CN1460722A

CN1460722A - 核酸扩增检测方法

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Publication number: CN1460722A
Application number: CN 03123596
Authority: CN
Inventors: 田敬东; 龚启洪
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-05-19
Filing date: 2003-05-19
Publication date: 2003-12-10
Anticipated expiration: 2023-05-19
Also published as: CN1233847C

Abstract

核酸扩增检测方法，包括向检测样品中加入至少一种线状探针和至少一种环状探针，二者的摩尔浓度比在1∶100至100∶1的范围内；其中，线状探针至少包含：(1)5’端与靶核酸配对的序列；(2)3’端与环状探针配对的短序列；环状探针至少包含：(1)与靶核酸配对的序列；(2)与线状探针3’端配对的序列；(3)用于调节环状探针总长度的填充序列。本发明方法可在同一反应管内，只用一种DNA聚合酶，通过一步恒温反应完成核酸杂交、扩增、检测等多项操作，可在约一小时内将DNA量扩增10¹⁰倍以上，检测灵敏度达到单拷贝水平，没有产物交叉污染，适用于检测RNA和DNA。可用来检测各种生物样品中是否有指定的核酸序列存在及定量地测出其浓度。

Description

核酸扩增检测方法

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，更具体地说，涉及一种在体外通过核酸杂交和恒温扩增来特异性检测样品中的靶核酸是否存在及确定其浓度的方法。

发明背景

在医学和生物学领域中经常遇到的一个问题是要确认在某个样品(例如用于输血的血液样品或从患者身上抽取的血液或体液样品等)中是否存在与某种疾病病原体相应的靶核酸并测定该靶核酸的浓度。但是，当这种靶核酸的浓度低于一定界限或与其它多种不同来源的核酸混合共存时就无法直接用仪器测定。目前解决这类问题的一个常用方法是特异性核酸扩增，扩增对象可以是靶核酸本身的序列或识别该靶核酸的特异性探针的序列。通过检测扩增后核酸产物及浓度，可以间接判定样品中该靶核酸是否存在及其原始浓度。

特异性核酸扩增的方法有若干种，可根据其是否需要温度循环分为两类。一类需要温度循环，如多聚酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)、连接酶链反应(Ligase chain reaction，LCR)；另一类不需要温度循环而在恒温下进行扩增，如依赖转录的复制***(transcription-based amplification system，TAS)、核酸序列自主复制***(self-sustained sequence replication，3SR)、Qβ复制酶***等。这些方法虽然都能将核酸进行高倍扩增，但在实际临床检测上都存在各自的缺点和局限性，诸如定量性差、复合度(multiplicity)低、易发生产物交叉污染、只适用于检测DNA或RNA中的一种，或需多种酶、多步操作等；而且温度循环方法与恒温方法相比有一个明显缺点在于需要使用特殊、昂贵的温度循环仪器。上述各种原因影响了这些方法在临床上的应用和推广。于是，如何找到一种能克服上述缺陷的、更为理想的体外核酸扩增和检测的方法就成为迫切需要解决的问题。

目前有一种新的、很有发展前途的核酸扩增方法称为滚环扩增法(Rolling-circle amplification，RCA)。滚环扩增是一种在恒温条件下、利用DNA聚合酶和单链环状DNA模板，将与环状模板杂交的引物以线性方式连续不断延伸的DNA扩增方式。这种扩增又被称为线性滚环扩增(LRCA)，其扩增产物是一条极长的由环状模板互补序列拷贝串联成的单链DNA(Fire and Xu，1995，PNAS美国科学院学报92：4641-45；Liu et al.1996 J.Am.Chem.Soc.美国化学社刊118：1587-94)。当有两种引物存在，其中一种引物与环状模板上一段序列互补，第二种引物与环状模板的另一片段序列相同时，可引起自发、连续的双向多重分支状链取代反应，称为超分支滚环扩增(Hyperbranched Rolling-circle amplifoication，HRCA)。HRCA呈指数(级数)方式连续扩增DNA，可在一个多小时内扩增10^9-12倍，扩增速度超过多聚酶链反应(PCR)。最终扩增产物是长度以环状模板为单位呈整数倍第增的双链DNA(Lizardi et al.1998 Nature Genet.自然遗传学杂志19：225-32)。

由于RCA反应具有简单、灵敏、定量、复合度高、无产物交叉污染等优点，因而在分子检测领域极有发展前途。然而在目前阶段，RCA在体外核酸检测中的应用还比较有限，主要用于原位信号放大和使用开环探针探测单核酸多样性(Single-nucleotide polymorphism，SNP)。在用于原位信号放大时，一般先用一线状核酸探针的一端与附着在固相载体上的靶核酸形成稳定杂交，然后将未杂交的探针洗去，加入环状DNA模板，与线状探针的另一端形成稳定杂交，引发线性滚环扩增；扩增后的单链DNA产物再与带有标记的探针杂交，直接或间接地检测扩增信号。该方法的不足之处在于：1)只使用一个识别靶核酸的探针，因而特异性不高；2)需要多步操作，比较繁琐；3)洗涤不彻底会造成较高本底。

