CN1387401A - 单倍体基因组用于遗传诊断、修饰和增殖 - Google Patents
单倍体基因组用于遗传诊断、修饰和增殖 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1387401A CN1387401A CN00815283A CN00815283A CN1387401A CN 1387401 A CN1387401 A CN 1387401A CN 00815283 A CN00815283 A CN 00815283A CN 00815283 A CN00815283 A CN 00815283A CN 1387401 A CN1387401 A CN 1387401A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- monoploid
- described method
- embryo
- genome
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims description 29
- 230000004048 modification Effects 0.000 title abstract description 9
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 title description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 104
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000010448 genetic screening Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 122
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 75
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 60
- 210000003783 haploid cell Anatomy 0.000 claims description 54
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 40
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 claims description 27
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 26
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 21
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 20
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 claims description 20
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 claims description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 16
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 14
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 13
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims description 12
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims description 12
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 10
- 210000004508 polar body Anatomy 0.000 claims description 9
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 8
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 claims description 8
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 8
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 claims description 7
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 241000288906 Primates Species 0.000 claims description 6
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 6
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 claims description 5
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- 108091060290 Chromatid Proteins 0.000 claims description 4
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 4
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 4
- 210000004756 chromatid Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000003935 denaturing gradient gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 4
- 208000009575 Angelman syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 3
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims description 3
- 208000001914 Fragile X syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061533 Myotonia Diseases 0.000 claims description 3
- 241000009328 Perro Species 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 claims description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 102000002735 Acyl-CoA Dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010001058 Acyl-CoA Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 2
- 208000003200 Adenoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010001233 Adenoma benign Diseases 0.000 claims description 2
- 201000006935 Becker muscular dystrophy Diseases 0.000 claims description 2
- 102100022548 Beta-hexosaminidase subunit alpha Human genes 0.000 claims description 2
- 206010068597 Bulbospinal muscular atrophy congenital Diseases 0.000 claims description 2
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 claims description 2
- 102100028843 DNA mismatch repair protein Mlh1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100034157 DNA mismatch repair protein Msh2 Human genes 0.000 claims description 2
- 206010013801 Duchenne Muscular Dystrophy Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 claims description 2
- 101001134036 Homo sapiens DNA mismatch repair protein Msh2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000738901 Homo sapiens PMS1 protein homolog 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 claims description 2
- MFGOTAHWOBKNNU-XMHGGMMESA-N Isodigeranyl Chemical group CC(C)=CCC\C(C)=C\CC(C)(C=C)CCC=C(C)C MFGOTAHWOBKNNU-XMHGGMMESA-N 0.000 claims description 2
- MFGOTAHWOBKNNU-FQEVSTJZSA-N Isodigeranyl Natural products CC(=CCCC(=CC[C@](C)(CCC=C(C)C)C=C)C)C MFGOTAHWOBKNNU-FQEVSTJZSA-N 0.000 claims description 2
- 208000027747 Kennedy disease Diseases 0.000 claims description 2
- 229910015837 MSH2 Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 208000001826 Marfan syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 108010074346 Mismatch Repair Endonuclease PMS2 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100037480 Mismatch repair endonuclease PMS2 Human genes 0.000 claims description 2
- 208000009905 Neurofibromatoses Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000599 Ornithine Carbamoyltransferase Deficiency Disease Diseases 0.000 claims description 2
- 102100037482 PMS1 protein homolog 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 claims description 2
- 102000005262 Sulfatase Human genes 0.000 claims description 2
- 208000022292 Tay-Sachs disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006269 X-Linked Bulbo-Spinal Atrophy Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000012130 acyl-CoA dehydrogenase deficiency Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000006682 alpha 1-Antitrypsin Deficiency Diseases 0.000 claims description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000005980 beta thalassemia Diseases 0.000 claims description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 claims description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 claims description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000029664 classic familial adenomatous polyposis Diseases 0.000 claims description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 claims description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 claims description 2
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 claims description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000004931 neurofibromatosis Diseases 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- 208000030761 polycystic kidney disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 claims description 2
- 108060007951 sulfatase Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 2
- 108700020463 BRCA1 Proteins 0.000 claims 1
- 102000036365 BRCA1 Human genes 0.000 claims 1
- 101150072950 BRCA1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 108700020462 BRCA2 Proteins 0.000 claims 1
- 102000052609 BRCA2 Human genes 0.000 claims 1
- 101150008921 Brca2 gene Proteins 0.000 claims 1
- 108010026664 MutL Protein Homolog 1 Proteins 0.000 claims 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 claims 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims 1
- 230000001776 parthenogenetic effect Effects 0.000 claims 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 abstract description 3
- 101500028867 Homo sapiens Neurotensin Proteins 0.000 abstract 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 14
- 230000008859 change Effects 0.000 description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 12
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 11
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 11
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 5
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 4
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 4
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 3
- 241001550206 Colla Species 0.000 description 3
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N UNPD149280 Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 3
- GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N cytochalasin B Natural products C[C@H]1CCC[C@@H](O)C=CC(=O)O[C@@]23[C@H](C=CC1)[C@H](O)C(=C)[C@@H](C)[C@@H]2[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N 0.000 description 3
- GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N cytochalasin B Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]3/C=C/C[C@H](C)CCC[C@@H](O)/C=C/C(=O)O[C@@]23C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 230000008186 parthenogenesis Effects 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 150000003053 piperidines Chemical class 0.000 description 3
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 3
- 241000282461 Canis lupus Species 0.000 description 2
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 2
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 2
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 2
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 2
- BVIAOQMSVZHOJM-UHFFFAOYSA-N N(6),N(6)-dimethyladenine Chemical compound CN(C)C1=NC=NC2=C1N=CN2 BVIAOQMSVZHOJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 208000028281 autosomal inheritance Diseases 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 231100000005 chromosome aberration Toxicity 0.000 description 2
- JVHIPYJQMFNCEK-UHFFFAOYSA-N cytochalasin Natural products N1C(=O)C2(C(C=CC(C)CC(C)CC=C3)OC(C)=O)C3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 JVHIPYJQMFNCEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZMAODHOXRBLOQO-UHFFFAOYSA-N cytochalasin-A Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(=O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 ZMAODHOXRBLOQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000012173 estrus Effects 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000011331 genomic analysis Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 2
- 230000008676 import Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 2-aminopurine Chemical compound NC1=NC=C2N=CNC2=N1 MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282817 Bovidae Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 206010067477 Cytogenetic abnormality Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 208000027219 Deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 241000282575 Gorilla Species 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000002151 Microfilament Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010040897 Microfilament Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 206010031243 Osteogenesis imperfecta Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102000009516 Protein Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010009341 Protein Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 108010016143 S variant alpha 1-antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108010067618 Sex Chromatin Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 1
- 208000031655 Uniparental Disomy Diseases 0.000 description 1
- 241000282458 Ursus sp. Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002669 amniocentesis Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229910052788 barium Inorganic materials 0.000 description 1
- DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N barium atom Chemical compound [Ba] DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001109 blastomere Anatomy 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004581 coalescence Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001771 cumulus cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N ent-staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 1
- 230000001158 estrous effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012248 genetic selection Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- -1 gentamicin sulphates Chemical class 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002980 germ line cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001456 gonadotroph Effects 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 230000037308 hair color Effects 0.000 description 1
- 244000309465 heifer Species 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000000236 ionophoric effect Effects 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 210000000088 lip Anatomy 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000003632 microfilament Anatomy 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000002406 microsurgery Methods 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 108700039855 mouse a Proteins 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010449 nuclear transplantation Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002394 ovarian follicle Anatomy 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N phenanthrene-3,4-diol Chemical compound C1=CC=C2C3=C(O)C(O)=CC=C3C=CC2=C1 RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000000671 sex chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000006884 silylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008010 sperm capacitation Effects 0.000 description 1
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N staurosporine Chemical compound C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1[C@H]1C[C@@H](NC)[C@@H](OC)[C@]4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N 0.000 description 1
- CGPUWJWCVCFERF-UHFFFAOYSA-N staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(OC)O1 CGPUWJWCVCFERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052712 strontium Inorganic materials 0.000 description 1
- CIOAGBVUUVVLOB-UHFFFAOYSA-N strontium atom Chemical compound [Sr] CIOAGBVUUVVLOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
- C12N2517/04—Cells produced using nuclear transfer
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了用于增殖雄性或雌性来源的单倍体基因组和对其进行遗传筛选和修饰的方法。可以将这些单倍体基因组用于生产单倍体胚胎和胚胎干细胞样细胞和分化的细胞。此外,这些单倍体基因组和含有这些单倍体基因组的细胞可以用作产生二倍体核转移单位的核转移供体。可以将这些二倍体NT单位、例如人NT单位用于获得多能细胞和分化细胞以及组织。
Description
政府权限
研发本发明是接受美国农业部的基金支出的结果,因此政府对本发明拥有权限。
发明领域
本发明涉及单倍体基因组的增殖和应用,目的在于(1)遗传诊断;(2)遗传选择;和(3)遗传修饰。所选择的单倍体基因组在与另一种单倍体基因组、优选一种具有所需遗传组成的单倍体基因组合时可用于生产胚胎和胚胎干细胞。
发明背景
配子是通过减数***产生的特定的单倍体细胞(例如***和***)且涉及有性生殖。相反,二倍体细胞具有同源配对的染色体且带有每种常染色体遗传基因座的两个拷贝。二倍数(2n)等于单倍数的2倍且是大多数细胞而非配子的特征数。合子是因受精过程中雄性和雌性配子融合而产生的二倍体细胞。参见:《细胞生物学词典》(THEDICTIONARY OF CELL BIOLOGY)103,139,388(J.M.Lackie等,编辑,1995)。仅(二倍体)合子能够产生存活的后代。相反,尽管单倍体配子有可能产生属于雌性衍生的单倍体细胞(***)的孤雌发育的胚胎,但是这些胚胎一般在胚胎发生完成前终止发育。这类胚胎可以自发产生,但更一般的情况是通过对***进行人工活化来产生。这类雌核发育胚胎可用于研究胚胎发生。
以前曾经报导了合适单倍体衍生的多能细胞系的生产。例如,据推定通过从129 SvE或C57BL x CBA杂种小鼠中获得卵并在与7%乙醇的磷酸缓冲盐水(PBS)溶液接触后以孤雌生殖方式将其活化来生成所述的多能单倍体细胞。然而,在检查这些早期传代的″单倍体″细胞系的染色体时,所有的细胞均为带有40条染色体模态数的二倍体(Kaufman等,《胚胎学和形态学实验杂志》(J.Embryol.Exp.Morphol.)73:249-61(1983))。
尽管已经充分报导了哺乳动物胚胎可以由单倍体基因组产生,但是尚未将这类哺乳动物胚胎用于遗传分析。相反,就本发明者所了解到的情况而言,通常使用显然正常的(二倍体)胚胎在子宫内或子宫外进行产前遗传诊断。然而,子宫内的遗传诊断是侵害性的且对发育中的胎儿而言可能存在危险性(例如羊膜腔穿刺术和绒毛膜取样)。可以使经诊断患有疾病的胎儿流产或孕育至分娩期,因为子宫内手术和基因疗法仍然具有很高的风险性和实验性。
在人体中,一般对通过体外受精(IVF)技术产生的胚胎进行子宫外遗传诊断。一般从最新的胚胎中取1个或2个细胞并检测诸如囊性纤维化(CF)、性连锁疾病、染色体异常、脆性X染色体综合征、脊柱肌肉萎缩和强直性肌营养不良这样的疾病(de Die-Smulders等,Ned.Tijdschr.Geneeskd.142:2441-4(1998))。可以使用聚合酶链反应(PCR)或嵌套式PCR进行植入前遗传诊断(PGD)以便诊断CF常见的ΔF508突变(Cui等,《人体生殖分子学》(Mol.Hum.Reprod.)2:63-1(1996);和Ao等,《产前诊断》(Prenat.Diagn.)16:137-42(1996))以及其它疾病(Ben-Ezra,《临床实验室医学》(Clin.Lab.Med.)15:95-815(1995))。还可以通过对猕猴卵裂早期胚胎血型分型进行单个卵裂球活检(RhD)(Avner等,《人体生殖分子学》(Mol.Hum.Reprod.)2:60-2(1996))或通过胚泡活检(Verlinsky等,Bailieres Clin.Obstet.Gynaecol.8:177-96(1994))来进行遗传筛选。可以将原位致敏标记(PRINS)和原位杂交用于为PGD检测人染色体的异常(Pellestor等,《人体生殖分子学》(Mol.Hum.Reprod.)2:135-8(1996))。还使用荧光原位杂交(FISH)进行了PGD以便防止因具有单倍体X的***(随后发生复制)与失活***受精而产生的胎块发育(Reubinoff等,《人体生殖》(Hum.Reprod.)12:805-8(1997))。可以对***进行PGD以便通过第一极体分析来诊断单一基因病症并鉴定含有母体未受影响的基因的***(Verlinsky等,《生物化学与分子医学》(Biochem.Mol.Med.)62:182-7(1997);Verlinsky等,《最新产科学与妇科学观点》(Curr.Opin.Obstet.Gynecol.)4:720-5(1992);和Verlinsky等,《人体生殖》(Hum.Reprod.)5:826-9(1990))。在一种情况中,通过稀释和显微操作使有两个具有成骨不全受侵染婴儿的父代的各个***分离。使用嵌套式PCR来扩增含有所述突变的I型胶原蛋白基因的片段并测序以便检测野生型基因和带有单一点突变的基因(Iida等,《人体生殖分子学》(Mol.Hum.Reprod.)2:131-4(1996))。就应用胞质内***注射技术(ICSI)而言,已经研发了选择***的方法(Meschede等,《人体生殖》(Hum.Reprod.)10:2880-6(1995))。对第一和第二极体的序列分析和多样PCR可以比通过单细胞DNA分析遇到的易产生的错误获得更精确的遗传诊断(Richitsky等,J.Assist.Reprod.Genet.16:192-8(1999)).
