CN1472324A - 编码向日葵γ生育酚甲基转移酶的DNA序列和氨基酸序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明的名称是“编码向日葵γ生育酚甲基转移酶的DNA序列和氨基酸序列及其应用”，属于生物技术领域。本发明涉及编码向日葵γ生育酚甲基转移酶的DNA序列、氨基酸序列以及此序列的植物、酵母或细菌表达载体；由此植物表达载体转化的植物细胞和由这些转化细胞产生的具有高α生育酚水平的转基因植物及其后代细菌，包括植物种子、完整植株、植物体的器官、组织和细胞及其产品如植物油；由此酵母或细菌表达载体转化的酵母、细菌和由这些转化酵母、细菌产生的向日葵γ生育酚甲基转移酶。

Description

编码向日葵γ生育酚甲基转移酶的DNA序列和氨基酸序列及其应用

技术领域  生物技术领域。

背景技术  维生素E是一类由植物等光合生物合成的脂溶性抗氧化剂，是人和动物必需的营养因子。V_E可以保护细胞膜中的不饱和脂肪酸免受自由基的破坏，这对于人和动物体内多种重要的生理功能的发挥具有重要意义，例如，维持正常的免疫功能，降低金属、臭氧以及吸烟的毒害，影响***素和花生四烯酸的代谢，抑制血小板的凝集等(Skrypin and Kagan，Biochem.Biophys.Acta 815：209 1995；Kagan，N.Y.Acad.Sci.p121，1989；Gomez-Fernandez et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.p109，1989)。V_E的缺乏与多种疾病相关，如免疫缺陷、癌症、心血管疾病、白内障、关节炎等。

人们从光合生物中发现有8种具有不同V_E活性的分子，分别是α-，β-，γ-，δ-生育酚(tocopherols)和相应的生育三烯酚(tocotrienols)，其中α-生育酚的活性最高(见表1)。尽管人体对各种生育酚的吸收相同，但只有α-生育酚可被选择性地保留并分布于人体全身。研究表明，在动物体中α-生育酚占总生育酚的90％以上，因此α-生育酚对人和动物来说最为重要(Traber and Sies，Annu.Rev.Nutr.16：321-347，1996)。表1.生育酚和生育三烯酚的生物活性种类             相对生物活性(％)d-α-Tocopherol  100d-β-Tocopherol  50d-γ-Tocopherol  10d-δ-Tocopherol  3d-α-Tocotrienol 30d-β-Tocotrienol 5d-γ-Tocotrienol 未知d-δ-Tocotrienol 未知

V_E每天推荐的摄取量是10-13.4IU(7-9mgα生育酚)。一般来说，每天的植物性食品中所含的V_E可满足以上要求。然而研究表明，每天多摄入适量的V_E(100-1000IU)可减少心血管疾病和一些癌症的发生，提高机体的免疫功能，减缓一些慢性病的发展。显然，普通的食物不能提供如此大量的V_E。

目前，人们药用的V_E大多是从大豆等植物油中提取纯化而来，价格较高。因此，每天口服补充V_E并非大多数人所能承受。

α-生育酚是脂溶性分子，所以植物油是人们所需的生育酚的主要来源。饮食中大约60％的V_E来源于植物油。但人们发现，多种植物油中α-生育酚的比例较低，其生物合成的前体γ-生育酚的含量却比较高(见表2)，这表明催化α-生育酚合成的最后一步关键酶γ-生育酚甲基转移酶(γ-tocopherol methyltransferase，γ-TMT)在这些组织中的含量或活性低。因此超量表达γ-TMT将可能提高α-生育酚的含量。这已在转基因拟南芥中取得成功。

1998年，David Shintani和Dean DellaPenna首次克隆了拟南芥的γ-TMT基因。他们用光合细菌Synechocystis PCC6803的γ-TMT蛋白质序列搜索拟南芥的EST文库，得到了同源66％的拟南芥EST克隆165H5T7，EST 165H5T7在大肠杆菌中的表达产物具有γ-TMT活性。由此得到了拟南芥的γ-TMT基因。

拟南芥的γ-TMT基因编码一个由348个氨基酸组成的蛋白，其中含有2个S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethione，SAM)结合位点，这与其甲基转移酶活性相关。此外，推测其氨基端带一个由47个氨基酸组成的叶绿体转运肽，这可能与植物叶绿体中α-生育酚的合成代谢相关。γ-TMT不仅可催化γ-生育酚甲基化生成α-生育酚，而且可催化δ-生育酚生成β-生育酚。