由此可见，需要有更加新颖、完善的设计来克服现有方法的缺陷，充分发挥滚环扩增原理的优势，扩大其在核酸检测中的应用范围。

发明内容

本发明的目的是针对上述存在的问题，提供一种只使用一种酶、在同一反应管内、只须通过一步恒温反应便能使样品溶液中的靶核酸(包括DNA和RNA)迅速地扩增，从而可以在很短时间内利用仪器较精确地测出该靶核酸的浓度的方法。

本发明的另一个目的是提供一个用于实现上述方法的专用试剂盒。

本发明人为了实现上述目的而进行了深入研究，结果发现，在上述现有滚环扩增技术的基础上，把只使用一种探针与靶核酸杂交、冲洗后再进行扩增的步骤改变为同时使用一种线状探针和一种环状探针与靶核酸片段杂交并将二探针的浓度比限定在一定的范围内，同时限定二者相互间具有一定长度的配对序列，即可达到上述目的，至此便完成了本发明。也就是说，本发明的技术方案如下：

1.一种核酸扩增检测方法，该方法包括：向被检测样品中加入核酸探针及其他公知的必要辅助成分，在设定温度下进行扩增反应，在反应进行中或完成后用仪器检测扩增信号并定量分析靶核酸，据分析结果判断样品中是否存在靶核酸并确定其浓度，其特征在于，

上述的核酸探针是至少包括一种线状探针和一种环状探针的探针组，其中，线状探针与环状探针的摩尔浓度比在1∶100至100∶1的范围内；其中，

线状探针至少包含如下两个部分：(1)5’端与靶核酸配对的序列，其长度在15-35个核苷酸的范围内；(2)3’端与环状探针配对的短序列，其长度在2-10个核苷酸的范围内；并且上述(1)和(2)两部分之间的间隔在0-5个核苷酸的范围内。

环状探针的总长度在35-200个核苷酸的范围内，其中至少包含如下3个部分：(1)与靶核酸配对的序列，其长度在15-35个核苷酸的范围内；(2)与线状探针3’端配对的序列，其长度在2-10个核苷酸的范围内；(3)用于调节环状探针总长度的填充序列；并且上述(1)和(2)两部分之间的间隔在0-5个核苷酸的范围内。

2.如技术方案1所述的方法，其特征在于，其中所说线状探针与环状探针的摩尔浓度比在1∶10-10∶1的范围内。

3.如技术方案1所述的方法，其特征在于，其中所说线状探针5’端与靶核酸配对的序列的长度在18-32个核苷酸的范围内。

4.如技术方案1所述的方法，其特征在于，其中所说环状探针中与靶核酸配对的序列的长度在18-32个核苷酸的范围内。

5.如技术方案1所述的方法，其特征在于，其中所说线状探针可呈下列3种状态中的任一种：(a)自由态；(b)附着于载体上；(c)部分呈自由态，部分附着于载体上；组成上还可包括任何修饰的核苷酸或其它成分。

6.如技术方案1所述的方法，其特征在于，其中所说探针组中还包括至少一种线状扩增引物，其长度在15-35个核苷酸的范围内；其序列的全部或部分与环状探针填充序列中一片段相同。

7.如技术方案1所述的方法，其特征在于，其中所说扩增反应成分中包括DNA产物检测试剂。

8.如技术方案1所述的方法，其特征在于，其中所说用仪器检测核酸扩增信号的方法可以是检测单链或双链DNA使用的任何方法。

9.如技术方案1-8中的任一项所述的方法，其特征在于，整个核酸扩增检测过程在同一反应容器中进行。

10.一种专用试剂盒，用于实施技术方案1-9中的任一项所述的方法，其特征在于，其中装有用于检测样品中可能存在的靶核酸种类及相对数量所需的试剂。

下面对本发明进行详细描述。

本发明所提出的方法的作用机理大致如下：当线状探针和环状探针与靶核酸杂交后，线状探针的3’端作引物以环状探针为模板，在DNA多聚酶催化下进行线性滚环扩增；反应溶液中的链取代扩增引物不断跟滚环扩增产生的单链DNA产物杂交并以其为模板，以链取代反应的方式进行二级扩增，连续产生不同长度的单链DNA；这些二级单链DNA产物的3’端与溶液中自由的线状探针杂交并合成最终的双链DNA产物；在此过程中，靶核酸不断地跟前一组杂交的线状探针和环状探针脱离，再与新一组线状探针和环状探针杂交，引起新一轮扩增，如此不断循环，直到原料来尽为止(见图1-3)。