遗传筛选的其它方法包括限制片段长度多态性(RFLPs)、串联重复(VNTR)序列和二核苷酸或其它短串联重复(STR)序列的可变数量的检测或改变。另一方面,使用与野生型或突变体序列互补的引物进行等位基因特异性扩增和等位基因特异性连接,为检测特异性突变提供了两种选择方式。还有其它方法可用于筛选突变的存在情况而不鉴定特异性突变自身。这些方法包括单链构象多态(SSCP)分析、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和通过酶(RNA酶A)或化学(哌啶)方式进行的错配裂解分析。参见Fujimura,《分子生物学和生物技术综合参考书》(MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY:A COMPREHENSIVE DESKREFERENCE)中的“遗传测试(″Genetic Testing″),374-379(RobertA.Meyers,编辑,1995)。
因此,以上述为基础,显然尽管在使植入前遗传筛选和体外生成的胚胎操作完善方面正在取得进展,但是在对配子进行遗传筛选或对用于生产转基因动物的配子进行遗传操作方面几乎没有取得任何进展。
因此,尽管文献中预先报导了什么内容,对配子遗传筛选的改进方法和遗传加工单倍体细胞用于生产转基因动物仍存在需求。
本发明的概括和目的
本发明的一个方面提供了一种选择用于生产胚胎、胚胎干细胞或胚胎种系细胞的基因组的方法,该方法包括下列步骤:(i)培养含有雄性或雌性衍生的单倍体遗传组成的细胞;(ii)将所述培养细胞的遗传组成进行遗传测试以便鉴定所述单倍体基因组是否包括遗传缺陷、所需基因或缺乏功能基因;和(iii)选择不包括遗传缺陷的细胞或选择含有所需基因或缺乏功能基因的细胞。
特别就雌性衍生的单倍体细胞而言,可以通过5种方法之一获得该细胞:(1)对其中一半染色体排出在极体中的***进行激活;(2)通过使卵受精并从其中除去雄性原核;(3)通过活化卵以便产生含有两个雌性原核的卵并除去所述原核之一;(4)通过将二倍体细胞核***不成熟的***,随后使所述染色体分入两个单倍体核;和(5)通过将单性胚胎(含有半数染色体,但增殖全部DNA成分即4条染色单体)的核转入***且随后从其中排出半数染色体。
本发明的另一个目的涉及可以通过下列方法之一获得的雄性衍生的单倍体细胞的筛选方法:(1)从除去雌性原核的受精卵中获得雄性衍生的单倍体细胞;(2)通过使去核的卵受精而获得雄性衍生的单倍体细胞;和(3)通过对精核进行人工解凝、然后将其注入非卵衍生的胞质体而获得雄性衍生的单倍体细胞。
本发明的另一个目的是一种增殖雄性或雌性衍生的单倍体细胞的方法,该方法通过选自的方法来进行:(i)使单倍体卵胞质体进行细胞***;(ii)使单倍体细胞产生单倍体胚胎,然后将这种胚胎培养成″增殖单倍体″细胞;(iii)将单倍体胚胎培养产生单倍体的胚胎干细胞样细胞并使这类胚胎于细胞样细胞分化;和(iv)在使细胞***的条件下培养单倍体体细胞胞质体。
本发明的另一个目的是提供雄性或雌性来源的增殖单倍体基因组细胞系、即包括所需遗传组成或包括所需遗传修饰的细胞系。
本发明的另一个目的是提供由单倍体细胞系产生的多能或胚胎干细胞样细胞和由其来源的分化细胞,它们包括所需遗传组成、例如包括所需的遗传修饰。
本发明的另一个目的是提供由遗传修饰或选择的单倍体雄性和/或雌性基因组产生的二倍体哺乳动物胚胎以及由其来源的多能细胞系和分化细胞。
定义
本发明涉及通过任意方法进行的含有雄性或雌性衍生的单倍体染色体组成的细胞的生产和增殖方法、这些细胞在特异性单倍体基因组的遗传评价、遗传修饰或增殖中的应用以及这些细胞在生产具有DNA的二倍体组成的胚胎中的应用。所增殖、筛选和/或修饰的单倍体基因组包括下列动物的单倍体基因组:有蹄类动物,诸如牛、绵羊、猪、马、山羊;犬、猫、鼠、家兔和啮齿动物(例如豚鼠、仓鼠和大鼠);人、非人灵长目,诸如猕猴、黑猩猩、狒狒和大猩猩。
所谓″遗传筛选″、″遗传诊断″、″遗传分析″和″遗传测试″指的是通过常规方法分析单倍体基因组以便检测存在或不存在与表型、疾病或疾患相关的特异性DNA。这类方法包括原位杂交、聚合酶链反应、嵌套式聚合酶链反应、荧光检测法、RFLP分析VNTR或STR检测法(其中筛选大量串联重复二核苷酸或其它短串联重复(STR)序列的用法)、单链构象多态性(SSCP)分析、指示梯度凝胶电泳(DGGE)和错配裂解分析、即通过酶(RNA酶A)或化学(哌啶)方式而进行的裂解分析。这类方法综述在Fujimura,《分子生物学和生物技术综合参考书》(MOLECULARBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY:A COMPREHENSIVE DESK REFERENCE)中的“遗传测试”(″Genetic Testing″),374-379(Robert A.Meyers,编辑,1995)中。
所谓″遗传选择″指的是使用遗传测试对基因型进行的定向选择。
所谓″遗传修饰″或″遗传操作″指的是对细胞、一般是单倍体细胞的基因组进行的修饰。它包括***、缺失和取代这样的修饰。优选在基因组中的靶位点上进行修饰。在一个优选的实施方案中,最终将修饰的单倍体细胞用于核移植以便产生表达所修饰/操作的基因的动物。
所谓″增殖″指的是增加包括所需雄性或雌性来源的单倍体基因组的细胞数。
所谓″单倍体细胞″指的是带有单倍体数量(n)染色体的细胞。″配子″是通过减数***产生并涉及有性生殖的特化单倍体细胞(例如***和***)。″二倍体细胞″具有同源配对的染色体并带有每种常染色体遗传基因座的两个拷贝(2n)。″合子″是因受精过程中雄性和雌性配子融合产生的二倍体细胞。
术语″核转移″或″核移植″指的是一种克隆方法,其中将来自供体细胞的核移植入去核的***。已知核转移技术或核移植技术公开在文献中(Campbell等,《动物生殖学》(Theriogenology)43:181(1995);Collas等,《生殖与发育分子学》(Mol.Reprod.Dev.)38:264-267(1994);Keefer等,《生物学与生殖》(Biol.Reprod.)50:935-939(1994);Sims等,《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:6143-6147(1993);Evans等,WO 90/03432(1990年4月5日);Smith等,WO 94/24274(1994年10月27日);Wheeler等,WO 94/26884(1994年11月24日))。另外,美国专利号US 4,994,384和US 5,057,420中描述了用于牛核移植的步骤。另外参见美国专利号US 5,945,577;WO 97/06668和WO 97/06669,受让人或申请人的名称分别为The University of Massachusetts和Roslin Institute。将该专利和申请引入本文作为参考。在本申请中,核转移或核移植或NT可以互换使用。本定义还包括植入一个或两个选择的单倍体基因组以便产生胚胎的过程。
