CN1470632A - 一种动物细胞的优化流加悬浮培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种动物细胞的优化流加悬浮培养方法，其特点是通过研究细胞生长动力学来确定细胞生长所需营养物质的最低浓度，通过化学计量的方法确定合成一个细胞所需要的所有关键营养物质的比例，以此为基础设计加料物流中所有营养物质的合理配方，按营养物质的消耗速率加入加料物流，以对细胞生长的化学环境进行控制，然后根据本次实测的实验数据对化学计量模型中的可调参数进行优化，重复上述步骤进行迭代直到最优。按本发明的优化工艺方法具有培养液使用效率高、细胞密度高、蛋白质浓度和产量高、生产成本低、和容易实现大规模GMP生产等特点，对生物工程制品的研究和GMP生产具有重要的使用价值。

Description

一种动物细胞的优化流加悬浮培养方法

技术领域

本发明涉及一种对动物细胞进行高浓度悬浮培养的方法，更确切地说，本发明涉及一种动物细胞的优化流加悬浮培养方法。

背景技术

动物细胞培养技术早在50年代初就已开始(Eagle H.1955.Nutrition needs of mammalian cells in tissue culture.Science 122：501-504.)，经过几十年的发展，细胞培养技术在蛋白质药物以及病毒疫苗和基因治疗产品的生产上已经得到了很好的应用。

高密度动物细胞培养是一种综合性的、多学科的和高难度的尖端技术和艺术。获得高的细胞密度需要解决细胞新陈代谢所需的营养的供给和控制、有毒副产物的控制或排出、氧气的供给、以及环境参数，如pH值，渗透压(osmolarity)，溶氧浓度(dissolved oxygen)，温度等的实时控制等问题。解决这些技术问题需要掌握细胞的生物化学反应***、细胞的生理学、化学工程的单元操作和工艺过程控制及优化等专门知识和技能。

研究高密度动物细胞培养的目的是为了提高单位反应器体积和单位体积的培养液的蛋白质产量，从而达到高生产效率、低的固定资产(厂房和设备)投入、和低生产成本。提高动物细胞培养中蛋白质产品的浓度和产量必须从三个方面着手：提高宿主细胞内的蛋白质表达水平；提高细胞浓度；和延长细胞培养寿命。

单克隆抗体在宿主细胞内的表达水平是一个十分重要的工艺参数，它直接影响单克隆抗体的浓度和产量。在通常情况下，蛋白质的表达水平在10×10^-12克/细胞/天左右。宿主细胞内的蛋白质表达水平取决于基因方面的特征，如蛋白质表达载体的结构、基因拷贝数目、以及外来基因在宿主细胞内的稳定性，和细胞生长环境因素，如细胞的生长速度、培养液的透压(osmolarity)、丁酸钠(sodium butyrate)的浓度、和细胞培养温度等。优化蛋白质表达载体结构，可以直接提高蛋白质的产量。进一步提高抗体表达水平需要增加抗体基因的拷贝数目和优化细胞培养的物理、化学环境。国际上通用的增加目标基因拷贝数目的技术有二类：在DHFR^-CHO细胞***采用增加氨甲叶酸(methotrexate(MTX))浓度和在GS-NSO(glutamine synthetase)细胞***采用增加甲硫氨酸硫氨(methionine sulfoxamine)浓度[Bebbington CR，RennerG，Thomson S，King D，Abrams D，Yarranton GT.1992.High-levelexpression of a recombinant antibody from myeloma cells using aglutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker.Biotechnology 10：169-175；Robinson DK，DiStefano D，Gould SL，CucaG，Seamans TC，Benincasa D，Munshi S，Chan CP，Stafford-Hollis J，Hollis GF，Jain D，Ramasubramanyan K，E.MG，Silberklang M.1995.Production of Engineered Antibodies in Myeloma and Hybridoma Cells：Enhancements in Gene Expression and Process Design.AntibodyEngineering.H.Wang and T.Imanaka.Worthington，ACS.；YoshikawaT，Nakanishi F，Ogura Y，Oi D，Omasa T，Katakura Y，Kishimoto M，SugaK.2000.Amplified gene location in chromosomal DNA affectedrecombinant protein production and stability of amplified genes.Biotechnology & Bioengeering 16：710-715.]。增加细胞生长的抑制剂的浓度不利于抗体基因的拷贝数目低(因而其DHFR或GS基因拷贝数目也低)的细胞生长，从而有选择性地获得含抗体基因的拷贝数目高的细胞株。采用此方法，Robinson et al.[1995]成功将抗体表达水平从优化前的10^-11克/细胞/天提高到5×l0^-11克/细胞/天，抗体基因的拷贝数目也相应从原来的1个提高到5个。