本发明设计了一种由一线状探针和一环状探针组成的新型探针组合(图1)。组合中线状探针和环状探针的各一部分能分别与靶核酸上两相邻(无间隔)或相近(间隔一至数个核苷酸)片段配对。每一配对片段的较适宜长度通常为15-35个核苷酸，更适宜长度为18-32个核苷酸。具体长度根据扩增反应温度和寡聚核苷酸的组成而定，一般配对片段的溶解温度(Tm)比扩增反应温度高3-6摄氏度。线状探针的3’端短片段不与靶核酸配对；只是当线状探针和环状探针同时与靶核酸上的正确部位杂交后，该片段才可能与环状探针上邻近和对应的短片段配对(见图1)。配对片段的适宜长度为2-10个核苷酸，具体长度因该片段的核苷酸组成而定，选择原则是：在无靶核酸存在时，在同样反应条件和温度下该片段不足以与环状探针杂交而引起滚环式复制。线状探针的两部分之间一般无间隔，但也可以间隔一至数个核甘酸或填充以其它成分，在某些情况下这样做也许有助于提高反应的特异性。线状探针的5’端没有特殊限制，可以附加其它序列及修饰基团，也可以与各种载体和表面基团相连接。

探针组中的环状探针大致由三部分组成：第一部分与靶核酸上的一个片段配对。如上所述，该片段较适宜长度通常为15-35个核苷酸，更适宜长度为18-32个核苷酸，具体长度根据扩增反应温度和寡聚核苷酸的组成而定，一般配对片段的溶解温度(Tm)比扩增反应温度高3-6摄氏度；第二部分含有可与线状探针的3’端相配对的短片段，配对短片段较适宜长度为2-10个核苷酸，该部分一般在第一部分的上游(5’端)并靠近第一部分；余下的第三部分可以有多种机动功能，例如：1)该部分可包含与一个或多个用于二级扩增的线状引物相同的序列；2)该部分可包含有一段序列，其在复制产物中的对应部分可与带有标记的探针杂交，作为检测扩增产物的一种方法；3)该部分可包含用做其它任何用途的序列，如可作为填充，来调节环状探针的总长度等，通常，环状探针的适宜总长度在35-200个核苷酸的范围内。太短不利于滚环扩增反应进行；太长会增加环状探针制作的难度和成本。

上述探针组还可以包括一个或多个人工合成的线状引物。线状引物的作用是跟一级扩增产物上的配对序列杂交并以其为模板，以链取代反应的方式进行二级扩增。线状引物的较适宜长度通常为15-35个核苷酸，更适宜长度为18-32个核苷酸，具体长度根据扩增反应温度和寡聚核苷酸的组成而定，一般配对片段的溶解温度(Tm)比扩增反应温度高3-6摄氏度。

本发明所提供的探针组合与通常RCA中使用的引物和环状模板对的主要不同在于：1)本发明中的线状探针和环状探针均要与靶核酸杂交；而通常RCA中，只有复制引物和环状模板两者之一跟靶核酸杂交，引物和环状模板不同时跟靶核酸杂交；2)本发明中的线状探针的3’端跟环状探针配对的序列长度较短，一般不超过10个核苷酸，在无靶核酸存在时相互并不形成稳定杂交；通常RCA中使用的复制引物和环状模板上配对片段的长度一般长于16个核苷酸，至少不短于10个核苷酸。两者之间预先便可形成稳定的杂交，无需靶核酸的帮助。

本发明中涉及的核酸杂交的稳定性可由文献中发表的方法计算，如：Lesnick and Freier，1995，Biochemistry生物化学34：10807-10815；McGraw et al.，1990，Biotechniques生物技术8：674-678；Rychliket al.，1990 Nucleic Acids Res.核酸研究18：6409-6412。

由于使用了新型探针组合，本发明方法的反应机制和反应动力学跟HRCA反应不同(见图2、3)。反应机制上的区别有：1)在HRCA反应中，自由的线状探针可以跟链取代反应产生的单链DNA产物上每一个环状模板的拷贝杂交而引发又一级链取代反应；在本发明反应中，线状探针只跟链取代反应产生的完整单链DNA产物的3’端，也就是线状探针的自身拷贝形成稳定杂交并合成双链DNA形式的最终产物；2)在HRCA反应中，每一个靶核酸分子一般只引起一次滚环扩增；在本发明反应中，每一个靶核酸分子循环不断地与探针对杂交、引发滚环扩增反应、然后脱离，再跟新一对探针杂交(图3)。从反应机理上可以推断，该方法扩增反应动力学比HRCA要缓和，可以避免HRCA过于灵敏的缺陷。另外，靶核酸浓度与荧光达到一定强度所用时间呈可预计关系，因而该方法很有潜力发展成为一种定量核酸检测的方法。

