CN1448511A - 耐盐基因mgx4及它的耐盐抗旱植物品种的培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种以红树等抗旱植物为材料，克隆到抗盐基因MGX4，将该基因编码序列同强力组成型表达启动子35S融合，构建成植物表达载体pHXZ，然后借助农杆菌芥导方法，经上述基因表达载体将MGX4抗盐基因导入被转化的植物染色体基因组内，并使其在转基因植物中大量表达、培养、转基因幼苗转移到生根培养基上诱导生根，两周后将卫生根的幼苗转移到土壤中。
Description
技术领域
本发明涉及转基因耐盐抗旱植物，更具体地说转基因西红柿、油菜、烟草等耐盐抗旱植物。
背景技术
可耕地面积减少，长期以来是世界一大难题，特别是今后30年内，随着世界人口增长，食物短缺问题将变得更加严重。在这期间，发达国家对食品的需求量会增加20％，而在发展中国家将高达60％。这是21世纪人类面临的重大挑战。农田灌溉引起的土地盐化，更使形势变得日趋严峻。灌溉水在环流过程中汲取土壤及岩石中的盐份，最后沉积在被灌溉的农田中，从而使可耕农田盐化。世界上最严重的地区集中在印度、中国、巴基斯坦及美国西部。由于在这些干旱地区，没有足够的降雨来冲刷土壤中滞留的盐份，从而形成恶性循环，农田中盐份日益增高，最后变成不可耕种的不毛之地。据美国农业部估计，全世界每年有1000万公顷(合1.5亿市亩)的农田因灌溉引起的盐化而丢失。
世界各国多年来投入了大量的人力和资金，对自然界中的盐生植物进行了大量的研究，企图通过了解这些喜盐植物的抗盐机理，来解决耕地的盐化及干旱地区的生态建设问题。研究发现，这些天然的盐生植物，大致通过以下方式在盐化的土地上生存：
1.植物具有特殊的根系，在摄取土壤中的养份时，根系不吸取过多的盐份，将盐离子保留在土壤中，不吸收到植物体内；
2.植物的叶片形成特殊的一种叫盐腺的结构，将其体内过多的盐份排到体外；
3.在植物体细胞内将盐份区域化到特定的区域，如液泡内。
以上第一种方式没有多大的应用研究价值，因为植物不吸收土壤中的盐份继续保留在土壤内，从而土地无法脱盐；第二种机理涉及植物体的形态、结构及生理代谢，十分复杂，至今仍无重大进展；第三种机理最具有应用研究价值，但一直未能找到相关的抗盐基因。一直到2001年，本人把从拟南芥菜中克隆的一个相关的基因(AtNHX1)在西红柿及油菜中表达，从而使转基因西红柿及油菜可以在相当于三分之一海水盐浓度的情况下正常生长，转基因抗盐作物才宣告诞生(详见相关论文1.Hong-xia Zhang and EduardoBlumwald，(2001)Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulatesalt in foliage but not in fruit.Nature Biotechnology.19(8)：765-768；2.Hong-xia Zhang，Joanna N.Hodson，John P.William and EduardoBlumwald(2001)Engineering salt tolerant Brassica plants：Characterization of yield and seed oil quality in transgenic plantswith increased vacuolar sodium accumulation.Proceedings of theNational Academy of Sciences，USA98(22)：12832-12836)。
发明内容
本发明目的在于提供一种从盐生植物中克隆的抗盐基因MGX4；本发明的另一目的是利用MGX4基因，通过转基因技术寻找出培育耐盐抗旱植物新品种的方法。
本发明涉及的科学术语如下：
△“转基因”，系指导入植物个体的一段外源的双链脱氧核糖核苷酸(DNA)片段，可以游离在染色体外，也可以整合到染色体的基因组上；可以通过生殖过程传递到后代，也可以不传递到后代。外源基因可以是从任何生物基因组中克隆的，也可以是人工合成的或用PCR在体外扩增的。
△“类似基因”，系指任何同MGX4的DNA编码序列中任何区域同源性在40％以上的DNA片段，或任何DNA片段，其编码的氨基酸序列同MGX4编码的氨基酸序列中任何区域有40％以上的同源律。类似基因(DNA)片段可以是从任何生物基因组中克隆的，也可以是人工合成或用PCR在体外扩增的。
△“基因片段”，系指长度在300个碱基对(bp)以上的同MGX4的DNA序列中的任何域区同源律在40％以上的任何DNA片段，或任何编码100个氨基酸以上的DNA片段，其编码的氨基酸序列同MGX4编码的氨基酸序列中的任何区域同源性在40％以上。该基因片段可以是从任何生物基因组中克隆的，也可以是人工合成的或用PCR在体外扩增的。
△“植物”系指整个植物界包括低等植物、高等植物、藻类以及任何利用光合作用生存的水生物，主要包括光合水生物、藻类、厥类、裸子植物(松、柏等)、被子植物(蔬菜、粮食作物、油料作物、药用植物、苗木、花卉、苗木包括所有木本植物)。
△“抗逆植物”，指任何具有抗盐、抗旱、抗寒、抗热、抗虫等特性的植物。
