，得到本发明的抗癌镇痛的中药组合物。
实施例2
1)提取黄芩甙：
i)向2千克黄芩中加入10倍(体积)量水煎煮1小时，过滤；
ii)用酸将滤液调到pH2，在80℃下保持30分钟，离心沉淀；沉淀物加水搅拌均匀，加碱将pH调节到中性，再加入5倍(体积)量的乙醇，过滤；
iii)向滤液中加盐酸，将pH调节到2，搅拌，在80℃下保持30分钟，过滤；
iv)所得的沉淀物用分别用水、50％乙醇洗涤，再用95％乙醇洗涤或重结晶，得到黄芩甙。
2)提取三七皂甙：
i)用40％的甲醇提取1.5千克三七根部粗粉中的可溶成分，减压浓缩甲醇提取液，向残留物中加入5倍(体积)量水；
ii)水溶液用***提取，水层再用正丁醇萃取，减压蒸干，经硅胶柱层析，用CHCl3-MeOH-H2O比65∶35∶10洗脱得到三七皂甙。
3)提取冬凌草甲素
用***提取2.5千克冬凌草叶干粉，弃去残渣，回收***液中的***，得到绿褐色残留物；甲醇溶解残留物，脱色得到澄明甲醇液，减压浓缩后室温放置过夜，过滤，甲醇母液蒸干，研细；再用中性Al2O3吸附，用***洗脱，结晶。
4)提取延胡索素：
2千克延胡索粉末用14％氨水湿润，加入***∶氯仿∶乙醇为25∶8∶0.5的混合溶剂浸泡过夜，过滤；蒸干滤液得到所述的延胡索素。
5)提取汉防己碱：
2千克防己粗粉用0.6％硫酸浸泡4次，酸水浸出液用石灰乳调节到pH＝10，过滤；
沉淀在60℃下干燥，粉碎成细颗粒状，得到防己砂；
用冷苯浸泡6次，每次6小时；
回收苯液中的苯，干燥残留物；
向残留物中加入20倍体积量的丙酮使其溶解，加热到55℃，回收丙酮至原体积的1/4，放置，冷却，过滤，得到结晶；
向结晶中加入5倍体积量苯及活性碳，室温放置30分钟，过滤；
回收苯液中的苯，并用20倍体积量的乙醇重结晶，得到汉防己碱。
6)提取甘草素、异甘草素
1.5千克甘草用3倍(体积)量的95％乙醇提取，乙醇液经石油醚萃取，水层经硅胶柱洗脱，用MeOH-H2O为7∶3洗脱，浓缩洗脱液，得到残留物；
向残留物中加水至完全溶解，向水液中加乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用5％Na2CO3水液萃取，用稀盐酸将碳酸钠水液调节到pH5，再用乙酸乙酯萃取，干燥乙酸乙酯液，经60目聚酰胺柱分离，10-90％的乙醇水溶液梯度洗脱得到甘草素和异甘草素。
7)I.a)灵芝子实体去杂质后粉碎，加水8倍浸泡24小时，加热到95℃下搅拌8小时；
b)离心分离提取液与药渣，得到滤液和药渣；
c)向药渣中加水3倍进行浸提，在95℃下搅拌8小时；重复步骤b)和c)，
II.a)将灵芝发酵液(含有菌球)加热到95℃，搅拌4小时；
b离心分离提取液与菌球；
c)向含菌球的药渣中加水3倍(体积)，提取2小时，过滤，分离提取液和药渣，
d)合并I.b)，c)和II.c)中的滤液，浓缩至原体积的1/8，加入食用酒精(3-5倍)，至酒精达到70％左右，静置醇析24小时，用离心机分离沉淀物，回收酒精，干燥沉淀物。
将上述步骤1)-7)提取得到的活性成分混合得到本发明中药组合物(1)。
将中药组合物(1)粉碎至≤200微米细粉(2)；
粉碎，干燥无漏籽/海枣籽(PHOENIX DACTYLIFERA L)，用8倍体积量的无水乙醇提取，优选的是提取三次，合并滤液，减压浓缩，用乙炔化钾处理，得到粉末(3)，
将细粉(2)和粉末(3)以100-200∶1的重量比混合，然后装入胶囊，得到本发明的中药组合物的胶囊。
实施例3
1)提取黄芩甙：
i)向1千克黄芩中加入10倍(体积)量水煎煮1小时，过滤；
ii)用稀盐酸将滤液调到pH2，在80℃下保持30分钟，离心沉淀；沉淀物加水搅拌均匀，加碱将pH调节到中性，再加入3倍(体积)量的乙醇，过滤；
iii)向滤液中加盐酸，将pH调节到2，搅拌，在80℃下保持30分钟，过滤；