David Shintani和Dean DellaPenna将拟南芥的γ-TMT基因置于种子特异启动子DC3的驱动下转化拟南芥。使转γ-TMT基因的拟南芥种子中的α-生育酚含量比转空质粒pDC3的对照提高了80多倍，种子中的V_E活性是对照种子的9倍。这为提高其它植物V_E含量提供了一条有效的途径。

发明内容  向日葵油中含有丰富的α-生育酚，占总生育酚的96％(表2)。因此，向日葵可能存在着活性较强的γ-TMT或是其γ-TMT有着高水平的表达。为此，本发明从向日葵中克隆γ-TMT基因，为改良其它作物品质提供基因。

       表2.植物组织及油中不同生育酚和生育三烯酚的比例(％)

              α-T   β-T   γ-T   δ-T   α-T-3   β-T-3  γ-T-3   δ-T-3向日葵¹(种子油)   96      2      2      -      -        -       -         -棉籽¹(种子油)     40      -      58     1      -        -       -         -油菜籽²(种子油)   25      -      75     -      -        -       -         -花生²(种子油)     33      -      67     -      -        -       -         -玉米²(种子油)     22      3      68     7      -        -       -         -玉米²(全谷粒)     11      -      69     -      4        7       9         -大豆¹(种子/油)    7       1      70     22     -        -       -         -麦胚¹(油)         72      25     -      -      -        3       -         -棕榈¹(种子/油)    25      -      -      -      30       -       40        5水稻²(全谷粒)     50      -      50     -      -        -       -         -生菜¹(叶)         53      -      47     -      -        -       -         -花椰菜²           44      -      56     -      -        -       -         -

注：T及T-3分别表示tocopherol和tocotrienol。(¹McLaughlin，P.J，Weihrauch，J.c.”Vitamin E content of foods”，J.Am.Diet.Ass.75：647-665，1979²Bauernfein，J.“Tocopherols in foods”，In Vitamin E：A Comprehensive Treatise，L.J Machlin ed.，MarcelDekker，Inc.New York pp99-168)

大豆、油菜、棉籽、花生、玉米、麦胚是主要的食用油来源。从表2中可以看出，大豆油中α-生育酚的含量比较低，仪为总生育酚的7％，其前体γ-生育酚却为α-生育酚的10倍，占总生育酚的70％，因此导入γ-TMT基因将可能显著提高豆油中的VE水平。同时还可催化含量22％的δ-生育酚转变成活性较高的β-生育酚(相对生物活性50％，见表1)。同时豆饼中V_E水平的提高，也将增加其作为饲料的营养价值。同理，将种子特异启动子或组成型表达的启动子驱动的γ-TMT基因导入油菜、棉籽、花生、玉米、小麦则可以提高这些食用油的V_E水平。将γ-TMT基因导入水稻、生菜、花椰菜则可提高谷粒、蔬菜的V_E水平。

此外，向日葵γ-TMT还可能用于体外的γ-生育酚的转化。比如人工合成V_E过程中，利用向日葵γ-TMT催化合成产物中γ-生育酚向α-生育酚的转化，提高V_E水平。

本发明根据已知的拟南芥和紫苏γ-TMT基因的序列，按照保守区的序列设计合成了引物Primer1(SEQ NO3)、Primer2(SEQ NO4)。以向日葵cDNA文库(以向日葵10天幼苗叶片为材料，用Clontech公司的Smart cDNA Library Construction Kit试剂盒构建)为模板，用试剂盒中的引物CDSIII/3’PCR Primer(SEQ NO5)和Primer1(SEQ NO3)，5’PCR Primer(SEQNO6)和Primer2(SEQ NO4)进行PCR扩增，分别获得了向日葵γ-TMT基因的3’端和5’端序列。由此得到了向日葵的γ-TMT基因(SEQ NO1)。

向日葵的γ-TMT基因编码区长1026bp，编码342个氨基酸(SEQ NO2)。其包括C端的叶绿体定位信号肽和成熟蛋白编码区及N端27个氨基酸的未知功能序列三部分。其成熟蛋白氨基酸序列与拟南芥γ-TMT基因成熟蛋白编码区的同源性达72.3％。

