CN1457260A - 填装有配体－二生物素结合物的可重复使用的体外柱 - Google Patents

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CN1457260A CN01812454.2A CN01812454A CN1457260A CN 1457260 A CN1457260 A CN 1457260A CN 01812454 A CN01812454 A CN 01812454A CN 1457260 A CN1457260 A CN 1457260A
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S·威尔伯
R·尼尔森
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Abstract

描述了调节体外装置的方法，和用于体外从与哺乳动物状况或疾病的诊断或治疗相关的哺乳动物体液中提取毒性物质的方法，在本发明方法中包括能从哺乳动物体液中提取毒性物质的试剂，以及含有所述试剂的体外装置。

Description

填装有配体-二生物素结合物的可重复使用的体外柱
                  发明领域
本发明涉及调节体外装置的方法，和用于体外从与哺乳动物状况或疾病的诊断或治疗相关的哺乳动物体液中提取毒性物质的方法，在本发明方法中包括能从哺乳动物体液中提取毒性物质的试剂，以及含有所述试剂的体外装置。
                  发明背景
通过意外事故、疾病状态、细菌或病毒感染或为治疗某些疾病(例如治疗癌症)而施用的物质，可将毒性物质引入人血液中。其中的许多毒性物质对身体组织例如肾、肝、肺和骨髓有很大损害，甚至可致命。因此，需要尽可能快地从血液中清除这样的物质。尽管机体具有除去不想要毒性物质的天然防御机制，但这些方法在许多情况下是无效的。因此，需要采用体外装置以最有效地清除血液中的某些毒性物质。这种装置的示例是肾透析机，它可用来消除因肾功能低下而蓄积于血液中的毒性物质。能利用体外装置的其他医药应用包括：[1]清除放射性物质，[2]清除毒性水平的金属，[3]清除细菌或病毒产生的毒素，[4]清除毒性水平的药物，和[5]清除全细胞(例如癌细胞，特异性造血干细胞-例如B、T、或NK细胞)或清除细菌和病毒。
为了使体外装置具有消除毒素的功能，必须使其与化学实体结合，所述化学实体对血液中待消除的毒性物质有高度亲和性。化学实体并不是直接结合于体外装置中的柱基质(column matrix)上，而是优先通过分子的另一结合对而结合。这种结合排列通常会使毒素结合部分在血液中更有效，并使装置更适于各种毒性物质。所用的柱基质物质应能提供高表面积，并且不限制血流的通过(Nilson，R.等，EPC567514)。柱基质上含有与之结合的蛋白质(抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白)，使之对其他分子(例如生物素)有高度亲和性。将对毒性物质具有高度亲和性的部分与生物素双分子结合，使得可以很容易达到附着于柱基质上，即可实现对柱的调节，使其适用于特殊医药用途。该调节剂含有两个(而不是一个)生物素部分，因为这种构型可为柱基质提供高度的稳定性。
尽管肿瘤特异性免疫结合物可选择性地与肿瘤细胞结合，但是仍需要在血液循环中保持初始高浓度的细胞毒性免疫结合物，以利于其在患者靶组织内达到足够高的浓度。当需要对癌症进行最佳治疗时，在大多数情况下，血液和其他非肿瘤组织中的高浓度细胞毒性物质会在敏感和重要组织(例如骨髓)中形成组织损伤和/或病变。虽然有时会采用骨髓援救来防止这些潜在的致死效应，但是对于患者来说，这种移植术过于昂贵且具有高风险。即使在骨髓移植术有效的情况下，也可能对其他敏感器官(例如肝、肾、脾、肺等)造成无法挽回的损伤。用于防止血液中毒性物质损伤组织和骨髓的最有效方法，是显著地减少血液中毒性物质的含量。当然，前提是必须在待治疗组织(例如肿瘤)中保持治疗水平的毒性物质。
已经对放射性标记的抗体在癌症治疗方面的应用研究了几十年。施用放射性标记的抗体可将毒性物质引入血液。许多方法均建议，在肿瘤积蓄了足量的免疫结合物以达到诊断或治疗目的后，将放射性标记抗体从血液循环中快速清除出去。一些方法包括通过形成免疫复合物来增强机体自身的清除机制。采用能与放射性标记抗体结合的分子，可提高放射性标记抗体的血液清除率，这种分子例如：其他单克隆抗体(Klibanov等，J.Nucl.Med.29，1951-1956，1988：Marshall等，Br.J. Cancer 69，502-507，1994：Sharkey等，BioconjugateChem.8，595-604，1997)，或抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白(Sinitsyn等，J.Nucl.Med.30，6669，1989；Marshall等，Br.J.Cancer，71，18-24，1995)，或含有可被肝细胞上受体消除的化合物的糖基(Ashwell和Morell，Adv.Enzymol.41，99-128，1974)。其他方法涉及采用体外方法除去循环的免疫结合物(参见Schriber，G.J.和Kerr，D.E.在Current Medical Chemistry，1995，2卷，616-629页的综述)。