iv)所得的沉淀物分别用水、50％乙醇洗涤，再用95％乙醇洗涤或重结晶，得到黄芩甙。
2)提取三七皂甙：
i)用40％的甲醇提取0.5千克三七根部粗粉中的可溶成分，减压浓缩甲醇提取液，向残留物中加入5倍(体积)量水；
ii)水溶液用***提取，水层再用正丁醇萃取，减压蒸干，经硅胶柱层析，用CHCl3-MeOH-H2O比65∶35∶10洗脱得到三七皂甙。
3)提取冬凌草甲素
用***提取1.5千克冬凌草叶干粉，弃去残渣，回收***液中的***，得到绿褐色残留物；甲醇溶解残留物，脱色得到澄明甲醇液，减压浓缩后室温放置过夜，过滤，甲醇母液蒸干，研细；再用中性Al2O3吸附，用***洗脱，结晶。
4)提取延胡索素：
1千克延胡索粉末用浓氨水湿润，向索氏提取器中加入所述的延胡索粉末和95％乙醇，回流提取；
ii)蒸干醇提取液，残留物加1％盐酸搅拌，过滤；
iii)用1％盐酸洗涤沉淀物，过滤；
iv)合并ii)和iii)得到的滤液，加氨水调节pH至9，氯仿萃取；
v)蒸发氯仿层中的氯仿，得到所述的延胡索素；
5)提取汉防己碱：
1千克防己粗粉用0.6％硫酸浸泡4次，酸水浸出液用石灰乳调节到pH＝10，过滤；
沉淀在60℃下干燥，粉碎成细颗粒状，得到防己砂；
用冷苯浸泡6次，每次5小时；
回收苯液中的苯，干燥残留物；
向残留物中加入20倍体积量的丙酮使其溶解，加热到55℃，回收丙酮至原体积的1/4，放置，冷却，过滤，得到结晶；
向结晶中加入5-6倍体积量苯及活性碳，室温放置30分钟，过滤；
回收苯液中的苯，并用20倍体积量的乙醇重结晶，得到汉防己碱。
6)提取甘草素、异甘草素
0.9千克甘草用4倍(体积)量的95％乙醇提取，乙醇液经石油醚萃取，水层拌入硅胶，用MeOH-H2O为7∶3洗脱，浓缩洗脱液，得到残留物；
向残留物中加水至完全溶解，向水液中加乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用5％Na2CO3水液萃取，用稀酸将碳酸钠水液调节到pH5-6，再用乙酸乙酯萃取，干燥乙酸乙酯液，经聚酰胺柱分离，10-90％乙醇水溶液梯度洗脱得到甘草素和异甘草素。
7)对灵芝子实体进行索氏提取，用乙酸乙酯提取4小时，抽滤，得到的残渣再进行索氏提取，用丙酮提取4小时，抽滤，所得的残渣用90％乙醇浸泡24小时，离心，抽滤；残渣用0.2摩尔/升磷酸缓冲液(PBS，pH＝7.0)在80℃下提取三次，4小时/次，抽滤，弃去残渣，缓冲液去除蛋白质，离心，将所得的上层液清水透析7天，蒸馏水透析3天；
向非透析液中加入大量丙酮，出现沉淀，弃去上清液，沉淀用丙酮洗涤6次，得到所需产品的粉状固体。
将上述步骤1)-7)提取得到的活性成分混合，将该混合物粉碎成细粉，装入胶囊供使用。
试验实施例1
将患有中晚期癌症的病人随机分成3组，以每人900mg淀粉、900mgDHE(***类制剂)和900mg本发明中药组合物对3组病人给药，24小时后对病人的一般活动、情绪、走路能力、食欲、睡眠、生活情趣、体温等进行评估，积分越高，说明对生活质量的影响越大，结果如图1所示。
从图1结果可见，淀粉作为对照，不能改变癌痛对生活质量的影响；本发明的中药组合物能最大程度地提高患者的生活质量，例如一般活动、情绪、走路能力、食欲、睡眠、生活情趣的影响，并将体温降低到正常的体温，其药效优于DHE。
试验实施例2
如试验实施例1所述对癌症病人给药，并对药物的最佳癌痛缓解后的疼痛、给药后24小时内癌痛缓解程度、和不同药物作用后24小时内平均抗癌痛程度进行评估，结果如图2-4所示，表明本发明中药组合物具有上佳的镇痛效果。
试验实施例3
如试验实施例1所述对癌症病人给药，24小时后评估各自的临床不良反应，结果如下表所示：
| 组别 | 例数 | 无副作用 | 嗜睡 | 头晕 | 恶心 | 呕吐 | 心慌 | 便秘 | 欣快感 |
