CN1472342A - 一种定量检测传染性非典型肺炎冠状病毒拷贝数的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种定量检测传染性非典型肺炎冠状病毒拷贝数的试剂盒。该试剂盒标本处理采用硅胶柱纯化法，定量检测采用TagMan探针荧光定量检测原理，定量标准品为体外转录RNA。

Description

一种定量检测传染性非典型肺炎冠状病毒拷贝数的试剂盒

技术领域

本发明涉及诊断试剂领域，特别是涉及一种定量检测病毒拷贝数的试剂盒。

背景技术

传染性非典型肺炎是一种通过呼吸道传播的疾病，2002年底在中国广东省首先发现，至2003年5月，共有32个国家和地区有病例报告，累计发病人数超过6000，死亡率约5-10％。世界卫生组织将其命名为Severe Acute RespiratorySyndrome(缩写SARS，意译为重症急性呼吸道综合症)。经10国13家研究机构组成的联合研究网络共同研究，世界卫生组织于2003年4月16日确认一株新的冠状病毒为病原体，并命名为SARS coronavirus，简称SARS-COV，中文称为“传染性非典型肺炎冠状病毒”。该病毒是一种单链RNA病毒，与常见的人类冠状病毒OC43和229E毒株同源性低于60％。由于SARS早期临床症状易与一般呼吸道疾病混淆，故需要特异性诊断试剂盒进行确诊。同时，在对SARS患者抗病毒治疗过程中，也需要定量检测病毒拷贝数以检测治疗效果。

基于TaqMan探针的荧光定量PCR技术是一种定量检测病毒拷贝数的方法。德国ATRUS公司和中国华美生物工程公司已开发出了用上述方法检测SARS-COV的试剂盒。但ATRUS公司的HPA-Coronavirus LC RT PCR Reagents只是一套PCR扩增和检测试剂组合，没提供相应的标本处理试剂和方案。而华美生物工程公司的SARS Coronavirus核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒只是一种定性试剂盒，无法提供定量病毒拷贝数的检测结果。

本发明提供一种定量检测传染性非典型肺炎冠状病毒拷贝数的试剂盒，克服了上述现有技术的缺陷。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种定量检测传染性非典型肺炎冠状病毒拷贝数的试剂盒，可以定量检测传染性非典型肺炎冠状病毒拷贝数，克服了现有技术的缺陷。在实践中，既可以对感染SARS病毒的人群进行早期临床诊断，也可以对病人的治疗情况进行定量检测，效果极为良好。

本发明的定量测定传染性非典型肺炎冠状病毒拷贝数的试剂盒，包含裂解液，硅胶吸附柱，洗涤液，洗脱液，引物，探针，定值标准品，阴性对照样品，和酶混合物，其中，所述裂解液为裂解血清、血浆、液化痰液或漱口水标本中病毒颗粒的硫氰酸胍溶液；所述洗涤液为含乙醇溶液；所述洗脱液低盐缓冲液或水；所述引物为编码传染性非典型肺炎冠状病毒基因组orflab区的序列；所述探针为TaqMan探针；所述酶混合物为逆转录酶、DNA扩增酶、dNTP；所述定值标准品为经定量的编码传染性非典型肺炎冠状病毒基因组orflab区的体外转录RNA。其中，所述硅胶吸附柱采用负压抽提方法纯化病毒RNA。

本发明的试剂盒对标本处理没有采用类似于中国华美生物工程公司的液相提取法，而是采用硅胶柱吸附纯化法。该技术原应用于各类科研用分子生物学试剂盒，其原理是利用病毒核酸与其他核酸、蛋白质在不同条件下与硅胶吸附柱结合能力的差异，通过负压抽提组件和含乙醇洗涤液，将非病毒核酸类杂质去除，再用低盐或水，将仍吸附于硅胶吸附柱上的病毒洗脱下来。将该技术应用于本诊断试剂盒后，一方面避免了传统方法中使用酚、氯仿、异戊醇等有毒试剂，另一方面引入机械化操作，减少了人为操作因素对结果的影响。本领域技术人员只需自行选用由一个负压形成***(如真空泵)和一个或若干个与硅胶吸附柱接口组成的负压抽提组件，即可使用本硅胶柱吸附纯化***。

