CN1405306A - 特效菌剂的制备与处理化工废水或常规有机废水的方法 - Google Patents
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Abstract
一种特效菌剂的制备方法，由白腐真菌(亲株1)、土著细菌YZ1(亲株2)、酿酒酵母(亲株3)三个亲株菌体的原生质体融合，通过基因在同一个细胞内的重组整合，构建获得的基因工程菌。其发酵工艺参数为：发酵温度，33±2℃；pH值，7.0±1；反应器中溶解氧，≥2mg/L；矿物盐流量，0.001－0.005V/(V.d)；菌体浓度，2－10g/L；在含C、P、N培养液中培养。NJU－Fhhh1特效菌剂生降解精对苯二甲酸石化废水的最大比降解率qmax＝0.226h－1，具有高降解、高絮凝、高适应优势；提高处理效率和节约费用25％以上。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种制备特效微生物菌剂的生物技术及其应用。
二、背景技术：
国际上已有多种处理废水特效菌剂，但是没有制备与应用原生质体融合菌剂处理废水的专利。典型的如日本的EM，又如美国PARADISF公司的高智能微生物制剂HIMP(High-Intelligence Microorganism Preparation)，1升/24元。由于成本和售价太高，国内厂家一般不用进口的处理废水特效菌剂，而国内这方面产品目前仍是空白。
三、发明内容
本发明目的是提供一种制备与应用NJU-Fhhh1特效菌剂高效处理废水的方法。尤其是应用本发明构建的原创性的基因工程特效菌NJU-Fhhh1为出发菌株，制备NJU-Fhhh1特效菌剂，具有白腐真菌的高降解性、土著细菌YZ1的高适应性、酿酒酵母的高絮凝性，利于高效处理有机废水。本发明目的还在于本特效菌剂，成本低，可供国内厂家广为使用，并配套相关的应用技术，在国内有持久性。
本发明的技术实质：将原创性特效菌，发酵制备成处理废水的特效菌剂。
(1).技术构思：以本课题构建的原创性的基因工程特效菌NJU-Fhhh1为出发
菌株，制备处理废水的NJU-Fhhh1特效菌剂，具有白腐真菌的高降解性、土
著细菌YZ1的高适应性、酿酒酵母的高絮凝性，利于高效处理有机废水。在
国内生产NJU-Fhhh1特效菌剂，成本仅为进口的1/4左右，国内的厂家用得
起。配套相关的应用技术，在国内有持久性。
(2).技术构成：
出发菌株NJU-Fhhh1特效菌：是本课题组的原创性科研成果。NJU-Fhhh1特效菌由白腐真菌(亲株1)、土著细菌YZ1(亲株2)、酿酒酵母(亲株3)三个亲株菌体的原生质体融合，通过基因在同一个细胞内的重组整合，构建获得的基因工程菌。NJU-Fhhh1特效菌集中了三个亲株的高降解性、高适应性、高絮凝性的三高优势，利于高效处理有机废水。国际公认原生质体融合构建的新菌株，不存在基因污染问题，所以NJU-Fhhh1特效菌剂也不存在基因污染问题。
NJU-Fhhh1特效菌由亲株1白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)、亲株2土著细菌YZ1(Pseudomonas)、亲株3酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)原生质体融合而成。先经原生质体制备：用蜗牛酶脱去真菌的细胞壁或用溶菌酶脱去细菌的细胞壁、生成原生质体并经离心收集原生质体、缓冲液清洗后获得，然后进行二次融合，第一次融合：等量的亲株1白腐真菌细胞和亲株2土著细菌YZ1细胞的原生质体混合、并在聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、和CaCl2、蔗糖配制的诱导液中融合，经离心后收集融合产物、高渗缓冲液离心清洗后分别涂布于SIM1、SIM2、SIM3三种固体鉴别培养基上、30℃培养7天，同时能在三种培养基上长出的菌落，为第一次双亲跨界融合的产物Fhh；而亲株1白腐真菌细胞和亲株2土著细菌YZ1细胞，只能分别在SIM1和SIM2上生长；第二次融合：上次得到的等量的Fhh和亲株3酿酒酵母细胞的原生质体混合、在聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、和CaCl2、蔗糖配配制的诱导液中融合，经离心后收集融合产物、含蔗糖高渗缓冲液离心清洗后、分别涂布于SIM1、SIM2、SIM3三种固体鉴别培养基上，同时能在SIM1、SIM2、SIM3三种培养基上长出的菌落为三亲跨界融合的产物NJU-Fhhh1或Fhh。