本发明将MGX4基因(序列附后)在西红柿中表达后，使转基因西红柿可以在相当于二分之一海水盐浓度的营养液中正常生长并结出果实，其抗盐性比已发表的表达拟南芥菜ATNHX1基因的转基因西红柿更好，同时本研究中还将MGX4基因在烟草中表达，使转基因烟草可以在相当于三分之一海水盐浓度的培养基上萌发，并在相当于海水盐浓度的土壤中正常生长。
将该MGX4抗盐基因，装配于强力组成型表达的花椰菜花叶病毒35S强力启动子(CaMV35S)之下，构建成可以在植物中表达的载体，通过农杆菌介导的转化方法，使该基因在转基因植株内大量表达，使该基因编码的蛋白(Na+-H+交换泵)的含量大幅度提高，将细胞液中的钠离子“包装”到液胞内，从而使转基因植物获得耐盐抗旱的特性。本发明的关键是克隆到了抗盐基因并将其在目的植物中大量表达。由于拟南芥菜并非喜盐植物，为研究开发性能更好的抗盐转基因植物，本发明以海生植物红树为材料，克隆到抗盐基因MGX4，该基因编码的蛋白为Na+-H+交换泵，该蛋白定位在植物细胞内的液泡膜上，其功能为将细胞液中的钠离子转移到液泡中，而将液泡内的氢离子交换到液泡外的细胞液中，从而使植物吸收的大量盐份(Na+)区域化到液泡内，而细胞液中Na+的含量保持在较低的水平，各种生理代谢活动可以正常进行，因此表达该基因的植物体具有抗盐特性。MGX4基因的序列如下：agctcgattgcgtttggtgatatcacatcgtcgaaaacgattacacctcatcgtgtgata 60
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1.构建可以在植物中强力表达的基因表达载体；
2.借助农杆菌介导的方法，经上述基因表达载体导入被转化的植物染色体基因组内，并在安装于抗盐基因MGX4上游的强力组成型表达启动子的带动下，在转基因植物中大量表达；
3.对第一代转基因植株进行DNA(Southern Blots)，RNA(Northern Blots)及蛋白(Western Blots)分析，并检测其抗盐性能；
4.对上述蛋白分析呈阳性的第一代个体进行继代繁殖，并分析其后代(F1，F2，F3，F4)中Na+-H+交换泵的含量及个体的抗盐性；
5.对转基因后代进行中试及大田试验，并申请通过国家相关部门的品种鉴定。
本发明以海生植物红树为材料，将其中可以使植物体内的盐份区域化到液泡内的抗盐基因克隆出来。具体操作如下：
1.将1个月红树幼苗分别用50mM NaCl及300mM NaCl浇灌2周，每周2次，分别从嫩叶中提取mRNA(详细方法见CLONTECH，extract-N-RNA kit说明书)，用差异显示(differential display)的方法，共分离出79个只在300mM NaCl处理后的红树幼苗中大量表达的DNA片段。
2.对这些片段进行序列分析后，共选择出6个可能与抗盐基因相关的片段做探针，从用300mMNaCl处理后的红树幼苗构建的cDNA文库中克隆出全序列，其中只有MGX4编码的蛋白为膜蛋白，并同拟南芥菜中克隆出的ATNHX1基因有一定的同源性。抗盐基因MGX4同拟南芥菜AtNHX1基因具有大约55％的同源性1 atgagtctgggtattggagtccttctcaaatccggcggggcgtcggtctc 50
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将该MGX4抗盐基因，装配于强力组成型表达的花椰菜花叶病毒35S强力启动子(CaMV35S)之下，构建成可以在植物中表达的载体，通过农杆菌介导的转化方法，使该基因在转基因植株内大量表达，使该基因编码的蛋白(Na+-H+交换泵)的含量大幅度提高，将细胞液中的钠离子“包装”到液胞内，从而使转基因植物获得耐盐抗旱的特性。本发明的关键是克隆到了抗盐基因并将其在目的植物中大量表达。由于拟南芥菜并非喜盐植物，为研究开发性能更好的抗盐转基因植物，本发明以海生植物红树为材料，克隆到抗盐基因MGX4，该基因编码的蛋白为Na+-H+交换泵，该蛋白定位在植物细胞内的液泡膜上，其功能为将细胞液中的钠离子转移到液泡中，而将液泡内的氢离子交换到液泡外的细胞液中，从而使植物吸收的大量盐份(Na+)区域化到液泡内，而细胞液中Na+的含量保持在较低的水平，各种生理代谢活动可以正常进行，因此表达该基因的植物体具有抗盐特性。植物表达载体pHXZ的构建：
将该基因的编码序列同强力组成型表达启动子35S融合，构建成植物表达载体pHXZ，具体操作如下：
将植物二元表达载体pBI121首先用限制性内切酶SstI消化后，用T4DNA聚合酶切成平头，再用限制性内切酶SalI切割，将载体上原有的GUS基因切去，将载体纯化后回收；同时，将MGX4抗盐基因同样用SalI消化，再用Smal酶切，然后将其用T4DNA连接酶同回收的载体连接，得到植物表达载体pHXZ。
附图说明：图1为植物表达载体pHXZ的构建图
具体实施方法：