所谓″缺乏功能基因″指的是整个基因从本发明主题的基因组中缺失或该基因突变至它不再起作用(例如产生野生型蛋白)的程度。
所谓″遗传缺陷″指的是核酸缺失或***,相当于基因转录、基因mRNA翻译成蛋白质的改变、蛋白质或基因mRNA的半衰期改变或该基因野生型表达的其它改变。给定基因的不同形式称作″等位基因″。基因的″野生型等位基因″是那些在天然群体中以相对高的频率存在并产生野生型或正常表型的等位基因。产生异常或非野生型表型的基因的等位基因是″突变体等位基因″。
所谓″增殖单倍体细胞系″指的是在单倍体细胞宿主生物体外通过人工方式产生的增殖单倍体细胞的细胞系。一般来说,这类单倍体细胞系包含在体外培养物中。另一方面,例如可以通过注入SKID小鼠以产生分化细胞类型使单倍体细胞增殖。
发明详述
如上所述,本发明涉及单倍体基因组的生产和增殖方法、通过遗传分析从所述增殖单倍体基因组中选择所需单倍体基因组和所述选择的单倍体基因组在生产二倍体胚胎中的应用。正如本申请背景技术中所述,已知将对植入前胚胎进行遗传评价作为选择适合于移植和产生后代的胚胎的方式。这类方法包括在植入前对所述胚胎的一个或多个细胞的基因组进行遗传评价。
然而,这类方法可能产生伦理问题,即胚胎受到操作,且如果它表现出不需要的遗传特性,那么将会被破坏。最特别的情况是,就人植入前胚胎而言,这类方法可能产生伦理问题、尤其是通过核转移或常规体外受精产生的那些人体胚胎而言更是如此。
相反,本发明通过对单倍体细胞基因组进行遗传测试而选择用于生产二倍体胚胎的单倍体DNA。由于单倍体细胞不能产生存活后代,因此这类方法不会产生相同的伦理忧虑。因此,弃去不理想的单倍体基因组或对单倍体基因组操作避免了与操作和破坏二倍体胚胎、例如人二倍体胚胎相关的伦理问题。
因为本发明包括对单倍体基因组进行遗传测试,所以需要这类单倍体基因组的增殖来源。这种情况最初需要构建或获得含有单倍体基因组的细胞并要求其增殖。
可以使用生产含有雄性或雌性单倍体基因组的细胞的各种方法。例如,根据实例,生产含有雌性来源的单倍体基因组的单倍体细胞的方法包括下列步骤:
(i)在体外活化***,其中半数染色体被排出在极体中;
(ii)使卵受精并除去雄性原核;
(iii)在体外活化包括两个雌性原核的卵并从其中除去所述原核之一;
(iv)将二倍体细胞核***未成熟的***并将所述染色体分入两个单倍体核;和
(v)将包含半数染色体、但增殖全部DNA成分即四条染色单体的的孤雌生殖核转移入***并从其中排出一半染色单体。
在上述方法中,优选(i)、(iii)、(iv)和(v),因为这些方法在任何情况下均不会产生其中半数其DNA组成属于雄性来源且另一半属于雌性来源的二倍体胚胎。因此,即使将它们植入,它们也不能够发育成足月后代。
用于提供雄性来源单倍体基因组的方法包括:
(i)使卵受精并除去雌性原核;
(ii)使去核的***受精;和
(iii)将***核进行人工解凝并注入非卵衍生的胞质体。
可以通过各种方法增殖上述单倍体细胞和其它单倍体细胞。例如,可以通过诱导卵胞质体的***来增殖单倍体基因组。另一方面,可以将单倍体胚胎用于胚胎干细胞样细胞的生产中。这可以通过使用已知培养基和用于维持培养中的胚胎的方法培养所述胚胎并培养内细胞团或来源于其中的细胞来进行该步骤,以便产生胚胎干细胞样细胞。例如,可以通过将内细胞团或单倍体基因组衍生胚胎的内细胞团细胞置于饲养层、例如鼠胎儿成纤维细胞上来进行该步骤以便产生含有胚胎干细胞样细胞的培养物,所述的胚胎干细胞样细胞在例如移离饲养层后可产生不同的分化细胞类型。
另一方面,可以将来源于单倍体胚胎的胚胎干细胞样细胞用于产生具有亲代单倍体基因组的基因组的分化细胞。增殖单倍体基因组的另一种方式包括诱导通过将单倍体基因组导入胞质体产生的单倍体体细胞胞质体的***。
应注意,在优选的实施方案中,所述的单倍体基因来源于人,例如来源于人的***或***。然而,本发明包括任意哺乳动物种类来源的单倍体基因组的构建,所述的哺乳动物种类例如有:非人的灵长类、狗、猫、小鼠、大鼠、家兔、熊、牛、马、猪、绵羊、豚鼠、水牛、山羊、羚羊等。本发明主要适用于选择例如需要通过核转移增殖任意动物,这些含有特别重要的所需遗传组成的动物是农用动物、尤其是具有长妊娠期的动物。本发明应能够快速筛选可产生具有所需遗传特性的二倍体胚胎的单倍体基因组。例如,性连锁遗传疾病的存在或不存在可能是遗传筛选的基础。
此外,本发明使得按照本发明产生的单倍体细胞系通过同源重组进行遗传修饰成为可能。
这是本发明的一个有利的方面,因为在基因座上的等位差异不会干扰所需重组事件。此外,本发明可以使得对雄性和雌性单倍体细胞系中相同基因座进行打靶,然后将产生的修饰雄性和雌性单倍体基因组合并而产生对特定修饰(例如缺失特定基因)而言属于纯合的二倍体胚胎。
如上所述,本文所述的本发明对现有的移植前遗传诊断(PGD)方法进行了改进,因为这些方法不会涉及对胚胎的操作。一般来说,极少有胚胎可用于筛选。此外,为测试而从胚胎中取出细胞对该胚胎的进一步发育而言可能是有害的。而通常仅有一个或极少的几个细胞用于遗传测试,这将导致因DNA缺失或DNA污染而产生不准确的结果。最后,关于胚胎的处理存在伦理考虑。单倍体DNA的遗传筛选提供的优势在于,如果筛选雄性和/或雌性配子,那么尽管筛选的配子极少,但总体上可能的组合将是很大的。
就性连锁遗传疾病而言,可以仅对***进行筛选,而***通常易于大量获得。如果不能获得大量***,那么使***基因组增殖也是有用的。这项技术可以制成基因组的许多相同拷贝用于筛选,以便将误诊的可能性减小到最低限度,并允许分析其它样品以便检验结果。有关与***相关的工作和对***的操作的伦理忧虑与那些使用胚胎进行工作的情况相比是最小的。
例如,还可以筛选单倍体细胞,以便测定该单倍体细胞中的遗传或DNA甲基化缺陷是否可以导致由其发育而成的任何成年动物患癌或其它疾病。对遗传疾病和易感性的筛选可以用于消除含有这类缺陷的有缺陷单倍体细胞。可以将本发明用于筛选与疾病或其它不需要的性状相关的染色体畸变和DNA序列。一般将这些单倍体基因组弃去。然而,在某些情况中,可以保留这类单倍体基因组。例如,编码涉及疾病的基因的单倍体基因组的产生可以用于生产用于研究目的的动物,例如用于评价推定的治疗或预防的功效。此外,可以将本发明用于选择含有所需遗传组成、例如包括涉及促进生长、疾病耐受性、产奶或其它所需性状的DNA序列的单倍体基因组。例如,可以使用DNA探针和连锁(L)或突变(M)检测对表1中所列下列人体疾病进行单倍体细胞的遗传分析:
表1
疾病 | 染色体 | L/M | 克隆的 |
α-1抗胰蛋白酶缺乏症 | 14 | M | 是 |
α-地中海贫血 | 16 | M | 是 |
腺瘤样结肠息肉病 | 5 | L,M | 是 |
成人多囊性肾病 | 16 | L | 非 |
乳腺癌易感性(BRCA1) | 17 | L,M | 是 |
乳腺癌易感性(BRCA2) | 13 | L | 非 |
β-地中海贫血 | 11 | M | 是 |
沙-马-图病 | 1 | M | 是 |
结肠癌易感性(MSH2) | 2 | M | 是 |
结肠癌易感性(MLH1) | 3 | M | 是 |
结肠癌易感性(PMS1) | 2 | M | 是 |
结肠癌易感性(PMS2) | 7 | M | 是 |
先天性肾上腺增生 | 6 | M,L | 是 |
囊性纤维化(CF) | 7 | M | 是 |
杜兴/贝克肌营养不良 | X | M,L | 是 |
脆性X染色体综合征 | X | M,L | 是 |
A型血友病 | X | M,L | 是 |
戈谢病 | 1 | M | 是 |
B型血友病 | X | M,L | 是 |
亨廷顿舞蹈病 | 4 | M,L | 是 |
肯尼迪病 | X | M | 是 |
莱-尼综合征 | X | L,M | 是 |
马方综合征 | 15 | M | 是 |
中链脂酰辅酶A脱氢酶缺乏症 | 1 | M | 是 |
黑素瘤易感性 | 9 | M | 是 |
1型多发性内分泌腺瘤形成 | 11 | L | 非 |
2A型多发性内分泌腺瘤形成 | 10 | L,M | 是 |
强直性肌营养不良 | 19 | M,L | 是 |
1型神经纤维瘤病 | 17 | L,M | 是 |
鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症 | X | M,L | 是 |
视网膜母细胞瘤 | 13 | M,L | 是 |
镰形细胞贫血 | 11 | M | 是 |
类固醇硫酸酶缺乏症 | X | L,M | 是 |
泰-萨病 | 15 | M | 是 |
韦-霍病 | 5 | L | 非 |
Frank K.Fujimura,《分子生物学和生物技术综合参考书》(MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY:A COMPREHENSIVE DESKREFERENCE)中的“遗传测试”(″Genetic Testing″),374-379(RobertA.Meyers,编辑,1995)。
用于筛选基因组检查特异性DNA序列或染色体畸变是否存在的方法是众所周知的。根据实例,这类筛选方法包括:聚合酶链分析(PCR)技术,包括嵌套式PCR和直接PCR扩增;SSCP分析;RFLP分析;原位引发标记(PRINS)法(参见Pellestor等,1996);荧光原位杂交(FISH)分析;和VNTRs或STRs分析;变性梯度凝胶电泳(DGGE);以及使用酶(例如RNA酶A)或化学(例如哌啶)法进行的错配裂解分析。
其它筛选方法包括可用于鉴定基因组印记相关综合征的DNA甲基化分析。与基因组印记相关的人体综合征和疾病包括普-威综合征(PWS)、安格尔曼综合征(AS)、单亲异双躯干畸胎病(uniparentalisodisomy)、伯-韦综合征(BWS)、维尔姆斯瘤癌发生和冯·希佩尔-林道(yon Hippel-Lidau,VHL)病。就进行DNA甲基化分析的方法而言,参见Buchholz等,《人体遗传学》(Hum.Genet.)103:535-9(1998)。可以通过遗传突变、诸如缺失以及异常基因组印记产生PWS(Barabash等,《临床医学》(Med.Clin.)(Barc)108:304-6(1997))。在动物中,还将基因组印记与皮毛颜色联系起来了。例如,小鼠agouti基因赋予野生型毛色,Aiapy等位基因的差异表达与基因上游调节序列的甲基化情况有关(Michaud等,《基因发育》(Genes Dev.)8:1463-72)。可以将农学上的遗传筛选用于遗传选择以便产生最佳组合,这种组合可将隐性突变减小到最低限度、增加杂合性或纯合性或累积有益的或者所需的等位基因。
如上所述,许多遗传筛选和测试方法在本领域中是公知的且可以用于本发明。此外,已经鉴定了与所需或不需要的性状相关的许多序列。
可以将本发明的方法用于例如农业、实验室或驯养动物这样的动物以及人中的遗传选择。目前,构成胚胎的配子基因组的组合是随机的。然而,通过对配子进行遗传筛选,可以获得最佳组合以便将隐性突变最小到最低限度、增加杂合性、增加纯合性或累积有益的等位基因。选择到的具有所需遗传组成的单倍体基因组可以用于产生二倍体胚胎和后代。
如上进一步所述,还可以将生产增殖单倍体细胞的方法用于制备遗传修饰的单倍体细胞。就同源重组而言,基因座上的等位差异不会干扰重组事件。此外,靶向雄性和雌性细胞系可以获得纯合修饰。
用于进行基因组修饰的方法在本领域中是众所周知的,例如包括应用逆转录病毒载体、显微注射和使用包括待***序列的DNA进行转化。优选在基因组的靶位点上进行遗传修饰。已经充分报导了用于对基因组,特别是哺乳动物基因组进行靶向***、缺失和取代修饰的方法,它们是许多专利的主题。
本质上说,在本发明中,可以对增殖单倍体细胞系中包含的特定单倍体基因组进行遗传修饰以便除去、添加或取代特定的DNA序列。在例如通过同源重组进行这类遗传修饰后,对所述的单倍体基因组进行测试或筛选以便确定它确实包括所述修饰。例如,可以通过上文确定的遗传筛选方法或通过表达例如酶、抗生素抗性标记、荧光或放射性标记等这样在***的DNA中包含的特定标记来完成上述步骤。
在产生了遗传修饰的单倍体基因组后,优选通过上述方法扩增它。
所得选择的雄性或雌性来源的单倍体(其基因组可以是遗传修饰的)特别可用于核转移或核移植。这类方法主要包括将所选择的雄性和雌性单倍体基因组导入去核的***或将所选择的雄性或雌性单倍体基因组导入单倍体***的步骤,其中这类单倍体DNA是雄性或雌性来源。由此获得二倍体核转移单位,其中已基于其遗传组成对其中的雄性或雌性DNA进行了选择。可以将这些二倍体核转移单位用于生成具有所需遗传组成、例如含有涉及疾病耐受性、生长或编码所需产物的异源DNA的基因的子代。