SIM1＝SM+100u链霉素/ml(streptomycin，Sm)；
SIM2＝SM+100u制霉菌素/ml(nystatin，Nt)；
SIM3＝SM+100u链霉素/ml+100u制霉菌素/ml(Sm+Nt)。
制备NJU-Fhhh1特效菌剂的液体培养基：1000ml中：K2HPO4 3g；KH2PO4 1g；NH4NO3 0.5g；Na2SO4 0.1g；MgSO4·7H2O 10mg；MnSO4·4H2O 1mg；CaCl2 0.5mg；FeSO4·7H2O 1mg；CH3COONa 5g；酵母浸膏5g；蛋白胨10g；葡萄糖10g；200g马铃薯浸出汁，调pH至7.0；121℃、103kPa、湿热灭菌20min。最适培养温度：35℃；最适pH：7.0。
制备NJU-Fhhh1特效菌剂的发酵工艺：
发酵设备：全自控生物反应器；
发酵工艺：连续稳定发酵***；发酵温度，33±2℃；pH值，7.0±1；反应
器中溶解氧，≥2mg/L；，矿物盐流量，0.001-0.005V/(V.d)；菌体浓度，
2-10g/L；在含C、P、N培养液中培养。
表1.NJU-Fhhh1特效菌剂发酵工艺参数
工艺参数 数值 工艺参数 数值T，发酵温度，℃ 33±2 Sp，培养液P源浓度，gTP/L 0.10P，罐压，(1大气压＝105 5×105＜ Sf，C/N/P培养液流 0.33Pa)，Pa 量，V/(V.d)Fa，清洁空气供气量， 75≤ Mr，矿物盐流量，V/(V.d) 0.003m3/kgCODRr，搅拌转速，rpm 1000 X，菌体浓度，g/L 4.99PH 7.0±1 HRT，反应液发酵时间，h 8DO，反应器中溶解氧，mg/L ≥2 Fr，加硅油消泡剂流速 Sf＜Va，反应液装量，％ 80≤ μ，比增长率，mg/mgL h-1 0.1 27So，培养液C源浓度，gCOD/L 8.48 q，培养液比利用率，h-1 0.211Sn，培养液N源浓度，gTN/L 0.50 Yo，菌体产量率系数，％ 59发明的有益效果：
(1)NJU-Fhhh1特效菌剂的生产成本低，仅为500元/吨左右，售价可以远低于进口的菌剂；
(2)NJU-Fhhh1特效菌剂具有三亲株的三高优势；提高处理效率和节约费用25％以上；
(3)NJU-Fhhh1特效菌剂既可处理有毒有机废水，也可处理常规有机废水；
(4)NJU-Fhhh1特效菌剂应用原生质体融合工程菌，不产生新基因，没有基因污染问题。
总之，本发明菌剂比土著菌提高降解废水效率和节约运行费用25％以上。本发明是应用原生质体融合的原创性特效菌，是制备处理废水特效菌剂的首例。尤其是应用具有国际原创性的特效菌，制备的特效菌剂在成本和售价上具有国内推广的优势。降解精对苯二甲酸(PTA)石化废水等有机废水具有高降解、高絮凝、高适应优势。
四、附图说明
图1为本发明亲株1白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)电子显微镜照片
图2为本发明亲株2土著细菌YZ1(Pseudomonas)，电子显微镜照片
图3为本发明亲株3酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)电子显微镜照片
图4为本发明三株融合后得到的NJU-Fhhh1菌株电子显微镜照片图
五、具体实施方式
NJU-Fhhh1特效菌剂制备技术的发酵工艺流程
实例名称：NJU-Fhhh1特效菌剂制备及其降解精对苯二甲酸PTA石化废水
(1)应用NJU-Fhhh1特效菌株制备NJU-Fhhh1特效菌剂的条件控制制备菌剂的
生物反应器：德国产B.Braun全自控生物反应器，有效容积1L；自控参数设定：DO(溶解氧)＝2mg/L；pH＝7.0；T＝35℃；Sf(液体培养基流量)＝0.33(V/V)；
搅拌转速：1000rpm；除泡沫：硅油；液面：达1L有效容积；矿物盐流量：0.003(V/V)；液体培养基：同于上述液体培养基
(2)NJU-Fhhh1特效菌剂制备物的参数测定NJU-Fhhh1特效菌体生物量浓度X：4.99g/L；比增长率μ：0.127h-1；培养基的比利用率q：0.211h-1；产率系数Yo：59.84％；制备液中底物剩余浓度Se：0.15g(COD)/L.