本发明中的线状探针和线状引物可以呈下列两种状态之一或两种状态的混合态：1)自由态，指线状探针和线状引物溶解于溶液中，并可以带有任何已知的标记或修饰；2)固定于载体上，指线状探针或线状引物的一端(多数指5’端部分)在反应前或反应后直接或间接固定或附着在载体上。较适宜的固着形式为探针或线状引物的一端(多数指5’端部分)固定，另一端(一般指3’端)自由伸展。载体可以由任何材料制作，经过任何表面处理，呈任何形状，如微珠、微颗粒、微孔、链状多聚物、平面(芯片表面)等。

本发明中所用的线状探针在呈不同状态时有不同的特性和用途。当处自由态时，探针与溶液中靶核酸杂交的几率高，因而探测的速度快、灵敏度高。将探针固定在载体上，可以把跟其杂交的靶核酸从溶液中捕获和分离出来，然后再进行扩增。这样可避免样品中某些成分对扩增反应的抑制。同时，滚环扩增的反应产物可以由固定在载体上探针或引物延伸而产生，被原位固定在载体上。利用该原理可将多种不同的线状探针或引物固定在载体上，平行探测多个靶核酸。在DNA芯片上使用自由探针和固定探针的混合态有利于加快扩增反应速度和增加检测的灵敏度。

使用本发明方法可以检测的靶核酸包括RNA和DNA、链状或环状、单链或双链、自由的或固定于载体上的。当靶核酸与探针组杂交部分呈双链时，一般先要加热或加其它解链剂使双链解为单链，然后退火让探针跟靶核酸杂交。

本发明方法中使用的DNA多聚酶可有多种选择，原则上能催化DNA滚环复制的DNA多聚酶均可。这些酶一般有如下特性：1)有解链活性；2)不易从模板DNA上脱落；3)无5’至3’DNA外切酶活性。一些较适用于本发明的、符合上述条件的酶有：DNA多聚酶I的Klenow片段、phi-29 DNA多聚酶、噬菌体M2 DNA多聚酶、噬菌体PRD1 DNA多聚酶、BST大片段DNA多聚酶、Vent DNA多聚酶、T5 DNA多聚酶、T4 DNA多聚酶以及某些酶的突变或改造体等。更适用的酶包括：phi-29 DNA多聚酶、Vent DNA多聚酶和BST DNA多聚酶等。其中Vent DNA多聚酶和BST DNA多聚酶为嗜热型DNA多聚酶，可让反应在较高温度下进行，有利于提高检测的特异性。

另外，在反应中加入DNA解旋因子有助于解链，如DNA解旋酶和单链DNA附着蛋白等。

检测扩增信号的方法有多种，用来检测单链或双链DNA的方法基本都可以使用。例如，但不限于：

1)在扩增反应中使用带标记的核苷酸或核苷酸类似物，将标记物直接整合到扩增产物中去。标记可以是荧光标记、半抗原、或放射性标记等。其中较合适的荧光标记有：Cyanine Dyes(Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7)、Fluorescein(FITC)、Rhodamine、Texas red、nitrobenz-2-oxa-1，3-diazol-4-yl(NBD)、coumarin和dansyl chloride等；较合适的半抗原有：生物素(biotin)、地谷新(digoxigenin)等；较合适的放射性标记有：³²P，³³P，³⁵S，¹²⁵I等；较合适的带有探测标记的核苷酸类似物有BrdUrd和BrUTP等。

2)使用对单链或双链DNA有特异性的荧光染料，这些荧光染料的一个共同特性是跟核酸嵌合后发光强度明显增强。较合适的探测单链DNA产物的荧光染料有SYBR Green II等；较合适的探测双链DNA产物的荧光染料有SYBR Green I等。

3)使用联有标记或信号发生物质的核酸探针与单链DNA产物杂交，检测标记产生的信号。标记可以是但不限于荧光基团、色素基团、化学发光基团、半抗原、抗体、或酶标记等。较常用的酶标记有硷性磷酸酶和辣根过氧化物酶等。

4)使用分子信标(Molecular Beacon)、扩增荧标(Amplifluor)以及其它各种利用荧光淬灭技术或能量转移技术设计的探针，如荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)、后滞荧光能量转移(Delayed Fluorescence Energy Transfer，DEFRET)等。

较适用于信号检测与扩增反应同步进行的检测试剂有，但不限于：分子信标、扩增荧标和嵌合荧光染料(如SYBR Green)等。其它检测方法可由具有一般专业知识和技能的人员根据需要来选择和使用，如电泳法等。

本发明范围还包括了根据上述原理而设计出的形式和用途不同的各种生物检测试剂盒和检测芯片。这些试剂盒都至少直接或间接地使用了本说明书前面所述的探针组合，反应混合液中一般还包括等浓度的4种脱氧核糖核酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、pH缓冲成分、适当浓度的各种离子、核酸检测试剂，还可以包括适当的核酸提取方法，具体搭配可由使用者根据需要进行选择。