本发明的试剂盒中所用的引物和探针序列来自于传染性非典型肺炎冠状病毒基因组orflab开放读码框架。其特征为传染性非典型肺炎冠状病毒所特有，而其他感染人的病毒所不含有。在特定实施例中，本发明所确认的最优引物序列为传染性非典型肺炎冠状病毒BJ03病毒株(GenBank编号AY278490.3)第18181-18200bp和第18261-18240bp，引物序列为5’-gtt tat cac ccg cga aga ag-3′和5′-tct cta gtt gca tga cag ccc t-3′。探针采用TaqMan探针类型，即在探针碱基两段分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团，最优探针序列为传染性非典型肺炎冠状病毒BJ03病毒株(GenBank编号AY278490.3)第18212-18235bp，TagMan探针序列为5′-FAM-gct cgt gcg tgg att ggc ttt gat-TAMRA-3′。在PCR扩增时，对荧光信号强度进行检测，信号强度超过检测器阀值时的PCR扩增循环次数(CT)与标本中模板数成正比。

由于PCR扩增易受多种因素影响而扩增失败，使试剂盒使用人员得出检测标本为阴性的错误结论。为避免试剂盒使用人员得出上述错误判断，本发明的试剂盒的最优组成中使用内参照扩增质控***，即在裂解液中加入特定序列的内参照RNA，与标本共同经过裂解、纯化、扩增、检测各步骤。该内参照RNA序列为一与待测标本无关的质粒片段(如pUC18质粒片段)，两端含试剂盒中所用的引物序列，故可与待测标本共用同一对引物扩增。所用内参照探针为包含特异性针对该无关序列的TagMan探针。如果检测结果为标本、内参照均为阴性，则表明扩增失败，实验结果无效；如果检测结果为标本阴性、内参照阳性或标本阳性、内参照阳性或标本阳性、内参照阴性，则结果可信。在特定实施例中，当试剂盒采用上节所述引物序列时，所述内参照是将pGEM-T质粒与用引物5′-gtt tat cac ccg cga aga aga aag ttc tgc tat gtg gcg c-3′和5′-tct cta gtt gca tgacag ccc tga gta ctc aac caa gtc att-3′扩增的pUC18质粒片段连接、转化、扩增后，体外转录获得的RNA。不含内参照的试剂盒尽管缺少了一道质控标准，但不影响正常使用。

本发明的试剂盒是一种定量检测试剂盒，使用中需将待测标本的C_T值与标准曲线的C_T值比较，求出待测标本病毒拷贝数。标准曲线由已知拷贝数标准品同步提取和扩增得到。本发明的试剂盒采用的定值标准品为经定量的编码传染性非典型肺炎冠状病毒基因组orflab区片段的体外转录RNA。其来源是通过从传染性非典型肺炎患者液化痰液标本中抽提病毒颗粒，RT-PCR获得orflab区片段，接入质粒后在大肠杆菌内扩增，最后将质粒线性化后体外转录为RNA，并定量。较之常规的是以传染性非典型肺炎患者病毒阳性标本做定值标准品的方法，本发明的试剂盒在安全性上有显著优势。在特定实施例中，最优选的体外转录片段是由序列为5′-atg aat tac caa gtc aat ggt tac-3′[传染性非典型肺炎冠状病毒BJ03病毒株(GenBank编号AY278490.3)第18149-18172bp]和5′-cat aac cagtcg gta cag cta c-3′[传染性非典型肺炎冠状病毒BJ03病毒株(GenBank编号AY278490.3)第18338-18317bp]的引物从病毒颗粒中RT-PCR得到。将pGEM-T质粒(Promega公司)与上述扩增获得的orflab区基因片段连接后在大肠杆菌内扩增，最后将质粒线性化后体外转录为RNA。