| 本发明组合物 | 20 | 17 | 0 | 3 | 0 | 0 | 0 | 2 | 0 |
| DHE | 20 | 6 | 9 | 14 | 5 | 2 | 1 | 1 | 2 |
| 淀粉 | 20 | 20 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
从上述结果可见，本发明组合物副作用比DHE的低，并无成瘾性和***类的欣快感。
试验实施例4
本发明中药组合物对肝癌细胞影响的超微结构观察：
I.SMMC 7721肝癌细胞的培养：
1.细胞：SMMC 7721肝癌细胞株每2-3天传代一次，选用生长旺盛的对数生长期细胞，细胞滴度250000/ml。
2.试剂与培养基：DMEM培养液(含15％小牛血清和50单位青链霉素)；胰酶消化液(含0.02％EDTA、0.25％胰蛋白酶、PBS缓冲液)。
3.分瓶：从30毫升培养瓶中取对数生长期细胞，倒去原有瓶中培养液，加入1毫升胰酶消化液，消化至细胞出现输送状态，倒取胰酶，加入5毫升培养液，用吸管吹打，使细胞从瓶底脱落，用吸管将细胞吸入准备好的培养液瓶和表面喷碳的盖玻片上，注入DMEM培养液，使细胞滴度调整至250000/ml。在5％二氧化碳，37℃环境下培养24小时。
II.分组与用药：将分皿24小时后的36皿细胞随即分为对照组和试验组，每组各18皿，其中9皿用作表型结构观察，9皿用作内部结构观察。本发明组合物在分组确定后即以200微克/皿的用量加入本发明组合物。
III.观察与方法：
在加药后4、12和24小时作为取样点，每组每取样点为3个样本。癌细胞表型结构观察：先取出载有培养细胞株的盖玻片，浸入预冷的2.5％戊二醛溶液中，经临界点肝脏后，用FME COAT JEF-1100型离子溅射仪作样品表面喷金，在JEO JXA-840型扫描垫子显微镜下作细胞表型结构分析。
细胞内部结构观察：先吸取细胞培养液，加入预冷的2.5％戊二醛溶液，2小时后用磷酸缓冲液冲洗三次，用细胞刮匙将培养细胞刮落，再用1％锇酸作后固定，经磷酸缓冲液冲洗后，用75％乙醇脱水，植入琼脂内，再用Epon 812包埋，在60℃状态下聚合，制成超薄切片(500)，经醋酸铀和柠檬酸铅双重染色后，在JEOL JEM-1200型透射电子显微镜下作分析。
结果显示，对照组在24小时后，细胞基本铺满，主要呈平面生长状态。
试验组使用了本发明组合物后4小时，平面生长的细胞间伪足出现断离，细胞出现解离，细胞表面颗粒脱落，细胞显示出脱水。12小时后，该细胞出现变性，表面颗粒脱落，一部分细胞出现蚀孔。(见图5b)。给药后24小时，肝癌细胞的细胞数量明显减少，细胞散离，表面颗粒消失，肝癌细胞膜明显破损，部分细胞膜消失，细胞崩解。(见图5c)。
试验结果显示，本发明的中药组合物具有杀伤肝癌细胞的作用。
试验实施例5
本发明中药组合物对胃癌组织中cAMP含量的影响：
肿瘤的发生和生长对环核苷酸水平有直接相关的作用，其涉及到cAMP、cGMP、cCMP水平和其相应的腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶的活性。近年来研究结果提示，cGMP在正常组织再生中有主导地位，而cAMP对肿瘤组织的发展占主导地位。该试验实施例通过观察本发明中药组合物对癌变细胞中cAMP水平的影响来阐明其抗癌效应。
I.人胃癌裸鼠模型的建立：选择内窥镜取材，病理切片证实为胃癌患者，手术切除时取其胃癌组织，将其剪成3mm3的小型组织块，接种于裸鼠皮下，每区域接种3块，常规饲养。
II分组与用药：设种植胃癌组织株为空白对照组；选择胃癌裸鼠模型建立后72小时的实验裸鼠16只，随机分为阴性对照组和试验组，每组8只。阴性对照组腹腔注射0.9％NaCl 0.5ml/只；试验组腹腔注射等量的本发明中药组合物(内含本发明中药组合物2.5毫克)，每日一次，连续注射5天。