核转移技术或核移植技术在文献中是众所周知的。特别参见Sims等,《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:6143-6147(1993);Collas等,《发育的分子学报告》(Mol.ReportDev.)38:264-267(1994);Keefer等,《生殖生物学》(Biol.Reprod.)50:935-939(1994);Campbell等,《动物生殖学》(Theriogenology),43:181(1995);Campbell等,《自然》(Nature),380:64-66(1996);Schnieke等,《科学》(Science)278:2130-3(1997);Wells等,《生殖生物学》(Biol.Reprod.)57:385-393(1997);Wilmut等,《自然》(Nature)386:810-813(1997);Cibelli等,《科学》(Science)280:1256-8(1998);Kato等,《科学》(Science)282:2095-8(1998);Wakayama等,《自然》(Nature)394:369-74(1998);Wolf等,《生物技术杂志》(J.Biotechnol.)65:99-110(1998);Baguisi等,《国家生物技术》(Nat.Biotechnol.)17:456-61(1999);Dominko等,《生殖生物学》(Biol.Reprod.)60:1496-1502(1999);Wolf等,《生殖生物学》(Biol.Reprod.)60:199-204(1999);PCT/US99/00045;WO 94/26884;WO 94/24274;和WO 90/03432,将这些文献的全部内容引入本文作为参考。此外,美国专利号US 4,944,384和5,057,420中描述了用于牛核转移的步骤。另外参见美国专利号US 5,945,577,将该文献的全部内容引入作为参考。
用于核转移的***可以获自包括哺乳动物和两栖类动物在内的动物。***的合适的哺乳动物来源包括绵羊、牛、羊、猪、马、兔、豚鼠、小鼠、仓鼠、大鼠、灵长类、人和非人等。在优选的实施方案中,***可以获自:灵长类,例如人***;或有蹄类动物。
用于分离***的方法在本领域中是众所周知的。这些方法主要包括从例如牛这样的哺乳动物卵巢或生殖道中分离***的步骤。牛***的易于得到的来源是来自屠宰场的物质。
为了成功地使用诸如遗传工程、核转移和克隆这样的技术,在将这些细胞用作核转移用的受体细胞前并在能够与使***细胞受精而发育成胚胎之前,一般必须在体外使***成熟。这种方法一般需要从卵巢(例如在屠宰场获得的牛卵巢)中收集不成熟的(前I期)***并在受精或去核前在成熟培养基中使***成熟,直到***达到中期II阶段为止,就牛***的情况而言,中期II阶段一般发生在吸出后约18-24小时。就本发明的目的而言,将该时间期限称作″成熟期″。本文计算时间期限所用的″吸出″指的是从卵泡中吸出不成熟的***。此外,本发明包括通过从许可供体中吸出而分离人***的方法。
另一方面,可以将已经在体内成熟的中期II阶段的***用于核转移技术。例如,通过手术方法从动情期开始后或注射人绒毛膜促性腺素(hCG)或相似激素后35-48小时的非超***或超***的母牛或小母牛中采集成熟的中期II***。
已经报导去核和核转移时***的成熟阶段对NT法的成功是稻重要的。(例如参见Prather等,《分化》(Differentiation)48:1-8(1991);Tanaka等,《动物生殖科学》(Anim.Reprod.Sci.)49:113-23(1997))。一般来说,成功的哺乳动物胚胎克隆实践应用中期II***作为受体***,因为认为在该阶段***可能或被充分″活化″而将导入的核作为受精***对待。在驯养的动物且特别是牛中,***活化期通常是在吸出后约16-52小时、优选约28-42小时的范围。
例如,可以如Seshagine等在《生殖生物学》(Biol.Reprod.)40:544606(1989)中所述在HEPES缓冲的仓鼠胚胎培养基(HECM)中洗涤不成熟的***,且然后在39℃下将其放入处于轻质石蜡或硅烷层之下的成熟培养基液滴中,该液滴由含有10%胎牛血清(FCS)的50ul组织培养基(TCM)199组成,所述培养基含有诸如***(LH)和促卵泡激素(FSH)这样适当的促性腺素以及***。
在约10-40小时且优选约16-18小时范围的固定成熟期后,可以将***去核。在去核前,优选取出该***并在除去卵丘细胞前将其放入含有1mg/ml透明质酸酶的HECM中。通过经极其精密孔径分吸量管反复吸移或通过简单地涡旋来完成上述步骤。然后对剥离的***筛选极体,随后将通过存在极体确定的所选择中期II***用于核转移。去核过程如下。
可以通过诸如美国专利号US 4,994,384中所述的公知方法进行去核,将该文献引入作为参考。例如,将中期II***置于可以含有或不含有7.5μg/ml松胞菌素B的HECM中以便于即刻去核,或可以将其置于例如CR1 aa+10%动情期母牛血清的适宜培养基中以后再去核,优选在不超过24小时后且更优选在16-18小时后去核。
可以使用微量吸移管通过显微手术的方式进行去核以便除去极体和相邻的细胞质。然后可以筛选***以便鉴定已经成功去核的那些***。可以通过用HECM中的1μg/ml 33342 Hoechst染料对***染色且然后在紫外线照射下将所述***观测10秒以下进行这种筛选。可以将随后成功去核的***置于合适的培养基、例如CR1 aa+10%血清中。
在本发明中,可以将1个或2个选择的可能进行遗传修饰的单倍体基因组植入任选去核的***的卵周隙或其它胞质体中。按照本领域中公知的方法将所得的含有属于二倍体的***或胞质体的单倍体基因组用于产生NT单位。例如,可以通过电融合融合细胞。通过提供足以使质膜短暂破裂的电脉冲来进行电融合。质膜的这种破裂时间极短,因为该膜可快速重形成。实质上,如果诱导两个相邻的膜破裂,则重形成时脂双层渗入,在两个细胞之间将开放小的通道。由于这类小孔存在热力学不稳定性,它扩大至两个细胞合二为一为止。有关该方法的进一步讨论参阅Prather等的美国专利US 4,997,384。可以使用例如包括蔗糖、甘露糖醇、山梨醇和磷酸缓冲溶液在内的各种电融合介质。还可以使用仙台病毒作为融合剂进行融合(Graham,Wister Inst.Symp.Monogr.9:19(1969)。
此外,在某些情况中(例如使用小供体核),可能优选将单倍体细胞或核直接注入***而不是使用电穿孔融合法。这类技术公开在Collas等的Mol.Reprod.Dev.38:264-267(1994)中。
可以通过公知方法对人或动物细胞和***或胞质体进行电融合:例如在引发***成熟后约24小时,在500μm室内通过使用90-120V的电脉冲约15μsec。融合后,将所得的融合NT单位置于合适的培养基中至活化为止。可以在融合之前或之后不久、一般在小于24小时后且优选在约4-9小时后进行活化。