本发明的试剂盒的阴性对照采用健康人血清(各传染性指标如HBV，HCV，HIV，TP及SARS等均为阴性)。

本发明的试剂盒需配合荧光定量PCR仪使用。在特定实施例中，在使用不含内参照的试剂盒配方时，推荐的PCR仪为ROCHE公司Lightcycle型PCR仪。在使用含内参照的试剂盒配方时，推荐的PCR仪为MJ公司DNA Engine Opticon2型PCR仪。本领域技术人员亦可从BIO-RAD、Applied Biosystems等公司获得同类的PCR仪。

具体实施方式实施例1    SARS-COV片段体外转录RNA的制备与定量

取SARS患者液化痰液标本，用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QLAGEN公司)抽提病毒，按试剂盒使用说明书要求操作。抽提产物经AMV逆转录酶(购自上海生工公司)逆转录为cDNA后，加下列两条引物和Tag DNA聚合酶，按常规操作PCR扩增：

               5′-atg aat tac caa gtc aat ggt tac-3′

               5′-cat aac cag tcg gta cag cta c-3′

取扩增产物，与pGEM-T质粒(Promage公司)混合后用T4连接酶连接，按Promage公司产品说明书操作，连接产物转化大肠杆菌DH5α(GIBCO公司)。转化方法为标准的钙转化法，按《分子克隆实验指南(第二版)》操作。转化菌液涂布含氨苄青霉素的LB培养基平板，次日挑选长出的菌落，在含氨苄青霉素的LB液体培养基内扩大培养。收集菌体，用大量质粒抽提试剂盒(上海华舜生物技术公司)抽提质粒。将所获得的pGEM-T-SARS质粒用SalI酶切，0.8％琼脂糖电泳，胶回收线性化质粒片段。用RiboMAX^TM Large Scale RNAProduction Systems试剂盒(Promega公司)将回收的线性化的质粒体外转录为RNA，并用DNaseI消化DNA，酚(水饱和)/氯仿抽提纯化，最终溶于DEPC H₂O中。用HPA-Coronavirus LC RT PCR Reagents定量试剂盒(ATRUS公司)对该体外转录RNA进行定量，基本确认为1.2×10¹⁰拷贝/毫升。实施例2 内参照RNA的制备

取pUC18质粒(GIBCO公司)，混合下列两条引物和Tag DNA聚合酶，按常规操作PCR扩增：

        5′-gtt tat cac ccg cga aga aga aag ttc tgc tat gtg gcg c-3′

        5′-tct cta gtt gca tga cag ccc tga gta ctc aac caa gtc att-3′

取扩增产物，与pGEM-T质粒(Promage公司)混合后用T4连接酶连接，按Promage公司产品说明书操作，连接产物转化大肠杆菌DH5α(GIBCO公司)。转化方法为标准的钙转化法，按《分子克隆实验指南(第二版)》操作。转化菌液涂布含氨苄青霉素的LB培养基平板，次日挑选长出的菌落，在含氨苄青霉素的LB液体培养基内扩大培养。收集菌体，用大量质粒抽提试剂盒(上海华舜生物技术公司)抽提质粒。将所获得的质粒用SalI酶切，0.8％琼脂糖电泳，胶回收线性化质粒片段。用RiboMAX^TM Large Scale RNA Production Systems试剂盒(Promega公司)将回收的线性化的质粒体外转录为RNA，并用DNaseI消化DNA，酚(水饱和)/氯仿抽提纯化，最终溶于DEPC H₂O中，终浓度1×10⁹拷贝/毫升。实施例3 不含内参照的试剂盒各组分的配制与组装

