CN1425919A - 一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片及其制备方法 - Google Patents

一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片及其制备方法 Download PDF

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本发明公开了一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片及其制备方法，免疫芯片包括载玻片，所述载玻片具有经过醛基化试剂硅烷处理后，并经过与双功能交联试剂戊二醛交联的表面，所述表面与抗体分子通过共价键固定连接，所述的抗体分子是葡萄球菌肠毒素A型抗体、葡萄球菌肠毒素B型抗体、葡萄球菌肠毒素C型抗体和罂粟碱抗体中的至少一种，它可以简便、有效地检测食品中葡萄球菌肠毒素和罂粟碱，并且节省检测成本，大大改善现有的检测技术的前处理过程繁琐和不能进行高通量检测的不足。

Description

一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片及其制备方法
                                 技术领域
本发明涉及一种免疫芯片及其制备方法，特别是涉及一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片及其制备方法。
                                 背景技术
生物免疫芯片是指包被在固相载体上的高密度抗原或抗体微点阵，是继基因芯片之后提出的一种新型的生物芯片。免疫芯片是由固定于不同种类支持介质上的抗原或抗体微阵列组成，阵列中固定分子的位置及组成是已知的，用标记物(荧光物质、酶或化学发光物质等)标记的抗体或抗原与芯片上的识别分子进行反应，然后通过特定的扫描装置进行检测，结果由计算机分析处理。与传统的用于食品中污染物检测技术相比，免疫芯片有许多优点。传统的检测方法一次只能检测一种污染物，而免疫芯片可以同时检测多种污染物，每次检测仅需要少量的试剂和样品。如能将此项技术应用于食品卫生检测中，将会使卫生监督工作水平得到明显的提高。
我国每年都有许多食物中毒事件发生，造成很大的经济损失和不良的社会影响，给人民群众生活带来了极大的危害，如何更好的对这些事件进行预防，是食品检测研究中亟需解决的问题。
在食品的生产、加工及储存过程中，有许多有害物质可以造成食品的污染，如不规范的农药使用，造成食品中的高农药残留；食品与有毒的化学性物质接触，造成食品的化学性污染：食品中存在的微生物及其代谢产生的各种毒素，造成食品的生物性污染。特别值得一提的是，有少数人为了单纯追求一时的经济利益，向食品中添加有毒有害物质，严重的威胁人民群众的生命健康，如：一些不法餐饮业主在食品中添加罂粟壳，严重损害消费者的利益。现在用于食品检测的方法有很多，如高效液相色谱法、气相色谱法、化学分析法、免疫荧光法、酶联免疫法等，这些方法具有灵敏度高、特异性强等优点，在食品检测中发挥了重要作用。然而，这些技术一次只能检测一种或一类污染物，而食品中的污染物都是未知的，有时是多种污染物同时存在，以上方法将很难满足多元检测的需要。
                                 发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片。
本发明的另一个目的是提供一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片的制备方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片，包括载玻片，所述载玻片具有经过醛基化试剂硅烷处理后，并经过与双功能交联试剂戊二醛交联的表面，所述表面与抗体分子通过共价键固定连接，所述的抗体分子是葡萄球菌肠毒素A型抗体、葡萄球菌肠毒素B型抗体、葡萄球菌肠毒素C型抗体和罂粟碱抗体中的至少一种。