可以通过公知方法活化NT单位。这类方法包括:例如在亚生理学温度下培养NT单位,实质上是通过对NT单位施用冷或事实上冷却的温度休克。最方便的是通过在与胚胎通常暴露的生理学温度相比属于室温的条件下培养NT单位来进行该步骤。
另一方面,可以通过施用公知的活化剂来进行活化。例如,已经证实在受精过程中由***透入***可活化充满的***而产生较大数量的存活受孕体并在核转移后倍增出遗传方式相同的幼体。此外,可以将诸如电休克和化学休克这样的处理方法用于活化融合后的NT胚胎。***的活化方法是Susko-Parrish等的美国专利号US5,496,720的主题。
另一方面,可以同时或依次进行下述步骤完成活化:
(i)增加***中二价阳离子的浓度;和
(ii)降低***中细胞蛋白的磷酸化。
一般可以通过将例如镁、锶、钡或钙这样的二价阳离子以例如离子载体的形式导入***细胞质来进行上述步骤。其它增加二价阳离子浓度的方法包括使用电休克、用乙醇处理和用笼状螯合剂(cagedchelators)处理。
可以通过公知方法、例如通过添加诸如丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂(例如6-二甲氨基嘌呤、staurosporine、2-氨基嘌呤和鞘氨醇)这样的激酶抑制剂来减少磷酸化。另一方面,可以通过将磷酸酶(例如磷酸酶2A和磷酸酶2B)导入***来抑制细胞蛋白的磷酸化。
进行NT活化的一种方式通过下列步骤来进行:使融合的NT单位与含有5μM离子霉素和1mg/ml BSA的TL-HEPES培养基简单接触,随后在融合后约24小时内、且优选在融合后约4-9小时内在含有30mg/ml BSA的TL-HEPES中洗涤。另一方面,可以通过使用乙醇或反复的电脉冲来进行活化。
然后可以将由一种或两种选择的单倍体基因组产生的活化NT单位在合适的体外培养基中培养至胚胎或胚胎干细胞样细胞和细胞集落产生为止。适合于培养胚胎和使之成熟的培养基在本领域中是众所周知的。可以用于牛胚胎培养和维持的已知培养基的实例包括Ham’s F-10+10%胎牛血清(FCS)、组织培养基-199(TCM-199)+10%胎牛血清、蒂罗德清蛋白-乳酸-丙酮酸(TALP)、Dulbecco’s磷酸缓冲盐水(PBS)、Eagle’s和Whitten’s培养基。用于收集***并使之成熟的最常用培养基之一是TCM-199+1-20%血清补充剂、包括胎牛血清、新生血清、动情期的母牛血清、小羊血清或公牛血清。优选的维持培养基包括含有Earl盐、10%胎牛血清、0.2mM丙酮酸钠和50μg/ml硫酸庆大霉素的TCM-199。上述任何一种还可以包括与诸如颗粒细胞、输卵管细胞、BRL细胞、子宫细胞和STO细胞这样不同细胞类型的共培养物。
此后,优选将活化的培养NT单位进行洗涤且然后置于例如带孔平板中的含有10%FCS和6mg/ml的CRIaa培养基这样合适的培养基中,这些平板优选含有合适的汇合饲养层。合适的饲养层包括例如成纤维细胞和上皮细胞,例如来源于有蹄类动物的成纤维细胞和子宫上皮细胞、鸡成纤维细胞、鼠(例如小鼠或大鼠)成纤维细胞、STO和SI-m220饲养层细胞系和BRL细胞。
在饲养层上将NT单位培养至NT单位达到适合于获得可用于产生胚胎干细胞样细胞或细胞集落的细胞的大小。优选将这些NT单位培养至至少约2-400个细胞、更优选约4-128个细胞和最优选至少约50个细胞。在合适的条件、例如约38.5℃和5%CO2条件下进行培养,并且一般约每2-5天、优选约每3天更换所述培养基以使生长达到最佳。
在获得所需大小的NT单位后,以机械方式从所述区域中取出所述细胞且然后用于产生胚胎或胚胎干细胞样细胞和细胞系。优选通过取出包括一般含有至少约50个细胞的所述NT单位的细胞块、洗涤这类细胞并将这些细胞铺在例如照射的成纤维细胞这样的饲养层上来完成上述步骤。一般来说,用于获得所述干样细胞或细胞集落的细胞将获自优选至少为50个细胞大小的培养NT单位的最内层部分。然而,也可以将较小或较大细胞数量的NT单位以及来自NT单位其它部分的细胞用于获得ES-样细胞和细胞集落。将这些细胞维持在例如补充了10%FCS和0.1mM β-巯基乙醇(Sigma)和L-谷氨酰胺的αMEM这样的适宜生长培养基内的饲养层中。根据需要更换生长培养基以便使生长最佳化,例如每2-3天更换一次。该培养过程导致形成胚胎或胚胎干细胞样细胞或细胞系。在这类细胞产生前的培养时间可能随特定核供体细胞、具体***和培养条件的不同而改变。本领域技术人员可以根据需要的不同而改变培养条件以便使特定胚胎或胚胎干细胞样细胞的生长最佳化。
由所述单倍体基因组所生成胚胎或胚胎干细胞样细胞和细胞集落应表现出与用作核细胞供体的种类的天然胚胎或胚胎干细胞样细胞相似的外观。
已经参照优选实施方案描述了本发明。然而,对本领域技术人员而言,显然能够以非如上所述的特定方式使本发明具体化而不会脱离本发明的实质。下面实施例中所述的优选实施方案是解释性的而不应将其看作以任何方式来限定本发明。本发明的范围由所附的 而非上述描述确定,并且属于权利要求范围内的所有改变和等同内容均包括在其中。
实施例
单倍体细胞系的产生
大鼠A9细胞的产生
在补充了10%胎牛血清的αmem(Biowhittaker,location)中用3.75μg/ml松胞菌素B(Sigma,location)将鼠A9细胞(HPRT-)培养96小时。松胞菌素B是微丝的抑制剂,可防止细胞进行胞质***,同时使细胞合成DNA并增加大小。撤离该药物24小时后,可以从培养物表面取出细胞并操作。所得细胞约为30μm直径。
培养
用聚-D-赖氨酸包被直径约为2.5cm的玻璃圆盘。以60-80%汇合率将松胞菌素B处理的A9细胞平板铺在该圆盘上并使之贴壁24小时。将圆盘细胞侧朝下置于含有5ml去核培养基(磷酸缓冲盐水、10%胎牛血清、10ug/ml松胞菌素B)的离心管内。在37℃下将细胞保温20分钟。将离心管置于37℃的超速离心机中并以23,000g再旋转20分钟。所得的胞质体可存活24-48小时。
通过胰蛋白酶消化从玻璃表面取下胞质体。以1X浓度向培养基中加入HAT补充剂以便杀伤剩余的有核细胞。该步骤的另一种选择是在导入供体核后加入HAT补充剂。该步骤会消除任何有核A9细胞,而任何未融合的胞质体会在48小时内裂解。
供体核的导入
通过获能或用蛋白酶处理来制备从携带新霉素抗性基因(Neo)的转基因小鼠中采集的***用于融合。将这些处理方法用于确保***将粘着胞质体。转基因标记可用于证实***的来源,但对该过程来说并非必需。或者,单倍体供体可以是通过显微操作从新近受精胚胎中取出的雄性和雌性原核(单倍体核体)。
融合