适于本发明植物或细菌表达载体中的γ-TMT基因在植物细胞、酵母和细菌中启动该编码DNA序列转录的启动子包括组成型、诱导型、组织或器官特异性或发育阶段特异性的启动子。例如，它们包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S或19S启动子、胡萝卜胚特异表达启动子DC3、甘露碱合成酶(MAS)启动子、胭脂碱合成酶和章鱼碱合成酶启动子、玉米乙醇脱氢酶启动子、二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基启动子以及适于在单子叶植物中表达的Ubi、Emu、ActinI启动子等；酵母中表达的GAL1、CUP1、PGK、AOX1、GAP等启动子；细菌中表达的P_E、tac、trc、T7等启动子。

另外，在适用于本发明的γ-TMT基因高效植物表达载体上还应包括衍生于花椰菜花叶病毒或胭脂碱合成酶(Nos)基因或其他基因的终止子。

使用本领域已知的方法，可将本发明提供的适于在植物细胞、酵母和细菌中表达的γ-TMT基因构建体，连接到任何一种可在植物细胞、酵母或细菌细胞中自我复制的载体上。这样的载体包括例如衍生于大肠杆菌的质粒载体pUC18、pUC19(Yanisch-perron等，Gene，33：103-119，1985)，植物表达载体pBI101，pBI121，pBI131***(Jefferson等，EMBO J.，16：3901，1987)及pCAMBIA1301(Hajdukiewicz等，Plant Mol Biol，25：989-994，1994；Hiei等，The Plant J.，6：271-282，1994)等；酵母表达载体pYES2、pYEX、pA0815、pPIC3.5K、pPICZ/α、pGAPZ/α；细菌表达载体pLEX、pKK223-2、pET-5、pEZZ18、pRSET、pMAL、pGEX等。

当然，如前所述，为正确选择和鉴定被转化的植物细胞，本发明的上述重组表达载体还应含有可选择标记基因。所使用的选择标记基因的两侧可带有各自的调节序列，以促使它们在植物中的表达。适用的选择标记是本领域内已知的。编码选择标记的外源基因及其他基因可以包含于同一个表达载体中，或者包含于转化时同时应用的不同载体中。

应当指出，凡是应用本发明所描述的γ-TMT基因所构建的任何表达载体均包括在本发明之内。这些表达载体包括如下实现方式：

1)与其它一种或几种基因重组，构建多价基因的表达载体并转入植物、酵母或细菌；

2)与其它一种或几种基因融合，构建表达载体并转入植物，酵母或细菌；

3)与其它一种或几种基因相协同，分别构建植物或细菌表达载体，同时或分步导入同一种植物、酵母或细菌受体。

为在植物细胞中，特别是整株植物中表达外源γ-TMT基因，以改善整株植物及其种子和后代的生育酚含量，必须使用适当的方法将携带γ-TMT基因的重组表达载体转化或转导到适当的宿主细胞或植物体内。

将携带外源基因的重组载体导入宿主植物或其细胞内的许多方法都是本领域技术人员熟知的。这些方法包括但并不限于：1)农杆菌介导的转化法(Agrobacterium-mediatedtransformation)；2)物理法，如基因枪法(Particle bombardment或Particle gun或Genegun)、电击法(Electroporation)、显微注射法(Microinjection)、超声波法(Ultrasonic)、激光微束法(Laser microwave)、碳化硅纤维介导法(Silicon carbide fiber)、电泳法(Eleetrophoretic transfection)等；3)化学法，如PEG介导的转化法、脂质体介导转化法等；4)种质***转化法，如花粉介导法、花粉管通道法(子房注射法)、浸泡法等；5)以花椰菜花叶病毒(CaMV)、双生病毒(Geminiviruses)或RNA病毒等病毒载体所介导的转化法等。

因此，本发明涉及编码γ-TMT基因的DNA序列、氨基酸序列，包含所说的DNA序列的高效植物和细菌表达载体，用所说的表达载体转化植物细胞、组织和整株植物及细菌的方法，以及由此产生的生育酚含量变化的转基因植物和能产生向日葵γ-TMT的酵母或细菌。

本发明提供了获得高V_E植物的方法，该方法包括：

1)构建包含所说γ-TMT基因的植物表达载体；

2)用任何一种可行方法将步骤1)中得到的植物表达载体导入到植物细胞内，并由此获得的转基因植物及其后代，包括任何部分的植物器官、组织和种子及其产品如α生育酚含量发生改变的植物油。

因此，使用本发明所述的γ-TMT基因的植物、酵母或细菌表达载体，以本领域技术人员已知的任何一种方法导入任何植物组织或细胞、酵母或细菌中，以及由此而获得的转基因植物及其后代的种子和植物部分及转化酵母或细菌，均包括在本发明之内。以该转基因植物作亲本，通过杂交或转育所产生的植株、品系或品种，亦均包括在本发明之内。