由于可快速地将毒性物质从体内除去，因此这种能从血液循环中清除医药物质的体外技术尤其具有吸引力。这些方法在免疫治疗方面的应用已有描述(Henry CA，1991，18卷，565页；Hofheinze D等，Proc.Am.Assoc.Cancer.Res.1987，28卷，391页；Lear J K，等，Radiology1991，179卷，509-512页；Johnson T.K.等，Antibody Immunoconj.Radiopharm.1991，4卷，509页；Dienhart D.G.，等，AntibodyImmunocon j.Radiopharm.1991，7卷，225页；DeNardo G.L.等，J.Nucl.Med.1993，34卷，1020-1027页；DeNardo S.J.等，J.Nucl.Med.1992，33卷，862-863页；DeNardo G.L.J.Nucl.Med.1992，33卷，863-864页；和美国专利5,474,772：澳大利亚专利638061，EPO；和Maddock的EP090 914303.4。
为了使血液清除更有效，并使对全血(而不是上述方法所指的血浆)的处理成为可能，医药物质已经生物素化并被柱基质上的抗生物素蛋白吸附剂清除，所述医药物质例如携带细胞杀伤剂的肿瘤特异性单克隆抗体或用于肿瘤定位的放射性核素。许多出版物提供的数据表明，该技术对于清除生物素化的和放射性核素标记的肿瘤特异性抗体均具有有效性和实用性(Norrgren K，等，Antibody Immunoconj.Radiopharm.1991，4卷，54页；Norrgren K，等，J.Nucl.Med. 1993，34卷，448-454页；Garkavij M，等，Acta OncologicAl996，53卷，309-312页；Garkavij M，等，J.Nucl.Med.1997，38卷，895-901页。美国专利申请08/090,047；EPC567 514和08/434,889中也描述了这些技术。
除了长时间循环可导致毒性免疫结合物不希望的暴露于健康组织这一不利之外，不充分的肿瘤组织穿透、非特异性器官中的滞留和新陈代谢均可使治疗指数降低。针对这些问题，对以抗体为基础的多步骤放射性核素传递方法进行了广泛研究。基本原理首先包括注射病变特异性的靶向部分，该部分除了可特定地与病变结合之外，还可与随后注入的放射性诊断剂或治疗剂结合的特征。通过将这两步分开，可使缓慢穿透组织性的非放射性/非细胞毒性抗体在肿瘤块中得到充分的积蓄，同时选择携带放射性核素/细胞毒素的物质用于更快速地穿透组织。然而，先决条件是前者(也优选后者)能快速从血液循环中清除。
大多数这些多步骤方法利用了抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白与生物素的结合对。抗生物素蛋白是在蛋清和鸟以及两栖动物组织中发现的67kDA糖蛋白。它含有4个非共价结合的亚单位。每一亚单位能结合1个生物素分子。抗生物素蛋白的等电点较高(pI＞10)，这是由于其具有能与细胞膜非特异性结合的36个赖氨酸残基。在阿维丁氏链霉菌(Streptomyces avidinii)中产生的链霉抗生物素蛋白(SAv)，是接近于抗生物素蛋白的相关物。它对生物素具有很高的亲和性，但是其氨基酸含量以及净电荷(pI 6.5)不同，并且未糖基化。由于没有糖基，SAv的分子量略低(60kDa)，并且其体内药动学和生物分布明显不同于抗生物素蛋白。相对于静脉内注射的放射性标记抗生物素蛋白可快速从血液中清除并大量积蓄于肝中，放射性标记的SAv表现出更长的循环时间和较低的器官蓄积(Pimm Mv等，Nucl.Med.Comm.1988，9卷，931-941：Schechter B等，Eur.J.Biochem.1990，189卷，327-331：Rosebrough SF，Nucl.Med.Biol.1993，20卷，663-668)。
结合对中的另一部分--生物素是一种维生素，并且是合成氨基酸及奇碳链(odd-chain)脂肪酸所必需的B族-复合物成员。通常可在胞内发现生物素，它通常与酶结合并在羧化反应期间用作辅因子。在食物中和在代谢性蛋白质转变期间，生物素通常表现为赖氨酸-生物素加合物(生物胞素)形式。赖氨酸与生物素间的链接可被血浆酶、生物素酶分解。
为了改善在肺癌患者中的成像，Kalofonos等采用了两步SAv-MAb/1llIn DTPA-生物素方法(Kalofonos HP等，J.Nucl.Med.1990，31卷，1791-1796)。Van Osdol等和Sung等开发出了用于两步成像的数学模型，以及采用SAv-MAb和放射性标记生物素螯合物的治疗方案。鉴于靶向SAv-MAb部分和放射性标记生物素成像剂的体内参数，他们作了如下推测：
1)大分子量的SAv-Mab可降低Mab(定位于肿瘤)的用量和在肿瘤中结合的均匀性。
2)放射性标记生物素会快速扩散到肿瘤中，但是由于它对外周肿瘤结合的SAv-Mab具有高亲和性，放射性标记生物素的剂量太低则不能深度穿透至瘤结中。
3)与直接标记的MAbs相比，两步SAv-MAb/放射性标记的生物素法可在放射性注射之后瞬间成像，并产生较高的肿瘤/血液比。
4)与使用直接标记的Mabs相比，24小时的肿瘤/血液比例高2倍。
在模拟实验中，有高百分比的放射性与循环的SAv-MAb结合，并且在注射放射性标记生物素之前加入清除剂可提高肿瘤/血液的比例。
已在动物模型以及患者中对一种采用生物素化的MAbs和放射性标记的SAv的两步法进行了试验(Paganelli G.等，Eur.J.Nucl.Med.1992，19卷，322-329：Khawli LA等，Abs.Immunoconj．Radiopharm.1993，6卷，13-27：Kassis AI.等，J.Nucl.Med.1996，35卷，1358-1365)。在该方法中，靶向剂和成像剂均是具有较大分子量并可从血液中缓慢清除的物质。完成全部操作需历时多天，放射性在器官中积蓄并会随着代谢而从体内缓慢消除。然而，这些研究显示，与直接标记MAbs相比，生物素/SAv的结合可在体内完成，形成了正像(positive image)并提高了肿瘤活性。
