CN1407052A

CN1407052A - 新型稀土荧光标记物及其应用

Info

Publication number: CN1407052A
Application number: CN 01128075
Authority: CN
Inventors: 袁景利; 谭明乾; 王桂兰
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2001-08-22
Filing date: 2001-08-22
Publication date: 2003-04-02
Anticipated expiration: 2021-08-22
Also published as: CN1181156C

Abstract

本发明涉及一种新型稀土荧光标记物及其应用。新型稀土荧光标记物是稀土离子Eu³⁺、Sm³⁺、Gd³⁺、Tb³⁺、Dy³⁺与含有2，2’：6’，2”－联三吡啶骨架结构或2，6－二吡唑基吡啶骨架结构类配位体的荧光配合物。该类配合物可通过其含有的功能性基团与蛋白质、氨基酸、多肽、核酸、核苷酸、有机化合物等物质共价结合而标记这些物质，进而用于这些物质的荧光测定。

Description

新型稀土荧光标记物及其应用

技术领域

本发明涉及微量生理活性物质的测定技术，具体地说是一种新型稀土荧光标记物及其应用。

背景技术

作为生体试料(细胞组织、血液、尿等)中微量生理活性物质的测定方法，免疫测定法、DNA杂交测定法等已广泛应用于各种临床测定中。在这些测定中均需使用某种标记物来标记抗体、抗原、核苷酸、核酸等物质。目前作为标记物使用的物质包括放射性元素、酶、荧光化合物、化学发光化合物等。它们的不足之处在于：1)使用放射性标记物的方法，放射性标记物及其标记产品在储藏、运输、使用、废液处理等方面存在许多的不便和麻烦，并可导致环境污染，而且放射性标记物的自身衰减问题，导致其可保存时间较短。2)使用酶标记物的方法，酶标记物的分子量太大，其活性极易受到温度、保存条件、酸度、杂离子、防腐剂等的影响，导致该方法再现性较差。3)使用有机荧光标记物的测定方法在用于生体组织、血清等样品测定时，由于激发光的散乱光和样品产生的强本底荧光的影响，使该方法的灵敏度较低，只适用于高浓度物质的测定。

近年来稀土荧光配合物作为标记物的时间分辨荧光测定法已广泛应用于各种测定中。稀土荧光配合物具有荧光寿命极长、Stokes位移大、荧光发光峰尖锐等特点，通过使用时间分辨荧光测定法，可非常有效地消除激发光的散乱光和样品产生的本底荧光对荧光测定的影响，从而极大地提高测定灵敏度。目前的稀土荧光标记物及时间分辨荧光测定法包括：

(1)芬兰Wallac公司开发的溶解增强时间分辨荧光测定法(简称DELFIA测定法)，文献1：E.Soini and T.Lovgren，CRC.Crit.Rev.Anal.Chem.，1987，18，105-154.文献2：E.P.Diamandis and T.K.Christopoulos，Anal.Chem.，1990，62，1149A-1157A.文献3：I.Hemmila，J.Alloys Compd.，1995，225，480-485。DELFIA测定法使用三价铕与N¹-(p-异硫腈基苯基)-二乙基三胺四乙酸的配合物作为标记物来标识抗体、抗原等物质，当免疫反应结束后，由于该标记物是非荧光性铕配合物，所以在进行时间分辨荧光测定之前，必须要在反应体系中加入弱酸性的含有β-二酮类配位体、三辛基氧化膦及表面活性剂的所谓荧光增强溶液，使铕离子转化为强荧光性配合物后才能进行测定。DELFIA测定法的灵敏度较高，其不足之处在于：该法的荧光测定的溶液中含有大过量的β-二酮类配位体及三辛基氧化膦，极易受到测定环境、测定样品及测定用溶液等中的金属离子的污染，对测定操作环境及所用试剂要求极其严格；而且该体系只能进行液相荧光测定，其应用范围受到很大限制。

(2)加拿大的Diamandis等人开发的FIAgen测定法，文献4：E.P.Diamandis，Clin.Biochem.，1988，21，139-150.文献5：E.F.G.Dickson，A.Pollakand E.P.Diamandis，Pharmacol.Ther.，1995，66，207-235。该测定法使用荧光性铕配合物4，7-二(氯磺酰基苯基)-1，10-啡罗啉-2，9-二羧酸(简称BCPDA)与Eu³⁺的配合物作为标记物来标识抗体、抗原等物质，当免疫反应结束后不需加入荧光增强溶液即可直接对免疫复合物进行时间分辨荧光测定。该法的缺点是BCPDA的铕配合物荧光较弱，测定灵敏度较低。

(3)法国的Mathis等人开发的TRACE测定法，文献6：G.Mathis，Clin.Chem.，1995，41，1391-1397.文献7：G.Mathis，J.Clin.Ligand Assay，1997，20，141-147。该法是同时使用三(联二吡啶)窝穴体(简称TBP)与Eu³⁺的荧光配合物和蓝藻蛋白(allophycocyanin)作为荧光标记物的均相时间分辨荧光测定法。其缺点是测定灵敏度较低并且试剂价格昂贵。