提高蛋白表达水平的另一个方法是优化细胞生长的环境：包括温度、pH值、透压、和添加一些可以刺激细胞蛋白表达的化学物质如丁酸钠。Chang et al.[Chang DYH.2000.Development of a technologyplatform for production of human monoclonal antibodies in recombinantCHO cell culture.Cell Culture Engineering Conference VII.]通过改善细胞培养的化学环境，成功将单克隆抗体在CHO细胞中的表达水平从2.1×10^-11克/细胞/天提高到3.5×10^-11克/细胞/天。Oh et al.[Oh SKW，Vig P，Chua F，Teo WK，Yap MGS.1993.Substantial overproduction ofantibodies by applying osmotic pressure and sodium butyrate.Biotechnology & Bioengeering 42：601-610.]通过在培养液中添加丁酸钠和提高透压的办法来提高蛋白质的表达水平。可见细胞培养的环境参数对蛋白质生产的重要影响。

提高蛋白质产量的另一个重要方法是提高细胞密度和延长细胞的生长时间，采用流加工艺过程可以取得很好的效果。流加工艺过程基本上是一种分批生产的工艺，所不同的是在细胞培养过程中，采用了事加料的方式来补充细胞生长过程中所消耗的营养，以此来延长细胞生长的时间，达到高的细胞密度。通常的做法是采用商业性的分批生产用培养液，先进行分批生产，在快接近分批生产的尾声时，向反应器中加入预先配制的营养物质的混合物[Park S，Ramifez WF.1988.Optimal productionof Secreted protein in fed-batch reactors.AIChE J.34：1550-1558.；Tremblay Md，Perrier M，Chavarie C，Archambault J.1992.Optimizationof fed-batch culture of hybridom cells using dynamic programming：single and multi feed cases.Bioprocess Engineering 7：229-234]。由于细胞生长需要几十种营养物质，而加料物流通常只有一个，确定加料物流的组成就变得十分重要，但目前缺乏一种***合理的方法。通常的做法是根据商业性的分批生产用培养液的成分培植浓缩的加料物流，其缺点是有的物质过多而造成积累，有些物质不够而造成过早耗尽和细胞死亡[Bushell ME，Bell SL，Scott MF，Spier RE，Wardell JN，SandersPG.1994.Enhancement of monoclonal antibody yield by hybridomfed-batch culture，resulting in extended maintenance of viable cellpopulation.Biotechnology & Bioengeering 44：1099-1106.；Jo E，ParkH，Kim D，Moon HM.1993.Repeated fed-batch culture of hybridoma cellsin nutrient-fortified high density medium.Biotechnol.Bioeng.42：1229-1237.]。

发明内容

本发明提供了一种动物细胞的优化流加悬浮培养方法，包括以下步骤：

a).确定细胞生长所需营养物质的最低浓度，配成一个进行细胞培养的初始营养环境，将待培养细胞接种到该初始营养环境中；

b).给出一个或多个可变参数，据此确定合成一个细胞所需要的所有关键营养物质的比例，并以此配成加料物流；按营养环境中营养物质的消耗速率，将加料物流补充到营养环境中，进行细胞培养；

c).测定实际培养体系的可变参数；将该实测的可变参数值代入到b)步中；

d).重复b)和c)步一次或多次，进行试差迭代，直到营养环境达到优化并不再变化为止。

按本发明确定和控制细胞生长的最佳营养环境，从而使细胞凋亡减少和延缓，以获得高细胞密度和延长细胞培养时间，并得到高的蛋白质浓度和产量。本发明通过研究细胞生长动力学的方法来确定细胞生长的最佳营养环境，而通过化学计量关系和流加工艺来满足细胞生长所需的营养物质量。从而解决了细胞生长动力学和化学计量关系对营养物质浓度要求不同的冲突。该发明即可降低有毒废物的产生，不影响细胞生长速率，又可获得高的细胞密度。具体说明如下：

