CN1400018A - 治疗肥胖症、糖尿病及相关疾病的药物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗肥胖症、糖尿病以及相关疾病的药物，该药物含有治疗有效量的组织蛋白酶抑制剂。该药物通过以组织蛋白酶，特别是组织蛋白酶L，K和S，尤其是蛋白酶L的基因和基因产物为靶向，来降低血糖水平，降低血液胰岛素水平，及治疗糖尿病，肥胖症及相关疾病如：高胰岛素，高血糖，高血压，心血管病，肌肉营养失调和不育症等。

Description

治疗肥胖症、糖尿病及相关疾病的药物

技术领域

本发明是关于治疗肥胖症及其相关疾病的药物，如治疗高胰岛素症，高血糖症，高血压症，心血管疾病，肌肉萎缩症及不育症等疾病的药物。尤其是，本发明涉及采用特定的基因打靶技术及组织蛋白酶的基因产物来治疗肥胖症及非胰岛素依赖型糖尿病。

背景技术

肥胖症是西方国家最严重的营养紊乱疾病。在中年人中，估计占30％到50％的人患有此病。一般来说，当人体重量超过正常体重的20％则被认为患有肥胖症。严重的肥胖症是一种需要长期治疗来减轻并保持体重的慢性疾病，并且这种疾病正在影响越来越多的人。

肥胖症是由于含有肥胖细胞或是脂肪细胞的多余的脂肪组织在皮肤，腹部，骨骼肌肉，血管周围以及乳腺周围堆积而引起。70公斤的正常人的脂肪组织里大约含有15公斤的脂肪。

脂肪细胞由类纤维原细胞发展而成，无论是在正常的哺乳类的发展还是在不同的病理环境中进行，当肌肉营养失调时，肌肉细胞死亡的地方慢慢的被脂肪过多的连接组织代替。脂肪细胞的分化始于一种特殊酶的产生，接着是小脂肪颗粒的积累，这些小脂肪颗粒相互结合，直到细胞被极大的扩张，只有很薄的一圈细胞质围绕在一大块脂质周围。参见SUL(1989)CURR.OPIN.CELL BIOL.1：1116-1121。

脂肪细胞的分化受不同因素的影响。其中一种因素即为生长素，它是一种蛋白质，通常通过垂体腺分泌进入血液。但生长素并不是唯一调节脂肪细胞发展的信号分子。已被生长素刺激过的脂肪细胞的先驱(前脂肪细胞)对类胰岛素的生长剂敏感(IGF-1)，IGF-1能激发分化的肥胖细胞增殖。近来发现，LEPTIN(一种源自脂肪细胞的激素)的整合，在丘脑下部网络中能引起控制能量的组建和消耗的***代谢路径的活性。血浆中LEPTIN的水平与脂肪的储存有关联，并且受酶的平衡的改变的影响。最初认为LEPTIN是一种抗肥胖症的基础激素，它的作用常常被抗LEPTIN的物质所干扰。AHIMA AND FLIER(2000)ANNU.REV.PHYSIOL.62：413-437。

目前最常见的治疗肥胖症的方法是“抑制食欲”疗法。抑制食欲的药物治疗是通过降低食欲或是增加已经吃饱的感觉来使体重减轻。这些疗法是通过增加血液中的复合胺或是儿茶酚胺，这两种能影响心情和胃口的大脑化学产物来达到目的。

长期采用这类药物治疗会有一些潜在的副作用。例如，两种已获FDA批准的通过影响血液中复合胺的释放和再吸收来抑制食欲的药物(FENFLURAMINE及DEXFENFLURAMINE)已从市场上消失。通过影响儿茶酚胺的水平来进行治疗的药物如PHENTERMINE，DIETHYLPROPION，MAZINDOL能引起失眠，神经质和兴奋等的综合症。关于采用SIBUTRAMINE来进行治疗的基本副作用是使血压上升和脉搏加快，该副作用通常很轻微，但对患有高血压，心脏病，不规则心跳，以及有中风史的人来说则不宜使用。

肥胖症使发生心血管疾病、糖尿病、中风、肌肉营养失调以及不育症的危险性增高。特别是肥胖症能逐渐在连续的阶段下发展成II型糖尿病。临床上，这些阶段可分为：一般性的葡萄糖耐受性，削弱了的葡萄糖耐受性，高胰岛素的糖尿病，低胰岛素的糖尿病。这种对葡萄糖储存的逐步削弱伴随着基本血糖的增高。

一般说来，糖尿病主要有两种：胰岛素依赖型(I型)和非胰岛素依赖型(II型)。I型糖尿病也叫幼年发作糖尿病，通常是在人的幼年时代突然发病，相反，II型糖尿病，也叫成年发作糖尿病，一般是在40岁后逐步形成。

多肽型的胰岛素激素主要对肌肉、肝脏和脂肪组织细胞起作用，它刺激肝糖、脂肪和蛋白质的合成，同时抑制这些代谢能源的衰减。此外，胰岛素刺激大部分细胞对葡萄糖的吸收，但对大脑和肝脏细胞特别例外。与之起相反作用的胰高血糖素一起，胰岛素维持着人体内血糖的适当水平。

在糖尿病人中，胰岛素不是分泌得不够就是对靶细胞的刺激作用不够。结果，血糖水平升高导致尿中血糖升高，这为检测该种疾病提供了方便的临床诊断。尽管血糖水平如此高，细胞却由于胰岛素刺激葡萄糖进入细胞的作用被削弱而“饥饿”。甘油三酯的水解，脂肪酸的氧化，葡萄糖生成，以及酮体的形成，这一切的加速，将导致血液量的减少，并最终危及生命状况。

I型糖尿病是由于胰岛素缺乏，胰腺缺乏引起的胰岛素不足或是产生有缺陷的β细胞引起。这种情况是由于自体免疫反应对β细胞有选择的破坏造成。胰岛素依赖型的个体需要定期注射胰岛素来维持生命，并且要配合非常讲究的饮食控制和体育锻练。

II型糖尿病或叫非胰岛素依赖型糖尿病，占临床案例的90％，在美国影响着1.6亿多的人，在世界范围影响20亿多的人(YOUSEF ETAL.(1999)DIABETES Review 7：55-76.)。与I型糖尿病相比，II型糖尿病患者具有正常的或是更高的胰岛素水平。其症状起因于正常对胰岛素起反应的细胞含有的胰岛素受体的数量非常少。假定过量饮食导致胰岛素分泌增多，接着引起肥胖症，最终抑制了胰岛素受体器的合成。

II型糖尿病能引起多种微循环紊乱并发症。除了视网膜病，肾病，神经病，这种疾病还会加速动脉硬化症和早熟性心血管病的发病率和死亡率。动脉硬化症(如：心肌梗塞，中风和血管末梢疾病)发病率的提高与抗胰岛素的阻力有非常复杂的联系，这种II型糖尿病中的对胰岛素的阻力是一种主要的病理生理学反常，是由高血糖症、高胰岛素症、高血压症以及高凝固性症所引起的代谢反常而导致的。

近年来，肥胖症和糖尿病的基因原理已逐步被查明(参见ZHANGET AL.CLONED THE MOUSE OBESITY (OB)GENE AND ITSHUMAN HOMOLOGUE IN 1994.ZHANG ET AL.(1994)NATURE372：425-432)。肥胖基因上的改变导致了肥胖症的症状。最常见的用于研究遗传肥胖症的动物模型是含有正染色体隐性改变的OB/OB和DB/DB的老鼠。这些改变分别位于染色体6和4上，但在临床上引起类似肥胖症的症状：包括多食症，严重的葡萄糖和胰岛素代谢的反常，很难调节体温和非颤抖性的生热作用，极端迟钝，以及瘦的人体胞块发育不好。限制这些动物的饮食来恢复正常的人体脂质块和瘦的人体胞块的比例是最关键的，并且不会影响到正常的体质。

OB和DB的基因产物由成对的激素/受体(LEPTIN和LEPTIN受体)组成。LEPTIN是一种由肥胖细胞产生的缩氨酸激素，OB/OB和DB/DB的老鼠不能产生LEPTIN(OB/OB)，或是对LEPTIN不受影响(DB/DB)。给OB/OB的老鼠加入LEPTIN，老鼠吃得更少，更有活力，并且极大的减轻了体重。

除了OB和DB，在老鼠身上已发现了几种能导致肥胖症的单一的基因改变。例如，发现刺豚鼠位点的黄色改变能引起多向的综合症，这种综合症能引起中年人患上肥胖症，并使肿瘤形成的可能性加大(HERBERG AND COLEMAN 1977，METABOLISM 26：59)，还可引发人体脂质的解剖学上的反常分布(COLEMAN 1978，DIABETOLOGIA 14：141-148)。此外，在肥胖位点的改变能引起中等程度的成年人肥胖症，并伴有比在OB和DB老鼠身上稍微缓和一点的葡萄糖静态平衡失调[COLEMAN AND EICHER(1990)J.HEREDITY 81：424-427]。更进一步的是，已经证实在染色体7上的脂肪细胞位点上的常染色体的显性改变能引起肥胖症。

其他的动物模型，包括FA/FA(肥胖)老鼠，是一种和OB/OB或DB/DB老鼠有多处类似的老鼠。区别之一在于：当FA/FA老鼠对寒冷非常敏感时，他们对非颤抖性生热作用的能力是正常的。相比老鼠的突变异种来说，在FA/FA老鼠身上，迟钝对肥胖症的保持起更大的作用。此外，天生的老鼠族群如NZO老鼠和日本KK老鼠都较肥胖。某种杂交鼠如WELLESLEY老鼠则天生肥胖。还有，一些沙漠里的啮齿动物，如刺鼠，在其栖息地则不会肥胖，而进行实验室喂养则可变得肥胖。

用来研究肥胖症的动物模型还经过药理学上的或是身体上的处理。例如：VMH和VLH的双面损害的老鼠同时分别患有食欲过盛和肥胖症，以及不能吞咽和恶病质。更进一步的是，已经证实对新生老鼠喂养谷氨酸一钠-谷氨酸盐(MSG)同样能导致肥胖症综合症。

已经有人利用这些动物模型来从分子上研究肥胖症的致病机理。如，ADIPSIN，一种鼠类的丝氨酸蛋白酶，其活性与人类的产于前脂肪细胞的D剂极为相似，这种蛋白酶在OB/OB，DB/DB，及由MSG引发的肥胖症中受到了抑制(FLIER(1987)SCIENCE 237：405)。每个模型都是先发现ADIPSIN的被抑制，然后出现肥胖症。对这些模型中的缺陷位点进行了进一步的研究，以便了解促ADIPSIN剂的活性[PLATT(1989)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 86：7490]。科学家又更深入的了解到，在OB/OB老鼠的视丘下部的中，神经传递缩氨酸的表达出现变化[WILDING(1993)ENDOCRINOLOGY 132：1939]，在β细胞岛上葡萄糖的传递蛋白出现变化，以及G蛋白的水平也出现变化[MCFARLANE-ANDERSON(1992)BIOCHEM.J.282：15]。

对不同于当前有关机理的肥胖症、糖尿病及相关疾病的治疗，仍然需要做进一步的改进。

发明内容

本发明基于发明人的一个研究结果，即某种组织蛋白酶，尤其是蛋白酶L，K，和S，特别是蛋白酶L，在脂肪形成以及脂肪或是肥胖细胞的分化过程中起着非常重要的作用。

通过发明人的研究发现，体内调节脂肪的组织蛋白酶，尤其是蛋白酶L，K，和S，特别是L，与脂肪储存的调控、血糖水平的高低以及胰岛素水平的高低有着紧密联系，基于这项研究，本发明提供了能够调节体内脂肪储存、血糖水平及胰岛素水平改变的药物和方法。该药物和方法也可用于诊断、监测和治疗各种由不适当的、反常的或是多余的脂肪储存，血糖水平和胰岛素水平所引起的疾病。

因此，本发明提供了一种可用来降低动物体内的脂肪储存的制剂，这种制剂可用来降低动物体内组织蛋白酶L的活性，从而降低了动物体内的脂肪储存。

本发明还提供了一种用来降低血糖水平的制剂，这种制剂可用来降低动物体内组织蛋白酶L的活性，从而降低了动物体内的血糖水平。

本发明还提供了一种用来降低胰岛素水平的药物，这种制剂可用来降低动物体内组织蛋白酶L的活性，从而降低了动物血液中的胰岛素水平。

另外，本发明的药物制剂还可以用于治疗高胰岛素症，高血糖症，高血压症，心血管疾病，肌肉萎缩症及不育症等疾病，这种制剂可用来降低动物体内组织蛋白酶L的活性。本发明还提供了组织蛋白酶L，K，和S抑制剂的药物新用途，即，组织蛋白酶L，K，和S抑制剂在制备治疗肥胖症、糖尿病的药物中的应用。

本发明还提供了组织蛋白酶L，K，和S抑制剂的药物新用途，即，组织蛋白酶L，K，和S抑制剂在制备治疗高胰岛素症、高血糖症、高血压症、心血管疾病、肌肉萎缩症及不育症等疾病的药物中的应用。

本发明所说的组织蛋白酶L，K，和S抑制剂包括如下物质：

1、组织蛋白酶S的选择性抑制剂包括：α-氧代-β-醛衍生物和乙烯砜，参见表2；如Cbz-Phe-Leu-COCHO，吗啉脲-亮氨酸-高苯丙氨酸-乙烯砜-苯基(LHVS：N-morpholinurea-leucine-homophenylalanine-vinylsulfone-phenyl)；

2、组织蛋白酶K抑制剂包括：非肽类氨腈；非肽类碳酰肼类；烷氧甲基酮衍生物，参见表3；如，1-氰基-吡咯啉基氨基甲酸卞基酯，N-[1-(氰基-3-氮杂环丁烷基)甲基]环己烷羧酰胺，2，2′-(N-卞基氧基羰基-L-亮氨酸基)碳酰肼，(3S)-3-[(N-卞基氧基羰基)-L-亮氨酸基]氨基-1-(4-苯基)-苯甲酰基-氧-5-甲基-2-己酮；

3、组织蛋白酶L抑制剂包括：多肽类物质，如，mutant CystatinC(V10W/W106W)，saxiphilin；环氧琥珀酸酯衍生物，如，CLIK 148〖L-(+)-(2S，3S)-N-[2-(2，-吡啶基-)-1-乙基-]-钠-氨基-(L-苯丙氨酸-二甲基酰胺)-反式-环氧琥珀酰胺〗，其IUPAC名称：N-[2-(2-吡啶基)-1-乙基]-L-(+)-(2S，3S)-3-[(S)-1-二甲基氨基甲酰基-2-苯基乙基氨基甲酰基]-2-环氧乙烷羧酰胺，和CLIK 195，即，(L-(+)-(2S，3S)-双-(钠-氨基-L-苯丙氨酸二甲基酰胺)-反式-环氧琥珀酰胺，IUPAC名称是：N，N-二甲基-L-(+)-(2S，3S)-2-{3-[(S)-1-二甲基氨基甲酰基-2-苯基-乙基氨基甲酰基]-2-环氧乙烷氨基甲酰基氨基}-(S)-3-苯基-丙酰胺)；氮丙啶-2，3-重碳酸盐衍生物，如，N-{(2S，3S)-1-[[N-(叔-丁氧基羰基)-(S)-苯基丙氨酰基]-3-(乙氧基羰基)氮丙啶-2-基]羰基}-(S)-亮氨酸卞基酯，(2R，3S)+(2S，3S)1-[N-(叔-丁氧基羰基)-(S)-苯基丙氨酰基]氮丙啶-2，3-二羧酸；肽醛衍生物，如，L-异亮氨酰基-L-色氨酸基醛衍生物，N-(1-奈基黄酰基)-L-异亮氨酰基-L-色氨酸基醛，N-(卞基氧基羰基)-L-苯基丙氨酰基-L-酪氨酸基醛，N-(2-卞基-3-苯基丙酰基)-L-色氨酸基醛；二肽羟酰胺酸酯衍生物和磺酰基衍生物，参见表4，如(3S)-3-[(N-卞基氧基羰基)-L-亮氨酸基]氨基-1-(4-苯基)-苯甲酰基-氧-5-甲基-2-己酮，Z-Phe-Gly-NHO-Bz，Z-Phe-Gly-NHO-NBz，SB468430，SB468432，

N-(1-奈基黄酰基-L-异亮氨酰基-L-色氨酸基醛。

反义RNA作为组织蛋白酶L的抑制剂已经被应用于肿瘤细胞生长的抑制(European Journal of Cancer，36，787-795，2000)。因此，该文献所说的反义RNA也可以用作本发明的组织蛋白酶L的抑制剂，用于治疗肥胖症、糖尿病及相关性疾病。