对由生物素化Mab、抗生物素蛋白和lllIn-DTPA-生物素组成的三步法也进行了试验(Paganelli G等，Canc.Res.1991，51卷，5960-5966：Dosio F.等，J.Nucl.Biol.Med. 1993，37卷，228-232)。在注射之间的这一程序需要1-3天以使其在肿瘤中蓄积并从血液清除。总之，所有这些研究显示了体内利用SAv/生物素***的免疫学方法的可行性。然而，由于其长时间循环和非特异性器官蓄积，使高分子量靶向剂的循环水平成为难题。
也对另一预靶向(pretargeting)方法进行深入的研究，该方法包括单独注射以下三种组分：[1]SAv-Mab，[2]清除剂，和[3]含有放射性金属螯合部分DOTA的放射性标记生物素衍生物(Axworthy DB等，J.Immunother.1994，16卷，158)。注射肿瘤特异性Mab与SAv的共价结合物，并使其在肿瘤部位积蓄。在充分的肿瘤摄取之后(24-48小时)，施用一种生物素清除剂，经肝脏清除血液中的结合物。最终，注射放射性标记生物素-DOTA衍生物。该文所用的清除剂典型地为结合有半乳糖残基的生物素化的蛋白质。半乳糖受体存在于肝细胞中，并对具有暴露的末端半乳糖残基的大分子表现出高度亲和性和专属性。肝摄取与结合到SAv上的半乳糖残基数量有关(Rosebrough SF，J.Nucl.Med. 1996，37卷，344-350)。
然而，所有这些原理必将陷入矛盾之中，即一方面是靶向分子初始浓度与其深入穿透肿瘤的能力间的矛盾，另一方面是在施用放射性/细胞毒性剂之前能否迅速并完全地从血液中清除靶向分子。原则上，放射性/细胞毒素剂适用于同样的调节。足够高的初始血液浓度，对于达到并使靶向分子饱和来说是必要的。同时，该毒性剂不应滞留在血液循环和暴露于敏感组织(例如骨髓)中。即使毒性剂从身体中清除相当迅速，象肾和泌尿道等器官所接受的积蓄毒性剂量通常也会相当于或高于在肿瘤组织的剂量。
因此，非常需要优化这些方法和其他治疗方案的条件，特别是需要适用于治疗实体瘤的方法。如果这些原理具有相当的通性，那将是至关重要的，这样就会有尽可能多的参数独立于疾病的类型和定位，并且会尽可能多地独立于个体患者的药动力学参数和代谢速率。
                  发明概述
本发明的目的是与消除上述提及的体液中毒性或不想要化合物有关的问题。采用本发明用于调节体外装置的方法，以及用于体外从与哺乳动物状况或疾病的诊断或治疗相关的哺乳动物体液中提取毒性物质的方法，即可实现这一目的。在该方法中，采用了能从体液中提取毒性物质的试剂，其通式如下：
Figure A0181245400171
其中：
生物素部分为天然生物素或其衍生物，
a、b和c为相同或不同的链接子，和其中d为三官能交联部分，该试剂在说明书也称作调节剂；或者在所述方法的优选实施方案中，该试剂的毒素结合部分是用于体外从哺乳动物体液中提取毒性物质的生物素或其衍生物，所述体液与哺乳动物状况或疾病的诊断或治疗相关。其他目的和优势将通过本发明的详述和权利要求书得以体现。
在本发明一个方面中，反应性二生物素化合物与配体结合，该配体能选择性地结合血液中天然存在或人工引入的组分，所得结合物用来调节含有抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的医药用途柱基质的。在本发明另一方面中，含有柱(经二生物素结合物调节)的体外装置，与一种仪器连接，该仪器可泵送患者体内的全血循环通过柱，并最终将其送回患者体内，以清除患者血液中与二生物素偶联物结合的物质。因此，本发明目的还包括使体外清除毒性物质更为容易，这可通过使用含有两个生物素部分的水溶性分子将生物素结合装置一步转化成毒性物质结合装置而得以实现。
至于其中涉及三生物素化的试剂的其他方面，将在以下实施例中进行描述。
                   附图简述
附图1表示用衍生的二生物素化合物调节(链霉)抗生物素蛋白基质。
附图2表示毒性物质与经调节柱的结合。
附图3表示柱调节剂通式结构。
附图4为生物素-三聚体ELISA的标准曲线。
附图5为抗生物素蛋白经生物素-三聚体/抗生物素蛋白柱后的典型耗损(depletion)曲线。
                 优选实施方案
本发明还涉及调节方法，该方法可将生物素结合基质转化成能与对身体有毒性的多种物质结合的基质。本发明使用特定抗生物素蛋白或SAv包被的柱，这是因为它们可为附着有生物素的毒性化合物(例如放射性标记的抗体)提供结合表面(Nilsson.R.等，EPC567514)。这些柱具有使全血通过并在合理时期内得到良好清除的特性。通过两个步骤的操作，本发明将抗生物素蛋白/SAv柱转化成能结合其他类型分子的柱，从而极大地扩展其应用。在第一步中，用附图1所示的过量二生物素衍生物，调节生物素结合性的(链霉)抗生物素蛋白包被的柱，将其将转化为能结合毒性物质的柱。在第二步骤中，经调节的柱可在体外装置中用于清除血液中的毒性物质。附图2显示了毒性物质与经调节柱的结合。两个步骤无需连续，经调节的柱可贮存备用。
在本发明的一个优选实施方案中，从血液中除去用于治疗人疾病的毒性医药物质，以提高该物质对靶向/非靶向的浓度比。这种改善的靶向/非靶向比率提供了更佳的治疗指数。医药物质的特异性组织或器官定位在其有效应用中是非常重要的因素。在采用医药物质的治疗中，当其预期效应是杀死某些类型的细胞(例如癌症治疗)时，特异性组织定位的缺乏是尤其重要的。为了提高特异性，可采用肿瘤特异性单克隆抗体作为多种细胞毒素剂(例如但不限于：放射性核素、细胞毒素)的载体(免疫结合物)，和采用前药方案中所用的酶(Meyer等，Biocon jugate Chem.6，440-446：1995：Houba等，Biocon jugate Chem.7，606-611，1996：Blakey等，Cancer Res.56，3287-3292，1996)。
术语“试剂”(也是“调节剂”)在此是指一种化合物，它含有用于与单一生物素结合分子特异性作用的两个官能团和用于结合毒性物质的独立(separate)官能团。它能将生物素结合基质转化成一种基质，后者能从体液中提取特殊的毒性物质，或者能将生物素结合基质转化成连接生物素结合分子的基质。