动物细胞在生长过程中会产生有毒的废物如氨和乳酸，它们是葡萄糖和谷氨酸的主要副产物。研究表明，要有效地降低氨和乳酸的产量，必需把葡萄糖和谷氨酸减低到1mM以下。但另一方面，细胞的生长需消耗大量的营养物质，尤其是葡萄糖和谷氨酸。本发明有效地采用一种新型的流加工艺过程来同时达到这二个目的：采用自行配制的培养液作为细胞生长的初始营养环境，其关键营养物质的浓度是由细胞生长动力学研究所决定的；采用控制加料物流的添加速率来补充细胞消耗的营养物质，使细胞生长的初始环境维持不变，加料物流的营养配方是由化学计量关系所确定的。

按本发明的方法，可以采用细胞生长动力学方法确定细胞生长所需的营养物质的最低浓度。细胞生长动力学的研究方法早有文献发表[Glacken MW，Adema E，Sinskey AJ.1988.Mathematical descriptions ofhybridoma culture kinetics：I.initial metabolic rates.Biotechnology& Bioengeering 32：491-506.；Hayter PM，Curling EMA，Baines AJ，Jenkins N，Salmon I，Strange PG，Bull AT.1991.Chinese hamster ovarycell growth and interferon production kinetics in stirred batchculture.Applied Microbiology Biotechnology 34：559-564.；Miller WM，Blanch HW，Wilke CR.1988.A kinetics analysis of hybridoma growthand metabolism in batch and continuous suspension culture：effectof nutrient concentration，dilution Rate，and pH.  Biotechnology &Bioengeering 32：947-965.；Ozturk SS，Palsson BO.1991.Growth，metabolic，and antibody production kinetics of hybridoma cell culture：1.analysis of data from controlled batch reactors.BiotechnologyProgress 7：471-480.]。在此声明将有关内容并入本申请，供参考。研究细胞生长的目的往往是为了建立计算细胞生长速率的数学模型。本发明则通过研究细胞生长动力学来确定细胞生长所需的最低营养物质浓度，从而使有毒废物的产生速率降到最低。按细胞生长动力学确定细胞生长所需的最低营养物质浓度后，配成一个进行细胞培养的初始营养环境，然后再将待培养的细胞接种到该初始营养环境中。

按本发明的方法，可以采用化学计量方法来确定合成一个细胞所需的所用关键营养物质的比例。主宰细胞生长的化学计量关系的研究已经发表[Xie L，Wang DIC.1994a.Stoichiometric analysis of animal cellgrowth and its application of medium design.Biotechnology &Bioengeering 43：1164-1174.；Xie L，Wang DIC.1994b.Fed-batchcultiVation of animal cells using different medium design conceptsand feeding strategies.Biotechnology & Bioengeering 43：1175-1189.；Xie L，Wang DIC.1994c.Applications of improved stoichiometric modelin medium design and fed-batch  cultivation of animal cells inbioreactor.Cytotechnology 15：17-29.]。在此声明将有关内容并入本发明申请，供参考。简述如下：

每一个动物细胞都是一个十分复杂的有机体，也可以被看成是一个可以自行复制再生的机器。动物细胞内含有数不清的各种不同的有机化合物，但大致可以分为如下几个大的类别：蛋白质(protein)、糖类碳水化合物(carbohydrates)、脂类化合物(lipids)、DNA、RNA、和其他物质。细胞在生长和自我复制的过程中必需合成细胞内所有化合物。很显然，细胞内必须进行数以万计的不同的化学反应，因而可以说细胞本身就是一个同时有很多化学反应进行的多元反应器。更为复杂的是，在不同的周围环境条件下，细胞可以选择不同的化学反应途径合成某一个化合物。显然，这样一个复杂的反应器是无法用一组数学方程式来描述的，而且，由于其多变性，这样的反应器***没有唯一解。

通过研究细胞培养过程中实际关心的问题和细胞生长的特性，本发明人发现，尽管细胞的新陈代谢方式具有可变性，但对某一个特定的细胞株，必定存在一个的最佳方式。在此条件下，细胞的生长、蛋白质的生产、以及细胞的新陈代谢效率等都达到最优。在此假定的理想情况下，不必要的副反应可以不考虑，多种反应途径的情况只需考虑其中最佳的，因而需要考虑的化学反应数目大大减少。然后，再根据细胞内主要物质的类别将所涉及的化学反应进行归纳、分类处理，得到一个包含多个方程式的化学反应网络***。采用一个设定的细胞培养条件，利用物质和能量平衡关系即可解出这个反应网络***，从而得到一个可以描述在设定的培养条件下最佳的细胞生长过程的化学反应方程式：