组织蛋白酶L前肽是一种很好的组织蛋白酶抑制剂(Eur.J.Biochem.267，6311-6318，2000)。它对组织蛋白酶K和L的Ki分别是0.27和0.12nM，因此，组织蛋白酶L前肽可以用作本发明的组织蛋白酶抑制剂，用于治疗肥胖症、糖尿病及相关性疾病。

因此，本发明提高了一种降低动物脂肪储存的药物，该药物包含治疗有效量的能降低体内组织蛋白酶L活性的物质。所说的降低体内蛋白酶L的活性包括蛋白酶L表达的降低和蛋白酶L表达的被抑制。所说的能降低体内组织蛋白酶L活性的物质是一种核酸，所说的能降低体内组织蛋白酶L活性的核酸选自含有反义分子，核糖酶和三倍的螺旋分子，具体说，所说的能降低体内组织蛋白酶L活性的核酸是一种与部分人类组织蛋白酶L的CDNA序列(表1，SEQ ID NO：1)互补的反义分子，更具体说，所说的能降低体内组织蛋白酶L活性的核酸是一种与部分人类组织蛋白酶L基因的5’-末端未翻译的区域互补的反义分子。所说的能降低体内组织蛋白酶L活性的物质还可以是一种抗体，这种抗体是一种与组织蛋白酶L相结合的抗体。所说的能降低体内组织蛋白酶L活性的抗体是一种完全的人类抗体，一种单克隆抗体或一种人性化的抗体。所说的能降低体内组织蛋白酶L活性的物质还可以是一种能抑制蛋白酶L活性的多肽，这种多肽是一种如表3所列的CYSTATIN C的突变异种，所说的能降低体内组织蛋白酶L活性的物质还可以是一种能抑制蛋白酶L活性的环氧琥珀酸盐的衍生物，所说的环氧琥珀酸盐的衍生物选自于表3中包含有环氧琥珀酸盐的衍生物的一个小组。所说的能降低体内组织蛋白酶L活性的物质也可以是一种能抑制蛋白酶L活性的氮丙啶-2，3-重碳酸盐衍生物，这种氮丙啶-2，3-重碳酸盐衍生物选自如表3所列含有氮丙啶-2，3-重碳酸盐衍生物的一组。所说的能降低体内组织蛋白酶L活性的物质也可以是一种能抑制蛋白酶L的活性的二肽羟酰胺酸酯衍生物和磺酰基衍生物，所说的二肽羟酰胺酸酯衍生物和磺酰基衍生物选自表3所列的包含有二肽羟酰胺酸酯衍生物和磺酰基衍生物的小组。所说的能降低体内组织蛋白酶L活性的物质也可以是一种肽的乙醛的衍生物，这种衍生物是选自表3所列的包含有肽的乙醛的衍生物的小组。

如上所述，本发明是基于如下的研究结果，即某种组织蛋白酶，尤其是蛋白酶L，K，和S，特别是蛋白酶L，在脂肪形成以及脂肪或是肥胖细胞的分化过程中起非常重要的作用。研究观察发现，当动物体内的组织蛋白酶L活性降低时，其体内储藏脂肪的能力比蛋白酶L活性正常时显著降低。同时还注意到，蛋白酶K和S与L一起有着同样的作用，所以认为他们都具有调节体内脂肪储存的功能。进一步观察发现，其他的蛋白酶，功能大多类似于组织蛋白酶L，K和S，特别是类似与L的蛋白酶，同样在体内存在，并且对脂肪储存的调节路径起一定作用。做为一个功能相近的小组，在此我们把参与调节脂肪储存的所有组织蛋白酶称为：“调节脂肪的组织蛋白酶群”。

针对组织蛋白酶的不同构成采用选择性抑制剂来进行的一系列生物化学试验表明，蛋白酶L极为密切的参与了在胰岛素和胰岛素受体之间的复合体的代谢。与未分化的人类细胞(前脂肪细胞)相比，在人体脂肪细胞分化后蛋白酶L的活性加大。抑制组织蛋白酶L将导致完整的胰岛素受体和类胰岛素受体在人体前脂肪细胞中的堆积，或是在鼠的前脂肪细胞中降低退化的胰岛素受体中间体的数量。更进一步的是，抑制组织蛋白酶L将阻碍人类和老鼠的前脂肪细胞形成脂肪。下文将对所做的生物化学研究做出说明。

根据本发明的研究结果，即体内调节脂肪的组织蛋白酶，尤其是蛋白酶L，K，和S，特别是L，与脂肪储存的调控、血糖水平的高低以及胰岛素水平的高低有紧密联系，基于这项研究，本发明提供了能够调节体内脂肪储存、血糖水平及胰岛素水平改变的药物和方法。该药物和方法也可用于诊断、监测和治疗各种由不适当的、反常的或是多余的脂肪储存，血糖水平和胰岛素水平所引起的疾病。例如：此项发明提供了可治疗肥胖症，糖尿病和由于体内反常的脂肪储存水平、血糖水平和胰岛素水平所导致的疾病的成分。

另外，通过降低动物体内调节脂肪的蛋白酶群的活性，可以控制从前脂肪细胞到脂肪细胞的分化(脂肪形成)，类似的也可控制IR复合体的转换。那么，降低体内调节脂肪的蛋白酶群的活性，特别是组织蛋白酶L，能用于此项发明来治疗肥胖症和与胰岛素再吸收相关的疾病，如高胰岛素症，高血糖症，II型糖尿病，和肥胖症相关疾病，如高血压，心脏血管病，肌肉营养失调症和不育症。

目前已有多种可用来进一步发展成为调节脂肪的靶蛋白酶，特别是关于蛋白酶L的治疗制剂。这些制剂可用来设计成为以组织蛋白酶为靶向，增加或是降低调节脂肪的组织蛋白酶的体内活性。

这些治疗制剂在CDNA的基础上或在蛋白酶调节脂肪的调节区域的基础上来以调节脂肪的组织蛋白酶为靶向。例如，以DNA为基础的治疗剂，如反链抑制剂和核糖酶，能以组织蛋白酶基因的基因内区和外显子为靶向，在RNA的水平上也一样。

做为选择，治疗剂可在氨基酸序列的基础上来以调节脂肪的蛋白酶为靶向，该基础包括调节脂肪的组织蛋白酶的蛋白质的三维结构和/或前体。以蛋白质为基础的治疗剂，如人类的抗体，非人类的单克隆型抗体和已人化的抗体，则可专门用来以调节脂肪的蛋白酶的不同抗原为靶向。肽或是PEPTIDOMIMETICS可作为高亲和力的抑制剂专门用来与一种特殊的蛋白酶的活性位点结合，从而抑制了体内蛋白酶的活性。小分子也可用来以组织蛋白酶为靶向，特别是那些对蛋白酶L有高选择性的分子。

除了对调节脂肪的组织蛋白酶靶向化，通过与组织蛋白酶的自然底物相竞争地参与与酶的结合，治疗剂也可用于竞争性的抑制调节脂肪的组织蛋白酶。

以调节脂肪的蛋白酶为靶向的治疗剂，相比与非调节脂肪的蛋白酶，更有选择的以调节脂肪的蛋白酶为靶向。如，与其他非调节脂肪的组织蛋白酶相比，治疗剂更有选择的以蛋白酶L，K或S为靶向。又如，治疗剂对蛋白酶L比对其他非脂肪调节蛋白酶的靶向更有选择性。再如，相比与组织蛋白酶K和S，治疗剂更有选择的以蛋白酶L为靶向。

上文所说的“更有选择的以……为靶向”，如果没有特殊说明，起含义为：“更有选择的抑制……的表达”，“更有选择的与……相结合”，或是“更强的降低了……的在体内的活性”。

当一种更有选择性的靶向治疗剂具备了更强的降低某种特定的组织蛋白酶在体内活性的能力，这种更强的能力的衡量是以这种治疗剂对改变组织蛋白酶的活性的能力为基础的。

治疗剂与一种组织蛋白酶结合的实施方案是：这种结合的亲和力可用于作为为更强的选择性做测定。在这种情况下，以调节脂肪的蛋白酶为靶向的治疗剂，相比与非调剂脂肪的蛋白酶，对调节脂肪的蛋白酶具有更强的结合亲和力。一个表达是，相比非调节脂肪的蛋白酶，治疗剂对蛋白酶L，K和S的粘合亲和力更强。另一个实施方案是，对蛋白酶L的结合亲和力超过其他非调节脂肪的蛋白酶。还有一个实施例是，这种亲和力对蛋白酶L的程度强于蛋白酶K和S。在一个特定的实施例当中，相比与其他的特定的蛋白酶或蛋白酶类别，特殊的治疗剂更有选择性的以某种特定的蛋白酶或是蛋白酶的某个特殊类别为靶向(如蛋白酶L)，在这种意义上说，治疗剂与特定蛋白酶或蛋白酶类别的结合亲和力最少要强10倍，较好的情况下要强100倍，最好的情况下强1000倍。举例来说，某种治疗剂对蛋白酶L的结合亲和力可能是对蛋白酶K或S的亲和力的10倍，较好的情况下100倍，最好的情况下达1000倍。

应注意到，可以将调节脂肪为靶向的不同的治疗剂混合到不同的药物制剂当中，使之在生物体中发挥这些作用。这些制剂可能会包含一种或多种制药载体。这些制剂可以以各种适当的医学形式给药，例如，非肠道(静脉内，腹膜内的，胸内的，或肌肉内给药)，透皮或口服给药。

对于选择性以调节脂肪的蛋白酶为靶向的治疗剂，本发明提供了多种使用方法。这些方法可对任何动物使用。如，该动物为脊椎动物，又如，该动物是哺乳动物。采用了这些方法的特定的动物例子包括，不仅仅局限于人类，宠物(如猫，狗，马等)，家畜(如鸡，鸭，鹅，猪，马等)，以及在动物园里饲养的动物。

通过使用这些治疗剂，可以在动物体内降低调节脂肪的组织蛋白酶的活性(在此可称作为“体内调节脂肪的组织蛋白酶的活性”)。这种状况也许是由动物体内的调节脂肪的蛋白酶的数量降低引起，也可能是由于动物体内的调节脂肪的蛋白酶受到抑制而引起。

如，一种方法可以降低动物体内的脂肪储存。某种治疗剂可以降低体内调节脂肪的蛋白酶的活性，从而降低了体内脂肪的储存。这种方法就是通过服用这种治疗剂来达到目的。这种方法也许在已测定的体内活性的基础上，更进一步的添加了一些测定体内调节脂肪的蛋白酶的活性的成分和对这种治疗剂所起的作用进行调节的成分。通过降低调节脂肪的蛋白酶的活性，如蛋白酶L，在前脂肪细胞向脂肪细胞分化时进行抑制，则可导致前脂肪细胞的传导阻滞，从而用了这种治疗剂的动物的体内脂肪储存就被降低了。

又如，一种方法是用来降低动物体内的血糖水平的。某种治疗剂可以降低体内调节脂肪的蛋白酶的活性，从而降低了体内的血糖水平。这种方法就是通过服用这种治疗剂来达到目的。这种方法可能还添加了一些测定血糖水平和体内蛋白酶活性的成分。对这种治疗剂的服用要依据这一种或这两种测定的结果来调节。

这种方法较适于用于人类，更适用于在比正常人的血糖水平高的人身上(如高于1.26克葡萄糖/升血液的正常值)，用在II型糖尿病人身上效果最好。

通过降低调节组织蛋白酶的活性，如组织蛋白酶L的活性，可阻碍胰岛素受体或类胰岛素受体的水解或极大限度地减小水解以产生完整的受体。已发现II型糖尿病的主要起因是胰岛素阻抗，胰岛素受体的变异可造成对胰岛素投药的阻抗或非响应性。尽管有极高的血浆胰岛素含量，具有胰岛素阻抗的人们还是容易患上糖尿病。这样，提高完整胰岛素受体和类胰岛素受体的含量将促进胰岛素的响应性并降低血糖含量，因而缓解糖尿病症状。

在另一种情况下，有一种降低动物血液胰岛素含量的方法，它是通过给动物投用一种在体内降低调节脂肪的组织蛋白酶活性制剂来实现的。这种方法还可包括测量动物和/或体内调节脂肪的组织蛋白酶活性血液胰岛素含量。当然，这种制剂的使用还可在此种或此两种测量基础上进行调整。这种方法最好在人体上进行，以患有胰岛素功能亢进型的人体为上，以患有II型糖尿病的人体为佳。

在另一种情况下，有一种治疗患有肥胖疾病，或与胰岛素再循环相关的疾病(如胰岛素功能亢进，多糖症，II型糖尿病)或与肥胖相关的疾病(如高血压，心血管疾病，肌肉营养失调和***症)的动物的方法。这种方法包括给动物服用一种可降低体内调节脂肪的组织蛋白酶活性的制剂，这样动物的血液胰岛素含量就可降低。这种方法还可进一步包括测量动物的血糖量，动物的血液胰岛素含量和/或动物体内调节组织蛋白酶活性的脂肪。当然，这种制剂的使用还可在此种或此两种测量基础上进行调整。

至于上述任何一种方法，降低调节体内脂肪的组织蛋白酶制剂比非调节脂肪的组织蛋白酶更能降低体内调节脂肪的组织蛋白酶活性。其中一种变化是，此制剂比其它非调节脂肪的组织蛋白酶更能降低体内组织蛋白酶L，K或S的活性。在另一种情况下，此制剂比其它非调节脂肪的组织蛋白酶更能降低体内组织蛋白酶L的活性。在另一种情况下，此制剂降低体内组织蛋白酶L的活性比降低体内组织蛋白酶K或S活性更强。

在某种具体情况下，此制剂比组织蛋白酶K或S更能有选择地作用于组织蛋白酶L。从这个意义来说，此治疗制剂对组织蛋白酶L的亲和力比组织蛋白酶K或S至少大10倍，100倍或1000倍。

至于上述情况，值得注意的是，体内某种组织蛋白酶活性的降低可能与另一种组织蛋白酶表达的显著降低有关，或是与体内某一表达组织蛋白酶活性的显著降低有关。

本发明也与通过测量调节脂肪的组织蛋白酶mRNA数量，例如组织蛋白酶L；调节脂肪的组织蛋白酶表达数量，例如组织蛋白酶L；和/或调节脂肪的组织蛋白酶含量，例如组织蛋白酶L，以诊断某一疾病状态的方法有关。

这一疾病状态包括异常的，不规则的或非希望有的脂肪积存量，血糖含量和/或胰岛素含量。值得注意的是，可一同监测包括组织蛋白酶L和K，L和S或L，K和S在内的调节组织蛋白酶的一种或多种脂肪。

本发明与通过测量调节脂肪的组织蛋白酶，如L，mRNA数量，调节脂肪的组织蛋白酶，如L，表达数量，和/或调节脂肪的组织蛋白酶，如L，含量，以诊断某一疾病状态起因的方法有关。这一疾病状态包括异常的，不规则的或非希望有的脂肪积存量，血糖含量和/或胰岛素含量。

与通过测量调节脂肪的组织蛋白酶，如L，mRNA数量，调节脂肪的组织蛋白酶，如L，表达数量，和/或调节脂肪的组织蛋白酶，如L，含量，以检测动物感染某种疾病状态的遗传性易患病体质的方法有关。这一疾病状态包括异常的，不规则的或非希望有的脂肪积存量，血糖含量和/或胰岛素含量。

上述每种诊断方法中，对调节脂肪的组织蛋白酶L有关的测量可与对动物的脂肪积存量，血糖含量和/或胰岛素含量的测量同时进行。例如，组织蛋白酶活性升高或异常高的动物在体内可能同时具有更高的脂肪含量。组织蛋白酶L的高度活性(或含量)和高脂肪含量结合起来可被用来鉴别高脂肪含量的可能起因。

在某一具体情况下，此方法包括：测量动物的调节脂肪的组织蛋白酶L的基因表达活性。其中，调节脂肪的组织蛋白酶基因表达的异常高度活性表明此动物先天患有遗传性肥胖症。调节脂肪的组织蛋白酶的基因表达活性包括但不仅限于如受制于调节脂肪的组织蛋白酶基因和转录mRNA促进剂区域的转录性因素的转录活性，如调节脂肪的组织蛋白酶蛋白产生的转录活性，以及如调节组织蛋白酶脂肪产生母体的解蛋白过程的转录后活性，与调节脂肪的组织蛋白酶内源性抑制剂的表达有所差别。

在另一具体情况下，此方法包括：测量动物的调节脂肪的组织蛋白酶L基因表达活性；测量动物的血糖含量和/或胰岛素含量。其中，调节脂肪的组织蛋白酶基因表达的异常高度活性以及异常高的血糖和胰岛素含量等表明此动物先天患有II型糖尿病或胰岛素功能亢进症。