(4)用氯磺化β-二酮与铕的配合物作为标记物的时间分辨荧光测定法，文献8：J.Yuan，K.Matsumoto and H.Kimura，Anal.Chem，1998，70，596-601.文献9：松本和子，袁景利，日本公开特许公报，1997，特开平9-241233.文献10：K.Matsumoto and J.Yuan，United States Patent，1999，Patent number5859297.文献11：J.Yuan and K.Matsumoto，Bunseki Kagaku，1999，48，1077-1083。该法的测定灵敏度高、不需使用荧光增强溶液，其缺点是标记物水溶性差，不适用于小分子物质的标记。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏度高、适用范围广的新型稀土荧光标记物及其应用。

本发明技术方案是：是以稀土离子与含有2，2’：6’，2”-联三吡啶骨架结构或2，6-二吡唑基吡啶骨架结构类配位体形成的荧光配合物，其所述配位体结构式为：

当R₁＝NH₂，NCS，SO₂Cl或时R₂＝OH当R₁＝H时或当骨架结构下部为冠醚结构时，R₁＝NH₂，NCS，SO₂Cl 或

本发明的荧光配合物能广泛用于制备标记蛋白质、氨基酸、多肽、核酸、核苷酸及其它标记有机化合物；具体制备方法如下：

1)将待标记物溶于pH值9.1的0.1mol/L碳酸氢钠缓冲溶液中后，加入荧光标记物的配位体，室温下搅拌反应3小时后；

2)通过透析或柱层析方法除去反应液中的未反应的标记物；

3)收集已标记的溶液，加入稀土离子溶液(标记物∶稀土离子＝1∶1～1.5)后即制得所需的标记产物；

制得的标记产物低温下保存；当标记产物是标记抗体等蛋白质时，应在溶液中加入防腐剂(如NaN₃)，和蛋白质活性稳定剂(如BSA)，然后低温下保存；

本发明的荧光配合物可在时间分辨荧光测定法中广为应用；即利用所述新型稀土荧光标记物在时间分辨荧光测定法中标记待测物，通过测定荧光标记物的荧光强度或相对荧光强度比值来测定待测物的浓度；首先利用所述新型稀土荧光标记物标记一种反应原料(如抗体或抗原)，在标记反应原料与待测物反应之后，分离除去未反应的标记反应原料，然后通过时间分辨荧光测定法测定反应生成物的荧光强度来测定待测物的浓度，或首先利用所述新型稀土荧光标记物标记样品中的待测物(如氨基酸，多肽，药物等)，(利用某种分离方法如液相色谱，电泳等)将标记待测物与未反应的稀土荧光标记物分离后，通过时间分辨荧光测定法测定标记待测物的荧光强度来测定待测物的浓度；

其中所述的时间分辨荧光测定法包括时间分辨荧光免疫测定法、时间分辨荧光免疫组织化学测定法、时间分辨荧光显微镜测定法、时间分辨荧光细胞活性测定法、时间分辨荧光液相色谱测定法和时间分辨荧光毛细管电泳测定法；

本发明的荧光配合物也可在核酸(DNA和RNA)荧光测定法中应用；即利用所述新型稀土荧光标记物在核酸(DNA和RNA)荧光测定法中标记待测物，用时间分辨荧光仪测定其浓度；即利用所述新型稀土荧光标记物标记核酸包括核酸探针，核苷酸，寡核苷酸，在标记核酸与待测核酸(包括DNA和RNA)反应之后，分离除去未反应的标记核酸，然后通过时间分辨荧光测定法测定反应生成物的荧光强度来测定待测核酸的浓度；

其中所述的核酸(DNA和RNA)荧光测定法为核酸杂交测定法、荧光PCR测定法、基因芯片测定法或分子信标测定法。

本发明具有如下优点：

1.本发明的新型稀土荧光标记物适用范围广。水溶性好；该类配合物可通过其含有的功能性基团与蛋白质、氨基酸、多肽、核酸、核苷酸、有机化合物等物质形成共价键结合而标记这些物质，进而用于这些物质的时间分辨荧光测定；并且该类配合物还可于核酸(DNA和RNA)荧光测定法中。

2.本发明的新型稀土荧光标记物使用简便。制得的新型配位体标记物不用进一步精制，可直接用于蛋白质等的标识。

3.本发明的新型稀土荧光标记物在固态或水溶态中均十分稳定。其荧光性质不受缓冲溶液组成等因素的影响。

4.本发明的新型稀土荧光标记物的荧光量子收率大。配合物的最大激发光波长在紫外区，其发光峰形状均为稀土离子配合物特征的尖锐形发光峰。

附图说明

图1是TTTA-Eu³⁺在pH值9.1的0.05mol/L硼酸缓冲溶液中的荧光光谱，其浓度是1.0×10^-6mol/L。

图2是BTTA-Eu³⁺在pH值9.1的0.05mol/L硼酸缓冲溶液中的荧光光谱，其浓度是1.0×10^-6mol/L。

图3是TTTA-Eu³⁺和BTTA-Eu³⁺溶液的时间分辨荧光测定结果。其中溶剂为pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液。

图4是使用TTTA-Eu³⁺标记链亲和素的时间分辨荧光免疫测定法测定人血清中TSH的工作曲线。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

标记物4’-(2-噻吩基)-2，2’：6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸单N-羟基琥珀酰胺酯(简称NHS-TTTA)的合成。标记物NHS-TTTA由下面所示合成路线合成，