术语“效应子分子”在此是指能连接到靶向分子或连接到作用于靶向分子的分子上的任何分子(靶向分子复合物)，它可以增加靶向分子/靶向分子复合物的效力，或者单独具有所需的药理学或诊断效力。
术语“毒性物质”在此是指任选与效应子分子、化合物簇、细胞等结合的任何化合物，使用试剂可将其从哺乳动物体液中提取出来。
术语“毒性结合部分”在此是指通过与毒性物质的特定作用而从哺乳动物体液中提取毒性物质的任何部分。在本发明的一些优选实施方案中，毒性结合部分为生物素或其衍生物。
术语“生物素化的分子”在此是指相对于免疫球蛋白可更容易地穿透哺乳动物组织的分子，例如含有放射性金属螯合部分的放射性标记的生物素衍生物。
术语“靶向生物分子”在此是指能选择性结合到哺乳动物某些细胞结构上的生物分子。
至于基质(M)上的亲和性吸附剂，可以是各种形状并含有许多化学成分。例如，可构成填有颗粒状的聚合物的柱室，所述聚合物为天然或人造来源。颗粒可以是大孔性的或其表面是经嫁接(graft)处理的，后者是为了扩大其表面积。颗粒可以是球形或细粒状的，并以多糖、陶瓷物质、玻璃、二氧化硅、塑料或它们的组合或类似物质为基础。例如，它们的组合可以是用适宜天然来源或人造聚合物包被的固体颗粒。也可采用人工膜。它们可以是由纤维素、聚酰胺、聚砜、聚丙烯或其他类型物质制成的平板型膜，该膜应具有足够的惰性，是生物相容和非毒性的，并且受体能直接或者对膜表面进行化学修饰后固定于其上。也可采用毛细膜，例如由纤维素、聚丙烯或适于该类型膜的其他物质组成的中空纤维膜。优选的实施方案是以琼脂糖为基础并适于体外施用的颗粒状物质。
可通过各种方法将生物素-结合分子固定在基质上。所用的结合方法取决于生物素-结合分子以及载体基质的性质。对于蛋白质，可利用官能团例如羟基、氨基、羧基或巯基。糖蛋白例如抗生物素蛋白可经由其糖基残基与该基质连接。可对固体载体进行活化，使其能与蛋白质的侧链或主链结构经特异性或非特异性反应形成键，而将蛋白质结合到载体上。固体载体与生物素-结合分子之间的键也可以是非共价性的(静电、氢键结合或疏水力)。非共价附着在免疫测定中是最合适的。在基质与生物素-结合分子之间也可采用间隔基。
调节剂由含有两个生物素部分以及毒性物质结合部分的分子组成。本发明的两个生物素部分是重要的，因为这种排列能使生物素部分与柱上的相同(链霉)抗生物素蛋白分子结合，其亚单位交联并且可使柱稳定至适于血液通过的状态。由于生物素二聚物会与相邻生物素结合袋(分子内结合)迅速结合，而不是与相邻分子上的生物素结合袋(分子间结合)结合，因此生物素部分不会与相邻(链霉)抗生物素蛋白部分交联[Wilbur等，Bioconjugate Chem.8，819-832，1997)。与生物素结合后，抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白会更稳定，并且交联的亚单位也提供了附加稳定性(Biomolecular Engineering 16，67-72，1999)。
如附图3所示，调节剂包括两个生物素部分、毒素结合部分、三官能交联部分和三个链接子分子(a-c)。两个生物素部分包括通过生物素羧基经酰胺键与链接子分子(a、b)结合的天然生物素或生物素衍生物。生物素部分通过链接子分子与三官能交联剂结合，生物素羧基碳原子间的间距为最小20至最大60(呈完全线性形式时测得)。链接子分子a、b和c也简称为链接子，可以是相同的或者每个链接子的性质不同。该链接子分子为直链或支链分子，并在链中含有水增溶性官能团(例如醚/-硫醚键、胺)，或者附着于包含胺、羧基或羟基官能团的链上的附属物。与生物素酰胺键连接的链接子α上的原子可以是未取代的(例如CH2)或可含有甲基、羟亚甲基或羧基官能团。较大的官能团可减少与(链霉)抗生物素蛋白柱的结合。后一官能团可提供稳定性(抗生物素酶)，但是对于结合了柱上的(链霉)抗生物素蛋白的两个生物素部分而言，由于其不会被生物素酶分解，所以不要求这种稳定性。如果毒素结合部分是另一生物素部分，则需要生物素酶稳定性。三官能交联剂是用于结合链接子分子的含有三官能团的脂族或芳族化合物，它们是亲核试剂或可与亲核试剂反应。优选的三官能交联剂为1，3，5-取代的芳环。最优选的是1，3，5-苯三甲酸、3，5-二氨基苯甲酸、5-氨基-1，3-二羧基苯(氨基间苯二酸)衍生物。毒素结合部分是对毒性物质具有高亲和性的分子。这种结合分子的示例包括：单克隆抗体(或碎片或遗传工程对应物)，适体，肽，寡聚脱氧核苷酸(或结合碎片)，嵌入剂(例如，染剂、化疗剂、天然物质)，以及可特定地与毒素或附着于毒性物质上的效应子分子结合的金属螯合物。示例性毒性物质包括：金属离子，化疗剂，游离的放射性核素，与其他化合物结合的放射性核素，摄入的毒素，细菌产生的毒素，病毒性感染产生的毒素，疾病状态产生的毒素，病态细胞，涉及免疫应答的细胞，血型或HLA不容以及与异种抗体不相容的物质等。
生物素残基优选是生物素或其衍生物。在大多数实施例中，生物素部分是可通过酰胺键与链接子结合的天然生物素。在一些实施例中，采用其结合不如天然生物素那样紧密的生物素衍生物，或者能优先于天然生物素与经化学修饰或遗传学变异的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合的生物素衍生物，将是有利的。示例性生物素包括：降生物素、高生物素、氧化生物素、亚氨基生物素、脱硫生物素、二氨基生物素、生物素亚砜和生物素砜。其他生物素变体包括对上述示例的进一步修饰。本发明试剂中两个生物素部分可选择性地包括上述任何生物素衍生物。