具体实施方式实施例1、向日葵γ-TMT基因的克隆1.1向日葵γ-TMT基因3’端序列的克隆

以向日葵cDNA为模板，用引物CDSIII/3’PCR Primer(SEQ NO5)和Primer1(SEQ NO3)进行扩增，反应条件为：

94℃ 2分钟(1个循环)

94℃ 30秒，54℃ 30秒，72℃ 1分钟30秒(36个循环)

72℃ 10分钟(1个循环)

扩增产物用琼脂糖电泳分离，回收目的条带，与pMD18-T载体(Takara公司)连接并测序。1.2向日葵γ-TMT基因5’端序列的克隆

以向日葵cDNA为模板，用引物5’PCR Primer(SEQ NO6)和Primer2(SEQ NO4)进行扩增，反应条件为：

94℃ 2分钟(1个循环)

94℃ 30秒，54℃ 30秒，72℃ 1分钟30秒(36个循环)

72℃ 10分钟(1个循环)

扩增产物用琼脂糖电泳分离，回收目的条带，连接到pMD18-T载体并测序。1.3向日葵γ-TMT基因序列的获得

将5’端序列和3’端序列拼接即得向日葵γ-TMT基因序列。

按照向日葵γ-TMT基因全序列设计引物Primer3(SEQ NO7)和Primer4(SEQ NO8)，并进行扩增，反应条件为：

94℃ 2分钟(1个循环)

94℃ 30秒，54℃ 30秒，72℃ 1分钟30秒(36个循环)

72℃ 10分钟(1个循环)

扩增产物用琼脂糖电泳分离，回收目的条带，连接到pMD18-T载体并测序，选正确克隆，命名为pTMT。实施例2、γ-TMT基因植物表达盒的构建

本实施例所构建的γ-TMT基因表达盒中包括以下基因表达调控元件：5’端的CaMV 35S启动子、加倍的增强子、Ω序列及Kozak序列，3’端的多联终止序列、切割序列、NOS终止子。pTMT经PstI和SmaI酶切，回收γ-TMT基因片段(约1050bp)并克隆于pTQ4A的PstI和HpaI位点间。重组质粒命名为pTΩ4A-TMT。实施例3、γ-TMT基因植物表达载体的构建：

pTΩ4A-TMT以EcoRI和HindIII双酶切，回收片段克隆于pBI121的相应位点间，得到植物表达载体pBTMT。这就是所构建的γ-TMT基因植物表达载体pBTMT。实施例4、冻融法转化根癌农杆菌：1.从平板上挑取农杆菌LBA4404单菌落，接种于5ml YEB培养基，28℃、250rpm摇菌培养过夜；2.取2ml菌液，加入50ml YEB培养基，28℃、250rpm摇菌培养至OD₆₀₀约0.6；3.将菌液转至50ml离心管中，冰浴30分钟，然后5000rpm离心5分钟；4.弃上清，沉淀用2ml 20mM CaCl₂悬浮，每份100ul分装到1.5ml离心管中，液氮中保存备用；5.取2ug pBTMT质粒DNA，加入到100ul感受态细胞中，混匀，冰浴5分钟；6.将离心管置液氮中冷冻5分钟，迅速转至37℃水浴中温浴5分钟；7.加入1ml YEB培养基，28℃、250rpm摇菌培养4-5小时；8.取适量菌液涂布于含抗生素的YEB平板上，28℃培养24-48小时。实施例5、根癌农杆菌介导转化烟草：1.农杆菌的活化：从平板上挑取农杆菌单菌落，接种到5ml YEB液体培养基(Kan 100mg/L，pH5.5)中，剧烈振荡培养至OD₆₀₀为0.4～0.5(约3～4h)，5000rpm离心5min，菌体用MS液体培养基(pH5.8)重悬，至OD₆₀₀为0.1～0.2；2.共培养：将侵染过的叶块摆放在铺有2层滤纸的烟草芽分化培养基(MS+IAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L)上，25℃暗培养4天；3.抗性芽的筛选：将经过共培养的烟草外植体转移到抗性芽筛选培养基(MS+IAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)上，2～3周后即可生芽；4.生根：待抗性芽长到1cm左右时，将其转移到生根培养基(MS+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)上，1～2周后即有不定根形成。实施例6、γ-TMT基因在大肠杆菌中的表达及酶活检测：