(3)NJU-Fhhh1特效菌剂制备物的保存配方(4℃)
配方1：NJU-Fhhh1特效菌剂发酵液，不加任何其它成份；
配方2：NJU-Fhhh1特效菌剂发酵液+抗氧化剂巯基乙醇(SH)；(终浓度0.2‰)；
配方3：NJU-Fhhh1特效菌剂发酵液+Fe3+，(终浓度0.14％)；
配方4：NJU-Fhhh1特效菌剂发酵液+Fe3++巯基乙醇(SH)；(终浓度0.2‰)；
(4)最佳保存配方的NJU-Fhhh1特效菌剂降解精对苯二甲酸PTA石化废水参数：经过2002/5/11-2002/7/21的70天(4℃)的保存，测定配方2：NJU-Fhhh1特效菌剂原发酵液体产物+抗氧化剂巯基乙醇(SH)为最佳配方。降解精对苯二甲酸PTA石化废水参数为：NJU-Fhhh1特效菌体最大比增长率μmax，为0.067h -1；最大比降解率qmax，为0.226h -1；产率系数Y为29.64％；自身衰减系数为0.0026h -1。
(5)NJU-Fhhh1特效菌剂制备实例总结
制备特效菌剂的发酵工艺控制条件是：DO(溶解氧)＝2mg/L；pH＝7.0；T＝35℃；Sf(液体培养基流量)＝0.33(V/V)；搅拌转速：1000rpm；硅油除泡沫；矿物盐流量：0.003(V/V)；保存NJU-Fhhh1特效菌剂的最佳条件是：4℃保存，特效菌发酵液+巯基乙醇(SH)；
NJU-Fhhh1特效菌剂解精对苯二甲酸石化废水参数：μmax＝0.067h -1；最大比降解率qmax＝0.226h -1；产率系数Y为29.64％；自身衰减系数为0.0026h -1。NJU-Fhhh1特效菌剂具有高降解、高絮凝、高适应优势；提高效率节约费用25％以上。
Fhhh1特效菌剂处理废水实例的应用研究结果
废水种类 PTA废水 剥绒废水 汰头废水
时间地点 2002南京 2002张家港 2001金湖
工艺 活性污泥法 活性污泥法 活性污泥法原废水COD，kg/m3 4.344 1.030 9.45原废水BOD，kg/m3 2.828 0.4777 8.18原废水SS，kg/m3 0.103 0.035 21.69原废水pH 4.9 ＞14 12原废水流量，m3/d 10,000 960 8废水反应温度，℃ 35 35 35Yobs，％ 0.1976 0.4638 0.6687Qmax，d-1 0.226 1.078 22.46Ksq，kg/m3 0.01 0.1 2.70μmax，d-1 0.067 0.6 15.02Ksμ，kg/m3 0.02 0.02 2.7Yt，％ 0.2046 0.5566 0.6688Kd，d-1 0.002 0.0455 0.0001q，d-1 0.113 0.4000 0.1651μ，d-1 0.0223 0.8624 0.1104出水COD，mg/L 0.01 0.04 0.02出水SS，mg/L 0.0005 0.0818 0.067出水pH 7.0 7.0 7.0Qr，m3/d 10000 90 8Xr，m3/d 0.57 0.76 5.35Θc，d 44.78 2.5 9.05HRT，d 0.04 1.34 0.11X，kg/m3 0.2855 0.1399 2.708土著菌所需体积V，m3 2293 1900 156Fhhh所需体积V，m3 1624 1524 19.4Fhhh节约建设投资，％ 29.18 19.79 87.56
本发明的微生物保藏资料：2002年7月26日保减，保藏编号是CGMCCNo.0783三亲株跨界融合特效菌是白腐真菌(phanerochaete chrysoporium)酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、土著细菌(YZ1)三者原生质体融合产物。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所。
Claims (8)
1、一种特效菌剂的制备方法，其特征是由白腐真菌(亲株1)、土著细菌YZ1(亲株2)、酿酒酵母(亲株3)三个亲株菌体的原生质体融合，通过基因在同一个细胞内的重组整合，构建获得的基因工程菌。其发酵工艺参数为：发酵温度，33±2℃；pH值，7.0±1；反应器中溶解氧，≥2mg/L；矿物盐流量，0.001-0.005V/(V.d)；菌体浓度，2-10g/L；在含C、P、N培养液中培养。
2、由权利要求1所述的特效菌剂的制备方法，其特征是所述矿物盐包括Na2SO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、CaCl2、FeSO4·7H2O。
3、由权利要求1所述的特效菌剂的制备方法，其特征是制备NJU-Fhhh1特效菌剂的液体培养基的组成是：1000ml中：K2HPO4 3g；KH2PO4 1g；NH4NO30.5g；Na2SO4 0.1g；MgSO4·7H2O 10mg；MnSO4·4H2O 1mg；CaCl2 0.5mg；FeSO4·7H2O 1mg；CH3COONa 5g；酵母浸膏5g；蛋白胨10g；葡萄糖10g；200g马铃薯浸出汁，调pH至7.0；121℃、103kPa、湿热灭菌20min。
4、由权利要求1所述的特效菌剂的制备方法，其特征是最适培养温度：35℃；最适pH：7.0。
5、由权利要求1所述的特效菌剂的制备方法，其特征是NJU-Fhhh1特效菌剂制备物的保存配方，在抗氧化剂巯基乙醇(SH)；(终浓度0.1-0.3‰)；
6、由权利要求1所述的特效菌剂的制备方法，其特征是NJU-Fhhh1特效菌剂制备物的保存配方，原发酵液体产物+Fe3+，(终浓度0.14％)。
7、由权利要求1所述的特效菌剂的制备方法，其特征是NJU-Fhhh1特效菌剂制备物的保存配方，原发酵液体产物+Fe3++抗氧化剂巯基乙醇(SH)。
8、由权利要求1所述的特效菌剂处理化工废水或常规有机废水的的方法，其特征是用于降解精对苯二甲酸石化废水、剥绒废水、汰头废水。
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