烟草的遗传转化：将植物表达载体pHXZ导入农杆菌LBA4404中(方法见Hong-xia Zhang & Jan A.D.Zeevaart(1999)An efficient Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation and regeneration system forcotyledons of spinach(Spinacia oleracea L.)Plant Cell Reports 18(7/8)：640-645)，用含有pHXZ的农杆菌培养液感染烟草幼叶切片，在共培养基(MS+1毫克/升6-BAP，0.1毫克/升NAA)上共培养2天后，转移到再生培养基上(MS+1毫克/升6-BAP，0.1毫克/升NAA，100毫克/升卡那霉素，200毫克/升氨卞霉素)；大约三周后，将再生的转基因幼苗切下，转移到生根培养基上(MS+0.1毫克/升NAA，50毫克/升卡那霉素，100毫克/升氨卞霉素)，诱导生根；两周后将已生根的幼苗转移到土壤中培养，并按上述方法进行分子及抗盐性鉴定。有关西红柿的转化方法，详见Hong-xia Zhang and EduardoBlumwald，(2001)Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulate salt in foliagebut not in fruit.Nature Biotechnology.19(8)：765-768本发明有如下优点：
1、本发明的MGX4基因在西红柿中表达后，使转基因西红柿能在相当于二分之一的海水盐浓度的营养液中正常生长，并结出果实，优于ATNHX1。
2、本发明从红树中克隆到MGX4的基因，该基因的编码蛋白质为Na+-H+交换泵，其功能为将细胞液中的钠离子转移到液泡中，而将液泡内的氢离子交换到液泡外的细胞液中，从而使植物吸收的大量盐份(Na+)区域化到液泡内，而细胞液中Na+的含量保持在较低的水平，各种生理代谢活动可以正常进行，因此表达该基因的植物体具有抗盐特性。采用这种机理使细胞液中Na+的含量保持低水平，可以使各种生理代谢活动得以正常进行，是较为理想的除盐方法之一。
序列表(1)一般信息：(i)发明名称：耐盐基因MGX4及它的耐盐抗旱植物品种的培育方法(ii)序列数目：2(2)序列SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：(A)长度：1837bp(B)类型：核酸(C)链性：双链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(ii)序列描述：SEQ NO：1：1 agctcgattgcgtttggtgatatcacatcgtcgaaaacgattacacctcatcgtgtgata61 atgagtctgggtattggagtccttctcaaatccggcggggcgtcggtctcgaaacacgac121 ctaatcgtctcggtcaacatctggatcgcgctggcatgcagctgcattgtcatcaaccac181 ttgctggatgggaaccgatggctgaacgagtccgccaccgcgcttgtcatgcaactctta241 accacaggcgtcatcctgatcgttactaatgggacaaactcacgcattgttgtgtggaac301 gaggacctgtttttcatatatatacttccgccgttaatcttcaatgtcgggtttcaagta361 aagagaaagcaatggttccgcaactttatacagattattttgttttccgctattagtact421 ctgattggctttgtagcaatctctctttctgcttgtgggttgttcaagaaaatcgatgtt481 ggtccaatcgagcttgggaaatatgttgcaattactgctcttttcggggcaacagagact541 ctttgcaacttacaggtgcttaaccagcatgaaacacccgtactctatagtatcgtttgg601 tcggaaggtctagttaatgaagccacaaccgttctactcttcaatgtcattgataacatc661 cacattgataattttgaagctattgttgtcttgcaattcgtctctcgatttatttacgta721 ttctggaccagcaacatacttactgtagctggtgggttggcaagtgcatacgtaatcgat781 gaactcccatttgccgatcataacactgatagaaaggtttctgtaatgatagcaatggca841 tacgcttcatacatggcgtcaatgctgatagacctgtacggaattcttgatgtcttctgg 901 cctggaatagtatgttcacattactcctggcatcaagtgacagaaggatttaaagttacc961 aacaagcattcatttgtaactttaggattcattatcgaactattcctctggctctatgtt1021 aacatggatatattggacctagaggactggagattagctagtcagagtcctaagagacca1081 