试剂盒包括标本处理单元和核酸扩增定量检测单元。

标本处理单元采用硫氰酸胍裂解病毒后负压柱纯化方法，要求配合负压抽提组件使用。其组成包括：1.裂解液：4.8M硫氰酸胍，50mM Tris；2.硅胶吸附柱；3.洗涤液I：2M硫氰酸胍，25mM Tris，30％乙醇；4.洗涤液II：2mM NaCl，2mM Tris，80％乙醇；5.洗脱液：DEPC处理过的纯化水

核酸扩增定量检测单元采用荧光定量PCR原理，要求配合荧光定量PCR仪使用。其组成包括：1.PCR反应液：1.8mM dNTP，3.6mM DTT，3.6mM MgCl₂，1.1μM引物一(序

         列5’-gtt tat cac ccg cga aga ag-3′)，1.1μM引物二(序列5′-tct

         cta gtt gca tga cag ccc t-3′)及buffer；2.酶混合物：0.6U/μl AMV逆转录酶，0.6U/μl Tag DNA聚合酶，1U/μl RNA

         酶抑制剂；3.探针：10μM探针(序列5′-FAM-gtt cgt gcg tgg att ggc ttt gat-TAMRA-3′)4.阴性对照：健康人血清；5.定量对照：经稀释得到的拷贝数分别为1×10²/ml、1×10⁴/ml、1×10⁶/ml的三

         支SARS-COV片段体外转录RNA实施例4 含内参照的试剂盒各组分的配制与组装

试剂盒包括标本处理单元和核酸扩增定量检测单元。

标本处理单元采用硫氰酸胍裂解病毒后负压柱纯化方法，要求配合负压抽提组件使用。其组成包括：1.裂解液：4.8M硫氰酸胍，50mM Tris，5000拷贝/毫升内参照RNA；2.硅胶吸附柱；3.洗涤液I：2M硫氰酸胍，25mM Tris，30％乙醇；4.洗涤液II：2mM NaCl，2mM Tris，80％乙醇；5.洗脱液：DEPC处理过的纯化水

核酸扩增定量检测单元采用荧光定量PCR原理，要求配合荧光定量PCR仪使用。其组成包括：1.PCR反应液：1.8mM dNTP，3.6mM DTT，3.6mM MgCl₂，1.1μM引物一(序

         列5’-gtt tat cac ccg cga aga ag-3′)，1.1μM引物二(序列5′-tct

         cta ggt gca tga cag ccc t-3′)及buffer；2.酶混合物：0.6U/μl AMV逆转录酶，0.6U/μl Tag DNA聚合酶，1U/μl RNA

         酶抑制剂；3.探针：10μMSARS探针(序列5′-FAM-gtt cgt gcg tgg att ggc ttt gat-TAMRA-3′)，

         5μM内参照探针(序列5′-HEX-aag ttc tgc tat gtg gcg cgg tat-

         TAMRA-3′)4.阴性对照：健康人血清；5.定量对照：经稀释得到的拷贝数分别为1×10²/ml、1×10⁴/ml、1×10⁶/ml的三支SARS-COV片段体外转录RNA实施例5 试剂盒的使用

取7个1.5ml离心管，编号P1、P2、P3、S0、S1、S2、S3，每管分别加入不同标本100μl(见下表)：

编号	标本
		P1	上海第4例SARS患者住院第9天血清
P2	上海第5例SARS患者住院第12天漱口水
		P3	上海第6例SARS患者住院第2天血清
S0	阴性对照
		S1	定量对照I
S2	定量对照II
		S3	定量对照III