其中θ_glc为葡萄糖(glucose)的、θ_a，i为氨基酸(amino acids)的、θ_v，i为维生素(Vitamins)的、θ_p为蛋白质产品(product)的、θ_ATP为细胞新陈代谢所需的能量(ATP)的、θ_k为副产物(by-products)的化学计量系数。

确定这些系数需要测定细胞内的化学物质的含量以及细胞生长所需的能量，其中包括细胞内所有蛋白质的总含量以及它们的氨基酸的平均组成、所有糖类碳水化合物(carbohydrates)的含量、所有脂类化合物(lipids)的含量、以及DNA和RNA的总含量。除此之外，还需要计算出细胞生长所需的能量以及设计所允许的最少副产物量。

因为细胞的生长对生物反应器中的营养物质的消耗，必需对消耗的营养物质进行补偿，才能使细胞生长的营养环境维持在初始的最佳状态。根据化学反应工程原理，进料物流中的化学成分的比例应该与所进行的反应化学计量关系匹配，才能使每一种物质的进料速率和该物质在反应器中的静消耗速率平衡，有效地控制反应器中的化学物质的浓度不变。根据这一基本原理和以上所建立的主宰细胞生长的最佳化学计量数学模型，进料物流中化学物质i的摩尔分数X_i应该与它的化学计量系数成正比： $X_i=\frac{{\mathrm{\θ}}_i}{{\mathrm{\Σ\θ}}_i}...........\left(2\right)$

其中θ_i为化学物质i的化学计量系数，∑θ_i为进料物流中所有化学物质的化学计量系数总和；进料物流的加料速率则为：

加料速率＝N_t∑θ_i    (3)

其中N_t为细胞数目的增长速率，可以根据以上所研究的细胞生长动力学方程确定。

采用以上方法可以用一个进料物流的加料速率来有效地控制所有营养物质在生物反应器中的浓度，从而防止某些物质的积累和另外一些物质的耗尽。

由于首次是在一个设定的细胞培养条件，如假定一个允许的有毒废物产生速率(可调参数)下，求解所归并而成的反应网络***，从而建立方程式(1)、(2)和(3)的，故开始时按方程式(1)、(2)、(3)配成的流加物料组成和流加量并不能保证细胞生长的营养环境不发生变化而一下达到最佳营养环境。因此需要根据实际测到的细胞生长营养环境来重新求解式(2)中的参数，按式(2)重新确定在新条件下合成一个细胞所需要的所有关键物质的比例，对化学计量模型中的可调参数进行必要的修正，配成加料物流，并按式(3)确定加料速率。该过程称为一次迭代过程。每进行一次迭代后得到一个新的营养环境，从而修正一次式(1)、(2)和(3)中的参数，据此调整流加物料的组成和流加量后，又完成一个新的迭代过程。重复该迭代过程一次或多次，直到营养环境达到优化，即有毒废物的产生速率最低且营养环境不再变化为止。

按本发明方法的一个优选实施方案，所用动物细胞是选自CHO的细胞、杂交瘤细胞、PER.C6、293、昆虫细胞中的任一种。

本发明适合于各种悬浮哺乳动物细胞的体外培养，包括CHO，杂交瘤(SP2/0，NSO，等)，PER.C6，293，HeLa，昆虫细胞等。可以在各种不同培养规模(实验室和生产规模)和反应器(摇瓶、转瓶、搅拦反应器等)中应用。

按本发明的方法的一个优选实施方案，所用的初始培养液是无血清的。

按本发明方法的一个优选实施方案，流加物料的加料方式可以是手动的或自动化的。

附图说明

图1是CHO细胞在分批工艺和按本发明方法进行培养时的生长情况对比。

其中曲线1为按分批工艺培养时的生长情况，曲线2为按本发明方法进行培养时的生长情况。

具体实施方式

作为对本发明方法的一种示例，在此较详细叙述一种结合细胞生长动力学研究和化学计量关系并采用重复迭代进行优化的动物细胞优化流加悬浮培养工艺技术如下。

1.确定细胞生长的最佳营养环境：

采用自行配制的培养液和批工艺过程培养所要研究的细胞株，获得细胞生长的基本特性。在物理参数(温度、pH值，溶氧浓度等)受严格控制的条件下，进行如下对比实验：(1)配制一个不含葡萄糖的培养液，然后加入不同的葡萄糖浓度(如0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，25.0mM)，并用来培养细胞并测定细胞在不同葡萄糖浓度下的生长速率和有毒副产物的产生速率；(2)配制一个不含谷氨酸的培养液，然后加入不同的谷氨酸浓度(如0.1，0.2，0.4，0.6，1.0，2.0，4.0mM)，并用来培养细胞并测定细胞在不同谷氨酸浓度下的生长速率和有毒副产物的产生速率；(3)根据以上所得数据，确定不影响细胞生长速率的最低葡萄糖和谷氨酸浓度，并以此配制流加工艺所用的初始培养液。