一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片的制备方法，它包括如下步骤：
(1)准备一个具有经过醛基化试剂硅烷醛基化后，并经过与双功能交联试剂戊二醛交联的表面的载玻片；
(2)制备葡萄球菌肠毒素A型抗体、葡萄球菌肠毒素B型抗体、葡萄球菌肠毒素C型抗体和罂粟碱抗体；
(3)抗体的固定，它包括：
①用pH5.7～8.0的磷酸盐缓冲液稀释葡萄球菌肠毒素A型抗体，使浓度为0.01～2.0mg/ml稀释葡萄球菌肠毒素B型抗体，使浓度为0.05～2.0mg/ml，稀释葡萄球菌肠毒素C型抗体，使浓度为0.01～1.0mg/ml，稀释罂粟碱抗体使其浓度为0.5～2.0mg/ml；
②用点样仪将四种抗体稀释液滴加到载玻片表面的不同区域，36～38℃，饱和湿度放置0.5～4小时，用pH5.7～8.0的磷酸盐缓冲液冲洗，再用蒸馏水冲洗，晾干；
③向载玻片上的含有葡萄球菌肠毒素A型抗体、葡萄球菌肠毒素B型抗体、葡萄球菌肠毒素C型抗体的区域，滴加20μl体积百分比为24～28％的小牛血清进行封闭，在载玻片上的含有罂粟碱抗体的区域，滴加20μl体积百分比为2～3％的卵清蛋白进行封闭，36～38℃，饱和湿度放置0.5～4小时，用蒸馏水冲洗，晾干，4℃保存，得到了一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片。
所述的磷酸盐缓冲液的pH以选7.2为宜。
所述的葡萄球菌肠毒素A型抗体的浓度最好为1.0mg/ml。
所述的葡萄球菌肠毒素B型抗体的浓度最好为0.5mg/ml。
所述的葡萄球菌肠毒素C型抗体的浓度最好为0.5mg/ml。
所述的罂粟碱抗体的浓度最好为1mg/ml。
所述的将四种抗体稀释液滴加到载玻片表面的不同区域的放置温度为37℃，放置时间为0.5小时。
所述的小牛血清的体积百分比为25％，卵清蛋白的体积百分比为2％，用小牛血清、卵清蛋白封闭的时间为0.5小时。
本发明提供的一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片，它简便、有效地检测食品中葡萄球菌肠毒素和罂粟碱，并且节省检测成本，它大大改善了现有的检测技术的前处理过程繁琐和不能进行高通量检测的不足。
                                 具体实施方式
一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片，包括载玻片，所述载玻片为玻璃载玻片，具有经过醛基化试剂硅烷处理后使玻璃片表面氨基化，氨基经过与双功能交联试剂戊二醛交联的表面，于所述表面与抗体分子通过共价键固定连接，所述的抗体分子是葡萄球菌肠毒素A型抗体、葡萄球菌肠毒素B型抗体、葡萄球菌肠毒素C型抗体和罂粟碱抗体。
一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片的制备方法，实施例如下：
实施例1：
1.准备一个具有经过醛基化试剂硅烷醛基化后，并经过与双功能交联试剂戊二醛交联的表面的载玻片；
2.提取葡萄球菌肠毒素A型抗体、葡萄球菌肠毒素B型抗体、葡萄球菌肠毒素C型抗体和罂粟碱抗体；
3.抗体的固定，它包括：
①用pH7.2的磷酸盐缓冲液稀释葡萄球菌肠毒素A型抗体，使浓度为1.0mg/ml稀释葡萄球菌肠毒素B型抗体，使浓度为0.5mg/ml，稀释葡萄球菌肠毒素C型抗体，使浓度为0.5mg/ml，稀释罂粟碱抗体使其浓度为1mg/ml；
②用点样仪将四种抗体稀释液滴加到载玻片表面的不同区域，37℃，饱和湿度放置0.5小时，用pH7.2的磷酸盐缓冲液冲洗，再用蒸馏水冲洗，晾干；
③向载玻片上的含有葡萄球菌肠毒素A型抗体、葡萄球菌肠毒素B型抗体、葡萄球菌肠毒素C型抗体的区域，滴加20μl体积百分比为25％的小牛血清进行封闭，在载玻片上的含有罂粟碱抗体的区域，滴加20μ1体积百分比为2％的卵清蛋白进行封闭，37℃，饱和湿度放置0.5小时，用蒸馏水冲洗，晾干，4℃保存，得到了一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片。