在另一具体情况下，此方法包括：测量动物的调节脂肪的组织蛋白酶如L基因表达活性；测量动物的血糖含量和/或胰岛素含量。其中，调节脂肪的组织蛋白酶基因表达的异常高度活性以及异常高的血糖和胰岛素含量等表明此动物先天患有II型糖尿病或胰岛素功能亢进症。

本发明通过调节脂肪组织蛋白酶活性或表达(组织蛋白酶K，L或S较好，组织蛋白酶K和L为佳，组织蛋白酶L为上)为调节脂肪形成的化合物或制剂也提供了鉴别方法。

在某一情况下，可提供鉴别在细胞***内抑制脂肪形成制剂的方法。此方法包括：把含有前成脂肪细胞的细胞与测试制剂进行接触，检测一下从前成脂肪细胞到脂肪细胞的不同含量。其中前成脂肪细胞含量的降低表明测试化合物抑制了脂肪的形成。变化之一是，此方法进步包括检测组织蛋白酶一个或更多脂肪的活性。调节脂肪组织蛋白酶活性的降低与前成脂肪细胞含量的降低相关。变化之二是，此方法进一步包括检测调节脂肪的组织蛋白酶基因表达的降低。调节脂肪的组织蛋白酶基因表达的降低与前成脂肪细胞差异含量的降低相关。

调节脂肪的组织蛋白酶活性包括但不仅限于：上述酶的活性及基因表达活性。前成脂肪细胞分化水平包括但不仅限于：分化细胞的数量(即：脂肪细胞)，胰岛素受体含量(如胰岛素受体β亚单位)和其前体，胰岛素受体样β亚单位和其前体的含量，CCAAT/增强子结合蛋白α及PPAR-γ的表达量。

本发明还提供了一种生产具有改善体内脂肪含量的非人类动物，如具有所希望的脂肪含量的牲畜，的方法，该方法是改变一种或几种调节脂肪的组织蛋白酶(组织蛋白酶K，L和S较好，KL为佳，L为上)体内活性。

在某一情况下，可提供一种能降低动物脂肪储量的方法。此方法包括：给动物投用一种可降低动物体内调节脂肪组织蛋白酶活性的制剂，由此，动物的脂肪含量可降低。

在另一种情况下，可提供一种提高动物脂肪储量的方法。此方法包括：给动物投用一种可提高动物体内调节脂肪组织蛋白酶活性的制剂，由此，动物的脂肪含量可提高。此动物可为脊椎动物，哺乳动物比较好，象鸡、鸭、火鸡、鸵鸟、牛、猪和马这些牲畜最佳。此动物还可包括猫、狗在内的宠物。此制剂为调节组织蛋白酶L的脂肪。

本发明还为降低动物的脂肪储量提供了某一合成物，此合成物包括：能降低调节脂肪组织蛋白酶如L在内的活性含量的制剂和动物食品。例如，对一只狗而言，此食品可以是包含有能降低调节脂肪组织蛋白酶活性量制剂的狗食品；对一只猫而言，此食品可以是包含有能降低调节脂肪组织蛋白酶活性量制剂的猫食品；对象马、猪、羊等牲畜来说，此食品可以是牲畜食品，而在这种食品中已添加了能降低调节脂肪组织蛋白酶活性量的制剂。

此合成物的摄取可通过调节脂肪组织蛋白酶活性量的降低来减少脂肪的吸收和贮存，从而在调节脂肪的组织蛋白酶调节下来抑制脂肪形成。

1、半胱氨酸蛋白酶科目中的组织蛋白酶

蛋白酶是通过催化氨基化合物酰氨键水解来把蛋白质或聚缩氨酸降解为小成分的一种酶。在蛋白质水解过程中，所有蛋白酶具有的共同原理是：催化作用是由对氨基化合物酰氨键的碳酰基碳进行亲核攻击来发起的。不同的蛋白酶利用不同的方法来产生亲核基团，并使之与目标键并列。基于在分子含量上的这些差别，蛋白酶可分为四个主要类别：丝氨酸酶，半胱氨酸酶，天冬氨酸盐酶和金属蛋白酶。丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶分别利用其副链的羟氢氧基和硫醇组直接作为亲核基团，而天冬氨酸盐和金属蛋白酶分别利用天冬氨酸盐残基和重金属，来固定和极化水分子，以便水中的氧原子成为亲核基团。

如上所述，半胱氨酸蛋白酶是在催化反应过程中起决定作用的。蛋白酶的活跃区中以半胱氨酸残基的存在为区别的一种蛋白酶。在生物***中已分离出了多种无数半胱氨酸蛋白酶。包括人类在内的哺乳动物***中，通常通过包括半胱氨酸蛋白酶的活性在内的许多原理来降解和处理蛋白质。然而当含量提高或当受异常刺激或当受病毒或细菌或寄生性感染而注入生物***时，其表达受到影响。人们通常认为半胱氨酸蛋白酶与细胞内的许多病理生理性过程和疾病状况有关。它具有许多消化性或处理性功能。而在细胞外，它可能与组织重塑和病理学有关，如：关节炎、发炎、心肌梗塞、早老性痴呆、癌症、肌肉营养失调、动脉硬化病及动脉瘤等。

半胱氨酸蛋白酶习惯上被看作是最终降解的溶酶体介质。然而，在人类生物学中，半胱氨酸蛋白酶还曾起了更多更广泛的作用。人们发现这个家族中的一些成员由有限的组织表达来调节并在细胞生理学中起重要作用，如：细胞刁亡，激素的激活，MHC二级免疫反应，以及对骨骼发展十分重要的细胞外基质重塑等。

基于其不同的结构和功能，半胱氨酸蛋白酶可分为两大类。与ICE相关的酶类和木瓜酶类。ICE酶类和木瓜酶类不具有序列同族关系，在炎症和细胞刁亡中起到越来越明显的作用。ICE促进了白细胞间介素-1β的形成，以及从其非活跃性产生母体，Pro-1β和pro-IGIF中IGIF的形成。白细胞间介素-1β为与发炎、糖尿病、败血休克、风湿性关节炎和早老性痴呆有关的一种免疫调节性蛋白质。ICE和/或其它caspases亦与包括帕金森疾病，局部缺血症和横向肌萎缩硬化症在内的与抑制神经紊乱相关的神经元细胞刁亡有关。

在半胱氨酸蛋白酶的木瓜酶类中，钙激活中性蛋白酶包括一组在哺乳动物组织中无处不在地表达的细胞内半胱氨酸蛋白酶。钙激活中性蛋白酶严格地依赖钙，但其蛋白酶区却与木瓜酶的极其相似。钙的感受性来自木瓜酶类蛋白酶与类调钙蛋白区的遗传性聚变。

现已鉴定出三种主要的钙激活中性蛋白酶。钙激活中性蛋白酶I，II和p94。半胱氨酸蛋白酶的钙激活中性蛋白酶家族与许多疾病和紊乱有涉，包括：中风、抑制神经病、早老性痴呆、肌萎缩、运动原神经细胞损坏、急性中枢神经***损伤，肌肉营养失调，骨再吸收、血小板聚合，白内障和炎症。钙激活中性蛋白酶I与由包括局部缺血、血糖过低和癫痫病在内的毒害神经性紊乱引起的刺激性氨基酸有涉。半胱氨酸蛋白酶p94是钙激活中性蛋白酶家族中一个肌肉-特异成员，已被认为是一种对肢带肌肉营养失调负责的基因产物。

组织蛋白酶是属于半胱氨酸蛋白酶超级家族中木瓜酶类的一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶。它在组织中广泛地分布而表达各异。在部分小环境中，这些酶素在具体蛋白质和组织的蛋白质水解和更新过程中起着一份作用。组织蛋白酶也通过酶原活化来启动分解蛋白串联，参与受制于抗原性多肽的功能性MHC II级分子表达，并在抗原表达细胞中处理抗原。

此家族中不同成员表达各异，某些形式的组织蛋白酶与免疫***中的单核细胞、巨噬细胞和其它细胞联系密切。这一家族中的一些能释放到细胞外面的成员通过胶原质，昆布氨酸，弹性蛋白和其它结构性蛋白质的降解在组织重塑中起作用，并和与免疫性反应密切相关的炎症有涉。

组织蛋白酶的异常调节和反应在不同的发炎性疾病状态下非常明显。在与发炎的关节骨液相隔离的细胞中，scromelysin，激素，TIMP-1，组织蛋白酶，胶原蛋白酶和其它分子的mRNA最先表达出来。例如：组织蛋白酶L和D的表达，在患有风湿性关节炎和骨关节炎的病人的关节骨液组织中会提高。组织蛋白酶L的表达还可以促成加剧风湿性滑膜破坏的单核细胞的注入。

组织蛋白酶还与其它几种免疫性反应有涉。在人类肾小球疾病的老鼠样本中，投用半胱氨酸蛋白酶的一种特有的，不可逆性的抑制剂可显著降低蛋白尿症。与血栓性血小板减少紫癜有关的血小板聚合半胱氨酸蛋白酶显示了溶酶体组织蛋白酶的特点。而且，组织蛋白酶的增加的表达与不同调节和多种癌症的新陈代谢潜力相关，因而在治疗和预兆方面具有意义。

目前，有许多种溶酶体半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶，其特点在于酶素活性的标准蛋白离析及随后的物理特性以及所使用的分子生物技术。当前组织蛋白酶的已知形式包括：组织蛋白酶B，C，F，H，J，K，L，M，O，Q，R，S，T，U，V，W和Z。在将来还可能鉴定出其它形式的组织蛋白酶。

在组织蛋白酶的所有形式中，组织蛋白酶B的数量最为丰富，分布最为广泛。它的内场酶活性较弱，但其羧肽酶活性极强。其主要作用是降解不需要的和循环的蛋白质，并将其转移至内涵体和溶酶体内的酸性成分中。组织蛋白酶B的作用似乎由其促进剂的辅助性来反应。已发现其在固状瘤中高度表达从而与瘤的侵入和转移有涉。

尽管表达的仅是N-端二肽酶活性，组织蛋白酶C已被发现是一种典型的木瓜酶类酶。

组织蛋白酶O也是一种典型的木瓜酶类酶。其首先从***癌cDNA库相分离但却被发现在其它组织分布中也很广泛。

组织蛋白酶F与组织蛋白酶W具有58％的相似性，而这一相似性与组织蛋白酶L，K，S，H和O为42-43％，与组织蛋白酶B为38％。

组织蛋白酶F在心脏、骨骼肌、大脑、睾丸及卵巢处大量表达，在***、胎盘、肝脏和结肠处表达适度，在白细胞末梢和胸腺处未见其表达。

组织蛋白酶K最初在兔子的破骨细胞中作为cDNA而被发现，被称为OC-2。组织蛋白酶K为一典型的半胱氨酸蛋白酶，具有木瓜酶家族显著的信息肽，前体肽及催化反应区特点。组织蛋白酶K的表达既有限又可调节。其在卵巢和破骨细胞中大量表达，亦在人类肺巨噬细胞里发现少量的这种酶。组织蛋白酶K似乎在炎症部位不受调节。

组织蛋白酶K是目前所知的最有效的哺乳动物弹性蛋白酶。其它弹性蛋白酶，例如与组织蛋白酶K具有一定程度氨基酸序列相似性的组织蛋白酶S和L，要比组织蛋白酶K较弱。组织蛋白酶K虽然比组织蛋白酶S或L更有效，但其中性pH值并不稳定，组织蛋白酶K的pH值不稳定性与其作为溶酶体酶和作为由破骨细胞隐匿于酸环境下的酶体的基本功能是相一致的。组织蛋白酶K在细胞外基体重塑中可能起一定作用，从而可作为治疗目标治疗象骨质疏松症那样的骨紊乱症。

组织蛋白酶S最初被确定为在淋巴节中活性的一种独特的酶。人们发现其显著表达随后从脾中得到净化。如上所述，组织蛋白酶S是一种具有大量酶素活性及中性pH值稳定性的弹性蛋白酶。此种酶显示了组织表达的有限性和可调性，可由如γ干扰素和白介素1β等激素的刺激来产生。在老鼠身上，组织蛋白酶S在甲状腺组织中表达，并可由刺激甲状腺性荷尔蒙产生。组织蛋白酶S亦在脾和抗原显示细胞中大量表达，这种细胞包括B淋巴球、巨噬细胞及树突状细胞。

人们发现组织蛋白酶S在II级抗原显示中起关键性作用。这与其在脾和淋巴节中大量表达是一致的。其也可以由激素产生，而激素已知与MHCII级抗原表达有涉。组织蛋白酶S与MHCII级抗原表达通道中的两个步骤有涉。1)降解与MHCII结合的不变性陪伴分子(Ii)。2)产生与肽分子来取代与MHCII结合的Ii终产物。

研究表明组织蛋白酶S对一相对较迟的Ii降解起作用，并被用来对随后多肽细胞内转移的进行有效蛋白质水解。组织蛋白酶S的抑制或不足会导致MHCII级过程进而造成抗原表达的削弱。人们已设想，白组织蛋白酶S在抗原表达中起重要作用以来，可把其作为发展治疗某些疾病的疗法目标，这些疾病与对外生性抗原免疫性反应有关，例如哮喘，移植注射，超敏性肺炎和可能的自体免疫性疾病。

组织蛋白酶L为弹性蛋白酶的一种，和组织蛋白酶B，F，H和O相比，与组织蛋白酶S和K具有更高的氨基酸序列同族关系。因其与组织蛋白酶K具有序列同族关系，组织蛋白酶L在骨形成和再吸收特别是在胶原质骨蛋白的分解中起了作用。

不同的组织蛋白酶蛋白酶在其基因结构和转录调节上不同。组织蛋白酶L基因促进剂没有TATA box但包括几个SP-1区，2个AP-2转系调整元素结合区和一个cAMP反应元素区。组织蛋白酶L的表达可由恶性变化，生长因素，瘤促进剂和循环性AMP来引起。最近，组蛋白L被发现参与了胸腺上皮细胞Ii的降解过程，从而影响了CD4+细胞的选择。

2、调节脂肪的组织蛋白酶的抑制剂

现已有许多组织蛋白酶的抑制剂被发现，尤其是组织蛋白酶L。这些制剂可通过降低组织蛋白酶表达的体内活性来对准调节脂肪。此制剂可在cDNA或调节组织蛋白酶的调整区基础上调节组织蛋白酶的活性。例如，可利用象反义抑制剂和核糖酶一类的以DNA为基础的制剂来对准组织蛋白酶基因的基因内显子和外显子。

或者，在包括处理和/或调节组织蛋白酶的三维蛋白结构的氨基酸序列的基础上，这些制剂可调节组织蛋白酶的活性。以蛋白质为基础的制剂，如人体抗原，非人体单克隆抗体和教化性抗体，可被用来对准调节组织蛋白酶脂肪的抗原决定基。缩氨酸可充任受制于某一组织蛋白酶活跃区的高亲和抑制剂，因而抑制了组织蛋白酶的体内活性。小分子亦可被用来对准组织蛋白酶，尤其是对组织蛋白酶L具有高度选择性的组织蛋白酶。

除了对准调节组织蛋白酶活性的作用外，这些可积极抑制调节脂肪的组织蛋白酶制剂还可通过与组织蛋白酶中性目标分子竞争来与酶结合。

a)、以核酸为基础的制剂

如反义分子和核糖酶这样的以核酸为基础的制剂可被用来对准组织蛋白酶基因的基因内显子和外显子以抑制基因表达，由此来抑制目标组织蛋白酶的活性。进一步地说，三重螺旋分子也可被用来抑制组织蛋白酶基因活性。这种分子可被用来降低或抑制野生型组织蛋白酶基因，或突变异种组织蛋白酶基因活性。有关此种分子的生产及应用已为业内所熟知。下面就简洁的介绍一下：

反义RNA和DNA分子通过与靶mRNA杂交直接阻遏mRNA的翻译，并阻止蛋白质翻译。反义途径包括与靶基因mRNA互补的寡核苷酸的设计。寡核苷酸将与互补靶基因mRNA结合转录并阻止翻译。完全互补虽然是优选的，但是不需要。

如这里所提及的，一个序列“互补”至一个RNA的一部分意味着一个序列有足够的互补与RNA杂交，形成一个稳定的双链，就双链反义核酸而言，双链DNA的一个单链可以这样被测定，或者三链形成可以被测定。杂交的能力将取决于互补的程度和反义核酸的长度。一般来讲，核酸杂交越长，它所包含的碱基与RNA的错配越多，并形成一个稳定的双链(或者三链，可以是这样)。