2.确定细胞生长的化学计量关系：

采用已发表的方法测定细胞的干重和细胞内高分子物质的含量(Xie and Wang，1994c)，假定一个允许有毒废物产生速率(可调参数)，根据已发表的数学模型和方法计算葡萄糖、氨基酸、和维生素的化学计量系数。根据方程式(2)计算出加料物流的营养物质配方，并配制加料物流。

3.采用化学计量控制的流加工艺进行动物细胞培养：

采用步骤1中所配制的培养液作为初始营养环境接种细胞，开始细胞培养过程。采用步骤2中配制的加料物流和方程式(3)控制加料物流的添加速率来实现对细胞生长的营养环境的控制。测定细胞生长过程中的参数，如生长速率、氨产生速率、乳酸产生速率、以及葡萄糖和谷氨酸浓度变化等。

4.根据步骤3的实验结果对可调参数进行优化：

根据以上步骤所得的氨产生速率和乳酸产生速率以及葡萄糖和谷氨酸浓度变化等实验数据，对化学计量模型中的可调参数(氨和乳酸的产生速率)进行必要的修正，即采用步骤3中测定的氨产生速率、乳酸产生速率，重新计算细胞生长的化学计量系数，并以此配制新的加料物流。重复步骤3中的流加工艺培养过程，直到氨和乳酸的产生速率达到最低即为优化的流加工艺技术。

本发明适合于各种悬浮哺乳动物细胞的体外培养，包括CHO，杂交瘤(SP2/0，NSO，等)，PER.C6，293，HeLa，昆虫细胞等。可以在各种不同培养规模(实验室和生产规模)和反应器(摇瓶、转瓶、搅拌反应器等)中应用。

实例一

实验方法：该实验采用表达一个单克隆抗体的基因工程CHO细胞株进行实验。所用的初始培养液为自主开发的无血清培养液，其中含3.0mM的葡萄糖和0.5mM的谷氨酸，其它氨基酸的浓度也较常用的商业性培养液有所降低。实验采用500毫升的转瓶(Spinner Flask)在转速为每分钟150转的速度下进行，CHO细胞接种密度为0.4×10⁶细胞/毫升，温度控制为37℃。初始培养液的配方见表一，加料物流的配方见表二。

实验结果：图一显示了CHO细胞在无血清培养条件下，采用普通的批工艺和按本发明的优化流加工艺时，细胞生长情况和细胞密度的对比。在批工艺培养中，无血清培养液中营养物质的浓度与常用的商业性培养液类似，尽管还有大量的营养物质剩余，最高细胞密度仅为3×10⁶细胞/毫升；与此形成对比的是，采用本发明的流加工艺过程经过很短的时间的优化，达到了3×10⁶细胞/毫升。蛋白质的产量也相应提高了三倍。值得注意的是，这些结果是在缺少自动化控制的转瓶培养中获得的，可以推断，在自动控制的生物反应器中将会有更好的结果。表一：CHO细胞培养的无血清培养液配方