用引物Primer5(SEQ NO9)和Primer6(SEQ NO10)，以pTMT为模板扩增得到TMT成熟蛋白的编码区，扩增产物经XhoI和EcoRI酶切后克隆于大肠杆菌表达载体pREST A(invitrogen公司)的相应位点之间。得到原核表达载体pRTMT。将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。以空表达载体pREST A为阴性对照。阳性菌经37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，在37℃诱导表达3h后离心收集500mL培养液的菌体，重悬于5mL超声波缓冲液(10mmol/L HEPES pH7.8；5mmol/L DTT；0.24mol/L sorbitol；1mmol/LPMSF)，于冰上用超声波破碎仪破碎细胞。匀浆中加入TritonX-100至终浓度1％，冰上置30min后，4℃ 30,000g离心30min，取上清用于酶活检测。

125uL酶活检测体系中有50mmol/L Tris，pH8.5；5mmol/L DTT；0.64mmol/L γ-tocopherol；1.28mmol/L SAM，样品60ul，于25℃温育1.5h后加入500ul 2∶1(v/v)的氯仿∶甲醇(含1mg/mL二丁基羟基甲苯)和125uL 0.9％的生理盐水中止反应。将样品剧烈涡旋1min后离心，将下层氯仿相转入新管并真空去处氯仿，用20uL乙酸乙酯溶解干燥的油液，点样育TLC板(硅胶GF254板)上，在二氯甲烷中展层。室温干燥TLC板，在紫外光(253nm)下观察色谱。

在酶促反应0，20，40，60，80，100，120min后，分别取出20uL反应液，按上述方法中止反应并进行薄层层析分离，在紫外光下标明相应于α生育酚谱带的位置。刮去取各带，加入2mL无水乙醇振荡，静置5min，12,000g离心5min，将上清液转入比色杯，并往杯中各加入0.5％的α，α’-双吡啶溶液0.5mL和0.2％的三绿化铁溶液0.5mL，混匀，在加入三绿化铁2min之后测定520nm的吸收值(见表3)。

表3.γ-TMT酶活检测的光谱吸收值

               0min    20min     40min     60min     80min     100min     120min

A₅₂₀/pRTMT      0     0.0354    0.0646    0.0977    0.096     0.0951     0.0947

A₅₂₀/pRESTA     0     0.0020    0.0023    0.0021    0.0023    0.0026     0.0023

从520nm处的吸光值可以看出，在含有γ-TMT的反应液中，随着反应的进行，A₅₂₀值逐渐增大，至60min时达到最高，之后略有下降，而对照组无此变化。这表明细菌中表达的γ-TMT参与了γ-生育酚的甲基化反应，具有酶活性。