本领域的普通技术人员能通过标准程序测定这种杂交复合物的解链点来确定错配的可容忍程度。

寡核苷酸与信息的5’末端互补，例如互补到5末端非翻译序列并包括AUG起始密码子，应该在阻止翻译中最有效，然而，与mRNA的3’端未翻译序列互补的序列也已显示有效地阻止mRNA的翻译[Wagner(1994)《自然》372：333-335]。

例如，与人或鼠的组织蛋白酶L基因的3’端或5’端未翻译区、非编码区互补的寡核苷酸，可被用于反义方法来阻止内源性组织蛋白酶L mRNA的翻译。表1列出了人[SEQ ID NO：5]和鼠[SEQ ID NO：6]组织蛋白酶L的5’端未翻译区的DNA序列。

与mRNA 5-端未转换区互补的低核苷酸应包括AUG启动密码子。与mRNA编码区互补的反义低核苷酸为效率较低的转换抑制剂，但可以用于本发明。无论是否设计成与目标基因mRNA的5’-，3’-端或编码区杂交，反义核酸的长度优选至为6个核苷酸，长为6-50个核苷酸的低核苷酸更佳。具体地说，低核苷酸至少为10个核苷酸，至少17个为佳。

或者，将反义分子设计成以翻译区为靶基因，即组织蛋白酶基因的cDNA。表1列出了人类组织蛋白酶L的DNA序列[SEQ ID NO：1]及氨基酸序列[SEQ ID NO：2]和老鼠组织蛋白酶L的DNA序列[SEQ IDNO：3]及氨基酸序列[SEQ ID NO：4]。

例如，可使用对准成熟老鼠组织蛋白酶L基因的整个编码序列或一部分的反义RNA分子来抑制组织蛋白酶L的表达，从而降低其酶活性。

此外，全部或部分组织蛋白酶LcDNA(表1)还可被反向进一步亚克隆到表达载体pcDNA3中，并将这种结构转染到细胞内以产生反义多聚RNA，来阻止象组织蛋白酶L在内的组织蛋白酶内源性转录，从而抑制组织蛋白酶的表达。

可在体外进行研究以测定反义低核苷酸抑制基因表达的能力。这些研究最好使用能够区别低核苷酸反义基因抑制和其非特异性生物效应的对照组。最好将目标RNA或蛋白质水平与内部对照RNA或蛋白质的水平相比较。而且要将使用反义低核苷酸获得的结果与通过使用对照低核苷酸获得的结果相比较。对照低核苷酸最好与测试低核苷酸在长度上大体相等，而低核苷酸的核苷酸序列与反义序列的差异不应当超过为防止与靶基因特异性杂交所必须的程度。

低核苷酸可以是DNA或RNA或嵌合混合物或衍生物或修饰物，可以是单链或双链，可以对低核苷酸的碱基，糖基或磷酸盐主链进行修饰以改进分子或杂交的稳定性。低核苷酸可以包括其它附加基团，例如：多肽(如，为在体内与宿主细胞受体结合)，或促进通过细胞膜[参见：Letsinger(1989)Proc.Natl.Acad.sci.U.S.A.86：6553-6556]或脑血屏障[参见：PCT公开号No.WO89/10134]转运的制剂，杂交启动阻断剂[Krol(1988)Bio Techniques6：958-976]或嵌入剂[参见Zon(1988)Pharm.Res.5：539-549]。低核苷酸还可以结合到另一种分子上，例如：多肽，杂交启动交叉结合制剂，传送制剂，杂交启动阻断剂等。

反义低核苷酸可以包括至少一种修饰的碱基，而且这种碱基是从包括但不局限于下列各项中选择出来的：5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，6-氧嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿甘，5-羧基甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，β-D-半乳糖甙次黄苷，次黄苷，N6-isotentenyladenine，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基次黄苷，2，2-二甲基胞嘧啶，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5｀-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基胞嘧啶，2-methylthio-N6-isotentenyladenine，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，5-甲基-2-硫尿嘧啶，-3(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶，(acp3)w，和2，6-二氨基嘌呤。

反义低核苷酸亦可以包括至少一种修饰的糖基，而这种糖基是从包括但不局限于阿糖，2-氟阿糖，木酮糖，和己糖木糖和己糖中选择出来的。

在另一种情况下，反义低核苷酸还可以包括至少一种修饰的磷酸盐主链部，而这种主链部是从包括硫代磷酸盐，二硫代磷酸盐，硫代氨基磷酸盐，酰胺磷酸盐，二酰胺磷酸盐，甲基膦酸盐，烷基磷三酯，和甲酰乙缩醛及其类似物在内的各项中选择出来的。

在另一种情况下，反义低核苷酸是一种α-端基异构低核苷酸。α-端基异构低核苷酸形成了与RNA互补的特异性双链杂交物，其中，与通常β-单位相比，各链互相平行，此低核苷酸为2’-O-甲基核糖核苷酸或为一种嵌合RNA-DNA类似物。

所发明的低核苷酸可由为业内众所周知的标准方法，例如自动DNA合成器来合成；再如，硫代磷酸盐低核苷酸可通过Stein方法进行合成[1988，Nuci.Acids res.16：3209]，甲基膦酸盐低核苷酸可通过可控制性细孔玻璃聚合体支撑物来准备。

根据本发明，反义分子被运送到细胞内，在体内表达调节脂肪的组织蛋白酶基因。把反义DNA或RNA运送到细胞内的许多方法已被找到。例如：可把反义分子直接注入到组织部位，或体内给药那些设计成直接作用于靶细胞的修饰反义分子(如，与肽相联的反义分子或者与受体特异性结合的抗体或在白细胞表面表达的抗原)。

然而，通常很难获得足以抑制内源性mRNA翻译的反义的细胞内含量。所以一个优选方法是利用一种重组DNA结构，在这种结构中，反义低核苷酸被置于一种polIII或polII启动子的控制之下。在病人身上使用这种结构来转染目标细胞会导致足量单链RNA的转录，而这种RNA会与内源性目标基因转录物形成互补性碱基对，从而阻止目标基因的mRNA的翻译。例如可以将一载体导入体内，转入细胞内，控制反义RNA的转录。只要这种载体能被转录产生所需的反义RNA，它就可成为附带体或在染色体水平上整合。可用现有技术中的重组DNA技术方法构建这种载体。这种载体可以是质粒，病毒或现有技术当中已知的在哺乳动物细胞内用来复制或表达的其他载体。病毒载体的例子包括但不限于基于重组病毒的病毒载体，如修饰或重组上位反转录病毒，腺病毒，腺性病毒，牛痘病毒及疱疹单式病毒。

可用现有技术中已知的在哺乳动物，最好是人类细胞内起作用的任何启动子来表达编码反义RNA的序列。这种启动子包括但不仅限：SV40前期启动子区(BERNOIST AND CHAMBON(1981)NATURE290：304-310)，包含在鲁斯氏肉瘤病毒的3’-长端重复序列(YAMANOTO ET AL.1980，CELL 22：787-797)，疱疹胸苷激酶启动子(WAGNER ET AL.1981 PROC.NATL ACAD SCI.USA 78：1441-1445)，金属硫因基因的调节序列(BRINSTER ET AL.1982NATURE 296：39-42)等。任何形式的质粒，YAC或病毒载体都可用来制备重组DNA结构，以便将其直接导入到组织位点。或者，可使用有选择地传染所需组织的病载体。在这种情况下，可通过另一途径来完成给药。

亦可使用用来促进断裂目标基因mRNA转录物的核糖酶分子，以防止目标基因mRNA的翻译，从而组织目标基因产物的表达。

核糖酶是一种能够促进RNA特异性断裂的酶RNA分子。其作用的机理包括核糖酶分子与互补目标RNA的特异性序列杂交，随后为一内切核苷酸的***过程。核糖酶分子的组成应包括与目标基因mRNA互补的一个或多个序列，还应包括负责断裂mRNA的催化序列。

尽管可使用在位点特异性识别序列断裂mRNA的核糖酶来破坏目标基因mRNA，最好还是使用锤头状核糖酶。锤头状核糖酶在某些部位***mRNA，这些部位由与目标mRNA形成互补碱基对的侧面区域决定。唯一的要求是目标mRNA具有下列双碱基序列：5’-UG-3’。锤头状核糖酶的制取已为业内所熟知，并在Haseloffand Gerlach，1988(Nature)334：585-591中有更为详尽的说明。

最好对核糖酸进行设计以便使***识别部位位于目标基因mRNA的5’末端附近；即：提高效率并尽量降低非功能性mRNA转录物的细胞内积聚。

目前发明的核糖酶亦包括RNA核糖核酸内切酶。如：在嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)中自然发生的(称作IVS或L-19 IVSRNA)，其已由Thomas Cech及其合作者进行过详尽的描述。这种类型的核糖酶具有8个碱基对活跃部位，其与某一目标RNA序列进行杂交后便引起了目标RNA的***。此发明包括那些对准至少8个在组织蛋白酶基因中存在的碱基对序列的核糖酶。

与反义方法相同，核糖酶由修饰的低聚核苷酸组成，并被运送到在体内表达组织蛋白酶基因的细胞内。一个更可取的运送方法包括使用一DNA结构，在一增强连续性pol lll或pol ll启动子的控制下对核糖酶进行编码，以便转染细胞会产生足够数量的核糖酶来破坏内源性目标基因信息并抑制翻译。由于核糖酶起催化作用，与反义分子不同，较低的细胞内含量即产生效果。

内源性组织蛋白酶基因表达亦可通过使用目标同源重组技术灭活或破坏目标组织蛋白酶基因或其启动子来降低。例如，可使用带有或不带有可选择性标识和/或负性可选择性标识的一突变性、非功能性、与内源性目标基因(靶基因的编码区或调节区)同源的DNA位于两侧的目标基因(或一完全不相关的DNA序列)来转染在体内表达目标基因的细胞。

通过目标同源重组技术***DNA结构会导致目标基因的灭活。这些方法特别适合农业领域，其中可使用修正的干细胞以产生具有非活跃目标基因的动物后代。例如，可破坏牲畜的组织蛋白酶L基因以产生具有较低体内脂肪含量的动物。然而只要重组DNA结构被直接投用或使用适当的病毒载体在体内对准所需部位，此方法在人类身上亦可使用。

或者，可通过对准与组织蛋白酶基因调整区域(即，靶基因启动子和/或增强子)互补的脱氧核苷酸序列来降低内源性组织蛋白酶基因表达，以形成避免体内目标细胞中目标基因转录的三级螺旋结构。

用以抑制转录的在三级螺旋形成中使用的核酸分子应该是单链的并由脱氧核苷酸组成。这些寡核苷酸的碱基组成必须通过Hoogsteen碱基配对规则来设计以促进三级螺旋的形成，这通常需要嘌呤或嘧啶的大量伸展以在某一复式结构的单链上展现。核苷序列可以以嘧啶为基础，这会导致TAT和CGC三联体横穿三股螺旋的三个相关链。富含嘧啶的分子提供了与复式结构的单链富嘌呤区域互补的碱基，并与此单链方向平行。此外，可选择富含嘌呤的核酸分子，例如，包含有G残基的伸展。这些分子会形成带有丰富GC对DNA复式结构的三股螺旋，其中嘌呤残基的大部分位于目标复式结构的单链上，导致GGC三联体横穿三股螺旋的三个链。

或者，可通过创造一个称为“之”字核酸分子来增加可对准三股螺旋形成的潜在序列。“之”字分子以5’-3’，3’-5’交替的方式合成，这样它们与复式结构的第一个链形成基对，然后再和另一个形成基对，排除了嘌呤或嘧啶的大量伸展以在某一复式结构的单链上展现的必要性。

在此所述的利用反义、核糖酶和/或三股螺旋分子来抑制突变异种基因表达的情况下，有效的降低或抑制由正常目标基因等位基因产生的mRNA的转录(三股螺旋)和/或转换(反义、核糖酶)的技术是可能的。当正常目标基因产物的含量比正常显型所必需的要低时，这种可能性就会出现。在这种情况下，为保证目标基因活性的正常水平得以维持，可通过基因治疗方法将编码并表达显示一般靶基因活性的靶基因多肽的核酸分子引入到细胞内，而这些细胞不含有对使用反义、核糖酶或三股螺旋疗法敏感的序列。或者，在目标基因编码一种细胞外蛋白质的情况下，为了保持目标基因活性必不可少的水平，最好同时一般靶基因蛋白质。

如上所讨论，反义RNA和DNA、核糖酶以及本发明的三股螺旋分子可由业内所熟知的任何一种合成RNA和DNA分子的方法来制备。这些方法包括业内所熟知的用化学手段合成寡聚脱氧核苷酸和寡核苷酸的技术，例如固相氨基磷酸酯化学合成。或者，通过反义RNA分子RNA分子DNA编码序列体内或体外转录来产生RNA分子。这种DNA序列可被整合入多种载体中，这些载体结合有合适的RNA聚合酶启动子，如T7或SP6聚合酶启动子。或者，根据所使用的启动子，将合成反义RNA的反义cDNA结构稳定地引入细胞系中。

b)抑制组织蛋白酶基因产物的抗体

以蛋白质为基础的治疗剂，如人类抗体，非人类单克隆抗体及人性化抗体，可被用来特异性地作用于调节脂肪的组织蛋白酶不同抗原决定基。对组织蛋白酶基因蛋白质有特异性并干预其活性的抗体可被用来抑制组织蛋白酶基因功能。无论哪里需要，亦可用对干预这种突变异种组织蛋白酶产物活性的突变异种组织蛋白酶蛋白质有特效的抗体来抑制组织蛋白酶基因功能。这种抗体可使用抗组织蛋白酶或抗与组织蛋白酶的部分相一致的多肽的标准方法来产生。这种抗体包括但不限于多克隆的、单克隆的，Fab断片、单链抗体，嵌合体抗体等等。

已发展了许多方法来产生能够特别辨别一个或更多表达不同或通路基因抗原决定基的抗体。这种方法包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体(mAbs)、人性化或嵌合体抗体、单链抗体、Fab断片、F(ab’)₂断片、Fab表达库产生的断片、抗个体遗传型抗体和上述任何一种抗原决定基-结合断片。例如，这种抗体可在生物样本中的指纹、目标或通路基因的检测中使用，或是作为抑制异常的目标基因活性的方法来使用。因此，这种抗体可被用来作为体重紊乱治疗方法的一部分，和/或被用来作为诊断技术的一部分，利用它可检测病人的指纹、目标或通路基因蛋白质的异常水平或这种蛋白质异常形式的存在。

为产生某一组织蛋白酶基因的抗体，可通过注射一组织蛋白酶蛋白质或其一部分来使不同的寄主动物获得免疫。这种寄主动物包括但不限于兔、老鼠及田鼠，这里仅举几例。可使用不同的免疫佐剂来提高免疫性反应，而这取决于宿主种类，包括但不限于Freund’s矿物胶凝体(完全和不完全)，如：氢氧化铝；表面活性物质，如溶血卵磷脂、pluronic多羟基化合物、聚苯胺、缩氨酸、油乳剂、键孔帽贝血蓝质、二硝基酚及对人类有潜在用处的辅剂，如BCG和短小棒状杆菌。

多克隆抗体为衍生自以抗原免疫动物的血清的抗体分子的不同种类群体。例如，组织蛋白酶基因产物或其抗原功能衍生物。为产生多细胞株抗体，上文所述的寄主动物可由注射组织蛋白酶基因产物获得免疫，亦可用上述辅剂加以补充。

单克隆抗体为与某一抗原同类的抗体群体，可由任何通过人工繁殖的持续细胞系为抗体分子的产生创造条件的技术获得。这些包括但不限于Kohler和Milstein的杂种细胞技术。这些抗体可为任何免疫血球素中的一种，包括1gG、1gM、1gE、1gA和其它任何亚纲。可在试管或体内培植产生本发明mAb的杂种细胞。体内mAb高滴度的生产使其成为目前最佳的生产方法。

根据本发明，在某一更佳的情况下，抗组织蛋白酶L，前组织蛋白酶L或另一调节脂肪的组织蛋白酶的单克隆抗体被用来作治疗肥胖和相关疾病的基因治疗剂。这种抗体的实例包括但不限于：通过给老鼠注射净化的人类前组织蛋白酶L使之获得免疫，因而所产生的老鼠抗组织蛋白酶L单克隆抗体。这种抗体可从德国Labsoft Diagnostics AG处获得，包括克隆CPLH2D4，CPLH33/1，CPLH33/2和CLP1/36。

克隆#CPLH2D4可辨别抗原决定基：人类前组织蛋白酶L的前体多肽分子T67SEEFRQVMNGFQ79[SEQ ID：7]，但不能辨别成熟单或双链组织蛋白酶L。