在本发明的一个优选实施方案中，毒素结合部分为生物素或生物素衍生物。抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白柱经这种试剂(三生物素试剂)的调节后，可消除与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合的毒性物质(或者这些试剂经化学修饰、被酶促消化截短或通过遗传突变方法改变)。优选的含有3生物素的示例调节剂如方案1所示。这种调节剂的优选医药应用是从患者血液中除去结合有治疗放射性核素的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。在所示的实施例中(化合物1-3)，除了链接子基团性质和长度之外，它们的调节作用是相同的。所用的交联剂是1，3，5一苯三甲酸，所用的链接子含有用于水增溶作用的醚官能团。在化合物3中，链接子也含有天门冬氨酸(可提供有助于水增溶的游离羧基并阻断生物素酶的作用)。方案1：含有3个用于结合放射性标记链霉抗生物素蛋白衍生物的生
                    物素二聚物示例
A.生物素三聚体(生物素羧基的间距为31)
B.生物素三聚体(生物素羧基的间距为41)
c.生物素三聚体(生物素羧基的间距为53)
将含有亲核试剂或者是亲核试剂反应性二生物素化合物与毒性物质结合部分结合，可很容易地制备本发明方法涉及的其他毒性物质结合性二生物素调节剂。反应性二生物素化合物的合成示例如方案2和3所示。在这些示例中，采用经四氟苯基酯活化和N-tBoc保护的氨基间苯二酸酯(化合物4)作为三官能交联剂。结合了生物素的4与链接子4，7，10-三氧杂十三烷二胺(trioxatridecanediamine)的反应，得到二生物素化合物5。用纯的三氟醋酸，可很容易地将5中的N-tBoc保护基团转化成游离胺6。苯胺基化合物6与毒性物质结合化合物反应，后一化合物含有活化的羧酸酯或将进行其他亲核置换反应。6的游离胺也很容易转化成能与亲核试剂反应的官能团，所述亲核试剂例如异硫氰酸酯，7；马来酰亚胺，8，或其他试剂例如α-卤代乙酰胺。异硫氰基-二生物素化合物7与含有胺的毒性物质结合分子反应，马来酰亚胺基-二生物素8与含有巯基(或者胺)的毒性物质结合分子反应。采用相同方式可很容易地制备另外的反应试剂。与氧化的糖和醇反应的试剂是羟胺衍生物10。在方案2的示例中，链接子c或者是不出现，或者是首先与毒性物质结合分子连接。在许多情况下，希望链接子分子能使毒性物质结合部分更利于同血液中毒性物质作用。因此，在与毒性物质结合分子反应之前，可先使链接子成为分子的组成部分。其中引入链接子分子的示例如方案3所示(化合物11-14)。
方案2：合成能与其它分子结合的二生物素试剂
方案3：合成二生物素试剂(含有链接字部分和能与其它分子结合的 实施例
以下提供的实施例，描述了制备本发明公开的各种类型化合物的方法，以及这些化合物在从全血中除去毒素的柱的调节中用作试剂的应用。这些实施例旨在说明，并不作任何限制。从所述实施例中可以预见出许多进一步的实施例。
             实施例1
制备可与毒素结合分子结合的二生物素化合物步骤1：制各N-叔-Boc-5-氨基间苯二酸
Figure A0181245400291
冰/水浴温度下，将二叔丁基碳酸氢钠(1.27g，5.80mmol)加至5-氨基间苯二酸(1.0g，5.52mmol)、氢氧化钠(0.49g，12.14mmol)、DMF(10mL)和水(10mL)的溶液中。反应混合物在环境温度下搅拌16小时。在冰/水浴温度下，溶液用53.0mL的0.5 N HCl中和，然后过滤白色沉淀，用水洗涤并真空干燥。残渣在MeOH/H2O中结晶，得到白色固体的纯化合物。收率为0.94g(61％)。mp＞300℃。1H NMR(DMSO-d6)：δ1.50(s，9H)，8.08(t，J＝1.5Hz，1H)，8.31(d，J＝1.5Hz，2H)，9.80(s，1H)。HRMS计算1cd C13H16N6(M+H)+：282.0977。发现：282.0981。HPLC：tR＝11.3分钟。步骤2：制备N-叔-Boc-5-氨基间苯二酸双四氟苯基酯
Figure A0181245400292
室温下，将2，3，5，6-四氟苯基三氟醋酸酯(0.47mL，2.71mmol)滴加至叔-Boc-5-氨基间苯二酸(0.35g，1.23mmol)、NEt3(0.52mL，3.70mmol)、DMF(4.0mL)和水(10mL)的溶液中。反应混合物在室温下搅拌30分钟后，加入60mL水，过滤白色沉淀，用水洗涤，真空干燥得到粗品。粗品经硅胶柱层析法(40g)纯化得到无色固体，其中用10％ EtOAc/己烷洗脱。收率为0.213g(30％)。mp为159.7-161.8℃。1H NMR(CDCl3)：1.55(s，9H)，6.83(s，1H)，7.08(m，1H)，8.54(d，J＝1.5Hz，2H)，8.67(t，J＝1.5Hz，1H)。HRMS分析C25Hl5F8NNaO6(M+Na)+：600.0669。发现：600.0674。HPLC：tR＝16.1分钟。步骤3：制备N-(13-氨基-4，7，10-三氧杂十三烷基)生物素酰胺
Figure A0181245400301
氩气下，将生物素(10g，40.9mmol)溶于在200mL热(70℃)DMF中。溶液冷却至环境温度，加入10mL(82mmol)三乙胺，随后添加16g(61mmol)的2，3，5，6-四氟苯基三氟醋酸酯。反应物室温下搅拌30分钟，并真空除去溶剂。产物在100mL醚中研磨并过滤。分离出的产物经真空干燥，得到收率为14g(83％)的无色固体生物素TFP酯，mp为185-187℃。1HNMR(DMSO-d6，()：1.4-1.8(m，6H)，2.5(m，1H)，2.6-2.9(m，3H)，3.1(m，1H)，4.2(m，1H)，6.4(d，2H)，7.9(m，1H)；IR(KBr，cm-1)3250，2915，1790，1710，1520，1480，1090。分析计算C16H16F4N2O3S：C，48.98；H，4.11：N，7.14。发现：C，48.90；H，4.14；N，6.86.