与现有体外核酸检测方法相比，本发明提供的方法显示了如下优越性和有益效果：

本发明实现了在恒温条件下，在同一反应管内，只使用一种DNA聚合酶，通过一步反应完成核酸杂交、扩增、和信号检测等多项操作。全部过程可以在大约一小时内完成，没有产物交叉污染，同样适用于检测RNA和DNA。

本发明方法可以在约一个小时内将DNA量扩增10¹⁰倍以上，检测灵敏度达到单拷贝水平。在反应动力学上较HRCA缓和，更适用于定量检测。

本发明提供的双探针组合在原理和实际效果上都比PCR和RCA等方法具有更高的特异性。原因在于本发明使用的探针组合不但使用两个探针，而且对两个探针在靶核酸上杂交的相对位置有严格控制，即两个探针必需杂交在靶核酸上两个相邻或非常相近的位置上才能引起扩增。当两个探针或其中之一偶尔与靶核酸发生非特异性杂交时，会由于距离不合适而无法扩增。相比之下，RCA只有一个探针与靶核酸杂交，所以非特异性杂交的几率大。另外洗涤不彻底也会造成假阳性。其它一些使用DNA连接酶的RCA形式会因为非依赖于靶核酸的自发性连接而出现假阳性。PCR虽使用两个引物，但当两个引物中的任何一个与靶核酸非特异性杂交时，扩增反应便有可能发生。本发明方法实际检测的准确率可接近和达到100％。

本发明可用来检测各种生物样品中是否有指定的核酸序列存在及定量地测出其浓度，可用于多种类型的快速基因检测。例如：检测血清或其它生物样品中是否有各种病毒存在及其浓度；快速确定细菌、真菌或其它微生物感染或污染的染源等。在医疗卫生、检疫、食品、环保和科研等领域用途广泛。

附图说明

图1是一例由一线状探针和一环状探针组成的探针组合与靶核酸上两相邻片段杂交的示意图。其中线状探针至少由2部分构成：3’端跟环状探针配对部分(1)，较适宜长度为2-10个核苷酸；5’端跟靶核酸配对序列(2)，较适宜长度为15-35个核苷酸，更适宜长度为18-32个核苷酸。环状探针由三部分组成：跟靶核酸配对部分(3)，较适宜长度为15-35个核苷酸，更适宜长度为18-32个核苷酸；与线状探针的3’端配对序列(4)，较适宜长度为2-10个核苷酸；剩余的多功能部分(5)，例如可包含与一个或多个用于二级链取代扩增引物相同的序列。

图2显示了当一对探针分别与靶核酸上两个相邻部位杂交后，线状探针的3’端利用环状探针为模板在DNA聚合催化下进行滚环式复制，产生单链DNA产物。环状探针在DNA聚合酶作用下与靶核酸脱离；滚环复制产生的单链DNA产物与二级链取代扩增引物杂交。

图3为一例反应过程示意图，显示了反应溶液中的链取代扩增引物不断跟滚环扩增产生的单链DNA产物杂交并以其为模板，以链取代反应的方式进行二级扩增，连续产生不同长度的单链DNA；这些二级单链DNA产物的3’端与溶液中自由的线状探针杂交并合成最终的双链DNA产物(过程C、D)；同时，靶核酸不断地跟前一组杂交的线状探针和环状探针脱离，再与新一组线状探针和环状探针杂交，引起新一轮扩增(过程A、B)；上述过程连续不断地重复，直至反应终止或因原料耗尽而停止。

图4显示了滚环式复制产生的单链DNA可与标记探针杂交，从而定量指示靶核酸浓度。

图5为实施例1结果。1)为无靶核酸的阴性对照；2)为实验样品的相对荧光强度。

图6显示了实施例2中反应结果的1％DNA电泳图谱。1)无靶核酸的阴性对照；2)实验样品；M)DNA分子量标准。

图7为实施例3实验结果。

图8为实施例4实验结果。1)无靶核酸的阴性对照平均值；2)乙肝病毒序列组；3)丙肝病毒序列组；4)人巨噬细胞病毒序列组。

具体实施方式

下面结合实例及图示对本发明及其用途作进一步阐述。实例中使用的具体方法、操作步骤、试剂、设备等均可以根据需要而进行适当改变和替换，在任何意义上所举实例和附图并不限制本发明的范围。实施例1.检测样品中的靶RNA(丙型肝炎病毒RNA序列)

该例描述了一种利用本专利所述原理和探针组合特异性探测溶液中靶RNA序列的方法。该例中选择使用BST DNA聚合酶在恒温下扩增核酸，并使用SYBR Green I荧光染料检测双链DNA扩增产物浓度。整个过程，包括核酸恒温扩增反应和检测在同一管内进行，约1小时完成。