克隆#CPLH33/1(异型鼠IgG1，kappa)可辨别抗原决定基：F241YKE244[SEQ ID：8]辨别成熟单或双链组织蛋白酶L。

克隆#CLP1/36(异型鼠IgG1，kappa)可用人类前组织蛋白酶L的多肽Y200SVANDTGFVDIPKQEKA217[SEQ ID：9]使老鼠获得免疫后产生。其能辨别抗原决定基：I211PKQ214[SEQ ID：10]并亦能辨别成熟单或双链组织蛋白酶L。

克隆#CPLH3G10(异型鼠IgG1，kappa)与抗原决定基结合：老鼠前组织蛋白酶L的H304CGLATAASY313[SEQ ID：11]，能辨别成熟单链老鼠组织蛋白酶L和成熟双链老鼠组织蛋白酶L(轻链)以及老鼠前组织蛋白酶L。此抗体亦可辨认成熟人类单链组织蛋白酶L，成熟人类双链组织蛋白酶L(轻链)，人类前组织蛋白酶L以及老鼠组织蛋白酶L(轻链)。

此外，也可利用可产生嵌合体抗体或人性化抗体的技术来修饰老鼠单克隆抗体以降低非人类抗体的免疫原性。这种抗体由适当抗原特异性的老鼠抗体分子基因与适当生物活性的人类抗体分子基因的结合产生，也可被使用。嵌合体抗体为一不同部分衍生自不同动物种类的分子，例如那些具有衍生自老鼠mAb的不同区域及人类免疫血球素恒定区域的抗体。

或者，可对描述单链抗体产生的技术进行修改以产生表达不同或通路基因单链抗体。单链抗体通过一氨基酸桥连接Fv区域的重链轻链断片来形成，产生一单链多肽。

能辨别具体抗原决定基的抗体断片可由已知技术来产生。例如，这种断片包括但不限于：可由胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab’)₂断片以及可由降低F(ab’)₂断片的二硫化物桥所产生的Fab断片。或者，可构建Fab表达库，来迅速而容易地辨认具有所需特异性的单克隆Fab断片。

由于目标基因蛋白质——组织蛋白酶是一种细胞内酶，可使用整个抗体而内在抗体最佳。然而，脂质体可被用来把抗体或结合到目标基因产品抗原决定基的Fab断片运送到细胞内。只要有使用抗体断片的地方，最好使用结合到目标蛋白质结合区的最小抑制性断片。例如，可使用具有与结合到组织蛋白酶上的抗体可变区相一致的氨基酸序列的多肽。这种肽可用化学方法合成，或通过重组DNA技术用业内众所周知的方法来制成。

或也可使用结合到组织蛋白酶抗原决定基的单链中和抗体。例如，可对这种单链抗体的给药可以通过使用Marasco所表述的技术把编码单链抗体的核苷序列在目标细胞内部进行表达来实现的。

C)抑制组织蛋白酶基因表达或合成的制剂

根据本发明，可通过使用调节脂肪的组织蛋白酶基因，优选组织蛋白酶K，L和S，更优选是组织蛋白酶K和L，最好是组织蛋白酶L，的表达调节剂来对脂肪形成加以调整。

目前有很多方法可以用来抑制调节脂肪的组织蛋白酶基因或基因产物的表达，从而抑制了脂肪形成，于是最终减轻由于肥胖病以及相关疾病如II型糖尿病和高血压带来的症状。

基因的活性可以被抑制。举例来说，即可通过降低从靶向组织蛋白酶基因转录而来的mRNA的活性，也可通过抑制蛋白酶基因产物的转化或后转化过程等方法来加以抑制。

受肥胖病，糖尿病以及相关疾病困扰的患者可以利用基因疗法来进行治疗。控制蛋白质产生的一份或多份基因或者基因片段可以被用来注入到细胞中，以干扰组织蛋白酶基因的转录与翻译机制。用在基因疗法中的载体包括，但并不局限于腺病毒，腺相关病毒和逆转录酶病毒载体，以及其他可以用来作为向细胞中引入DNA的粒子，如脂质体。

这些技术可以被用来干扰调节脂肪的组织蛋白酶的转录，如人类组织蛋白酶L。人类的[SEQ ID NO：5]和鼠类的组织蛋白酶L[SEQ IDNO：6]的5’调整序列(如启动子/增强子序列)已经分别在Chauhan etal.(1993)J.Biol.Cherm 268：1045(人类)和Troen et al.(1991)CellGrowth Differ.2：23-31(鼠类)中加以描述。

另外，可以给药一种与某种特定的蛋白质，如人类组织蛋白酶基因的转录剂因子，特异性结合抗体，可以直接或间接地激活组织蛋白酶L的功能。这些抗体包括但并不局限于多克隆或单克隆抗体，Fab片段，单链抗体，嵌合性的抗体和类似体等。这些抗体可利用在上述b部分中所描述的标准技术来制造。这些抗体可制备成抗蛋白质或蛋白质相应部分出来。根据上文提到的技术，它们也可做为药物使用，请参见文章后面的B部分。

此外，任何其他能改变组织蛋白酶基因表达水平或是蛋白酶基因产物表达水平的已鉴定出的化合物，都可在此运用。用药的技术可参见下文的第三部分。d)抑制调节脂肪的组织蛋白酶的活性的药剂

多肽或peptidomimetics由于其能够非常紧密地附着在调整脂肪的组织蛋白酶的活性部位，从而可以作为限制组织蛋白酶活性的非常有效的工具。在表2，3，4中分别列出了限制组织蛋白酶S，K和L的例子。

另外，组织蛋白酶的前区可以用来限制其亲本酶的活性。游离态的组织蛋白酶的前区是其成熟酶的强有力的非共价的活性抑制剂，参见Guay et al.(2000)Euro.J.Biocherm.：6311-6318.有结论证明人类组织蛋白酶L的前肽的抑制作用是人类组织蛋白酶S的500倍，同时人类组织蛋白酶L的选择性是人类组织蛋白酶S和人类组织蛋白酶B的至少10000倍。请参见Carmona et al.(1996)Biocherm.35：8149-8157.有研究表明，与人类组织蛋白酶K，L和B相比，肝吸虫组织蛋白酶L的前肽是更好选择性的抑制剂。

对于组织蛋白酶K，L和B的晶体结构的X射线分析显示，前区会在酶之间的有活性的裂缝处产生重叠，使其相互干扰，从而对其原有或非原有的结合点进行破坏，同时也影响了所谓前肽结合环的作用。关于这方面的论述可参见Sivaraman et al.(1999)Protein 32：504-514.前区伸展通过活性位点的方向与天然底物的反向是相反的，因此，前肽的结构不是正确的在活性位点残基出被切割。

对于组织蛋白酶K，L和S来说，其相应的前肽可依照在Guay etal.supra中描述的方法，利用E.coil细胞中蛋白质的表达来获得。其他的，如利用化学合成来生产蛋白质的方法，对于本领域的普通技术人员来说是已知的。

另外，小分子也可以被用来抑制组织蛋白酶的活性。这种小分子抑制剂相对于其他形式的组织蛋白酶来说对某些特定结构的组织蛋白酶更具有选择性，或者它只对于某一种结构的组织蛋白酶具有抑制作用。我们希望这种小分子在各种组织蛋白酶中对于组织蛋白酶K，L和S的作用更强；在更为理想的情况下，我们希望小分子应更倾向于对组织蛋白酶K，L发生作用；当然，我们最希望看到在各种组织蛋白酶中，它对于组织蛋白酶L的作用更具有选择性。

小分子对于组织蛋白酶L，K或S的抑制作用相对于其他各种非脂肪控制的组织蛋白酶来说是更好的抑制剂。在某种情况下，小分子抑制剂对比其他各种非脂肪控制的组织蛋白酶，对组织蛋白酶L的作用更强；在另一种情况下，小分子抑制剂对于组织蛋白酶L的作用强于组织蛋白酶K或S；在某种特定情况下，对于某种或某类组织蛋白酶(如组织蛋白酶L)来说，小分子对其的抑制作用比对于其他某种或某类组织蛋白酶的抑制作用要强的多，例如对组织蛋白酶L的抑制作用是对于组织蛋白酶K或S抑制作用的至少10倍，更为理想的情况是至少100倍，最理想的情况是至少1000倍。

表4列出了文中所示的利用小分子，多肽以及peptidomimetics抑制组织蛋白酶L进行治疗的一些范例。表2和表3分别列出了利用小分子抑制组织蛋白酶S或K的一些例子。关于各种不同结构组织蛋白酶的抑制潜能(Ki，离解常数)以及相关资料也在这些表格中相应列出用于说明这些生物材料的合成。3.药物制剂和给药方法

上文所提到的用来抑制组织蛋白酶基因表达、合成和/或活性的化合物，核酸分子和病毒载体可以以治疗有效剂量给患者给药，用来治疗或缓解肥胖病，糖尿病以及相关疾病。治疗的有效剂量是指剂量达到一定程度，从而有效改善肥胖症，糖尿病和相关疾病的症状，或是指一定剂量的核酸分子，能表达一定浓度的基因产物，从而改善了相应疾病的症状。

通过标准的在细胞培养或实验动物的制药过程，可以决定这些药剂的毒性和疗效，如，决定LD₅₀和ED₅₀的剂量。在毒性和疗效之间的剂量比例是治疗的指数，可以由LD₅₀/ED₅₀的比例来表达。有很大的治疗指数的药剂被优先选取。当使用的药剂有毒副作用时，需要小心地设计出一套传递***，使得这些化合物能靶向治疗感染的组织，使未感染的细胞受到的潜在损害降低到最小范围，从而降低副作用。

从细胞培养化验和动物研究中所获得的数据，可以用来设置一个给人用药的剂量范围。这些化合物的剂量范围倾向与在一个包含ED50的，有一小点或没有毒性的循环的浓度范围内。剂量是否在这个范围内取决于使用和给药的途径。在这项发明中所采用的方法中用了的各种药剂，治疗的有效剂量最初从细胞培养化验中估计而得。就如同在细胞培养化验中来决定那样，一剂药可能要用在动物模型上来获得包括IC50的循环血浆浓度范围，  这些信息可以用来更精确的决定用在人身上的剂量。血浆中的水平可被测定，如，采用高性能的层析法。

根据这项发明所使用的治疗剂，可以通过使用一种或多种生理学上接受的载体或赋形剂的传统的制药方法来制备。

因而，组织蛋白酶抑制剂以及他们的生理学上可接受的盐类和可溶物可通过吸入，吹入(从嘴或是鼻子)，口服，注射和直肠的方式给药。

对口服用药，药品可采用药片或胶囊的形式，这些药片或胶囊可通过传统的制药方法以及用一些制药上接受的赋形剂，如黏合剂，填充剂，润滑剂，分解剂，或润湿剂来获得。药片可由广为人知的工艺来做包衣。口服液的形式可以是溶液，糖浆或悬浮液，或是在使用前是一种由水或其他方便的媒介组成的干的产品。口服液也可由传统的方法以及用一些制药上接受的添加剂，如悬浮剂，乳化剂，非水的媒质，防腐剂等来获得。口服液中可能还适当的包含了缓冲的盐类，调味品，色素和增甜剂。

为了口服，可适当的制备成活性化合物的控释制剂。

为了吸入使用，此药物化合物根据本发明可以借助适当的推进剂，如：二氯四氟代甲烷，三氯氟甲烷，二氯二氟甲烷，二氧化碳或其它气体，采用压力容器或喷雾器形式进行输送。如果是喷雾器的话，其剂量单位可由所提供的用来输送一定数量的活门来决定。在吸入器或吹药器中所使用的凝胶胶囊和药筒，可由包含有如乳糖或淀粉的适当粉剂基质和化合物的粉剂混合物来配制。

组织蛋白酶抑制剂可通过注射，如丸药注射或持续灌输来配制，以供非肠道注射药物的使用。注射用配制物与添加的防腐剂一起以单位剂量的形式，如用安瓿或多剂容器来体现。此化合物可采用在以油或水为媒介物中的悬浮体，乳剂，溶液的形式，可包括如悬浮，稳定和/或分散制剂在内的配制性制剂，或者，活性成分在使用前以粉剂形式，与一适当的媒介物如消过毒的脱热原水来进行配制。

组织蛋白酶抑制剂可在如栓剂的直肠化合物或如包括有可可酱或其它甘油酯的传统栓剂基质的保留灌肠剂中配制。

除了上述的配制方法外，组织蛋白酶抑制剂亦可作为储存制剂进行配制。如此长时间作用的配制物可通过皮下或肌肉培植或肌肉注射来使用。然后，例如，此化合物可与适当的聚合性或不易被水浸湿的材料，或离子交换树脂，或作为如可溶性盐的可溶性衍生物来配制。

如果需要的话，此药物化合物也可在一包装或分配器装置中来体现，而此包装或分配器装置可包含具有活性成分的一个或多个单位剂量。此包装可包括金属或塑料箔片，如薄膜包装。包装或分配器装置可带有使用说明。4、肥胖症、糖尿病和其它相关疾病的遗传性易患病体质的诊断。

本发明亦可通过特别地检测和监测调节组织脂肪的蛋白酶活性来提供诊断动物的肥胖症或其相关疾病的易患病体质的方法。这种调节脂肪的组织蛋白酶可以包括：组织蛋白酶K，L和S，组织蛋白酶K和L为佳，组织蛋白酶L为上。

可使用一系列方法，通过测量调节脂肪的组织蛋白酶如LmRNA数量，调节脂肪组织蛋白酶如L的表达数量，和/或调节脂肪组织蛋白酶如L的含量，来检测动物的遗传性易患病体质，而这种体质可发展成与异常的，不规则的脂肪含量，血糖含量和/或胰岛素含量有关的疾病状态。

与调节脂肪组织蛋白酶如L的相关的测量，可与动物的血糖含量、胰岛素含量和/或脂肪含量的测量一起使用。例如，具有升高的或异常高的组织蛋白酶L活性的动物亦可能具有更高的脂肪含量。还可使用组织蛋白酶L的高度活性(或含量)和脂肪的高度含量共同鉴别高脂肪含量的可能原因。

在某一具体情况下，此方法包括：测量动物调节脂肪的组织蛋白酶如L的基因表达活性，其中调节脂肪的组织蛋白酶基因表达的异常高频活性表明此动物具有先天性肥胖症。调节组织脂肪的蛋白酶基因表达活性包括但不限于：转录活性如将转录因子结合到脂肪调节组织蛋白酶基因启动子区的活性和转录mRNA的活性，翻译活性如调节脂肪组织蛋白酶蛋白质的产生，以及后翻译活性如调节脂肪组织蛋白酶前体的分解过程，调节脂肪组织蛋白酶内源性抑制剂的不同表达。

在另一具体情况下，此方法包括：测量动物调节脂肪的组织蛋白酶如L基因表达活性；测量动物的血糖和/或胰岛素含量，其中，调节脂肪的组织蛋白酶基因表达的异常高度活性和异常高的血糖和/或胰岛素含量表明此动物具有先天性胰岛素功能亢进或II型糖尿病。

然而在另一具体情况下，此方法包括：测量动物的调节脂肪组织蛋白酶如L的基因表达活性；测量动物的血糖和/或胰岛素含量，其中，调节脂肪的组织蛋白酶基因表达的异常高度活性和异常高的血糖和/或胰岛素含量表明此动物具有先天性胰岛素功能亢进或II型糖尿病。

本发明亦提供了通过特别检测或监测调节脂肪组织蛋白酶活性(最好是组织蛋白酶K，L和S，组织蛋白酶K和L为佳，组织蛋白酶L为上。)以诊断动物的肥胖症、糖尿病和其它相关疾病的方法。

在某种场合，此方法包括：测量动物的调节脂肪的组织蛋白酶基因表达活性，其中调节脂肪的组织蛋白酶基因表达的异常高度活性表明此动物患有先天性肥胖症。调节脂肪的组织蛋白酶基因表达活性包括但不限于：转录活性如将转录因子结合到脂肪调节组织蛋白酶基因启动子区的活性和转录mRNA的活性，翻译活性如调节脂肪组织蛋白酶蛋白质的产生，以及后翻译活性如调节脂肪组织蛋白酶前体的分解过程，调节脂肪组织蛋白酶内源性抑制剂的不同表达。

在另一种情况下，此方法包括：测量动物的调节脂肪的组织蛋白酶基因表达活性；测量动物的血糖和/或胰岛素含量，其中，调节脂肪的组织蛋白酶基因表达的异常高度活性和异常高的血糖和/或胰岛素含量表明此动物患有先天性胰岛素功能亢进或II型糖尿病。