用带滤芯吸嘴反复吹打5次后，再分别用带滤芯吸嘴加入100μl裂解液，盖上管盖，振荡混匀，离心数秒，置70℃反应10分钟，再用带滤芯吸嘴加入110μl无水乙醇，振荡混匀，离心数秒。将7支作好标记的硅胶吸附柱固定在连接有真空泵(上海博汇真空泵厂)的接口基座上，将上述离心管内液体移入硅胶吸附柱，开启真空泵，把柱内的液体全部抽干。随后在每个柱内加入500μl洗涤液I，再开启真空泵，把柱内的液体全部抽干。再在每个柱内加入500μl洗涤液II，再开启真空泵，把柱内的液体全部抽干。然后从接口基座上取下硅胶吸附柱，将其放入2ml离心管中，盖上管盖，14000rpm离心1分钟。最后将柱放入新的2ml离心管中，在柱面中央各加50μl洗脱液，静置1分钟后10000rpm离心1分钟，取2ml离心管中的收集液10μl做PCR反应模板。

取PCR反应液56μl，酶混合物20μl，荧光探针4μl混合，充分混匀后离心数秒，分装至PCR毛细反应管中，每管10μl，再分别加入10μl已处理好的标本(即上述离心管中的洗脱液)，离心数秒后放入LightCycler扩增仪进行扩增检测，参数设定为：

Slope(℃/sec)	AcquisitionMode	Program	Cycles	Temperature Target(℃)	Hold Time(min：sec)
						20	None	1	1	55	16:00
20	None	2	1	94	1:40
						20	None	3	5	94	1
20	None	50	15
				20	None	72	12
20	None	4	42							92	1
				20	Single	58	42
20	None							5	1	35	30

选F1或F1/F2荧光检测通道，将S1、S2、S3的拷贝数和对应C_T值做标准曲线，根据P1、P2、P3的CT值，在标准曲线上得到相应的拷贝数，结果如下：

编号	病毒拷贝数(copies/ml)
		P1	20
P2	3.3×104
		P3	23

根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无须过多实验即可对本发明所要求保护的定量检测传染性非典型肺炎冠状病毒拷贝数的试剂盒进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行详细描述，但并不是构成对本发明的限制。本领域的熟练技术人员用显而易见的相似替代物或改造，或用某些在化学上或生理上相关的制剂替代在此描述的制剂，或对本发明的有关内容进行变动，但不超出本发明的精神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种定量检测传染性非典型肺炎冠状病毒拷贝数的试剂盒，包含裂解液，硅胶吸附柱，洗涤液，洗脱液，引物，探针，定值标准品，阴性对照样品，和酶混合物，其中，所述裂解液为裂解血清、血浆、液化痰液或漱口水标本中病毒颗粒的硫氰酸胍溶液；所述洗涤液为含乙醇溶液；所述洗脱液为低盐缓冲液或水；所述引物为编码传染性非典型肺炎冠状病毒基因组orflab区的序列；所述探针为TaqMan探针；所述酶混合物为逆转录酶、DNA扩增酶、dNTP；所述定值标准品为经定量的编码传染性非典型肺炎冠状病毒基因组orflab区的体外转录RNA。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述硅胶吸附柱采用负压抽提方法纯化病毒RNA。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述裂解液中含有浓度为200-10000拷贝数/毫升的内参照，探针为SARS探针和内参照探针的混合物。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其中，所述内参照是包含引物序列和无关质粒序列的体外转录RNA片段。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其中，内参照所含无关质粒序列来自pUC18质粒。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述引物序列为5’-gtt tat cac ccg cga aga ag-3′和5′-tct cta gtt gca tga cag ccc t-3′。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述SARS探针序列为5′-FAM-gct cgt gcg tggatt ggc ttt gat-TAMRA-3′。

8.如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述定值标准品是由包含传染性非典型肺炎冠状病毒基因组orflab区基因片段的质粒经扩增、线性化、体外转录后所得到的产物。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其中，所述质粒是将pGEM-T质粒与用引物5′-atgaat tac caa gtc aat ggt tac-3′和5′-cat aac cag tcg gta cag cta c-3′从传染性非典型肺炎冠状病毒感染者液化痰液标本中扩增获得orflab区基因片段连接获得。