III.取材与样品处理：在末次用药完成后的24小时采用颈椎脱位处死阴性对照组和试验组的裸鼠，摘取种植的人胃癌组织，用滤纸吸干表面体液，称重定量约50毫克左右(空白对照组直接称重定量)。加入50mM醋酸缓冲液1毫升，匀浆后将样品转移至离心管。用无水乙醇2毫升冲洗匀浆器，合并至离心管内，离心(3000转/分，15分钟)，取上清液，同时再次用75％乙醇2毫升洗涤匀浆器，将洗涤液离心(3000转/分，15分钟)取上清液，合并2次离心后上清液入试管，置60℃烘箱内烘干，冰箱4℃环境内保存，采用125I标记环核苷酸放射免疫分析技术检测。
IV.结果：图6显示了对照组和试验组组织cAMP水平差异，从中可见本发明的中药组合物能非常显著地提高组织cAMP水平(p＜0.01)。相对比表明：本发明中药组合物比空白对照组高7.2倍，比阴性对照组高4.2倍。
恶性肿瘤普遍存在腺苷酸环化酶活性低下和磷酸二酯酶活性上升，故导致细胞第二信使cAMP水平下降，激活肿瘤组织的进一步发展和恶化。cAMP水平有所上升，体现了对控制癌变组织的发展起到积极的作用。由此可见，本发明的中药组合物能有效地控制癌组织细胞的动力。
Claims (9)
1.一种抗癌镇痛的中药组合物，其特征在于，它是由下述重量配比的原料制成的：
灵芝 3-4
冬凌草 1.5-2.5
延胡索 1-2
黄芩 1-2
防己 1-2
三七 0.5-1.5
甘草 0.5-1.5
2.根据权利要求1所述的中药组合物，其中各原料的重量配比是：灵芝∶冬凌草∶延胡索∶黄芩∶防己∶三七∶甘草＝3∶1.8∶1.8∶1.5∶1.2∶0.9∶0.9。
3.如权利要求1所述的中药组合物的制备方法，其特征在于，它包括混合提取制备方法或目的物提取制备方法。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其中所述的混合提取制备方法包括：
1)准备原料：
将灵芝、冬凌草、延胡索、黄芩、防己、三七、甘草以重量比为3-4∶1.5-2.5∶1-2∶1-2∶1-2∶0.5-1.5∶0.5-1.5的比例进行混合，将所述的混合物分成5等份；
2)提取生物碱：
i)将步骤1)得到的一份中药混合物用0.1％盐酸乙醇液渗滤或分次浸滤，得到酸性乙醇提取液；
ii)减压浓缩得到浓缩物；
iii)酸性水(pH＝4-5)洗涤，过滤，得到残渣，残渣用酸性水(pH＝4-5)洗涤，得到酸性水液；
iv)向步骤iii)中得到的酸性水液中加氨水沉淀，过滤得到总生物碱沉淀；或者
a)向步骤iii)中得到的酸性水液中加稀酸至pH＝2，用氯仿萃取，得到氯仿层和水层；蒸发氯仿层中的氯仿，得到弱生物碱；
b)所述的水层加碱至pH＝6-7，用氯仿提取，得到水层和氯仿层，蒸发氯仿层中的氯仿，得到强生物碱；
c)上述b)得到的水层用碱调节到pH10，然后用丁醇提取，蒸发丁醇层中的丁醇，得到水溶性的生物碱；
d)合并上述a)、b)和c)得到的生物碱，得到总生物碱；
3)提取多糖：
将步骤1)得到的一份中药混合物用95-100℃的热水提取，弃去残渣，滤液放置12小时后，向上清液中加入浓度50％以上的乙醇，离心得到多糖沉淀；
4)提取内酯：
将步骤1)得到的一份中药混合物用***回流，除去色素，回收***，得到总内酯；
5)提取皂甙：
将步骤1)得到的一份中药混合物用石油醚回流，蒸发石油醚得到脱脂粗粉，用90-95％乙醇提取，减压浓缩得到浓缩液；
a)浓缩液依次用氯仿、乙醇提取，减压回收氯仿、乙醇，得到皂甙粗品；或者
b)浓缩液用丁醇提取，减压回收丁醇，得到皂甙粗品；
6)提取黄酮：
向步骤1)得到的一份中药混合物加70-80％乙醇浸渍，减压回收乙醇液中的乙醇，残留物用水溶解，过滤，得到水液；用乙酸乙酯提取水液，减压浓缩乙酸乙酯液，得到总黄酮；