在另一具体情况下，此方法包括：测量动物的调节脂肪的组织蛋白酶基因表达活性；测量动物的血糖和/或胰岛素含量，其中，调节脂肪的组织蛋白酶基因表达的异常高度活性和异常高的血糖和/或胰岛素含量表明此动物具有先天性胰岛素功能亢进或II型糖尿病。

通过使用目前发明的诊断方法，肥胖症和糖尿病的分子遗传性致病原因可由具有体内脂肪含量和/或血糖和胰岛素含量的组织蛋白酶的某一具体形式活性表达出来。在其症状显示出来之前，这些方法尤其可用来预测这些疾病的发作。

例如，可用此方法来诊断人体中胰岛素的阻抗情况。人们已发现胰岛素阻抗是II型糖尿病的充分起因。在大多数情况下导致了这种疾病的进一步发展。患有II型糖尿病或成熟发作糖尿病蜜剂的人，其血浆胰岛素含量比非糖尿病患者要高出许多。这些人具有下列特点：1、肥胖，尤其是中心肥胖；2、胰岛素阻抗；3、异常的胰岛素神秘功能；4、后吸收性肝葡萄糖产生率的提高。因而，血液胰岛素的更高含量往往与血液葡萄糖的更高含量相关，它是糖尿病的传统指示剂。

例如，这些诊断方法可以利用一些试剂，如一种或多种调节脂肪的组织蛋白酶(最好包括组织蛋白酶L)指纹基因核苷序列和针对表达不同的组织蛋白酶产物的抗原。例如，这些试剂可特别用来：1、检测组织蛋白酶基因的变化或检测与非肥胖状态相关的调节脂肪的组织蛋白酶基因mRNA过多或不足表达。2、检测与非肥胖状态相关的调节脂肪组织蛋白酶基因产物的过多或不足。例如，在此所描述的方法可利用预先包装诊断工具来实施。它至少包括一种使用方便的具体组织蛋白酶基因核酸或反组织蛋白酶抗原试剂，比如，在临床上用来诊断患有肥胖症或相关疾病的病人。在此可利用的方法之一是在治疗肥胖或相关疾病的临床实验中，用于监测调节脂肪组织蛋白酶抑制剂功效的方法。可用于调节脂肪组织蛋白酶抑制剂包括但不限于上述第三部分所述情况。

例如，在临床实验中，组织蛋白酶L基因的表达或有关基因表达的细胞显型可由测试的抑制剂的有无来决定。可通过比较所获得的表达资料与通常非肥胖状况的相对为人所熟知的表达来判断抑制剂的功效。

在临床试验中，比较肥胖症与非肥胖症或正常人的组织蛋白酶基因的产物或活化可以用于确定其抑制剂的效果。例如，在临床实验期间，一种或多种表达不同的组织蛋白酶基因产物的表达和/或活性，由实验的合成物存在或缺乏的相关细胞和/或组织来决定。可通过比较所获得的蛋白质含量和/或活性与在正常的、非肥胖状态下相对为人所知的细胞和/或组织的活性/含量来判断合成物的功效。

显示功效的合成物为那些把与肥胖相关的细胞和/或组织方式改变到与正常的、非肥胖状态极其相似的合成物。

附图说明图1、老鼠腹膜的巨噬细胞采用合成抑制剂对半胱氨酸蛋白酶的抑制全貌。对标注有[¹²⁵I]-Z-Tyr-Ala-CHN₂的老鼠的腹膜巨噬细胞进行细胞溶解，并把他们分离到12％的SDS-PAGE来显现所标注的活性蛋白酶。剂量及所用抑制剂都已做出说明。图2、抑制组织蛋白酶L导致95kDa胰岛素受体β亚单位及前体的积累。在有抑制剂和无抑制剂的条件下，以及不同剂量下，对人体前脂肪细胞进行培养，溶解，分离到7％SDS-PAGE中，并用山羊的抗人类的胰岛素受体β亚单位的多克隆抗体来探测。所测出的成熟的β亚单位及其前体都已标出，IR Precursor代表胰岛素受体前体，subunit代表亚单位。图3、抑制组织蛋白酶L导致95kDa类胰岛素受体蛋白β亚单位及其前体的积累。细胞处理如图2。采用山羊的抗人体的IGF-1R的多克隆抗体来进行免疫检测。图4、抑制组织蛋白酶L阻止CCAAT/增强子结合蛋白质α的表达。如图2般对人体前脂肪细胞进行分化。采用山羊的抗人体C/EBP-α多克隆抗体和10％的凝胶来进行western印迹免疫分析，并用相应的HRP-结合的二级抗体来检测。图5、抑制组织蛋白酶L可以阻止PPAR-γ的表达。如图4般采用人体前脂肪细胞和免疫分析来替代老鼠的抗人体的PPAR-γ单克隆的抗体作为基本抗体。图6、对人体的前脂肪细胞和脂肪细胞做红油着色。进行细胞分化时，使用与前脂肪细胞一同孵化组织蛋白酶L的选择性抑制剂CLIK 148(10μM)和195(10μM)，则细胞的分化完全被这些抑制剂阻塞。图7、在已分化的人体脂肪细胞中降低了组织蛋白酶S的表达，提高了组织蛋白酶L的表达。从脂肪细胞(诱导组，以induced表示)和前脂肪细胞(对照组，以control表示)所获得的细胞溶解产物被溶解，进而分离到12％的SDS-PAGE中，并用兔子的抗人体组织蛋白酶S(顶部)，L(底部)，和K(未显示)的多克隆抗体来检测。在对照细胞和分化的细胞中未发现有给组织蛋白酶K的信号。图8、在老鼠3T3-L1的前脂肪细胞分化中的组织蛋白酶L和S的表达。使老鼠的3T3-LI细胞进行分化，并在分化的不同的时间收集细胞。所得的溶解产物分离到12％SDS-PAGE中，并用兔子的抗组织蛋白酶L，S的多克隆抗体来做western印迹免疫分析。图9、在老鼠3T3-L1前脂肪细胞分化中组织蛋白酶L抑制剂的效用。老鼠3T3-L1细胞被引导形成脂肪。此过程中在不同的时间点跳跃使用CLIK148(10μM)。分化的最后阶段采用红油着色。图10、在老鼠3T3-LI的分化中降低组织蛋白酶K的表达。在分化中收集细胞，溶解细胞，并分离到12％的SDS-PAGE中，用兔子的抗组织蛋白酶K的抗体着色。显示出了成熟形式的组织蛋白酶K。图11、经组织蛋白酶L抑制剂处理过的老鼠3T3-L1细胞，其胰岛素受体的消化中间体的形成减少。在脂肪形成中采用不同剂量的抑制剂来处理3T3-L1细胞。准备好细胞的溶解产物，并把它们分离到10％的SDS-PAGE中，用山羊的抗老鼠IR-β亚单位多克隆抗体来进行western印迹免疫检测。

实施例1

我们引用生物化学和细胞生物学的研究来展示某种组织蛋白酶尤其是组织蛋白酶L在调节脂肪形成和胰岛素受体的更新中起着重要的作用。而且也引用了用以抑制组织蛋白酶L活性的方法举例。

1、材料和方法

材料：除非特别说明，所有的化学品从Sigma和Aldrich公司购买。兔抗人/鼠组织蛋白酶S，K，和L多克隆抗体，羊抗人/鼠IR，IGF-1R，和C/EBP-α多克隆的抗体，以及鼠抗人/鼠PPAR-γ单克隆抗体都从Santa Cruz Biotechnologies公司购买。CA 074来自BachemBiosciences Inc.(King of Prussia，PA)。E64d从Calbiochem(SanDiego，CA)公司获得.Z-Tyr-Ala-CHN₂来源于Enzyme Systems(Livermore，CA).下述物质是根据Katunuma等人的描述(1999)FEBSLett.458：6-10合成而得：CLIK 148〖L-(+)-(2S，3S)-N-[2-(2’-吡啶基-)-1-乙基-]-钠-氨基-(L-苯丙氨酸-二甲基酰胺)-反式-环氧琥珀酰胺〗，IUPAC名称：N-[2-(2-吡啶基)-1-乙基]-L-(+)-(2S，3S)-3-[(S)-1-二甲基氨基甲酰基-2-苯基乙基氨基甲酰基]-2-环氧乙烷羧酰胺，CLIK 060，即，(N-{L-3-反式[(1-苯基氨基甲酰基-5-氨基)戊基氨基甲酰基]环氧乙烷-2-羰基}-L-苯丙氨酸基-二甲基酰胺盐酸盐，和CLIK 195，即，(L-(+)-(2S，3S)-双-(钠-氨基-L-苯丙氨酸二甲基酰胺)-反式-环氧琥珀酰胺，IUPAC名称是：N，N-二甲基-L-(+)-(2S，3S)-2-{3-[(S)-1-二甲基氨基甲酰基-2-苯基-乙基氨基甲酰基]-2-环氧乙烷氨基甲酰基氨基}-(S)-3-苯基-丙酰胺)。人体前脂肪细胞的脂肪形成：将人体前脂肪细胞先在MSCGM培养基(BioWhitaker)当中培养，在温度为37摄氏度，5％的二氧化碳中培养7-12天，并且要进行3-4次的培养基更换直到完全融合。未被诱导的细胞被保存在脂肪形成维持培养基中，该维持培养基含有0.01mg/ml的胰岛素，0.05units/ml的青霉素，0.05μg/ml的链霉素，和10％胎牛血清。为引导脂肪形成，完全融合的细胞在分别含有蛋白酶抑制剂和缺少蛋白酶抑制剂的脂肪形成诱导培养基中培养3天，接着在维持培养基中培养3天。该脂肪形成诱导培养基含有：1μM的***，0.2mM的消炎痛(indomethacin)，0.01mg/ml的胰岛素，0.5mM的3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤，0.05units/ml的青霉素，0.05μg/ml的链霉素，和10％胎牛血清。经历三次诱导和维持的循环，细胞要在维持培养基中再进行额外的7天培养，期间要进行两次新鲜的培养基换。老鼠前脂肪细胞的脂肪形成：老鼠前脂肪细胞按Patel and lane(2000)J.Biol.Chem.275：17653-17660所描述的那样被进行分化。简要地说，老鼠的3T3-L1细胞在含有10％小牛血清的DMEM培养基中，在温度为37℃和10％CO₂条件下培养，直到完全融合。在同样的培养基中再经过额外的两天维持，分别在有蛋白酶抑制剂和没有蛋白酶抑制剂的情况下添加0.5mM的甲基异丁基黄嘌呤，1μM的***，1μg/ml的胰岛素，and 10％的FBS培养两天，使细胞分化。用含有1μg/ml的胰岛素，和10％FBS的DMEM取代培养基。4天后，在没有胰岛素的DMEM培养基中隔天添加10％FBS，7-8时，细胞就完全被分化了。Western印迹免疫检测：分化后，收集细胞并把他们溶解到1 X RIPA的缓冲器中。根据从制造商(Bio-Rad，Hercules，CA)处获得的Bio-RadDc蛋白质化验体系来决定蛋白质浓度。等同数量的蛋白质被分离到含有7％的SDS-PAGE中以测定IR和IGF-IR，含有12％的SDS-PAGE中以测定组织蛋白酶S，K和L的抗原。IR和IGF-IR的初级多克隆抗体都从山羊身上获得，并且所有的组织蛋白酶抗体都是从兔子身上获得的多克隆抗体。相应的共扼辣根过氧物酶的二级抗体用于检测。半胱氨酸蛋白酶活性位点标注：如Shi et al.(2000)J.Exp.Med.191：1177-1786所描述通过向老鼠注射入硫化乙醇酸盐而产生老鼠腹膜的巨噬细胞。经过3-4天的孵化，腹膜巨噬细胞可通过含有6mM EDTA(pH 8.0)的Tris-EDTA缓冲液冲洗出来。然后，细胞被种植到24个装有10％FBS的盘子里直到细胞全面扩散。在细胞黏附在盘子上后，添加不同剂量的抑制剂。经过2-3个小时的孵化，把细胞标注为[¹²⁵I]-Z-Tyr-Ala-CHN₂整晚处于37摄氏度下来测定细胞内的活性半胱氨酸蛋白酶。细胞被1X的还原蛋白样本缓冲器溶解并被分离到12％的SDS-PAGE中。

2、结果和讨论

组织蛋白酶B、S、K和L是在人类病理生理学上起着非常重要作用的溶酶性半胱氨酸蛋白酶。组织蛋白酶B是一种辅助性蛋白酶，其主要作用是降解不需要的或转移到酸性代谢区内涵体和溶酶体内的循环蛋白质。其在固体瘤中的高频表达因而与瘤侵袭和转移有涉。与此相反，组织蛋白酶S在抗原显示细胞中有选择地表达，并在不变链降解中起作用，因而是MHC II级调节免疫性中所需要的。此种蛋白酶的抑制或缺乏会导致MHC II级程序的损伤，从而引起抗原显示。而且，此种蛋白酶与动脉硬化症的病理过程和早老性痴呆有涉。组织蛋白酶K亦为一有效弹性组织蛋白酶，但其主要在破骨细胞中表达因而与骨骼的新陈代谢有涉。组织蛋白酶L是与组织蛋白酶S和K相似的另一种有效弹性蛋白酶，其早在10多年前就已经被析出。此种蛋白酶相当广泛地表达着。其有效弹性蛋白酶活性使得这种蛋白酶成为在患有肺气肿病人身上治疗肺衰弱的酶素候补物质之一。最近，此蛋白酶被发现与胸腺CD4T细胞选择有涉。

胰岛素的主要作用是通过刺激葡萄糖转移到肌肉和脂肪细胞中，并通过降低肝脏的葡萄糖输出来控制血浆葡萄糖含量。胰岛素的信号可由其结合到细胞表面受体，随后通过内涵素覆盖的小水包的自磷化作用和内吞作用来调节的。这种复合体最终在酸性内涵体和溶酶体中得到降解。然而，负责此生物过程的蛋白酶却不为人们所熟知。已有人建议在体内用组织蛋白酶B降解合成性胰岛素肽链。

根据本发明，人们设想半胱氨酸蛋白酶可能极大的参与了胰岛素/胰岛素受体的转换。为检测这一假设，合成性小分子化合物被用来作为抑制剂，来有选择性地阻塞组织蛋白酶S，B，K和L的活性。

首先，检测一下合成性小分子化合物对不同形式组织蛋白酶的选择性。老鼠腹膜巨噬细胞在选择性抑制剂和半胱氨酸蛋白酶活跃部位标明探测器内培养。如图1所示，组织蛋白酶B的活性可由2um的CA074完全抑制，而组织蛋白酶S，K和L的活性则保持原样。与此相反，所使用的其它抑制剂对组织蛋白酶B没有影响。尽管组织蛋白酶L的活性在某种程度上受到影响，CLIK060在2-10μM的含量时显著地抑制了组织蛋白酶S的活性。相比较而言，CLIK148和CLIK195对组织蛋白酶L具有更大的选择性。它们在10μM含量时完全抑制了组织蛋白酶L的活性，而非没有抑制组织蛋白酶B或组织蛋白酶S或组织蛋白酶K的活性(图1)。因此，这些抑制剂可被用来实验上述的组织蛋白酶是否在胰岛素受体(IR)或IR更新的衰变中起作用。

为试验哪种组织蛋白酶与IR转换有关，在有无抑制剂的情况下，可使人类前成脂肪细胞变成脂肪细胞。如前所述，分化的的脂肪细胞比对照组表达出更多的IR。组织蛋白酶B抑制剂(CA074，10μM)和组织蛋白酶S抑制剂(CLIK060，2μM)对IR转换或分化没有作用(图2)。与此相对照，E64d(20μM)，CLIK148和CLIK195(10μM)处理细胞增加了95kDa1Rβ亚单位及其前体的含量。当用类胰岛素受体(IGF-IR)抗体(图3)进行印迹试验时，结果相同。

为对前述抑制剂对细胞分化的影响作一评估，我们对使用抑制剂和没有抑制剂处理过的细胞中的转录因子CCAAT/增强子结合蛋白质-α(C/EBP-α)及过氧物酶体繁殖激活受体-γ(PPAR-γ)的水平进行了免疫测定。C/EBP-α和PPAR-γ皆为重要的脂肪细胞决定因素。