将生物素TFP酯(5g，12.8mmol)加至含有200mL无水DMF的干燥烧瓶中。向另一含有28g(128mmol)4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺8的干燥烧瓶中加入4mL三乙胺。两个烧瓶均用冰水浴冷却至0-5℃。将生物素TFP酯滴加至三氧杂十三烷二胺溶液中，用时1小时。反应物于室温下搅拌30分钟，并真空除去溶剂。所得油状物在500mL醚中研磨并搅拌30分钟。过滤所得固体，然后溶于甲醇：醋酸乙酯(4：1)中，然后填入二氧化硅柱中(2.5cm×35cm)。用相同的溶剂混合物洗脱柱子。收集含有产物的级分，真空下除去溶剂。分离出的产物经真空干燥，得到无色固体9，收率为4.5g(79％)，mp为104-106℃。1H NMR(MeOH，()：1.46(m，2H)，1.6-1.8(m，9H)，2.2(t，2H)，2.7(d，1H)，2.75-2.9(m，3H)，3.2-3.3(m，5H)，3.5-3.6(m，14H)，4.3(m，1H)，4.5(m，1H)：IR(KBr，cm-l)：3280，2910，2850，1690，1640，1110，940。分析计算C20H38N4O5S-H2O：C，51.70；H，8.68；N，12.06。发现：C，51.95；H，7.98；N，11.65.步骤4：1-N-叔-Boc-3，5-二(13-(生物素胺基)-4’，7’，10’-三氧杂 十三烷胺基)-氨基间苯二酸酯
Figure A0181245400311
室温下，将无水DMF中的生物素-三氧杂二胺4(100mg，0.22mmol)滴加至无水DMF的3(65mg，0.11mmol)和三乙胺(47L，0.33mmol)溶液中。反应混合物于室温下搅拌2小时，然后真空下将溶液蒸发干燥。残渣用经20％MeOH/EtOAc洗脱的硅胶柱(40g)纯化，得到收率为73mg(58％)的无色固体，mp为209-211℃。1H NMR(CD3OD，200MHz)：δ1.43(t，3H)，1.54(s，9H)，1.69(m，6H)，1.88(m，3H)，2.19(m，4H)，2.69(d，4H)，2.92(m，2H)，4.30(m，2H)，4.48(m，2H)，7.83(m，1H)，8.00(m，2H)；质量计算C53H88N9O14S2(M+H))+：1139。发现：1139。质量计算C53H87N9O14S2Na(M+Na)+：1161。发现：1161。HPLC 11.8分钟。步骤5：1-异硫氰基-3，5-二(13’-(生物素胺基)-4’，7’，10’-三氧杂十 三烷基)-氨基间苯二酸酯
Figure A0181245400321
120mg的22(0.11mmol)溶于纯TFA(1mL)中，并于室温下搅拌10分钟。然后，真空除去过量的TFA。将残渣溶于2mL甲醇中，并用0.2mL三乙胺处理。真空下除去挥发性物质，然后分别地加入水(3mL)、氯仿(3mL)和二氯硫化碳(42μL，0.55mmol)。混合物于室温下搅拌1小时。然后，氩气流下，在通风橱中蒸发掉过量的二氯硫化碳和氯仿。剩余的水相真空下蒸发至干，得到77mg(68％)发粘的淡黄色固体23。1H NMR(DMSO-d6，200MHz)：δ1.24-1.35(m，6H)，1.43-1.67(m，14H)，1.77(t，J＝6.6Hz，6H)，2.05(t，J＝7.1Hz，6H)，2.58(d，J＝12.5Hz，2H)，2.82(dd，J＝4.8，12.5Hz，2H)，3.07(m，8H)，3.28-3.57(m，18H)，4.13(dd，J＝4.6，7.7Hz，2H)，4.31(dd，J＝4.6，7.7Hz，2H)，7.80(t，J＝5.0Hz，2H)，7.98(s，2H)，8.34(s，1H)，8.77(t，J＝5.1Hz，2H)。质量计算C49H78N9O12S3Na(M+Na)+：1103。发现：1103。HPLC 11.8分钟。
             实施例2
二生物素化合物与毒素结合分子的结合
将4μL DMSO中的108mg(15当量)的二生物素异硫氰酸酯化合物23加至150μL单克隆抗体53-6A2(1mg)的溶液中(6.7mg/mL)。混合物轻微涡流振荡，然后室温下反应过夜。采用Centricon 30，以6000rpm超速离心过滤过量的二生物素试剂，然后用0.9％盐水4×1mL洗涤，纯化结合抗体的二生物素。
                  实施例3
用二生物素-毒素结合物调节抗生物素蛋白柱
该实施例涉及含有另一生物素部分的二生物素化合物。其中两个生物素部分将与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合，余下的第三个生物素部分可用来结合毒性化合物，该毒性化合物也可与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合，或者是含有融合蛋白的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。因此，该实施例中的二生物素化合物为生物素三聚体，但是也可采用含有其他高亲和性结合配体的二生物素化合物以相同方法调节柱。生物素结合柱经调节转化成抗生物素蛋白-结合柱：
将2mL的Mitra抗生物素蛋白-琼脂糖填入柱室中，并用多于10mL的PBS洗涤，流速为1mL/分钟(1.6cm/分钟)。将在PBS中的5mL生物素-三聚体1mg/mL溶液循环通过抗生物素蛋白-柱20分钟，速度为1mL/分钟。再循环结束时，从再循环溶液中取出样品(0.5mL)，并用Mitra Medical Technology AB公司开发的ELISA技术进行分析。用磷酸盐缓冲剂洗涤生物素-抗生物素蛋白-琼脂糖-柱20分钟，流速为1mL/分钟。通过测定再循环液中生物素-三聚体的浓度，可以估计吸附的生物素-三聚体量约为1.9mg，即再循环结束时的浓度为0.95mg/mL凝胶。用于测定生物素-三聚体浓度的标准曲线如附图4所示。