DNA与氨基酸序列表SEQ NO1(向日葵γ-TMT基因序列)：1    GCCCATTACG GCCGGGGACG TGCCATTGTT GACACACGTC ACCACCACCA CCGCCAAATT61   CACCACTCAC TCACACAACC TGCTATGGCT ACGACGGCAG TTGGCGTATC GGCGACGCCG121  ATGACGGAGA AGCTGACGGC GGCAGATGAT GACCAGCAGC AGCAGAAGCT CAAAAAAGGA181  ATCGCAGAGT TCTACGACGA ATCCTCAGGT ATGTGGGAGA ACATATGGGG AGAACACATG241  CATCACGGAT ATTATAACTC CGACGACGTC GTTGAACTCT CCGATCACCG TTCTGCTCAG301  ATCCGTATGA TTGAACAAGC CCTAACGTTC GCCTCTGTTT CAGATGATCC GGAAAAGAAA361  CCTAAAACCA TAGTTGATGT CGGGTGTGGT ATAGGAGGTA GCTCAAGGTA TCTAGCAAGA421  AAATACGGAG CCGAATGTCA CGGAATCACC CTCAGCCCTG TGCAAGCTGA GAGAGNTAAT481  GCCCTTGCTG CGGCCCAAGG GTTGGCCGAT AAGGTTTCAT TTCAAGTTGC TGATGCTTTA541  AACCAGCCGT TTCCTGATGG AAAGTTTGAC CTTGTTTGGT CAATGGAGAG TGGAGAGCAC601  ATGCCTGACA AACTTAAGTT TGTTAGTGAG TTGACTCGGG TGGCTGCCCC CGGAGCCACC661  ATTATCATAG TTACATGGTG CCACAGAGAT CTTAACCCCG GAGAAAAATC CCTTCGCCCC721  GAGGAAGAAA AAATCTTGAA TAAGATTTGT TCCAGCTTTT ATCTTCCCGC TTGGTGTTCT781  ACAGCTGATT ATGTAAAGTT ACTAGAATCC CTTTCTCTTC AGGACATAAA ATCCGCAGAC841  TGGTCTGGCA ATGTGGCCCC ATTTTGGCCT GCTGTAATAA AAACAGCATT GTCTTGGAAG901  GGCATTACTT CATTGCTACG TAGTGGTTGG AAGTCCATAA GAGGGGCAAT GGTAATGCCA961  CTAATGATTG AAGGATTTAA GAAGGATGTA ATAAAATTCT CCATCATTAC ATGCAAAAAG1021  CCTGAATAASEQ NO2(向日葵γ-TMT氨基酸序列)：1     AHYGRGRAIV DTRHHHHRQI21    HHSLTQPAMA TTAVGVSATP41    MTEKLTAADD DQQQQKLKKG61    IAEFYDESSG MWENIWGEHM81    HHGYYNSDDV VELSDHRSAQ101   IRMIEQALTF ASVSDDPEKK121   PKTIVDVGCG IGGSSRYLAR141   KYGAECHGIT LSPVQAERXN161   ALAAAQGLAD KVSFQVADAL181   NQPFPDGKFD LVWSMESGEH201   MPDKLKFVSE LTRVAAPGAT221   IIIVTWCHRD LNPGEKSLRP241   EEEKILNKIC SSFYLPAWCS261   TADYVKLLES LSLQDIKSAD281   WSGNVAPFWP AVIKTALSWK301   GITSLLRSGW KSIRGAMVMP321   LMIEGFKKDV IKFSIITCKK341   PE^*SEQ NO3(Primer1)：5’ ATAGTTGATGTCGGGTGTGG  3’SEQ NO4(Primer2)：5’ GGCATGTGCTCTCCACTCTCCAT  3’SEQ NO5(CDSIII/3’PCR Primer)：5’ ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG  3’SEQ NO6(5’PCR Primer)：5’ AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT  3’SEQ NO7(Primer3)：5’ GCCCATTACGGCCGGGGACGTG  3’SEQ NO8(Primer4)：5’ TTATTCAGGCTTTTTGCATGTAAT  3’SEQ NO9(Primer5)：5’ GCCTCGAGGCCCATTACGGCCGGGGACGTG  3’SEQ NO10(Primer6)：5’ GCGAATTCTTATTCAGGCTTTTTGCATGTAAT  3’

Claims (15)

1.一种编码向日葵γ生育酚甲基转移酶的DNA序列，其特征是该DNA序列具有如SEQ NO 1所示的DNA序列，其编码SEQ NO2所示的氨基酸序列；

2.权利要求1的DNA序列，其中所说的DNA序列包括该DNA序列的同源序列；

3.权利要求1的DNA序列，其中所说的DNA序列包括该DNA序列的部分序列；

4.一种编码向日葵γ生育酚甲基转移酶的氨基酸序列，其特征是该氨基酸序列具有如SEQNO2所示的氨基酸序列；

5.权利要求4的氨基酸序列，其中所说的氨基酸序列包括该氨基酸序列的同源序列；

6.权利要求4的氨基酸序列，其中所说的氨基酸序列包括该氨基酸序列的部分序列；

7.一种嵌合基因，其特征是该嵌合基因包含权利要求1到3的DNA编码序列；

8.一种用于转化植物细胞的载体，其特征是该载体包含权利要求7的嵌合基因；

9.一种转化植物细胞，其特征是该转化植物细胞含有权利要求8的载体；

10.一种转化植物，其特征是该转化植物来自于权利要求9的转化植物细胞；

11.权利要求10的转化植物，其中所说的转化植物包括但不限于转化植物及其后代，包括植物种子、完整植株、植物体的器官、组织和细胞及其产品如植物油；

12.权利要求11的转化植物，其中所说的转化植物具有高α-生育酚水平；

13.一种用于转化细菌或酵母的载体，其特征是该载体包含权利要求1、2、3和7的DNA编码序列；

14.一种转化细菌或酵母，其特征是该转化细菌或酵母含有权利要求13的载体；

15.权利要求14的转化细菌或酵母，其中所说的转化细菌或酵母可产生向日葵γ生育酚甲基转移酶；