具体操作过程如下：

(1)4’-(2-噻吩基)-2，2’：6’，2”-联三吡啶(化合物1)的合成

在500ml干燥甲醇中加入23.1克醋酸铵，16.3克N-[2-(pyrid-2’-yl)-2-oxoethyl]pyridinium iodide(N-[2-(2′-吡啶基)-2-氧代乙基]吡啶碘化物，50mmol)，和10.76克(E)-3-(2”-thenyl)-1-(pyrid-2’-yl)prop-2-enone((E)-3-(2″-噻吩基)-1-(2’-吡啶基)-2-丙烯酮，50mmol)，溶液搅拌下回馏24小时。反应液冷至室温后，在-15℃放置1小时，过滤收集沉淀，用冷甲醇(-15℃左右)充分洗涤后，产品用乙腈重结晶。得目标化合物6.91克(43.8％收率)。¹H NMR(CDCl₃即氘代氯仿)测定结果：8.74(d，J，7.9Hz，2H)，8.69(s，2H)，8.64(d，J，7.9Hz，2H)，7.87(t，J，7.9Hz，2H)，7.78(d，J，3.6Hz，1H)，7.44(d，J，5.1Hz，1H)，7.38-7.32(m，2H)，7.19-7.15(m，1H)。

(2)4’-(2-噻吩基)-2，2’：6’，2”-联三吡啶-1，1”-二氧化物(化合物2)的合成

500ml二氯甲烷中加入12.61克化合物1(40mmol)和40克间氯过氧化苯甲酸，室温下搅拌反应20小时后，反应液用200ml的10%碳酸钠洗涤4次。有机相用无水硫酸钠干燥后，蒸馏除去二氯甲烷。将产物溶于300ml甲醇中，过滤除去微量的不溶物，滤液减压蒸馏除去甲醇后，产品用乙腈充分洗涤并真空干燥。得目标化合物8.53克(61.4％收率)。¹HNMR(CDCl₃)测定结果：9.23(s，2H)，8.35(d，J，6.6Hz，2H)，8.23(d，J，7.9Hz，2H)，7.70(d，J，3.6Hz，1H)，7.45-7.28(m，5H)，7.16-7.13(m，1H)。

(3)6，6”-二腈基-4’-(2-噻吩基)-2，2’：6’，2”-联三吡啶(化合物3)的合成

在300ml二氯甲烷中加入8.69克化合物2(25mmol)和24.80克(CH₃)₃SiCN(250mmol)，室温搅拌20分钟后，搅拌下缓慢(约20分钟)滴入14.05克苯甲酰氯(100mmol)。反应液室温下搅拌20小时后，减压蒸发溶剂至溶液体积为150ml，加入10％碳酸钾水溶液600ml，继续室温下搅拌1小时。过滤收集沉淀，用水充分洗涤后，再用冷二氯甲烷(-15℃左右)洗涤，然后真空干燥。得目标化合物9.0克(98.5％收率)。¹H NMR(DMSO-d₆)测定结果：8.95(d，J，7.9Hz，2H)，8.62(s，2H)，8.32-8.26(m，2H)，8.19(d，J，7.6Hz，2H)，8.07(d，J，3.6Hz，1H)，7.86(d，J，5.1Hz，1H)，7.28-7.31(m，1H)。

(4)4’-(2-噻吩基)-2，2’：6’，2”-联三吡啶-6，6”-二羧酸甲酯(化合物4)的合成

将4.40克化合物3加入到45ml硫酸-45ml醋酸-12ml水的溶液中。75-80℃下搅拌反应48小时后，反应液加入到300ml冰水中，过滤收集沉淀，用水充分洗涤后，再用无水乙醇洗涤，真空干燥(得4.85克水解产物)。

在400ml干燥甲醇中，外部用冰水冷却下加入8克氯化亚砜，搅拌15分钟后，加入4.85克上述水解产物，反应液搅拌回馏8小时后，室温下继续搅拌16小时。蒸去溶剂后，生成物用氯仿反复抽提。氯仿溶液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤后，用无水硫酸钠干燥。蒸去溶剂后，生成物用硅胶柱层析分离，用二氯甲烷-甲醇(w/w，99∶1)展开，收集最先洗出的第一个组分。蒸去溶剂后，产品用甲苯重结晶，真空干燥，得目标化合物2.50克(48.1％收率)。元素分析结果(％)，按C₂₃H₁₇N₃O₄S计算值：C＝64.03，H＝3.97，N＝9.74；实测值：C＝63.76，H＝3.83，N＝9.52。¹H NMR(CDCl₃)测定结果：8.16(d，J，7.8Hz，2H)，8.78(s，2H)，8.20(d，J，7.6Hz，2H)，8.03(t，J，7.8Hz，2H)，7.82(d，J，3.6Hz，1H)，7.49(d，J，5.1Hz，1H)，7.22-7.19(m，1H)，4.08(s，6H)。