将生物素-三聚体吸附到2mL的Mitra抗生物素蛋白琼脂糖上。所用的抗生物素蛋白-琼脂糖对生物素的静态结合能力约为74g/mL。如果每一有效的结合位置上结合了一个生物素-三聚体，则相当于514g生物素-三聚体/毫升。当每毫升抗生物素蛋白-琼脂糖结合了约0.95mg生物素-三聚体时，可以设想吸附剂已被生物素-三聚体饱和。评估抗生物素蛋白在经调节柱中的吸附：
用磷酸缓冲剂填装(prime)经生物素三聚体(即附图4，化合物#2)调节的抗生物素蛋白-琼脂糖柱。然后，将20mL抗生物素蛋白溶液(1mg抗生物素蛋白/mL，在PBS中)再循环通过生物素-抗生物素蛋白-琼脂糖-柱，流速为1.0mL/分钟(1.6cm/分钟)。在再循环开始之前，先用三体积的抗生物素蛋白溶液(3×20mL)进行，然后从容器中取出等分试样，2分钟之后以5分钟的间隔取样。用Mitra Medical TechnologyAB公司开发的ELISA技术分析等分试样，以测定其中的抗生物素蛋白含量。再循环容器中抗生物素蛋白的浓度如附图5所示。虚线表示理论上的期望值(即未出现饱和效应)。约40分钟之后，柱被饱和(2体积)，此时约结合了16mg(80％)的抗生物素蛋白。在约20分钟(1.0体积)之后，可观察到饱和迹象，此时实验曲线开始偏斜理论曲线(约有10mg抗生物素蛋白结合到柱上)。
再循环40分钟之后，约有16mg抗生物素蛋白被结合，即8mg/mL生物素-抗生物素蛋白-琼脂糖。这相当于结合到琼脂糖上的抗生物素蛋白与生物素三聚体上吸附的抗生物素蛋白间的摩尔比为1∶1。约在一个再循环体积之后即可观察到初始饱和效应。在2个体积之后，不再有抗生物素蛋白被结合。
实验显示，抗生物素蛋白-琼脂糖能被生物素-三聚体饱和，生物素-三聚体能与适合单体生物素结合的所有部位结合，再循环的游离抗生物素蛋白可有效地与生物素-抗生物素蛋白-琼脂糖填充的柱结合。每毫升吸附剂约结合8mg抗生物素蛋白，这相当于结合的抗生物素蛋白与在琼脂糖颗粒上固定的抗生物素蛋白间的摩尔比为1∶1。
            实施例4
使用经调节的柱从血液中清除毒素
使血液通过抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白包被的装置，以促进从血液循环中消除特定毒素，其中该装置在使用前通过流经包含携带有特定毒素结合部分的柱调节剂溶液，而转化成特殊的装置。这使抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白包被的装置成为用来消除各种毒素的技术平台。在特殊情况下，需要在同一处理过程中清除一种以上的毒素，通过使携带有不同专属性毒素结合部分的柱调节剂混合物流经装置，即可很容易地实现这一需求。这种多功能装置的适宜应用，是在器官或细胞移植之前用于从血液清除抗HLA抗体、抗血型抗体或抗异种抗体。采用携带可直接作用于特定亚型(例如抗HLA抗体)的不同专属性毒素结合部分的适宜柱调节剂混合物，可在处理前调节毒素清除装置，而使其适用于不同的患者。
在医院中，可如下进行调节：将包含适宜调节剂的输液袋与体外处理用的监控设备(可重编程的透析机)连接，其中调节剂携带可直接作用于特定亚型的不同专属性毒素结合部分，可通过监控装置手工或自动完成对抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白装置的调节。在这种情况下，柱调节剂溶液进入装置的流速决定了不同专属性毒素结合部分在最终经调节装置中的比例。
另外，也可采用特殊毒素结合部分的某些混合物，预先配制包含携带了不同专属性毒素结合部分的柱调节剂混合物的输液袋或者最终装置。
            实施例5
应用调节柱改善免疫靶向作用(两步法)
为了在两步法中提高免疫靶向，在第一步中，使血液通过生物素结合装置，提供有效清除血液循环中生物素化的靶向分子的方法；在第二步中，使血液流经生物素结合装置，而从血液中清除接着施用的抗生物素蛋白/-链霉抗生物素蛋白毒性衍生物，所述装置由包含本发明试剂(例如生物素二聚物或三聚体)的溶液流经生物素结合装置而制得。
也可如下改变该方法的操作顺序。
为了在两步法中提高免疫靶向，在第一步中，使血液通过抗生物素蛋白/-链霉抗生物素蛋白结合装置(由含有生物素二聚物或三聚体的溶液流经生物素结合装置而制得)，提供有效清除血液循环中SA/抗生物素蛋白结合的靶向分子的方法；在第二步中，通过使血液流经生物素结合装置，而从血液中清除含有本发明方法试剂的分子(例如，生物素和放射性核素/细胞毒性部分)。
在提高免疫靶向的两步法中，也可在第一步中提供监控肿瘤摄取生物素化的靶向分子的方法，所述靶向分子采用可由γ照相、PET-扫描、MRI或其他体内诊断技术检测出的试剂标记，并在适当时间后，使血液流经生物素-结合装置以清除血液中非靶向结合的靶向分子，和在适当的时间施用携带细胞杀伤放射性核素/细胞毒素剂的抗生物素蛋白/SA，然后使血液流经抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白结合装置(由包含本发明例如二聚物或三聚体试剂的溶液流经生物素结合装置而制得)，从而清除了血液循环中的细胞杀伤放射性核素/细胞毒素剂。
              实施例6
应用调节柱改善免疫靶向(三步法)
为了提高三步法中免疫靶向作用，在第一步中，使血液流经生物素结合装置，提供有效清除血液循环中生物素化的靶向分子的方法；和在第二步中，使血液流经抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白结合装置，清除血液中施用的抗生物素蛋白/SA，所述装置由含有本发明试剂(例如生物素二聚物或三聚体)的溶液流经生物素结合装置而制得；和在第三步中，使血液流经生物素-结合装置，以清除血液中含有生物素和放射性核素/细胞毒性部分的分子。

Claims (20)

1.用于调节体外装置的方法，所述装置用于从与哺乳动物状况或疾病的诊断或治疗相关的哺乳动物体液中提取毒性物质，其中包括将含有试剂的溶液流经具有生物素结合能力的装置，其中所述试剂结合到该装置中，由此将所述装置从生物素结合装置转化成毒性物质结合装置，所述试剂的通式如下：
其中生物素部分为天然生物素或其衍生物，