反应总体积为20微升，反应液组成为：10⁶拷贝靶RNA，0.5μM环状探针，0.5μM线状探针(比例1∶1)，0.5μM线状引物，20mM Tris-Cl(pH8.8，25℃)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，0.5mM dNTP，0.5U/μl BST DNA聚合酶，SYBR green I(1X)。零对照组中不加靶核酸。

操作过程如下：将探针组与靶核酸溶液在微管中混合后，将微管放入荧光分析仪中读取初始荧光强度，荧光激发波长为487nm，发射波长为525nm。然后95℃加热3分钟，冷却至65℃，加入适量BST DNA聚合酶，65℃继续保温60分钟。反应完毕后可立即读取反应后荧光强度，计算反应前后荧光强度的变化。图5比较了含有10⁶拷贝靶RNA的实验组(2)和零对照组(1)反应前后荧光强度的相对变化。该例中实验组的荧光强度的相对变化(0.97)比零对照组(0.005)高193倍，显示了该方法可在短时间内将靶核酸信号高倍扩增，而且用普通荧光检测仪即可检测。

该例中所用核酸序列(5’->3’)如下，具体特征见序列表：靶核酸RNA序列：GCCACCAUAGAUCACUCCCCUGUGAGGAACUACUGUCUUCACGCAGAAAGCGUCUAGCCAUGGCGUUAGU(SEQ ID NO：1)RNA是使用T7 RNA聚合酶由体外反应合成，DNA模板的序列为：CGAAATTAATACGACTCACTATAGGGCCACCATAGATCACTCCCCTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGT(SEQ ID NO：2)环状探针序列：GATATACAACCACATCAGCTAGACAGTAGTTCCTCACAGGGGAGTGATATCAGCATAGCAGTAGACTTGCGTACCTAAG(SEQ ID NO：3)线状探针序列：TGGCTAGACGCTTTCTGCGTGAATAGCTGAT(SEQ ID NO：4)扩增引物序列：TCAGCATAGCAGTAGACTTGCG(SEQ ID NO：5)实施例2.检测样品中靶DNA(人巨噬细胞病毒DNA序列)

该例描述了一种利用本专利所述原理和探针组合特异性探测溶液中靶DNA序列的方法。该例中选择使用BST DNA聚合酶在恒温下扩增核酸，反应后用琼脂糖凝胶电泳显示扩增产物。

操作过程如下：在微管中加入总体积为18微升的反应混合物，包括：0.5μM环状探针，0.5μM线状探针(比例1∶1)，0.5μM线状引物，20mMTris-Cl(pH8.8，25℃)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，0.5mM dNTP，实验组中含10⁴拷贝靶DNA；零对照组中不加靶核酸。95℃加热3分钟，冷却至65℃，然后加入2微升(16U)BST DNA聚合酶，65℃继续保温60分钟。反应完毕后取10微升反应液用1％琼脂糖凝胶电泳分析。

从图6显示的凝胶电泳图谱可以明显看出，扩增反应后实验组(2)中产生了大量双链DNA产物，其长度以环状探针的长度为单位递增，形成一DNA“阶梯”，跟反应机理所预测的结果相符；零对照组(1)中则探测不到任何扩增产物。M为DNA分子量标记。

该例中所用核酸序列(5’->3’)如下，具体特征见序列表：靶DNA序列(取自人巨噬细胞病毒序列)：CCTAATCGCATCCTGCATCAAAGCGTCAATCAGACTTTCGACGTGCGCCAG(SEQ ID NO：6)环状探针序列：GATATACAACCACATCAGCTAACGCTTTGATGCAGGATGCGATTTATCAGCATAGCAGTAGACTTGCGTACCTAAG(SEQ ID NO：7)线状探针序列：GCGCACGTCGAAAGTCTGATTGATAGCTGAT(SEQ ID NO：8)扩增引物序列：TCAGCATAGCAGTAGACTTGCG(SEQ ID NO：5)实施例3.用实时荧光PCR仪记录扩增反应曲线

实时荧光PCR仪目前被用来定量测定样品中靶DNA含量。本发明所提供方法无需温度循环，只利用仪器的快速荧光扫描部分实时记录反应释放的荧光强度，从而对样品中靶核酸进行相对定量探测。

该例中操作方法与例1基本相同，使用BST大片段DNA聚合酶和SYBRGREEN I荧光染料，核酸恒温扩增反应和检测在同一管内进行。反应溶液总体积为20微升。多个反应可在8、12管条或96孔板内进行。

将探针组与靶核酸溶液在微管中混合后，95℃加热3分钟，冷却至65℃，加入少量BST DNA聚合酶等的混合液，这时反应溶液总体积为20微升，反应溶液的最终组成与例1中的相同，靶DNA总量约为10⁵和10²拷贝，另加入500ng人基因组DNA作背景。阴性对照中只有500ng人基因组DNA，无靶核酸。将0.2ml PCR管放入ABI 7700(Perkin Elmer)序列探测仪的96孔反应槽内，65℃保温80分钟(2分钟×40循环)。荧光激发波长为487nm，发射波长为525nm。