将步骤2)-6)提取得到的生物碱、多糖、内酯、皂甙、黄酮混合，得到所述的中药组合物。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其中所述的目的物提取制备方法包括：
1)提取黄芩甙：
i)向上述黄芩组分中加入10-15倍(体积)量水煎煮1-2小时，过滤；
ii)用酸将滤液调到pH1-2，在80-90℃下保持30-40分钟，离心沉淀；沉淀物加水搅拌均匀，加碱将pH调节到中性，再加入3-5倍(体积)量的乙醇，过滤；
iii)向滤液中加酸将pH调节到1-2，搅拌，在80-90℃下保持30-40分钟，过滤；
iv)所得的沉淀物用分别用水、50％乙醇洗涤，再用95％乙醇洗涤或重结晶，得到黄芩甙；
2)提取三七皂甙：
i)用浓度在50％以下的甲醇提取三七根部粗粉中的可溶成分，减压浓缩甲醇提取液，向残留物中加入3-5倍(体积)量水；
ii)水溶液用***提取，水层再用正丁醇萃取，减压蒸干，经硅胶柱层析，用CHCl3-MeOH-H2O比65∶35∶10洗脱得到三七皂甙；
3)提取冬凌草甲素
用***提取冬凌草叶干粉，弃去残渣，回收***液中的***，得到绿褐色残留物；用甲醇溶解残留物，脱色得到澄明甲醇液，减压浓缩后，室温放置过夜，过滤，甲醇母液蒸干，研细；用***洗脱，结晶；
4)提取延胡索素：
a)冷浸法：延胡索粉末用14％氨水湿润，加入***∶氯仿∶乙醇为25∶8∶0.5的混合溶剂浸泡过夜，过滤；蒸干滤液得到所述的延胡索素；或者
b)95％乙醇提取法：i)延胡索粉末用浓氨水湿润，向索氏提取器中加入所述的延胡索粉末和95％乙醇，回流提取；
ii)蒸干醇提取液，残留物加1％盐酸搅拌，过滤；
iii)用1％盐酸洗涤沉淀物，过滤；
iv)合并ii)和iii)得到的滤液，加氨水调节pH至9-10，氯仿萃取；
v)蒸发氯仿层中的氯仿，得到所述的延胡索素；
5)提取汉防己碱：
防己粗粉用0.6％硫酸浸泡4次，酸水浸出液用石灰乳调节到pH＝10，过滤；
沉淀在60℃下干燥，粉碎成细颗粒状，得到防己砂；
用冷苯浸泡6次，每次5-6小时；
回收苯液中的苯，干燥残留物；
向残留物中加入20倍体积量的丙酮使其溶解，加热到55℃，回收丙酮至原体积的1/4，放置，冷却，过滤，得到结晶；
向结晶中加入5-6倍体积量苯及活性碳，室温放置30分钟，过滤；
回收苯液中的苯，并用20倍体积量的乙醇重结晶，得到汉防己碱；
6)提取甘草素、异甘草素
甘草用3-4倍(体积)量的90-95％乙醇提取，乙醇液经石油醚萃取，水层拌入硅胶，用MeOH-H2O 7∶3洗脱，浓缩洗脱液，得到残留物；
向残留物中加水至完全溶解，向水溶液中加乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用5％Na2CO3水液萃取，用稀酸将碳酸钠水液调节到pH5-6，再用乙酸乙酯萃取，干燥乙酸乙酯液，经聚酰胺柱分离，用10-90％乙醇水溶液梯度洗脱得到甘草素和异甘草素；
7)使包含灵芝糖肽和灵芝β-D葡聚糖的灵芝多糖与上述步骤1)-6)提取得到的活性成分混合得到所述的中药组合物。
6.根据权利要求5所述的方法，它还包括步骤8)：
a)将所述的步骤1)-7)得到的活性成分粉碎至≤200微米细粉；
b)粉碎，干燥无漏籽/海枣籽或酸石榴籽/矮石榴籽，用8倍体积量的无水乙醇提取，减压浓缩，用乙炔化钾处理，得到粉末，
c)将a)、b)所得的物质以100-200∶1的重量比混合。
7.根据权利要求6所述的方法，它还包括步骤d)：将c)中得到的混合物装入胶囊。
8.如权利要求1所述的中药组合物在制备镇痛药物中的应用。
9.如权利要求1所述的中药组合物在制备抗癌产品中的应用。
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