attctgttaactgcatttattttgacattggttatgattggaagagtcgcatttatattc1141 cctttgaatttcgcatccaccctacaaaaaagggacgccgatccaagaatcaacttcgaa1201 acacaactaatcttatggttcgctagtctcatcagaggagcaatttcagttgcggttctt1261 tataccaagtttaacgcaactggtcactctgaaatccgactcaatgtcatcatgttaacc1321 agcacacttattgttattctattcggcacaatggctttcaacctggtgacgcgcccggta1381 gcaagtatcctcctcccaccagacactggactgtcaacgggttctctggtctcacaacag1441 actatgctggacccaatccttactggcatgatcgggtctgagtttgatgtagggacgatc1501 acctcccctcaatacaccctccagttccttctcggcgcgccagctcgcaccgtccataaa1561 gtttgggacaagtgggacgagcggttcatgcacccggtgttcggggggaaaggtttcgcc1621 ccctttctccctggtacgccggcggagaggactgtccctaaatctcacgtgggcaacgtg1681 Acggacgcttatggcagtatcgacctagctttcctctgattcctggataaataatgttca1741 ttacttcatcgataaatttcttgcttcaagatttattttcatataaaaaaacggaaaaat1801 tcgctatagactacgcaaaaaaaaaaaagggcgccga(3)序列SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：(A)长度：552AA(B)类型：氨基酸(C)拓扑结构：线性(ii)分子类型：多肽(ii)序列描述：SEQ NO：2：1 M S L G I G V L L K S G G A S V S K X D21 L I V S V N I W I A L A C S C I V I N H41 L L D G N R W L N E S A T A L V M Q L L61 T T G V I L I V T N G T N S R I V V W N81 E D L F F I Y I L P P L I F N V G F Q V101 K R K Q W F R N F I Q I I L F S A I S T121 L I G F V A I S L S A C G L F K K I D V141 G P I E L G K Y V A I T A L F G A T E T161 L C N L Q V L N Q H E T P V L Y S I V W181 S E G L V N E A T T V L L F N V I D N I201 H I D N F E A I V V L Q F V S R F I Y V221 F W T S N I L T V A G G L A S A Y V I D241 E L P F A D H N T D I K V S V M I A M A261 Y A S Y M A S M L I D L Y G I L D V F W281 P G I V C S H Y S W H Q V T E G F K V T301 N K H S F V T L G F I I E L F L W L Y I321 N N D I L D L E D W R I A T Q S P K R P341 I L L T A F I L T L V M I G R V A F I F361 P L N F A S T L Q K R D A D P R I N F E381 T Q L I L W F A S L I R G A I S V A V L401 Y S K F N A T G H S E I R L N V I M L T421 S T L I V I L F G T M A F N L V T R P V441 A S I L L P P D T G L S T G S L V S Q Q461 T M L D P I L T G M I G S E F D V G T I481 S S P Q Y T L Q F L L G A P A R T V H K501 V W D K W D E R F M H P V F G C K G F A521 P F L P G T P A E R T V P K S H V G N V541 T D A Y G S I D L A F L *
Claims (5)
1、一种用耐盐基因MGX4培育耐盐植物的方法包括：耐盐基因MGX4用该基因的编码序列与强力组成型表达启动子35S融合，拼建成植物表达载体pHXZ，将其导入农杆菌LBA4404中，感染植物子叶或植物外植体，共培养后，再转移到再生培养基上培养，将再生的转基因幼苗切下，转移到生根培养基上诱导生根，有根幼苗转移到土壤栽培得耐盐植物新品种。