(5)6，6”-二羟甲基-4’-(2-噻吩基)-2，2’：6’，2”-联三吡啶(化合物5)的合成

在200ml干燥乙醇中加入2.89克化合物4(6.7mmol)和1.05克NaBH₄，室温下搅拌3小时后，搅拌回馏1小时。减压蒸去乙醇，产物中加入100ml饱和碳酸氢钠水溶液，搅拌下加热至沸腾。冷却后过滤收集不溶物，用水洗涤后真空干燥。将产品加热溶于200ml四氢呋喃中，过滤除去不溶物，减压蒸去四氢呋喃后，产品用乙腈充分洗涤，真空干燥。得目标化合物1.82克(72.2％收率)。¹H NMR(DMSO-d₆)测定结果：8.63(s，2H)，8.50(d，J，7.3Hz，2H)，8.03(t，J，7.3Hz，2H)，7.93(d，J，3.6Hz，1H)，7.82(d，J，5.1Hz，1H)，7.61(d，J，7.1Hz，2H)，7.28-7.31(m，1H)，4.74(s，4H)。

(6)6，6”-二溴甲基-4’-(2-噻吩基)-2，2’：6’，2”-联三吡啶(化合物6)的合成

在200ml干燥四氢呋喃-30ml干燥N，N-二甲基甲酰胺中加入2.17克化合物5和4.75克三溴化磷，反应液搅拌回馏5小时后，减压蒸去溶剂。将生成物溶入300ml氯仿，氯仿溶液用4×100ml(即四次每次使用100毫升)的10％Na₂CO₃水溶液洗涤4次后，用无水硫酸钠干燥。过滤除去硫酸钠，减压蒸去氯仿溶液，产品用正已烷充分洗涤，真空干燥，得目标化合物2.02克(69.7％收率)。¹H NMR(CDCl₃)测定结果：8.71(s，2H)，8.54(d，J，7.8Hz，2H)，7.87(t，J，7.8Hz，2H)，7.78(d，J，3.6Hz，1H)，7.52(d，J，7.8Hz，2H)，7.48(d，J，5.1Hz，1H)，7.21-7.19(m，1H)，4.70(s，4H)。

(7)4’-(2-噻吩基)-2，2’：6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸四乙酯(化合物7)的合成

在200ml干燥乙腈-50ml干燥四氢呋喃中加入2.04克化合物6(4mmol)，1.53克二乙酸乙酯基胺(8.1mmol)溶于30ml干燥乙腈的溶液和5.52克K₂CO₃(40mmol)，反应液搅拌回馏24小时后，过滤除去不溶物。减压蒸去溶剂后，将生成物溶于200ml氯仿中，氯仿溶液用4×100ml饱和硫酸钠水溶液洗涤后，用无水硫酸钠干燥。过滤后溶液减压蒸去溶剂，用石油醚洗涤后真空干燥。所得油状物用硅胶柱层析分离，用乙酸乙酯-甲醇-四氢呋喃(w/w/w，10∶3∶2)展开，收集最先洗出的第一个组分。蒸去溶剂后，真空干燥。得目标化合物1.95克(67.9％收率)。¹H NMR(CDCl₃)测定结果：8.67(s，2H)，8.51(d，J，7.8Hz，2H)，7.86(t，J，7.8Hz，2H)，7.78(d，J，3.6Hz，1H)，7.63(d，J，7.8Hz，2H)，7.45(d，J，5.1Hz，1H)，7.20-7.17(m，1H)，4.19(q，J，7.3Hz，8H)，3.72(s，8H)，3.46(s，4H)，1.26(t，J，7.3Hz，12H)。

(8)4’-(2-噻吩基)-2，2’：6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸(简称TTTA)的合成

将1.94克化合物7(2.7mmol)加入到120ml乙醇中，然后加入4克氢氧化钾和10ml水，反应液搅拌回馏3小时。减压蒸去溶剂，将生成物溶于150ml水中，过滤除去微量不溶物，向搅拌下的溶液中漫漫滴入的三氟乙酸水溶液至溶液的pH值约为1为止。溶液室温下搅拌3小时后，过滤收集沉淀，用1％的三氟乙酸水溶液充分洗涤，真空干燥。将生成物加入到200ml乙腈中，搅拌回馏2小时，过滤收集沉淀，真空干燥。得目标化合物0.89克(51.4％收率)。元素分析结果(％)，按C₂₉H₃₁N₅O₉S(TTTA·2H₂O)计算值：C＝54.29，H＝4.87，N＝10.91；实测值：C＝54.09，H＝4.57，N＝10.41。¹H NMR(DMSO-d₆)测定结果：8.75(s，2H)，8.59(d，J，7.8Hz，2H)，8.18(t，J，7.8Hz，2H)，8.10(d，J，3.6Hz，1H)，7.87(d，J，5.1Hz，1H)，7.75(d，J，7.8Hz，2H)，7.34-7.31(m，1H)，4.72(s，4H)，4.28(s，8H)。

(9)NHS-TTTA的合成

将TTTA·2H₂O在P₂O₅真空干燥器中充分干燥后，取181.7mg(0.3mmol)溶于5ml干燥N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌下加入34.5mg(0.3mmol)的N-羟基琥珀酰胺(NHS)和61.9mg(0.3mmol)的N，N’-二环己基炭化二亚胺(DCC)，室温下搅拌24小时后，过滤除去不溶物。滤液减压浓缩除去溶剂后，生成物用少量异丙醇洗涤，真空干燥。得目标化合物180mg(85.4％收率)。制得的NHS-TTTA不用进一步精制，可直接用于蛋白质等的标识。