实施例2：
步骤1和步骤2同实施例1。
3.抗体的固定，它包括：
①用pH5.7的磷酸盐缓冲液稀释葡萄球菌肠毒素A型抗体，使浓度为0.01mg/ml稀释葡萄球菌肠毒素B型抗体，使浓度为0.05mg/ml，稀释葡萄球菌肠毒素C型抗体，使浓度为0.05mg/ml，稀释罂粟碱抗体使其浓度为0.5mg/ml；
②用点样仪将四种抗体稀释液滴加到载玻片表面的不同区域，36℃，饱和湿度放置1小时，用pH5.7的磷酸盐缓冲液冲洗，再用蒸馏水冲洗，晾干；
③向载玻片上的含有葡萄球菌肠毒素A型抗体、葡萄球菌肠毒素B型抗体、葡萄球菌肠毒素C型抗体的区域，滴加20μl体积百分比为24％的小牛血清进行封闭，在载玻片上的含有罂粟碱抗体的区域，滴加20μl体积百分比为2％的卵清蛋白进行封闭，36℃，饱和湿度放置1小时，用蒸馏水冲洗，晾干，4℃保存，得到了一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片。
实施例3：
步骤1和步骤2同实施例1。
3.抗体的固定，它包括：
①用pH8.0的磷酸盐缓冲液稀释葡萄球菌肠毒素A型抗体，使浓度为2.0mg/ml稀释葡萄球菌肠毒素B型抗体，使浓度为2.0mg/ml，稀释葡萄球菌肠毒素C型抗体，使浓度为1.0mg/ml，稀释罂粟碱抗体使其浓度为2mg/ml；
②用点样仪将四种抗体稀释液滴加到载玻片表面的不同区域，38℃，饱和湿度放置4小时，用pH8.0的磷酸盐缓冲液冲洗，再用蒸馏水冲洗，晾干；
③向载玻片上的含有葡萄球菌肠毒素A型抗体、葡萄球菌肠毒素B型抗体、葡萄球菌肠毒素C型抗体的区域，滴加20μl体积百分比为28％的小牛血清进行封闭，在载玻片上的含有罂粟碱抗体的区域，滴加20μl体积百分比为3％的卵清蛋白进行封闭，
38℃，饱和湿度放置4小时，用蒸馏水冲洗，晾干，4℃保存，得到了一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片。
实施例4：
步骤1和步骤2同实施例1。
3.抗体的固定，它包括：
①用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释葡萄球菌肠毒素A型抗体，使浓度为0.5mg/ml稀释葡萄球菌肠毒素B型抗体，使浓度为1.0mg/ml，稀释葡萄球菌肠毒素C型抗体，使浓度为0.1mg/ml，稀释罂粟碱抗体使其浓度为1mg/ml；
②用点样仪将四种抗体稀释液滴加到载玻片表面的不同区域，37℃，饱和湿度放置2小时，用pH7.4的磷酸盐缓冲液冲洗，再用蒸馏水冲洗，晾干；
③向载玻片上的含有葡萄球菌肠毒素A型抗体、葡萄球菌肠毒素B型抗体、葡萄球菌肠毒素C型抗体的区域，滴加20μl体积百分比为25％的小牛血清进行封闭，在载玻片上的含有罂粟碱抗体的区域，滴加20μl体积百分比为2％的卵清蛋白进行封闭，37℃，饱和湿度放置2小时，用蒸馏水冲洗，晾干，4℃保存，得到了一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片。
实施例5：
步骤1和步骤2同实施例1。
3.抗体的固定，它包括：
①用pH6.0的磷酸盐缓冲液稀释葡萄球菌肠毒素A型抗体，使浓度为0.1mg/ml稀释葡萄球菌肠毒素B型抗体，使浓度为0.1g/ml，稀释葡萄球菌肠毒素C型抗体，使浓度为0.01mg/ml，稀释罂粟碱抗体使其浓度为1mg/ml；
②用点样仪将四种抗体稀释液滴加到载玻片表面的不同区域，37℃，饱和湿度放置1小时，用pH6.0的磷酸盐缓冲液冲洗，再用蒸馏水冲洗，晾干；
③向载玻片上的含有葡萄球菌肠毒素A型抗体、葡萄球菌肠毒素B型抗体、葡萄球菌肠毒素C型抗体的区域，滴加20μl体积百分比为25％的小牛血清进行封闭，在载玻片上的含有罂粟碱抗体的区域，滴加20μl体积百分比为2％的卵清蛋白进行封闭，37℃，饱和湿度放置1小时，用蒸馏水冲洗，晾干，4℃保存，得到了一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片。
检测葡萄球菌肠毒素采用的是夹心法，检测罂粟碱时采用的是竞争法。