图7记录了扩增反应过程中荧光强度变化的曲线。可以看出，反应中靶核酸量越多，荧光出现和达到一定强度所需要的时间越短，因而可作为相对定量检测核酸的基础。该例中所用核酸序列与例2中相同。实施例4.在一个反应内同时检测多种靶核酸

该例描述了一种利用本专利所述原理和多种不同的探针组合检测溶液中可能存在的多种靶核酸序列的方法。在同一试管内用一个反应同时检测多种靶核酸可以减少核酸样品用量，降低检测费用，增加检测通量。

该例中要检测的靶核酸序列分别取自乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人巨噬细胞病毒基因组。反应溶液中相应混合了三种不同的探针组，每个探针组中的线性探针带有不同波长的扩增荧标，荧光激发波长(EX)/发射波长(EM)分别为：乙型肝炎病毒，FAM 495/519nm；丙型肝炎病毒，HEX 530/553nm；人巨噬细胞病毒，TAMRA 560/583nm。在反应结束后根据荧光颜色和强度可以判断有何种靶核酸存在及其相对浓度。反应使用BST DNA聚合酶在恒温下扩增核酸。整个过程，包括核酸恒温扩增反应和检测在同一管内进行，约1小时完成。

操作过程如下：将探针组与靶核酸溶液在96孔板微管中混合，将微管放入荧光分析仪中读取各个波长的初始荧光值，然后95℃加热3分钟，冷却至65℃，加入适量BST DNA聚合酶，65℃继续保温75分钟。反应完毕后可立即在各相应波长读取反应后荧光值。计算反应前后荧光变化值。

反应总体积为40微升，反应液组成为：0或10⁶拷贝靶核酸，0.5μg人基因组DNA，0.5μM每种环状探针(共3种)，0.5μM每种扩增荧标线状探针(共3种)，1μM共用线状引物，20mM Tris-Cl(pH8.8，25℃)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，0.5mMdNTP，0.5U/μl BST DNA聚合酶。

从图8中可以看出，扩增后实验组的荧光强度均比零对照组高近200倍。证明通过使用不同的探针组和荧光标记，本发明方法可用于在同一反应中同时检测多种不同的靶核酸。

该例中所用核酸序列(5’->3’)如下，具体特征见序列表：乙型肝炎病毒靶序列：ACCACATCATCCATATAACTGAAAGCCAGACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCACTAGTAAACTGAGCCA(SEQ ID NO：9)环状探针序列：GATATACAACCACATCAGCTAGCTTTCCCCCACTGTCTGGCTTTTATCAGCATAGCAGTAGACTTGCGTACCTAAG(SEQ ID NO：10)扩增荧标线状探针序列：5′FAM-TCGATGACTGACGGTCATCG(DABCYL-dT)ACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGTAGCTGAT(SEQ ID NO：11)丙型肝炎病毒靶核酸RNA序列同(SEQ ID NO：1)，环状探针序列同(SEQ IDNO：3)，扩增荧标线状探针序列：5′HEX-TCGATGACTGACGGTCATCG(DABCYL-dT)ACTTGGCTAGACGCTTTCTGCGTGAATAGCTGAT(SEQ ID NO：12)人巨噬细胞病毒靶序列同(SEQ ID NO：6)，环状探针序列同(SEQ ID NO：7)扩增荧标线状探针序列：5′TAMRA-TCGATGACTGACGGTCATCG(DABCYL-dT)ACTGCGCACGTCGAAAGTCTGATTGATAGCTGAT(SEQ ID NO：13)通用扩增引物序列同(SEQ ID NO：5)