实施例2

标记物N，N，N¹，N¹-[2，6-二(3’-胺甲基-1’-吡唑基)-4-(2”-噻吩基)吡啶]四乙酸单N-羟基琥珀酰胺酯(简称NHS-BTTA)的合成：

标记物NHS-BTTA由下面所示合成路线合成，

具体操作过程如下：

(1)2，6-二溴-4-(2’-噻吩基)吡啶(化合物I)的合成

在250ml乙酸中加入3.25克4-胺基-2，6-二溴吡啶(12.9mmol)和12.9克噻吩，搅拌溶解后，搅拌下滴加入1.93克亚硝酰异戊酯溶于13ml乙酸中的溶液。反应液室温下搅拌24小时后，50℃下继续搅拌反应3小时。减压蒸去溶剂，生成物用40ml的10％碳酸钾中和，用4×60ml的氯仿抽出生成物。氯仿溶液用无水硫酸钠干燥后，减压蒸去溶剂。生成物用硅胶柱层析分离，用二氯甲烷-甲醇(w/w，99∶1)展开，收集最先洗出的第一个组分。蒸去溶剂后，产品用甲醇重结晶两次，真空干燥。得目标化合物1.97克(47.9％收率)。元素分析结果(％)，按C₉H₅NBr₂S计算值：C＝33.88，H＝1.58，N＝4.39；实测值：C＝33.46，H＝1.46，N＝4.23。¹H NMR(CDCl₃)测定结果：7.60(s，2H)，7.50-7.48(m，2H)，7.16-7.13(m，1H)。

(2)2，6-二(3’-羧酸甲酯-1’-吡唑基)-4-(2’-噻吩基)吡啶(化合物II)的合成

在150ml干燥四氢呋喃中加入10.1克3-羧酸甲酯基吡唑(80mmol)，搅拌溶解后加入3.12克小块的金属钾，溶液在60℃下搅拌反应至金属钾全部反应完后，加入6.38克的化合物I(20mmol)。反应液连续搅拌回馏7天后，减压蒸去溶剂，生成物用6×150ml氯仿抽提可溶物。减压蒸去溶剂，产品用硅胶柱层析分离，用二氯甲烷-甲醇(w/w，99∶1)展开，收集最先洗出的第一个组分。蒸去溶剂后，产品用苯重结晶，真空干燥。得目标化合物3.0克(36.7％收率)。元素分析结果(％)，按C₁₉H₁₅N₅O₄S计算值：C＝55.74，H＝3.69，N＝17.10；实测值：C＝55.47，H＝3.62，N＝16.82。¹H NMR(CDCl₃)测定结果：8.60(d，J，2.7Hz，2H)，8.22(s，2H)，7.79(d，J，3.6Hz，1H)，7.53(d，J，5.0Hz，1H)，7.20-7.18(m，1H)，7.03(d，J，2.7Hz，2H)，4.01(s，6H)。

(3)2，6-二(3’-羟甲基-1’-吡唑基)-4-(2’-噻吩基)吡啶(化合物III)的合成

在300ml干燥四氢呋喃中加入1.30克LiAlH₄，然后加入2.72克化合物II(6.64mmol)，反应液室温下搅拌4小时后，慢慢滴入1.1ml水，1.1ml的15％氢氧化钠及4.5ml水。室温下搅拌30分钟后，过滤除去沉淀，用3×100ml四氢呋喃抽提沉淀中的可溶物，合并四氢呋喃溶液。减压蒸去溶剂后，产品用乙腈充分洗涤，真空干燥，得目标化合物1.60克(68.2％收率)。¹H NMR(DMSO-d₆)测定结果：8.88(d，J，2.6Hz，2H)，7.96(d，J，3.6Hz，1H)，7.90(s，2H)，7.85(d，J，5.1Hz，1H)，7.29-7.26(m，1H)，6.60(d，J，2.5Hz，2H)，4.58(s，4H)。

(4)2，6-二(3’-溴甲基-1’-吡唑基)-4-(2’-噻吩基)吡啶(化合物IV)的合成

在200ml干燥四氢呋喃中加入1.59克化合物III(4.50mmol)，搅拌溶解后加入3.65克PBr₃，反应液搅拌回馏4小时后，减压蒸去溶剂。生成物中加入100ml的10％碳酸钠溶液，充分搅拌后用氯仿抽出生成物。氯仿溶液中再加入6克固体的碳酸氢钠，室温下搅拌1小时后，加入无水硫酸钠干燥。过滤后减压蒸馏除去溶剂，产品用正己烷充分洗涤，真空干燥，得目标化合物2.03克(94.1％收率)。¹H NMR(CDCl₃)测定结果：8.50(d，J，2.7Hz，2H)，8.02(s，2H)，7.72(d，J，3.6Hz，1H)，7.50(d，J，5.1Hz，1H)，7.19-7.16(m，1H)，6.56(d，J，2.7Hz，2H)，4.59(s，4H)。