如图4和5所示，只有E64d和CLIK/48和CLIK195具有阻塞50kDaC/EBP-a(图4)和50kDa PPAR-γ(图5)积累的效果。这些观察表明组织蛋白酶L的抑制可阻塞人类前脂肪细胞的分化。此假设可由CLIK148或195处理前成脂肪细胞(图6)的红油染色进一步证实。此外，此两种抑制剂对脂肪形成的抑制要视剂量而定。少于50％的脂肪可由1цM的这种抑制剂阻塞。如果使用10μM的CLIK148或CLIK195(图6)就可观察到完全的抑制。与此对照的是，1μM的CLIK060，1或10μM的CA074对脂肪形成没有效果(未列数据)。所以，这些观察表明组蛋白L似乎在脂肪形成中控制胰岛素/IR复合物转换比组织蛋白酶S和K起到更为关键的作用。同时，组织蛋白酶B似乎未在此过程中起决定性作用。

有几个证据证明了这种观察。首先，组织蛋白酶B抑制剂CA074即使在更高的含量时对脂肪形成也没有影响(未列数据)。组织蛋白酶S抑制剂CLIK060在1μM时亦无效果，但在更高含量时有一些效果。当用10-15μM的CLIK060处理细胞时，观察到了IR积累和脂肪形成抑制。值得注意的是CLIR060在此含量时亦阻塞了组织蛋白酶L的活性(图1)。而且，对不同分化细胞和对照组所进行的western印迹免疫检测分析表明组织蛋白酶L的活性在分化后有所增加，而组织蛋白酶S的活性与非分化细胞相比在脂肪细胞中消失了(图7)。尽管未检测出前成脂肪细胞或脂肪细胞中的组织蛋白酶K的信号，它仍或许是另一潜在的起作用者。在所用的含量时，所有使用的抑制剂对组织蛋白酶K没有什么抑制性效果(图1)，所以组织蛋白酶L在控制脂肪形成方面似乎是最重要的蛋白质。

在使用老鼠前成脂肪细胞3T3-L1〕(ATCC，Manassas，VA)时亦可观察到类似的显型。在分化的脂肪细胞中可发现活性组织蛋白酶L和S(图8，8-11天)，然而，在分化后两种酶的含量有所增加，这与人类前成脂肪的含量有所不同。在3T3-L1细胞中，组织蛋白酶L在脂肪形成中的作用通过CLIK148(15μM)抑制脂肪形成得到进一步确实(图9)。在此试验中的脂肪形成过程表明，在脂肪形成产生的前4天可能比后几天(5-9天)更为重要。在前成脂肪细胞中可检测组织蛋白酶K抗原，但在脂肪细胞或胰岛素处理的细胞中没有检测到(图10)。

这些结果进一步证实组织蛋白酶L在脂肪形成中比组织蛋白酶S和K起到更为关键的作用。同时，组织蛋白酶B似乎仍未起重要作用。因此，有选择的降低组织蛋白酶K，L和S，特别是组织蛋白酶L在体内的活性，可以有效的治疗肥胖、糖尿病和相关疾病。

实施例2

将表5的化合物分别溶于DMSO，化合物A，B，C均为200mg/ml，化合物D为200μg/ml，小鼠在注射化合物2天后开始喂食高脂肪食物(Catalog#D12451，Research Diets，Inc.New Brunswick，NJ，USA)，每隔一星期称重一次，对照组注射DMSO，每组10只小鼠。实验结果见表5。由表5可以看出，服用了表5化合物的小鼠，与对照组相比均不同程度地减少了体重的增加，说明表5的化合物具有减少体重的作用。

本领域的普通技术人员应明白，在不背离此项发明的精神或范围的情况下，可在此发明中的方法、方案和成分中进行不同的修改和变化。因此，只要这些修正和变化属于权利要求或类似情况的范围内，此项发明就可包括这些修正和变化。此外，为了说明这项发明，提供了上述事例，这些实施例不能解释为限制本发明的范围。

序列表<110>新世纪药业公司<120>治疗肥胖症、糖尿病及相关疾病的药物<130>26748-701<160>11<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1575<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1agaaccgcga cctccgcaac cttgagcggc atccgtggag tgcgcctgca gctacgaccg60cagcaggaaa gcgccgccgg ccaggcccag ctgtggccgg acagggactg gaagagagga120cgcggtcgag taggtgtgca ccagccctgg caacgagagc gtctaccccg aactctgctg180gccttgaggt ggggaagccg gggagggcag ttgaggaccc cgcggaggcg cgtgactggt240tgagcgggca ggccagcctc cgagccgggt ggacacaggt tttaaaacat gaatcctaca300ctcatccttg ctgccttttg cctgggaatt gcctcagcta ctctaacatt tgatcacagt360ttagaggcac agtggaccaa gtggaaggcg atgcacaaca gattatacgg catgaatgaa420gaaggatgga ggagagcagt gtgggagaag aacatgaaga tgattgaact gcacaatcag480gaatacaggg aagggaaaca cagcttcaca atggccatga acgcctttgg agacatgacc540agtgaagaat tcaggcaggt gatgaatggc tttcaaaacc gtaagcccag gaaggggaaa600gtgttccagg aacctctgtt ttatgaggcc cccagatctg tggattggag agagaaaggc660tacgtgactc ctgtgaagaa tcagggtcag tgtggttctt gttgggcttt tagtgctact720ggtgctcttg aaggacagat gttccggaaa actgggaggc ttatctcact gagtgagcag780aatctggtag actgctctgg gcctcaaggc aatgaaggct gcaatggtgg cctaatggat840tatgctttcc agtatgttca ggataatgga ggcctggact ctgaggaatc ctatccatat900gaggcaacag aagaatcctg taagtacaat cccaagtatt ctgttgctaa tgacaccggc960tttgtggaca tccctaagca ggagaaggcc ctgatgaagg cagttgcaac tgtggggccc1020atttctgttg ctattgatgc aggtcatgag tccttcctgt tctataaaga aggcatttat1080tttgagccag actgtagcag tgaagacatg gatcatggtg tgctggtggt tggctacgga1140tttgaaagca cagaatcaga taacaataaa tattggctgg tgaagaacag ctggggtgaa1200gaatggggca tgggtggcta cgtaaagatg gccaaagacc ggagaaacca ttgtggaatt1260gcctcagcag ccagctaccc cactgtgtga gctggtggac ggtgatgagg aaggacttga1320ctggggatgg cgcatgcatg ggaggaattc atcttcagtc taccagcccc cgctgtgtcg1380gatacacact cgaatcattg aagatccgag tgtgatttga attctgtgat attttcacac1440tggtaaatgt tacctctatt ttaattactg ctataaatag gtttatatta ttgattcact1500tactgacttt gcattttcgt ttttaaaagg atgtataaat ttttacctgt ttaaataaaa1560tttaatttca aatgt1575<210>2<211>333<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Asn Pro Thr Leu Ile Leu Ala Ala Phe Cys Leu Gly Ile Ala Ser1               5                   10                  15Ala Thr Leu Thr Phe Asp His Ser Leu Glu Ala Gln Trp Thr Lys Trp

        20                  25                  30Lys Ala Met His Asn Arg Leu Tyr Gly Met Asn Glu Glu Gly Trp Arg

    35                  40                  45Arg Ala Val Trp Glu Lys Asn Met Lys Met Ile Glu Leu His Asn Gln

50                  55                  60Glu Tyr Arg Glu Gly Lys His Ser Phe Thr Met Ala Met Asn Ala Phe65                  70                  75                  80Gly Asp Met Thr Ser Glu Glu Phe Arg Gln Val Met Asn Gly Phe Gln

            85                  90                  95Asn Arg Lys Pro Arg Lys Gly Lys Val Phe Gln Glu Pro Leu Phe Tyr

        100                 105                 110Glu Ala Pro Arg Ser Val Asp Trp Arg Glu Lys Gly Tyr Val Thr Pro

    115                 120                 125Val Lys Asn Gln Gly Gln Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ala Thr

130                 135                 140Gly Ala Leu Glu Gly Gln Met Phe Arg Lys Thr Gly Arg Leu Ile Ser145                 150                 155                 160Leu Ser Glu Gln Asn Leu Val Asp Cys Ser Gly Pro Gln Gly Asn Glu

            165                 170                 175Gly Cys Asn Gly Gly Leu Met Asp Tyr Ala Phe Gln Tyr Val Gln Asp

        180                 185                 190Asn Gly Gly Leu Asp Ser Glu Glu Ser Tyr Pro Tyr Glu Ala Thr Glu

    195                 200                 205Glu Ser Cys Lys Tyr Asn Pro Lys Tyr Ser Val Ala Asn Asp Thr Gly

210                 215                 220Phe Val Asp Ile Pro Lys Gln Glu Lys Ala Leu Met Lys Ala Val Ala225                 230                 235                 240Thr Val Gly Pro Ile Ser Val Ala Ile Asp Ala Gly His Glu Ser Phe

            245                 250                 255Leu Phe Tyr Lys Glu Gly Ile Tyr Phe Glu Pro Asp Cys Ser Ser Glu

        260                 265                 270Asp Met Asp His Gly Val Leu Val Val Gly Tyr Gly Phe Glu Ser Thr

    275                 280                 285Glu Ser Asp Asn Asn Lys Tyr Trp Leu Val Lys Asn Ser Trp Gly Glu

290                 295                 300Glu Trp Gly Met Gly Gly Tyr Val Lys Met Ala Lys Asp Arg Arg Asn305                 310                 315                 320His Cys Gly Ile Ala Ser Ala Ala Ser Tyr Pro Thr Val

            325                 330<210>3<211>1374<212>DNA<213>Mus musculus<400>3cggcgacctc cggggatccg agtttgcaga cttcttgtgc gcacgtagcc gcctcaggtg60tttgaaccat gaatctttta ctccttttgg ctgtcctctg cttgggaaca gccttagcta120ctccaaaatt tgatcaaacc tttagtgcag agtggcacca gtggaagtcc acgcacagaa180gactgtatgg cacgaatgag gaagagtgga ggagagcgat atgggagaag aacatgagaa240tgatccagct acacaacggg gaatacagca acgggcagca cggcttttcc atggagatga300acgcctttgg tgacatgacc aatgaggaat tcaggcaggt ggtgaatggc tatcgccacc360agaagcacaa gaaggggagg ctttttcagg aaccgctgat gcttaagatc cccaagtctg420tggactggag agaaaagggt tgtgtgactc ctgtgaagaa ccagggccag tgcgggtctt480gttgggcgtt tagcgcatcg ggttgcctag aaggacagat gttccttaag accggcaaac540tgatctcact gagtgaacag aaccttgtgg actgttctca cgctcaaggc aatcagggct600gtaacggagg cctgatggat tttgctttcc agtacattaa ggaaaatgga ggtctggact660cggaggagtc ttacccctat gaagcaaagg acggatcttg taaatacaga gccgagttcg720ctgtggctaa tgacacaggg ttcgtggata tccctcagca agagaaagcc ctcatgaagg780ctgtggcgac tgtggggcct atttctgttg ctatggacgc aagccatccg tctctccagt840tctatagttc aggcatctac tatgaaccca actgtagcag caagaacctc gaccatgggg900ttctgttggt gggctatggc tatgaaggaa cagattcaaa taagaataaa tattggcttg960tcaagaacag ctggggaagt gaatggggta tggaaggcta catcaaaata gccaaagacc1020gggacaacca ctgtggactt gccaccgcgg ccagctatcc tgtcgtgaat tgatgggtag1080cggtaatgag gacttatgga cactatgtcc aaaggaattc agcttaaaac tgaccaaacc1140cttattgagt caaaccatgg tacttgaatc attgaggatc caagtcatga tttgaattct1200gttcccattt ttacatgggt taaatgttac cactacttaa aactcctgtt ataaacagct1260ttataatatt gaaaacttag tgcttaattc tgagtctgga atatttgttt tatataaagg1320ttgtataaaa ctttctttac ctcttaaaaa taaattttag ctcagtgtgt gtgt1374<210>4<211>334<212>PRT<213>Mus musculus<400>4Met Asn Leu Leu Leu Leu Leu Ala Val Leu Cys Leu Gly Thr Ala Leu1               5                   10                  15Ala Thr Pro Lys Phe Asp Gln Thr Phe Ser Ala Glu Trp His Gln Trp

        20                  25                  30Lys Ser Thr His Arg Arg Leu Tyr Gly Thr Asn Glu Glu Glu Trp Arg

     35                 40                  45Arg Ala Ile Trp Glu Lys Asn Met Arg Met Ile Gln Leu His Asn Gly

50                  55                  60Glu Tyr Ser Asn Gly Gln His Gly Phe Ser Met Glu Met Asn Ala Phe65                  70                  75                  80Gly Asp Met Thr Asn Glu Glu Phe Arg Gln Val Val Asn Gly Tyr Arg

            85                  90                  95His Gln Lys His Lys Lys Gly Arg Leu Phe Gln Glu Pro Leu Met Leu

        100                 105                 110Lys Ile Pro Lys Ser Val Asp Trp Arg Glu Lys Gly Cys Val Thr Pro

    115                 120                 125Val Lys Asn Gln Gly Gln Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ala Ser

130                 135                 140Gly Cys Leu Glu Gly Gln Met Phe Leu Lys Thr Gly Lys Leu Ile Ser145                 150                 155                 160Leu Ser Glu Gln Asn Leu Val Asp Cys Ser His Ala Gln Gly Asn Gln

            165                 170                 175Gly Cys Asn Gly Gly Leu Met Asp Phe Ala Phe Gln Tyr Ile Lys Glu

        180                 185                 190Asn Gly Gly Leu Asp Ser Glu Glu Ser Tyr Pro Tyr Glu Ala Lys Asp

    195                 200                 205Gly Ser Cys Lys Tyr Arg Ala Glu Phe Ala Val Ala Asn Asp Thr Gly

210                 215                 220Phe Val Asp Ile Pro Gln Gln Glu Lys Ala Leu Met Lys Ala Val Ala225                 230                 235                 240Thr Val Gly Pro Ile Ser Val Ala Met Asp Ala Ser His Pro Ser Leu

            245                 250                 255Gln Phe Tyr Ser Ser Gly Ile Tyr Tyr Glu Pro Asn Cys Ser Ser Lys

        260                 265                 270Asn Leu Asp His Gly Val Leu Leu Val Gly Tyr Gly Tyr Glu Gly Thr

    275                 280                 285Asp Ser Asn Lys Asn Lys Tyr Trp Leu Val Lys Asn Ser Trp Gly Ser

290                 295                 300Glu Trp Gly Met Glu Gly Tyr Ile Lys Ile Ala Lys Asp Arg Asp Asn305                 310                 315                 320His Cys Gly Leu Ala Thr Ala Ala Ser Tyr Pro Val Val Asn