其中a、b和c为相同或不同的链接子，和其中d为三官能交联部分。
2.如权利要求1的方法，其中含有亲核性或能与亲核试剂反应的三官能团的三官能交联剂是脂族或芳族化合物，优选为1，3，5-取代的芳族化合物，最优选为1，3，5-苯三甲酸、3，5-二氨基苯甲酸或5-氨基-1，3-二羧基苯的衍生物。
3.如权利要求1的方法，其中毒素结合部分是对含有或不含效应子分子的毒性物质具有高亲和性的分子，其选自：包括碎片或遗传工程对应物的单克隆抗体，适体，肽，包括结合碎片的寡聚脱氧核苷酸，包括染剂、化疗剂、天然物质的嵌入剂，以及能特定地与含有或不含效应子分子的毒性物质或者与附着于毒性物质上的效应子分子结合的金属螯合物。
4.如权利要求1的方法，其中一个或更多链接子a、b和c是直链或支链的，并含有水增溶性官能团或含胺、羧基或羟基官能团的侧基，优选为α羧基或N-甲基，以提高生物素部分或其衍生物与间隔基之间的生物素酰胺键对酶促分解的稳定性。
5.如权利要求1的方法，其中生物素衍生物选自：降生物素、高生物素、氧化生物素、亚氨基生物素、脱硫生物素、二氨基生物素、生物素亚砜，生物素砜，或能与抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和其衍生物结合的其他生物素分子。
6.如权利要求4的方法，其中呈完全线性形式时测得，链接子a和b提供的三官能交联部分与每一生物素部分的羧基碳原子间的间距为最小20至最大60。
7.如权利要求3的方法，其中毒素结合部分具有以高亲和性结合毒性物质的能力，所述毒性物质包括：金属离子，化疗剂，游离的放射性核素，结合了其他化合物的放射性核素，摄入的毒素，细菌产生的毒素，优选内毒素或肠毒素，病毒感染产生的毒素，疾病状态产生的毒素，病态细胞，涉及免疫应答中的细胞，抗血型抗体，抗HLA抗体，抗异种抗体，或者因疾病、失调或与治疗不相容产生的以不希望的水平存在于体液中的任何其他不需要的内源性组分，优选TNF和细胞激肽类，或者与疾病、失调或医药不相容有关的任何外源组分，优选生物素结合分子。
8.如权利要求7的方法，所述生物素结合分子可任选与效应子分子结合，所述生物素结合分子选自：抗生物素蛋白，链霉抗生物素蛋白或其衍生物或碎片，该碎片基本上具有与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白相同的结合生物素的功能。
9.如权利要求3的方法，其中效应子分子为放射性核素、细胞毒素剂、用于结合放射性核素的螫合剂、化疗剂、天然毒素或其衍生物、或合成毒素。
10.如前述任一权利要求的方法，其中毒素结合部分为生物素，间隔基a、b和c为4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺，和三官能交联部分为5-氨基-1，3-二羧基苯。
11.如权利要求1-9之一的方法，其中为
Figure A0181245400041
Figure A0181245400061
Figure A0181245400071
12.用于体外从与哺乳动物状况或疾病的诊断或治疗相关的哺乳动物体液中提取毒性物质的方法，其中直接或通过其他在前施用的分子已加到哺乳动物血液循环中，并在其中保持一定时间，使其富集于靶组织或细胞中的任选包括效应子分子的毒性物质，其未富集于所述靶组织或细胞中的毒性物质通过使哺乳动物血液或血浆流经含有权利要求1-11之一定义试剂的体外装置，完全或部分地从血液循环中清除。
13.如权利要求12的方法，其中试剂的毒素结合部分为生物素或其衍生物，其中
a)将生物素化的靶向生物分子加到哺乳动物的血液循环中，其中未富集于所述靶组织或细胞中的生物素标记的靶向生物分子经体外生物素结合装置从血液循环中清除掉，
b)在步骤a)之后，向血液循环中施用生物素结合分子，各自结合一个效应子分子，其中未富集于所述靶组织或细胞中的生物素结合分子流经体外装置从血液循环中清除掉，所述装置含有用于特异性吸附生物素结合分子及其结合的效应子分子的试剂。
14.如权利要求13的方法，其中
a)生物素化的靶向生物分子各自与效应子分子结合，将其施用于血液循环中，以便于经γ照相、PET-扫描、MR工或其他体内诊断技术检测效应子分子来监控肿瘤摄取，和其中步骤b)中的效应子分子为细胞杀伤性放射性核素或细胞毒素剂。
15.如权利要求13的方法，其中步骤b)中的生物素-结合分子不与效应子分子结合，和步骤c)中将效应子分子和生物素或试剂的结合物加到哺乳动物血液循环中，和任选地通过流经体外生物素-结合装置清除血液中未富集于靶组织或细胞的上述结合物。
16.如权利要求12的方法，其中试剂的毒素结合部分为生物素或其衍生物，其中
a)将附着于靶向分子的生物素结合分子加至哺乳动物血液循环中，其中未富集于靶组织或细胞的生物素结合分子经体外装置从血液循环中清除掉，所述装置含有用于特异性吸附生物素结合分子的所述试剂，和任选地，
b)在步骤a)后，将用生物素或试剂生物素化的各自与效应子分子结合的分子施用于血液循环中，其中未富集于靶组织或细胞的生物素化的分子经体外生物素-结合装置从血液循环中清除掉。
17.如权利要求13-16之一的方法，其中生物素化的靶向生物分子是含有天然生物素或其衍生物的靶向分子，其中
生物素结合分子是含有抗生物素蛋白，链霉抗生物素蛋白或其衍生物的分子，
生物素化的分子是含有放射性金属螯合部分的放射性标记的生物素衍生物，和
效应子分子是放射性核素或细胞毒素剂。
18.如权利要求12的方法，优选在器官或细胞移植之前，用于从血液中同时清除多抗HLA抗体、多抗血型抗体或多抗异种抗体，其中包括含有所述试剂或具有不同特异性毒素结合部分的几种试剂的体外装置。
19.用于从与哺乳动物状况或疾病诊断或治疗有关的哺乳动物体液中提取毒性物质的体外装置，其中包括能与如权利要求1-11任一定义试剂结合的生物素结合分子。
20.如权利要求19的体外装置，其中装置为柱，生物素结合分子是抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，和试剂为三生物素化的试剂。
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