(5)N，N，N¹，N¹-[2，6-二(3’-胺甲基-1’-吡唑基)-4-(2”-噻吩基)吡啶]四乙酸四乙酯(化合物V)的合成

在100ml干燥乙腈-30ml干燥四氢呋喃中加入1.20克化合物IV(2.50mmol)，984mg的二乙酸乙酯基胺(5.2mmol)溶于30ml干燥乙腈的溶液和3.45克K₂CO₃(25mmol)，反应液搅拌回馏24小时后，过滤除去不溶物。减压蒸去溶剂，将生成物溶于200ml氯仿中，氯仿溶液用2×100ml水洗涤后，用无水硫酸钠干燥。过滤后溶液减压蒸去溶剂，真空干燥。所得油状物用硅胶柱层析分离，用乙酸乙酯-二氯甲烷(w/w，100∶10)展开，收集最先洗出的第一个组分。蒸去溶剂后，真空干燥。得目标化合物0.87克(50.0％收率)。¹H NMR(CDCl₃)测定结果：8.51(d，J，2.7Hz，2H)，8.00(s，2H)，7.72(d，J，3.6Hz，1H)，7.49(d，J，5.1Hz，1H)，7.19-7.16(m，1H)，6.56(d，J，2.7Hz，2H)，4.20(q，J，7.2Hz，8H)，4.09(s，4H)，3.66(s，8H)，1.28(t，J，7.2Hz，12H)。

(6)N，N，N¹，N¹-[2，6-二(3’-胺甲基-1’-吡唑基)-4-(2”-噻吩基)吡啶]四乙酸(简称BTTA)的合成

将850mg的化合物V(1.22mmol)加入到60ml乙醇中，然后加入1.8克氢氧化钾和7ml水，反应液搅拌回馏3小时。减压蒸去溶剂，将生成物溶于50ml水中，过滤除去微量不溶物，向搅拌下的溶液中漫漫滴入的盐酸水溶液至溶液的pH值约为1为止。溶液室温下搅拌3小时后，过滤收集沉淀，用100倍稀释的浓度37％的盐酸水溶液充分洗涤，真空干燥。得目标化合物660mg(92.6％收率)。元素分析结果(％)，按C₂₅H₂₇N₇O₉S(BTTA·H₂O)计算值：C＝49.92，H＝4.52，N＝16.29；实测值：C＝50.08，H＝4.38，N＝16.09。¹H NMR(DMSO-d₆)测定结果：8.90(d，J，2.5Hz，2H)，7.98(d，J，3.6Hz，1H)，7.90(s，2H)，7.86(d，J，5.1Hz，1H)，7.30-7.27(m，1H)，6.59(d，J，2.5Hz，2H)，4.00(s，4H)，3.52(s，8H)。

(7)NHS-BTTA的合成

将BTTA·H₂O在P₂O₅真空干燥器中充分干燥后，取175.0mg(0.3mmol)溶于5ml干燥N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌下加入34.5mg(0.3mmol)的N-羟基琥珀酰胺(NHS)和61.9mg(0.3mmol)的N，N’-二环己基炭化二亚胺(DCC)，室温下搅拌24小时后，过滤除去不溶物。滤液减压浓缩除去溶剂后，生成物用少量异丙醇洗涤，真空干燥。得目标化合物172mg(84.2％收率)。制得的NHS-BTTA不用进一步精制，可直接用于蛋白质等的标识。

实施例3

TTTA和BTTA与稀土离子(Eu³⁺和Tb³⁺)配合物荧光性质测定

1.荧光光谱、荧光强度及荧光寿命

在水溶液中TTTA及BTTA与稀土离子混合后可迅速形成稳定的配合物。用pH值9.1的0.05mol/L硼酸缓冲溶液为溶剂测定了TTTA-Eu³⁺、TTTA-Tb³⁺及BTTA-Eu³⁺、BTTA-Tb³⁺在该溶剂中的紫外可见光谱、荧光光谱、摩尔吸光系数(ε)、荧光量子收率(φ)及荧光寿命(τ)。紫外可见光谱测定用仪器为天美UV7500分光光度计。荧光测定用仪器为Perkin Elmer LS 50B荧光分光光度计。量子收率测定使用4’-苯基-2，2’：6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸与Eu³⁺和Tb³⁺的配合物作为标准物测得(其Eu³⁺配合物的ε_335nm＝14300，φ＝0.160，Tb³⁺配合物的ε_337nm＝14000，φ＝0.100)文献12：M.Latva，H.Takalo，V.-M.Mukkala，C.Matachescu，J.C.Rodriguez-Ubis and J.Kankare，J.Lumin.，1997，75，149-169，计算式为φ₁＝I₁ε₂C₂φ₂/I₂ε₁C₁，式中I₂、ε₂、φ₂、C₂为标准物的荧光强度、摩尔吸光系数、量子收率和浓度，I₁、ε₁、φ₁、C₁为待测物的荧光强度、摩尔吸光系数、量子收率和浓度。表1所示为两种配位体及其配合物在pH值9.1的0.05mol/L硼酸缓冲溶液中的吸收及荧光性质。

表1.几种化合物在pH值9.1的0.05mol/L硼酸缓冲溶液中的吸收及荧光性质

化合物	最大吸收波长(nm)	摩尔吸光系数(mol^-1Lcm^-1)	最大荧光发光波长(nm)	荧光量子收率	荧光寿命(ms)
化合物	最大吸收波长(nm)	摩尔吸光系数(mol^-1Lcm^-1)	最大荧光发光波长(nm)	荧光量子收率	荧光寿命(ms)	TTTATTTA-Eu³⁺TTTA-Tb³⁺BTTABTTA-Eu³⁺BTTA-Tb³⁺	291296，336296，336271，307275，319275，319	3120026700，2460026700，2430033900，3410033600，2520033600，25000	615545620545	0.1500.0020.1140.001	1.2841.352