2、根椐权利要求1所述用耐盐基因MGX4培养耐盐植物的方法其特征在于带有耐盐基因MGX4的核苷酸序列为：agctcgattgcgtttggtgatatcacatcgtcgaaaacgattacacctcatcgtgtgata 60
0atgagtctgggtattggagtccttctcaaatccggcggggcgtcggtctcgaaacacgac 120M S L G I G V L L K S G G A S V S K X D 20ctaatcgtctcggtcaacatctggatcgcgctggcatgcagctgcattgtcatcaaccac 180L I V S V N I W I A L A C S C I V I N H 40ttgctggatgggaaccgatggctgaacgagtccgccaccgcgcttgtcatgcaactctta 240L L D G N R W L N E S A T A L V M Q L L 60accacaggcgtcatcctgatcgttactaatgggacaaactcacgcattgttgtgtggaac 300T T G V I L I V T N G T N S R I V V W N 80gaggacctgtttttcatatatatacttccgccgttaatcttcaatgtcgggtttcaagta 360E D L F F I Y I L P P L I F N V G F Q V 100aagagaaagcaatggttccgcaactttatacagattattttgttttccgctattagtact 420K R K Q W F R N F I Q I I L F S A I S T 120ctgattggctttgtagcaatctctctttctgcttgtgggttgttcaagaaaatcgatgtt 480L I G F V A I S L S A C G L F K K I D V 140ggtccaatcgagcttgggaaatatgttgcaattactgctcttttcggggcaacagagact 540G P I E L G K Y V A I T A L F G A T E T 160ctttgcaacttacaggtgcttaaccagcatgaaacacccgtactctatagtatcgtttgg 600L C N L Q V L N Q H E T P V L Y S I V W 180tcggaaggtctagttaatgaagccacaaccgttctactcttcaatgtcattgataacatc 660S E G L V N E A T T V L L F N V I D N I 200cacattgataattttgaagctattgttgtcttgcaattcgtctctcgatttatttacgta 720H I D N F E A I V V L Q F V S R F I Y V 220ttctggaccagcaacatacttactgtagctggtgggttggcaagtgcatacgtaatcgat 780F W T S N I L T V A G G L A S A Y V I D 240gaactcccatttgccgatcataacactgatagaaaggtttctgtaatgatagcaatggca 840E L P F A D H N T D I K V S V M I A M A 260tacgcttcatacatggcgtcaatgctgatagacctgtacggaattcttgatgtcttctgg 900Y A S Y M A S M L T D L Y G I L D V F W 280cctggaatagtatgttcacattactcctggcatcaagtgacagaaggatttaaagttacc 960P G I V C S H Y S W H Q V T E G F K V T 300aacaagcattcatttgtaactttaggattcattatcgaactattcctctggctctatgtt 1020N K H S F V T L G F I I E L F L W L Y I 320aacatggatatattggacctagaggactggagattagctagtcagagtcctaagagacca 1080N N D I L D L E D W R I A T Q S P K R P 340attctgttaactgcatttattttgacattggttatgattggaagagtcgcatttatattc 1140I L L T A F I L T L V M I G R V A F I F 360cctttgaatttcgcatccaccctacaaaaaagggacgccgatccaagaatcaacttcgaa 1200P L N F A S T L Q K R D A D P R I N F E 