            325                 330<210>5<211>1484<212>DNA<213>Homo sapiens<400>5agaaccgcga cctccgcaac cttgagcggc atccgtggag tgcgcctgca gctacgaccg60cagcaggaaa gcgccgccgg ccaggcccag ctgtggccgg acagggactg gaagagagga120cgcggtcgag taggtgtgca ccagccctgg caacgagagc gtctaccccg aactctgctg180gccttgaggt ggggaagccg gggagggcag ttgaggaccc cgcggaggcg cgtgactggt240tgagcgggca ggccagcctc cgagccgggt ggacacaggt accgcagcca ggccggcgcc300aacgactcag ggcctggccc ggccagacag ggaagctcag tccccgcacg ccagacagcg360gtactcctgc tggcgtcacc gcaaacatcc tctgaccgct acagccagtg tgtgggcagg420cgtcatgtcc ccggccctgc cacgcctgga gccctggaag ctggctgcag ggctctggct480tcccgcgtgc gcccatatga ccccgtccct gatttagggg agcagtttgg ggtgtcggca540gcacaggccc aagtgaatga aggagggaag cagtgcgtgc tctccttccc agtttttcct600gggaaagcat ttcagaaagg tttcatttaa gaagaggttg gggcggccag gtggctcact660cctgtaatcc cagcactttg ggaggctgag gtgggcggat cacctgaggt cagtagttca720gaccagcctg gccaacatgg tgaaaccccg tctctactga aaatacaaaa ttagacgggc780gaggcggcgc acgcctgtag ttccagctat tcaagaggct gaggaagaat ggcttgaacc840cgggaggcag aggttgctgt gagtcgatat cgcgccgttg aactccagcc tgggccacag900agcaagactc catctcaaaa aataaataaa taaataaata aataaataaa taggagagat960tggaaaactt atctcagctt ttggtgtttg ttagtcagga agatgtgtga aggcctccta1020actcttgggg atctctttgt cccctacttg ggaatcccac cttatcatta gtgaggtttt1080gcctgggcac gaaacctgga ttttttgcga ttggtacaaa acctggatca accgtttccc1140ggtttcctag ttgttgcctt aagcttctca cacacaaggt agtttcatac ggttctcata1200acctaaattg tcatcgcata aactgtttca gctcctacag ctctggacag gctgcttttc1260attttggtaa gtccatccag tacctccacg tgccctgttt ttctccaggc acatccttgg1320cctcttccac agtccttggg taaatgcttg ggagaataat ttaaatattt ttattctacc1380atggtggccc taatttttca gggggcagta agatggcttt ttaggattgg tctaatcaga1440tcctcatttt tgttcccttc ctaggtttta aaacatgaat ccta1484<210>6<211>1422<212>DNA<213>Mus musculus<400>6gtacggctga ggtggaaatt ccacagcagg tctttttttt ctacgctttt cttacagaac60caaggcacca cgctggcgtg aaccctccaa agtggatcag cctcgcccca aggcttgcac120cacaggacag gttacgaccc ggcggcggtc acgcgcccgg actcccgcag gctccgcccc180gaggcaggca tagccaatga cggggcgggg gcgggccctg tcggggctgt agcctgagag240cctttaaagc ctgagcccgg cgctgctcct ccagattctc ggacctcggc gacctccggg300gatccgagtt tgcagacttc ttgtgcgcag ctagccgcct caggtgagtg acccccgcgg360gtttaaaggc ttcccgagca agggcaggta ggggaatcta gaatgtggga accatagcat420ctgcaacccg gactggagac ccccggatgg gccaggatct cgaggatgtg tcctcggcct480ccccgaagtg ataggccctt gttgtcgagc ggggtcttca tcaggtcatg tgactccggg540ctgccgggac ccgtagggac agcgggaccc cctcaagctg gtcacgggac ccagggctcc600ttatgccgcc ataacattcg cgggcggtgg cccgagcgcg gagcggacgc ccatccccct660ctcccccgga cgggcccagc ttggccccta acccgaactg agatcgcata aggaggcatc720gccttgaggc ttcagttcgc ctgatgtgca gctgtgcgtt aaagtgtgtg gtggcagccc780accctctggg tattcctgta tgcccacttg gggtcactaa tacttgtcaa taaatgacct840ggacccagtt gtcctcttaa gattttgacg catacaatat cggaagactt aagactaccg900tggccctata ataagagaaa ggtggggagg ggggggctgt cgagatggtt cagcgggtaa960gagcactgac cgttctttca aaggtcctga gtgcaaatct cagcaaccac atggtggctc1020acaaccaccc ataatgagat ctgacaccct cttctagtgc gtcaaaaatc agctacagtg1080tacttatgta tgataataaa tectaataaa taaaagagaa aagggtttat ecctgttcca1140atgactacta ggctgttttt gtttcagtag ctagagtcta gtaacctcca aagattaatt1200cctgacttgt ttttctccac tcataatcac atttgttaac acgtgcaagg atgcttcaac1260tcagaacggt ttactgctgg gctggtggct catggatccc taaacttgag agatgggtca1320ttgaaaaagt ttaaagcctg aactacatga gaaactgtcc ttaaaagaga aagcttccgt1380gggattctca tttcctcttt ttccttccct aggtgtttga ac1422<210>7<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<400>7Thr Ser Glu Glu Phe Arg Gln Val Met Asn Gly Phe Gln1                5                  10<210>8<211>4<212>PRT<213>Homo sapiens<400>8Phe Tyr Lys Glu1<210>9<211>18<212>PRT<213>Homo sapiens<400>9Tyr Ser Val Ala Asn Asp Thr Gly Phe Val Asp Ile Pro Lys Gln Glu1               5                   10                  15Lys Ala<210>10<211>4<212>PRT<213>Homo sapiens<400>10Ile Pro Lys Gln1<210>11<211>10<212>PRT<213>Mus musculus<400>11His Cys Gly Leu Ala Thr Ala Ala Ser Tyr1                5                  10

                                表1人组织蛋白酶L全部长度序列[SEQ ID NO：1]1   agaaccgcga cctccgcaac cttgagcggc atccgtggag tgcgcctgca gctacgaccg61  cagcaggaaa gcgccgccgg ccaggcccag ctgtggccgg acagggactg gaagagagga121 cgcggtcgag taggtgtgca ccagccctgg caacgagagc gtctaccccg aactctgctg181 gccttgaggt ggggaagccg gggagggcag ttgaggaccc cgcggaggcg cgtgactggt241 tgagcgggca ggccagcctc cgagccgggt ggacacaggt tttaaaacat gaatcctaca301 ctcatccttg ctgccttttg cctgggaatt gcctcagcta ctctaacatt tgatcacagt361 ttagaggcac agtggaccaa gtggaaggcg atgcacaaca gattatacgg catgaatgaa421 gaaggatgga ggagagcagt gtgggagaag aacatgaaga tgattgaact gcacaatcag481 gaatacaggg aagggaaaca cagcttcaca atggccatga acgcctttgg agacatgacc541 agtgaagaat tcaggcaggt gatgaatggc tttcaaaacc gtaagcccag gaaggggaaa601 gtgttccagg aacctctgtt ttatgaggcc cccagatctg tggattggag agagaaaggc661 tacgtgactc ctgtgaagaa tcagggtcag tgtggttctt gttgggcttt tagtgctact721 ggtgctcttg aaggacagat gttccggaaa actgggaggc ttatctcact gagtgagcag781 aatctggtag actgctctgg gcctcaaggc aatgaaggct gcaatggtgg cctaatggat841 tatgctttcc agtatgttca ggataatgga ggcctggact ctgaggaatc ctatccatat901 gaggcaacag aagaatcctg taagtacaat cccaagtatt ctgttgctaa tgacaccggc961 tttgtggaca tccctaagca ggagaaggcc ctgatgaagg cagttgcaac tgtggggccc1021atttctgttg ctattgatgc aggtcatgag tccttcctgt tctataaaga aggcatttat1081tttgagccag actgtagcag tgaagacatg gatcatggtg tgctggtggt tggctacgga1141tttgaaagca cagaatcaga taacaataaa tattggctgg tgaagaacag ctggggtgaa1201gaatggggca tgggtggcta cgtaaagatg gccaaagacc ggagaaacca ttgtggaatt1261gcctcagcag ccagctaccc cactgtgtga gctggtggac ggtgatgagg aaggacttga1321ctggggatgg cgcatgcatg ggaggaattc atcttcagtc taccagcccc cgctgtgtcg1381gatacacact cgaatcattg aagatccgag tgtgatttga attctgtgat attttcacac1441tggtaaatgt tacctctatt ttaattactg ctataaatag gtttatatta ttgattcact1501tactgacttt gcattttcgt ttttaaaagg atgtataaat ttttacctgt ttaaataaaa1561tttaatttca aatgt人组织蛋白酶全部长度氨基酸序列[SEQ ID NO：2]：MNPTLILAAFCLGIASATLTFDHSLEAQWTKWKAMHNRLYGMNEEGWRRAVWEKNMKMIELHNQEYREGKHSFTMAMNAFGDMTSEEFRQVMNGFQNRKPRKGKVFQEPLFYEAPRSVDWREKGYVTPVKNQGQCGSCWAFSATGALEGQMFRKTGRLISLSEQNLVDCSGPQGNEGCNGGLMDYAFQYVQDNGGLDSEESYPYEATEESCKYNPKYSVANDTGFVDIPKQEKALMKAVATVGPISVAIDAGHESFLFYKEGIYFEPDCSSEDMDHGVLVVGYGFESTESDNNKYWLVKNSWGEEWGMGGYVKMAKDRRNHCGIASAASYPTV-stop鼠组织蛋白酶L全部长度cDNA[SEQ ID NO：3]：1    cggcgacctc cggggatccg agtttgcaga cttcttgtgc gcacgtagcc gcctcaggtg61   tttgaaccat gaatctttta ctccttttgg ctgtcctctg cttgggaaca gccttagcta121  ctccaaaatt tgatcaaacc tttagtgcag agtggcacca gtggaagtcc acgcacagaa181  gactgtatgg cacgaatgag gaagagtgga ggagagcgat atgggagaag aacatgagaa241  tgatccagct acacaacggg gaatacagca acgggcagca cggcttttcc atggagatga301  acgcctttgg tgacatgacc aatgaggaat tcaggcaggt ggtgaatggc tatcgccacc361  agaagcacaa gaaggggagg ctttttcagg aaccgctgat gcttaagatc cccaagtctg421  tggactggag agaaaagggt tgtgtgactc ctgtgaagaa ccagggccag tgcgggtctt481  gttgggcgtt tagcgcatcg ggttgcctag aaggacagat gttccttaag accggcaaac541  tgatctcact gagtgaacag aaccttgtgg actgttctca cgctcaaggc aatcagggct601  gtaacggagg cctgatggat tttgctttcc agtacattaa ggaaaatgga ggtctggact661  cggaggagtc ttacccctat gaagcaaagg acggatcttg taaatacaga gccgagttcg721  ctgtggctaa tgacacaggg ttcgtggata tccctcagca agagaaagcc ctcatgaagg781  ctgtggcgac tgtggggcct atttctgttg ctatggacgc aagccatccg tctctccagt841  tctatagttc aggcatctac tatgaaccca actgtagcag caagaacctc gaccatgggg901  ttctgttggt gggctatggc tatgaaggaa cagattcaaa taagaataaa tattggcttg961  tcaagaacag ctggggaagt gaatggggta tggaaggcta catcaaaata gccaaagacc1021 gggacaacca ctgtggactt gccaccgcgg ccagctatcc tgtcgtgaat tgatgggtag1081 cggtaatgag gacttatgga cactatgtcc aaaggaattc agcttaaaac tgaccaaacc1141 cttattgagt caaaccatgg tacttgaatc attgaggatc caagtcatga tttgaattct1201 gttcccattt ttacatgggt taaatgttac cactacttaa aactcctgtt ataaacagct1261 ttataatatt gaaaacttag tgcttaattc tgagtctgga atatttgttt tatataaagg1321 ttgtataaaa ctttctttac ctcttaaaaa taaattttag ctcagtgtgt gtgt鼠组织蛋白酶L全部长度氨基酸序列[SEQ ID NO：4]：MNLLLLLAVLCLGTALATPKFDQTFSAEWHQWKSTHRRLYGTNEEEWRRAIWEKNMRMIQLHNGEYSNGQHGFSMEMNAFGDMTNEEFRQVVNGYRHQKHKKGRLFQEPLMLKIPKSVDWREKGCVTPVKNQGQCGSCWAFSASGCLEGQMFLKTGKLISLSEQNLVDCSHAQGNQGCNGGLMDFAFQYIKENGGLDSEESYPYEAKDGSCKYRAEFAVANDTGFVDIPQQEKALMKAVATVGPISVAMDASHPSLQFYSSGIYYEPNCSSKNLDHGVLLVGYGYEGTDSNKNKYWLVKNSWGSEWGMEGYIKIAKDRDNHCGLATAASYPVVN-stop人组织蛋白酶L5’-末端UTR[SEQ ID NO：5]：1    agaaccgcga cctccgcaac cttgagcggc atccgtggag tgcgcctgca gctacgaccg61   cagcaggaaa gcgccgccgg ccaggcccag ctgtggccgg acagggactg gaagagagga121  cgcggtcgag taggtgtgca ccagccctgg caacgagagc gtctaccccg aactctgctg181  gccttgaggt ggggaagccg gggagggcag ttgaggaccc cgcggaggcg cgtgactggt241  tgagcgggca ggccagcctc cgagccgggt ggacacaggt accgcagcca ggccggcgcc301  aacgactcag ggcctggccc ggccagacag ggaagctcag tccccgcacg ccagacagcg361  gtactcctgc tggcgtcacc gcaaacatcc tctgaccgct acagccagtg tgtgggcagg421  cgtcatgtcc ccggccctgc cacgcctgga gccctggaag ctggctgcag ggctctggct481  tcccgcgtgc gcccatatga ccccgtccct gatttagggg agcagtttgg ggtgtcggca541  gcacaggccc aagtgaatga aggagggaag cagtgcgtgc tctccttccc agtttttcct601  gggaaagcat ttcagaaagg t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表2组织蛋白酶S选择性抑制剂

表3组织蛋白酶K选择性抑制剂

表4组织蛋白酶L选择性抑制剂

表4组织蛋白酶L选择性抑制剂(续-1)

表4组织蛋白酶L选择性抑制剂(续-2)

Claims (25)

1.一种治疗肥胖症、糖尿病及相关疾病的药物，其特征在于该药物含有治疗有效量的组织蛋白酶L，K，S的抑制剂。

2.根据权利要求1所说的药物，其特征在于所说的组织蛋白酶L，K，S抑制剂是一种核酸或抗体或多肽。

3.根据权利要求2所说的药物，其特征在于所说的核酸是一种与部分人类组织蛋白酶L的CDNA序列(SEQ ID NO：1)互补的反义分子。

4.根据权利要求2所说的药物，其特征在于所说的核酸是一种与部分人类组织蛋白酶L基因的5’-末端未翻译区互补的反义分子。

5.根据权利要求2所说的药物，其特征在于所说的抗体是一种与组织蛋白酶L特异性结合的抗体。

6.根据权利要求2所说的药物，其特征在于所说的多肽是一种希斯它丁(CYSTATIN C)的突变异种。

7.根据权利要求2所说的药物，其特征在于所说的多肽是撒克斯非林(saxiphilin)。

8.根据权利要求2所说的药物，其特征在于所说的多肽是组织蛋白酶L前肽。

9.根据权利要求1所说的药物，其特征在于所说的组织蛋白酶抑制剂是一种能降低组织蛋白酶L活性的环氧琥珀酸盐的衍生物。

10.根据权利要求9所说的药物，其特征在于所说的环氧琥珀酸盐的衍生物是L-(+)-(2S，3S)-N-[2-(2，-吡啶基-)-1-乙基-]-钠-氨基-(L-苯丙氨酸-二甲基酰胺)-反式-环氧琥珀酰胺。

11.根据权利要求9所说的药物，其特征在于所说的环氧琥珀酸盐的衍生物是(L-(+)-(2S，3S)-双-(钠-氨基-L-苯丙氨酸二甲基酰胺)-反式-环氧琥珀酰胺。

12.根据权利要求1所说的药物，其特征在于所说的组织蛋白酶抑制剂是一种能抑制蛋白酶L活性的氮丙啶-2，3-重碳酸盐衍生物。

13.根据权利要求12所说的药物，其特征在于所说的组织蛋白酶抑制剂是N-{(2S，3S)-1-[[N-(叔-丁氧基羰基)-(S)-苯基丙氨酰基]-3-(乙氧基羰基)氮丙啶-2-基]羰基}-(S)-亮氨酸卞基酯。

14.根据权利要求12所说的药物，其特征在于所说的组织蛋白酶抑制剂是(2R，3S)+(2S，3S)1-[N-(叔-丁氧基羰基)-(S)-苯基丙氨酰基]氮丙啶-2，3-二羧酸。

15.根据权利要求1所说的药物，其特征在于所说的组织蛋白酶抑制剂是一种能抑制蛋白酶L活性的肽醛衍生物。

16.根据权利要求15所说的药物，其特征在于所说的组织蛋白酶抑制剂是L-异亮氨酰基-L-色氨酸基醛衍生物。

17.根据权利要求15所说的药物，其特征在于所说的组织蛋白酶抑制剂是N-(1-奈基黄酰基)-L-异亮氨酰基-L-色氨酸基醛。

18.根据权利要求15所说的药物，其特征在于所说的组织蛋白酶抑制剂是N-(卞基氧基羰基)-L-苯基丙氨酰基-L-酪氨酸基醛。

19.根据权利要求15所说的药物，其特征在于所说的组织蛋白酶抑制剂是N-(2-卞基-3-苯基丙酰基)-L-色氨酸基醛。

20.根据权利要求1所说的药物，其特征在于所说的组织蛋白酶抑制剂是一种能抑制蛋白酶L活性的二肽羟酰胺酸酯衍生物和磺酰基衍生物。

21.根据权利要求20所说的药物，其特征在于所说的组织蛋白酶抑制剂是(3S)-3-[(N-卞基氧基羰基)-L-亮氨酸基]氨基-1-(4-苯基)-苯甲酰基-氧-5-甲基-2-己酮。

22.根据权利要求20所说的药物，其特征在于所说的组织蛋白酶抑制剂是Z-Phe-Gly-NHO-Bz。

23.根据权利要求20所说的药物，其特征在于所说的组织蛋白酶抑制剂是Z-Phe-Gly-NHO-NBz。

24.根据权利要求20所说的药物，其特征在于所说的组织蛋白酶抑制剂是N-(1-奈基黄酰基-L-异亮氨酰基-L-色氨酸基醛。

25.根据权利要求1的药物，其特征在于所说的相关疾病是高胰岛素症，高血糖症，高血压，心脏血管病，肌肉营养失调和不育症这些疾病中的一种或几种。

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