由表1可看出，TTTA-Eu³⁺和BTTA-Eu³⁺均为强荧光性化合物，并且具有非常长的荧光寿命，而TTTA-Tb³⁺和BTTA-Tb³⁺仅为弱荧光性化合物。

如图1、2所示，两种配合物的最大激发光波长均在紫外区，其最大荧光发光波长分别在615nm和620nm，其发光峰形状均为Eu³⁺配合物特征的尖锐形发光峰。

2.缓冲溶液pH值对配合物荧光性质的影响

用不同pH值的0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液为溶剂，测定了不同pH值下TTTA-Eu³⁺的荧光强度和荧光寿命，其结果见表2。测定结果表明，在pH值为9-5.8的变化范围内，TTTA-Eu³⁺的荧光强度和荧光寿命受pH值的影响不大。另外在Tris-HCl和硼酸盐缓冲溶液中测得的TTTA-Eu³⁺的荧光强度和荧光寿命几乎相同，说明TTTA-Eu³⁺在这些缓冲溶液中有很高的稳定性，其荧光性质不受缓冲溶液组成的影响。

表2 pH值变化对TTTA-Eu³⁺荧光性质的影响

pH值	10.0	9.0	8.5	8.0	7.5	6.8	5.8	5.4
pH值	10.0	9.0	8.5	8.0	7.5	6.8	5.8	5.4	荧光强度(arb.unit)	37.63	43.61	46.16	46.61	45.90	43.55	41.97	40.64
荧光寿命(ms)	1.103	1.072	1.163	1.217	1.229	1.209	1.182	1.157	荧光强度(arb.unit)	37.63	43.61	46.16	46.61	45.90	43.55	41.97	40.64

3.使用TTTA-Eu³⁺和BTTA-Eu³⁺进行时间分辨荧光测定的灵敏度

用pH值8.0的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液为溶剂，配制系列浓度的TTTA-Eu³⁺和BTTA-Eu³⁺溶液，通过时间分辨荧光测定确定了使用TTTA-Eu³⁺和BTTA-Eu³⁺进行时间分辨荧光测定的灵敏度。测定用仪器为WALLAC VICTOR 1420多标记计数仪(PerkinElmer Life Sciences公司产)，测定条件为：激发波长，340nm；检测波长，615nm；迟延时间(delay time)，0.2ms；窗口时间(window time)，0.4ms；循环时间(cycling time)：1.0ms。

如图3所示，用本底信号标准偏差的2倍计算最低检出下限，得TTTA-Eu³⁺和BTTA-Eu³⁺溶液的时间分辨荧光测定最低检出下限分别为：TTTA-Eu³⁺，1.3×10^-12mol/L，BTTA-Eu³⁺，1.4×10^-12mol/L。说明使用两者的时间分辨荧光测定均具有非常高的灵敏度。

实施例4

使用NHS-TTTA-Eu³⁺标记链亲和素

将5mg的链亲和素溶于10ml的pH值9.1的0.1mol/L碳酸氢钠缓冲溶液中后，加入10mg的NHS-TTTA，室温下搅拌反应3小时后。溶液在4℃下对3升的含有0.25克NaN₃(迭氮钠)的0.1mol/L碳酸氢钠溶液进行三次透析，每次24小时，除去未反应的标记物。透析后取少量溶液用标准EuCl₃溶液(浓度为1.0×10^-5mol/L)进行荧光滴定确定溶液中TTTA的浓度，然后计算标记率(TTTA浓度与链亲和素浓度的比值)。该法制得的标记链亲和素的标记率为20。所得溶液中加入EuCl₃溶液(Eu³⁺∶TTTA＝1.5∶1)后，即得到TTTA-Eu³⁺标记链亲和素溶液。该溶液中加入20mg的牛血清白蛋白(BSA)和25mg的NaN₃后，-20℃下冷冻保存。

在上述溶液用于时间分辨荧光免疫分析时，用含有0.2％BSA、0.9％NaCl和0.1％NaN₃的pH值7.8的0.05mol/LTris-HCl缓冲溶液稀释1000倍后使用。

实施例5

使用NHS-BTTA-Eu³⁺标记链亲和素

将5mg的链亲和素溶于10ml的pH值9.1的0.1mol/L碳酸氢钠缓冲溶液中后，加入10mg的NHS-BTTA，室温下搅拌反应3小时后。用Sephadex G-50柱分离已标记的链亲和素和未反应的标记物，用0.05mol/L的NH₄HCO₃溶液作为洗出溶液，每1.5ml分收，测定各分收溶液在280nm的吸光度，合并洗出的标记蛋白质溶液。取少量标记蛋白质溶液用标准EuCl₃溶液(浓度为1.0×10^-5mol/L)进行荧光滴定确定溶液中BTTA的浓度，然后计算标记率。该法制得的标记链亲和素的标记率为18。所得溶液中加入EuCl₃溶液(Eu³⁺∶BTTA＝1.5∶1)后，即得到BTTA-Eu³⁺标记链亲和素溶液。该溶液中加入20mg的BSA和25mg的NaN₃后，-20℃下冷冻保存。