序列表<110>田敬东

龚启洪<120>核酸扩增检测方法<130>PFO30007，Deng Dingji，Zhongzi Law Office<140><141><160>14<170>Patent In Version 3.1<210>1<211>70<212>RNA<213>丙型肝炎病毒<223>靶RNA<400>SEQUENCE：1gccaccauag aucacucccc ugugaggaac uacugucuuc acgcagaaag 50cgucuagcca uggcguuagu 70<210>2<211>95<212>DNA<213>重组序列<220><223>人工合成双链DNA模板<400>SEQUENCE：2cgaaattaat acgactcact atagggccac catagatcac tcccctgtga 50ggaactactg tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg ttagt 95<210>3<211>79<212>DNA<213>重组序列<220><223>环状探针<221><222>(14)..(21)<223>与线状探针杂交片段<221><222>(22)..(47)<223>与靶核酸杂交片段<221><222>(49)..(71)<223>与扩增引物相同序列<400>SEQUENCE：3gatatacaac cacatcagct agacagtagt tcctcacagg ggagtgatat 50cagcatagca gtagacttgc gtacctaag 79<210>4<211>31<212>DNA<213>重组序列<220><223>线状探针<221><222>(1)..(23)<223>与靶核酸杂交片段<221><222>(24)..(31)<223>与环状探针杂交片段<400>SEQUENCE：4tggctagacg ctttctgcgt gaatagctga t 31<210>5<211>22<212>DNA<213>重组序列<220><223>扩增引物<400>SEQUENCE：5tcagcatagc agtagacttg cg 22<210>6<211>51<212>DNA<213>人巨噬细胞病毒<220><223>人工合成靶DNA<400>SEQUENCE：6cctaatcgca tcctgcatca aagcgtcaat cagactttcg acgtgcgcca g 51<210>7<211>76<212>DNA<213>重组序列<220><223>环状探针<221><222>(14)..(21)<223>与线状探针杂交片段<221><222>(22)..(44)<223>与靶核酸杂交片段<221><222>(47)..(68)<223>与扩增引物相同序列<400>SEQUENCE：7gatatacaac cacatcagct aacgctttga tgcaggatgc gatttatcag 50catagcagta gacttgcgta cctaag 76<210>8<211>31<212>DNA<213>重组序列<220><223>线状探针<221><222>(1)..(23)<223>与靶核酸杂交片段<221><222>(24)..(31)<223>与环状探针杂交片段<400>SEQUENCE：8gcgcacgtcg aaagtctgat tgatagctga t 31<210>9<211>85<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<220><223>人工合成靶DNA<400>SEQUENCE：9accacatcat ccatataact gaaagccagac agtggggga aagccctacg 50aaccactgaa caaatggcac tagtaaactg agcca 85<210>10<211>76<212>DNA<213>重组序列<220><223>环状探针<221><222>(14)..(21)<223>与线状探针杂交片段<221><222>(22)..(44)<223>与靶核酸杂交片段<221><222>(47)..(68)<223>与扩增引物相同序列<400>SEQUENCE：10gatatacaac cacatcagct agctttcccc cactgtctgg cttttatcag 50catagcagta gacttgcgta cctaag 76<210>11<211>59<212>DNA<213>重组序列<220><223>扩增荧标线状探针<221><222>(1)<223>FAM修饰<221><222>(21)<223>DABCYL修饰<221><222>(25)..(52)<223>与靶核酸杂交片段<221><222>(53)..(59)<223>与环状探针杂交片段<400>SEQUENCE：11tcgatgactg acggtcatcg tactagtgcc atttgttcag tggttcgtag 50gtagctgat 59<210>12<211>55<212>DNA<213>重组序列<220><223>扩增荧标线状探针<221><222>(1)<223>HEX修饰<221><222>(21)<223>DABCYL修饰<221><222>(25)..(48)<223>与靶核酸杂交片段<221><222>(49)..(55)<223>与环状探针杂交片段<400>SEQUENCE：12tcgatgactg acggtcatcg tacttggcta gacgctttct gcgtgaatag 50ctgat 55<210>13<211>55<212>DNA<213>重组序列<220><223>扩增荧标线状探针<221><222>(1)<223>TAMRA修饰<221><222>(21)<223>DABCYL修饰<221><222>(25)..(48)<223>与靶核酸杂交片段<221><222>(49)..(55)<223>与环状探针杂交片段<400>SEQUENCE：13tcgatgactg acggtcatcg tactgcgcac gtcgaaagtc tgattgatag 50ctgat 55

Claims

线状探针至少包含如下两个部分：(1)5’端与靶核酸配对的序列，其长度在15-35个核苷酸的范围内；(2)3’端与环状探针配对的短序列，其长度在2-10个核苷酸的范围内；并且上述(1)和(2)两部分之间的间隔在0-5个核苷酸的范围内；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所说线状探针与环状探针的摩尔浓度比在1∶10-10∶1的范围内。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所说线状探针5’端与靶核酸配对的序列的长度在18-32个核苷酸的范围内。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所说环状探针中与靶核酸配对的序列的长度在18-32个核苷酸的范围内。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所说线状探针可呈下列3种状态中的任一种：(a)自由态；(b)附着于载体上；(c)部分呈自由态，部分附着于载体上；组成上还可包括任何修饰的核苷酸或其它成分。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所说探针组中还包括至少一种线状扩增引物，其长度在15-35个核苷酸的范围内；其序列的全部或部分与环状探针填充序列中一片段相同。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所说扩增反应成分中包括DNA产物检测试剂。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所说用仪器检测核酸扩增信号的方法可以是检测单链或双链DNA使用的任何方法。

9.根据权利要求1-8中的任一项所述的方法，其特征在于，整个核酸扩增检测过程在同一反应容器中进行。

10.一种专用试剂盒，用于实施权利要求1-9中的任一项所述的方法，其特征在于，其中装有用于检测样品中可能存在的靶核酸种类及相对数量所需的试剂。