组分                       毫克/升	组分                            毫克/升
		二水氯化钙(CaCl22H2O)     147硫酸镁(MgSO4)              72氧化钾(KCl)                 298碳酸氢钠(NaHCO3)           2940氯化钠(NaCl)                4091磷酸二氢钠(NaH2PO4)        240五水硫酸铜(CuSO4*5H2O)    0.00075硒酸钠(Na2SeO3)           0.0173七水磷酸锌(ZnSO4*7H2O)    0.2组氨酸(Arginine)            87天冬酰氨(Asparagine)        75天冬氨酸(Aspartic Acid)     53半胱氨酸(Cysteine)          36谷氨酸(Glutamic Acid)       44谷酰氨(Glutamine)           71甘氨酸(Glycine)             37.5组氨酸(Histidine)           83.8异亮氨酸(Isoleucine)        105白氨酸(Leucine)             105赖氨酸(Lycine)              146甲硫氨酸(Methionine)        60苯基丙氨酸(Phenylalanine)   66脯氨酸(Proline)             46丝氨酸(Serine)              53苏氨酸(Threonine)           71.5色氨酸(Tryptophan)          61酪氨酸钠(Tyrosine*2Na)      105颉氨酸(Valine)              70葡萄糖(D-Glucose)           540	HEPES缓冲剂                     6508丙酮酸钠(Pyruvate.Na)           110维生素H(D-Biotin)               0.013氯化胆碱(Choline Chloride)      10肌醇(myo-Inositol)              10烟酰酸(Niacinamide)             3本多生酸钙(D-Ca Pantothenate)   3吡哆醛(Pyridoxal)               3硫胺素(Thiamine)                3维生素B-12(Vitamin B12)         0.3维生素G(Riboflavin)             0.3维生素BC(Folic Acid)            3亚油酸(Linoleic Acid)           0.075硫辛酸(Lipoic Acid)             0.2腐胺(Putrescine)                0.16EDTA离子傲合剂                  5.84胆固醇(Cholesterol)             0.1谷胱甘肽(glutathione(reduced))  0.5维生素C(ascorbic acid)          0.5非离子活性剂80(tween 80)        0.2氯化锂(LiCl)                    0.02钒酸氨(NH4VO3)                0.0003钼酸钠(Na2MoO4)               0.00035氯化镍(NiCl2)                  0.0001蛋白质降解物(Primatone RL)      2000胰岛素(Insulin)                 2苯酚红(Phenol Red)              5.3

表二：加料物流的配方组成

成分	浓度(克/升)
		组氨酸(Arginine)	2.32
半胱氨酸(Cysteine)	0.76
		组氨酸(Histidine)	1.02
异亮氨酸(Isoleucine)	1.25
		白氨酸(Leucine)	2.39
赖氨酸(Lysine)	2.79
		甲硫氨酸(Methionine)	0.73
苯基丙氨酸(Phenylalanine)	1.18
		丝氨酸(Serine)	2.13
苏氨酸(Threonine)	1.54
		色氨酸(Tryptophan)	0.50
颉氨酸(Valine)	1.6
		葡萄糖(D-glucose)	59
磷酸二氢钠(NaH2PO4)	2.22
		天冬氨酸(Aspartic acid)	2.05
酪氨酸钠(Tyrosine.2Na)	1.06
		维生素H(D-Biotin)	0.023
氯化胆碱(Choline Chloride)	0.64
		肌醇(Myo-Inositol)	0.44
烟酰酸(Niacinamide)	0.081
		吡哆醛(Pyridoxal)	0.19
硫胺素(Thiamine)	0.051
		本多生酸(D-Pantothenic acid)	0.046
维生素B-12(Vitamin B-12)	0.016
		维生素G(Riboflavin)	0.022
维生素BC(Folic acid)	0.074
		亚油酸(Linoleic acid)	0.005
硫辛酸(Lipoic acid)	0.001
		乙醇胺(Etanolamine)	0.01
谷胱甘肽(Glutathione(reduced))	0.001
		腐胺(Putrescine)	0.0016
天冬酰氨(Asparagine)	0.0016
		古酰氨(Glutamine)	14.9

Claims (6)

1.一种动物细胞的优化流加悬浮培养方法，包括以下步骤：

a).确定细胞生长所需营养物质的最低浓度，配成一个进行细胞培养的初始营养环境，将待培养细胞接种到该初始营养环境中；

b).给出一个或多个可变参数，据此确定合成一个细胞所需要的所有关键营养物质的比例，并以此配成加料物流；按营养环境中营养物质的消耗速率，将加料物流补充到营养环境中，进行细胞培养；

c).测定实际培养体系的可变参数；将该实测的可变参数值代入到b)步中；

d).重复b)和c)步一次或多次，进行试差迭代，直到营养环境达到优化并不再变化为止。

2.按权利要求1的方法，其特征是，在b)步中，按化学计量方法来确定合成一个细胞所需要的所有关键营养物质的比例。

3.按权利要求2的方法，其特征是，在a)步中，采用细胞生长动力学方法确定细胞生长所需营养物质的最低浓度。

4.按权利要求3的方法，其特征是，所述动物细胞是选自CHO细胞、杂交瘤细胞，PER.C6、293、昆虫细胞中的一种。

5.按权利要求1-4中任一项的方法，其特征是，所用的初始培养液是无血清的。

6.按权利要求5的方法，其特征是，加料方式是手动的或自动化的。

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