用本发明的反应或抗原竞争反应完毕后，用激光共聚焦扫描仪ScanArray3000检测，扫描分辨率为10μm。激发和检测波长依荧光标记物而定。Cy3，Cy5激发波长为530nm，检测波长分别为585nm，650nm。荧光信号定量采用Imagene3.0(Biodiscovery，Inc)软件进行分析。

Claims (9)

1.一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片，包括载玻片，所述载玻片具有经过醛基化试剂硅烷处理后，并经过与双功能交联试剂戊二醛交联的表面，其特征在于所述表面与抗体分子通过共价键固定连接，所述的抗体分子是葡萄球菌肠毒素A型抗体、葡萄球菌肠毒素B型抗体、葡萄球菌肠毒素C型抗体和罂粟碱抗体中的至少一种。
2.一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片的制备方法，其特征是它包括如下步骤：
(1)准备一个具有经过醛基化试剂硅烷醛基化后，并经过与双功能交联试剂戊二醛交联的表面的载玻片；
(2)制备葡萄球菌肠毒素A型抗体、葡萄球菌肠毒素B型抗体、葡萄球菌肠毒素C型抗体和罂粟碱抗体；
(3)抗体的固定，它包括：
①用pH5.7～8.0的磷酸盐缓冲液稀释葡萄球菌肠毒素A型抗体，使浓度为0.01～2.0mg/ml稀释葡萄球菌肠毒素B型抗体，使浓度为0.05～2.0mg/ml，稀释葡萄球菌肠毒素C型抗体，使浓度为0.01～1.0mg/ml，稀释罂粟碱抗体使其浓度为0.5～2.0mg/ml；
②用点样仪将四种抗体稀释液滴加到载玻片表面的不同区域，36～38℃，饱和湿度放置0.5～4小时，用pH5.7～8.0的磷酸盐缓冲液冲洗，再用蒸馏水冲洗，晾干；
③向载玻片上的含有葡萄球菌肠毒素A型抗体、葡萄球菌肠毒素B型抗体、葡萄球菌肠毒素C型抗体的区域，滴加20μl体积百分比为24～28％的小牛血清进行封闭，在载玻片上的含有罂粟碱抗体的区域，滴加20μl体积百分比为2～3％的卵清蛋白进行封闭，36～38℃，饱和湿度放置0.5～4小时，用蒸馏水冲洗，晾干，4℃保存，得到了一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片。
3.根据权利要求2所述的一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片的制备方法，其特征在于所述的磷酸盐缓冲液的pH为7.2。
4.根据权利要求2所述的一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片的制备方法，其特征在于所述的葡萄球菌肠毒素A型抗体的浓度为1.0mg/ml。
5.根据权利要求2所述的一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片的制备方法，其特征在于所述的葡萄球菌肠毒素B型抗体的浓度为0.5mg/ml。
6.根据权利要求2所述的一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片的制备方法，其特征在于所述的葡萄球菌肠毒素C型抗体的浓度为0.5mg/ml。
7.根据权利要求2所述的一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片的制备方法，其特征在于所述的罂粟碱抗体的浓度为1mg/ml。
8.根据权利要求2所述的一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片的制备方法，其特征在于所述的将四种抗体稀释液滴加到载玻片表面的不同区域的放置温度为37℃，放置时间为0.5小时。
9.根据权利要求2所述的一种检测葡萄球菌肠毒素和罂粟碱的免疫芯片的制备方法，其特征在于所述的小牛血清的体积百分比为25％，卵清蛋白的体积百分比为2％，用小牛血清、卵清蛋白封闭的时间为0.5小时。
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