实施例6

使用TTTA-Eu³⁺标记链亲和素的时间分辨荧光免疫测定法测定人血清中的促甲状腺素(TSH)

1.生物素标记抗人TSHα-亚单元单克隆抗体的制备

按文献13：J.Yuan，G.Wang，H.Kimura and K.Matsumoto，Anal.Sci.，1998，14，421-423中方法制备。在用于时间分辨荧光免疫分析时，用含有0.2％BSA、0.9％NaCl和0.1％NaN₃的pH值7.8的0.05mol/LTris-HCl缓冲溶液稀释到所需浓度后使用。

2. 96微孔板的包被

在96微孔板(Fluoro Nunc微孔板)的各孔中加入60微升的抗人TSHβ-亚单元单克隆抗体(10微克/毫升，Mitsubishi Chem.Co.产品)的pH值9.6的0.1mol/L碳酸氢钠溶液后，4℃下放置24小时。弃去溶液后，各孔用含有0.05％吐温20的pH值7.8的0.05mol/LTris-HCl溶液洗涤两次，再用pH值7.8的0.05mol/LTris-HCl溶液洗涤一次，即得到抗人TSHβ-亚单元单克隆抗体包被的96微孔板。

3.人血清TSH的测定

在上述包被后孔板的孔中，加入50微升的TSH标准溶液(TSH标准溶液具体浓度是，100，10，1，0.1，0.01，0.00mIU/L)系列和人血清样品，37℃下放置1小时后，弃去溶液，各孔用含有0.05％吐温20的pH值7.8的0.05mol/LTris-HCl溶液洗涤两次，再用pH值7.8的0.05mol/LTris-HCl溶液洗涤一次。向各孔中加入50微升的生物素标记抗人TSHα-亚单元单克隆抗体溶液(溶液浓度参照文献13配制即可)，37℃下放置1小时后，弃去溶液，各孔用含有0.05％吐温20的pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl溶液洗涤两次，再用pH值7.8的0.05mol/LTris-HCl溶液洗涤一次。向各孔中加入50微升的TTTA-Eu³⁺标记链亲和素溶液，37℃下放置1小时后，弃去溶液，各孔用含有0.05％吐温20的pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl溶液洗涤4次后，进行固相时间分辨荧光测定。测定用仪器为WALLAC VICTOR 1420多标记计数仪，测定条件为：激发波长，340nm；检测波长，615nm；迟延时间(delay time)，0.2ms；窗口时间(window time)，0.4ms；循环时间(cycling time)：1.0ms。

如图4所示，用零浓度时的荧光信号(本底)的标准偏差的2倍计算TSH测定的最低检出下限，得本法的最低检出下限为0.09mIU/L。

2，2’：6’，2”-联三吡啶骨架结构和2，6-二吡唑基吡啶骨架结构与冠醚形成配位体的合成路线如下：

Claims

1 一种新型稀土荧光标记物，其特征在于：是以稀土离子Eu³⁺，Sm³⁺，Gd³⁺，Tb³⁺，Dy³⁺与含有2，2’：6’，2”-联三吡啶骨架结构或2，6-二吡唑基吡啶骨架结构类配位体形成的荧光配合物；其中所述配位体结构式为：

当R₁＝NH₂，NCS，SO₂Cl或

时R₂＝OH当R₁＝H时

或

当骨架结构下部为冠醚结构时，R₁＝NH₂，NCS，SO₂Cl 或

2.一种根据权利要求1所述新型稀土荧光标记物的应用，其特征在于：利用所述新型稀土荧光标记物制备标记蛋白质、氨基酸、多肽、核酸、核苷酸及其它标记有机化合物，具体制备方法如下：

2)通过透析或柱层析方法除去反应液中的未反应的标记物；

3)收集已标记的溶液，加入稀土离子溶液后即制得所需的标记产物，其标记物∶稀土离子＝1∶1～1.5。

3.一种根据权利要求1所述新型稀土荧光标记物的应用，其特征在于：首先利用所述新型稀土荧光标记物标记一种反应原料，在标记反应原料与待测物反应之后，分离除去未反应的标记反应原料，然后通过时间分辨荧光测定法测定反应生成物的荧光强度来测定待测物的浓度；或首先利用所述新型稀土荧光标记物标记样品中的待测物，将标记待测物与未反应的稀土荧光标记物分离后，通过时间分辨荧光测定法测定标记待测物的荧光强度来测定待测物的浓度。

4.根据权利要求3所述的标记物的应用，其特征在于：其中所述的时间分辨荧光测定法为时间分辨荧光免疫测定法、时间分辨荧光免疫组织化学测定法、时间分辨荧光显微镜测定法、时间分辨荧光细胞活性测定法、时间分辨荧光液相色谱测定法或时间分辨荧光毛细管电泳测定法。

5.一种根据权利要求1所述新型稀土荧光标记物的应用，其特征在于：利用所述新型稀土荧光标记物标记核酸，在标记核酸与待测核酸反应之后，分离除去未反应的标记核酸，然后通过时间分辨荧光测定法测定反应生成物的荧光强度来测定待测核酸的浓度。

6.根据权利要求5所述的标记物的应用，其特征在于：其中所述的核酸荧光测定法为核酸杂交测定法、荧光PCR测定法、基因芯片测定法或分子信标测定法。