380acacaactaatcttatggttcgctagtctcatcagaggagcaatttcagttgcggttctt 1260T Q L I L W F A S L I R G A I S V A V L 400tataccaagtttaacgcaactggtcactctgaaatccgactcaatgtcatcatgttaacc 1320Y S K F N A T G H S E I R L N V I M L T 420agcacacttattgttattctattcggcacaatggctttcaacctggtgacgcgcccggta 1380S T L I V I L F G T M A F N L V T R P V 440gcaagtatcctcctcccaccagacactggactgtcaacgggttctctggtctcacaacag 1440A S I L L P P D T G L S T G S L V S Q Q 460actatgctggacccaatccttactggcatgatcgggtctgagtttgatgtagggacgatc 1500T M L D P I L T G M I G S E F D V G T I 480acctcccctcaatacaccctccagttccttctcggcgcgccagctcgcaccgtccataaa 1560S S P Q Y T L Q F L L G A P A R T V H K 500gtttgggacaagtgggacgagcggttcatgcacccggtgttcggggggaaaggtttcgcc 1620V W D K W D E R F M H P V F G C K G F A 520ccctttctccctggtacgccggcggagaggactgtccctaaatctcacgtgggcaacgtg 1680P F L P G T P A E R T V P K S H V G N V 540Acggacgcttatggcagtatcgacctagctttcctctgattcctggataaataatgttca 1740T D A Y G S I D L A F L * 552
3、根椐权利要求1所述用耐盐基因MGX4培养耐盐植物的方法其特征在于耐盐基因MGX4的编码序列与强立组成型表达启动子35S融合，用限制性内切酶Sstl消化后，用T4DNA聚合酶切成平头，再用内切酶SalI切割，将载体上原有的GUS基因切去，将载体纯化回收；MGX4基因用Sall消化后，再用Sma I酶切，然后由T4DNA连接酶，同回收的载体连接得pHXZ载体。
4、根椐权利要求1所述用耐盐基因MGX4培养耐盐植物的方法其特征在于带有耐盐基因MGX4的pHXZ载体通过将耐盐基因导入农杆菌中，用含有pHXZ的农杆菌培养液感染萌发6-10天的植物外植体，在共生培养基上培养1-2天后，转移到再生培养基上，约培养2-4周后，将再生的转基因幼苗切下，转移到生根培养基上诱导生根；约二周后，再将已生根的幼苗转移到土壤中培养，培育出耐盐植物。
5、根椐权利要求1所述用耐盐基因MGX4培养耐盐植物的方法其特征在于通过该方法培育出的耐盐植物如：西红柿、油菜、烟草、苗木和草籽等。
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|---|---|---|---|
| CN 02111229 CN1448511A (zh) | 2002-04-02 | 2002-04-02 | 耐盐基因mgx4及它的耐盐抗旱植物品种的培育方法 |
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| CN (1) | CN1448511A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100334211C (zh) * | 2005-07-12 | 2007-08-29 | 中国科学技术大学 | 来源于盐芥的一个耐盐、抗旱基因及其编码蛋白与应用 |
| CN100339480C (zh) * | 2005-07-12 | 2007-09-26 | 中国科学技术大学 | 来自盐芥的一个耐盐、抗旱基因及其编码蛋白与应用 |
| CN102071203B (zh) * | 2009-11-25 | 2012-07-04 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 一种诱导型启动子 |
| CN102070705B (zh) * | 2009-11-25 | 2013-08-21 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 植物耐逆性相关蛋白TaFbox2及其编码基因与应用 |
-
2002
- 2002-04-02 CN CN 02111229 patent/CN1448511A/zh active Pending
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