用蛋白酶或PHA处理A9胞质体和***二者以便增加胞质体与***的粘附和融合的可能性。应利用适宜浓度的***或供体核和胞质体,以便增加带有单核的所得细胞的数量。可以用AC脉冲将核/胞质体偶联体定向,使得所融合的膜对电流而言是正交的。可以给予DC脉冲以便诱导核供体细胞与胞质体之间的融合。还可以将细胞融合的其它方法用于这样的步骤中,诸如聚乙二醇、融合-诱导病毒或脂质体。
选择
融合几天后,开始选择A9-单倍体核杂种。将HAT敏感性A9细胞用作胞质体的来源,因此,HAT培养基中形成的任何集落来自单倍体-胞质体杂种。非去核的A9细胞不能在选择中存活。将所得的杂种以克隆方式增殖直至获得足够数目用于分析。我们可通过荧光原位杂交或核型分析确定杂种是单倍体还是二倍体。
受精
可以将单倍体细胞用作***受精中的供体核。使用标准方法进行核转移。使用引起第二极体排出和雌性染色质单倍化的方法可活化胚胎。
Claims (39)
1.一种用于选择含有单倍体基因组的细胞的方法,该方法包括下列步骤:
(i)获得含有雄性或雌性来源的单倍体基因组的细胞并扩增其数目;
(ii)将所述单倍体细胞的基因组进行遗传筛选或分析以便测定所述单倍体基因组是否包括所需的遗传组成;和
(iii)选择含有所述所需遗传组成的细胞。
2.权利要求1所述的方法,其中所述的雌性衍生的单倍体细胞是通过活化其中半数染色体排出在极体中的***而产生的。
3.权利要求1所述的方法,其中所述的雌性衍生的单倍体细胞是通过使卵受精并从其中除去雄性原核而产生的。
4.权利要求1所述的方法,其中所述的雌性衍生的单倍体细胞是通过活化卵以便产生含有两个雌性原核的卵并除去所述原核中的一个而产生的。
5.权利要求1所述的方法,其中所述的雌性衍生的单倍体细胞是通过将二倍体细胞核***未成熟的***、随后使所述染色体分入两个单倍体核而产生的。
6.权利要求1所述的方法,其中所述的雌性衍生的单倍体细胞是通过下列步骤产生的:将含有半数染色体但增殖所有DNA成分即四条染色单体的单性胚的核转移到***中,随后从其中排出染色体的一半。
7.权利要求1所述的方法,其中所述的雄性衍生的单倍体细胞来源于除去了雌性原核的受精卵。
8.权利要求1所述的方法,其中所述的雄性衍生的单倍体细胞通过使去核卵受精而衍生。
9.权利要求1所述的方法,其中所述的雄性衍生的单倍体细胞通过对精核进行人工解凝、然后将其注入非卵衍生的胞质体而产生。
10.权利要求1所述的方法,其中通过选自下述的方法来扩增所述的雌性或雄性衍生的单倍体细胞:(i)使单倍体卵胞质体进行细胞***;(ii)使单倍体细胞产生单倍体胚胎,然后将这种胚胎培养以产生″增殖单倍体″细胞;(iii)将单倍体胚胎培养以产生增殖单倍体细胞并使这类胚胎干细胞样细胞分化;和(iv)在允许细胞***的条件下培养单倍体体细胞胞质体。
11.权利要求1所述的方法,其中将所述选择的单倍体基因组进行遗传修饰。
12.权利要求11所述的方法,其中对选择的雄性和雌性单倍体基因组二者均进行遗传修饰。
13.权利要求1所述的方法,其中进一步包括使用所述选择的雄性或雌性单倍体基因组或含有所述选择的单倍体基因组的细胞用于产生二倍体胚胎的步骤。
14.权利要求1所述的方法,其中进一步包括使用选择的雄性和雌性单倍体基因组产生二倍体胚胎的步骤。
15.权利要求1所述的方法,其中将所述选择的雄性或雌性单倍体基因组或将含有所述雄性或雌性基因组的细胞用作核转移供体。
16.权利要求15所述的方法,其中将选择的雄性和雌性单倍体基因组用作核转移供体以便产生含有所述选择的雄性和雌性单倍体基因组的二倍体核转移单位。
17.权利要求15所述的方法,其中所述的单倍体基因组是人的。
18.权利要求15所述的方法,其中所述的单倍体细胞或基因组包括来源于增殖单倍体胚胎的分化细胞、胚胎干细胞样细胞或内细胞团细胞。
19.权利要求18所述的方法,其中所述的分化细胞或胚胎干细胞样细胞通过体外培养单倍体胚胎而产生。
20.权利要求13所述的方法,其中将所述选择的单倍体基因组进行遗传修饰。
21.权利要求19所述的方法,其中将所述选择的单倍体基因组二者均进行遗传修饰。
22.权利要求20所述的方法,其中通过同源重组对所述选择的单倍体基因组进行遗传修饰,以便消除、***或取代特定的DNA。
23.权利要求21所述的方法,其中通过同源重组对所述选择的单倍体基因组二者均进行遗传修饰,以便消除、***或取代特定的DNA。
24.权利要求1所述的方法,其中所述的遗传测试包括下列步骤:对所述扩增的单倍体基因组筛选遗传缺陷、与异常基因组印记相关的DNA甲基化缺陷或选择含有所需DNA、等位性状或缺乏功能基因的细胞。
25.权利要求24所述的方法,其中所述的遗传缺陷导致下列遗传疾病中的一种:α-1抗胰蛋白酶缺乏症;α-地中海贫血;腺瘤样结肠息肉病;成人多囊性肾病;因BRCA1或BRCA2缺陷导致的乳腺癌易感性;β-地中海贫血;沙-马-图病;因MSH2、MLH1、PMS1或PMS2缺陷导致的结肠癌易感性;先天性肾上腺增生;囊性纤维化;杜兴/贝克肌营养不良;脆性X染色体综合征;A型和B型血友病;戈谢病;亨廷顿舞蹈病;肯尼迪病;莱-尼综合征;马方综合征;中链脂酰辅酶A脱氢酶缺乏症;黑素瘤易感性;1或2A型多发性内分泌腺瘤形成;强直性肌营养不良;1型神经纤维瘤病;鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏病;视网膜母细胞瘤;镰形细胞贫血;类固醇硫酸酶;泰-萨病;或韦-霍病。
26.权利要求24所述的方法,其中所测试的DNA甲基化缺陷选自普-威综合征、安格尔曼综合征、单亲异双躯干畸胎病、伯-韦综合征、维尔姆斯瘤癌发生和冯.希佩尔-林道综合征。
27.权利要求24所述的方法,其中所述的遗传测试包括使用直接或间接与标记连接的核酸序列或选择含有所需DNA或等位性状或缺乏功能基因的细胞的步骤,所述的标记可以和与特定遗传缺陷相关的核酸序列特异性结合。
28.权利要求1所述的方法,其中所述的遗传测试包括对特定DNA序列、等位性状或遗传缺陷使用质谱、荧光或放射性核检测的步骤。
29.权利要求1所述的方法,其中这类遗传筛选包括RFLP分析、SSCP分析、STR分析、VNTR分析或变性梯度凝胶电泳。
30.权利要求13所述的方法,其中将所述胚胎植入合适的雌性替代物并使之发育成可存活的后代。
31.权利要求1所述的方法,其中所述的单倍体基因组是牛的单倍体基因组。
32.权利要求1所述的方法,其中所述的单倍体基因组是灵长类的单倍体基因组。
33.权利要求1所述的方法,其中所述的单倍体基因组选自山羊、绵羊、牛、猪、羊、马、绵羊、犬、猫、鼠、兔、灵长类、人、象、豚鼠、小鼠、大鼠的单倍体基因组组成的组。
34一种使用权利要求10所述方法获得的增殖单倍体细胞系。
35.权利要求34所述的增殖单倍体细胞系,其中所述的细胞系是雌性细胞或雄性细胞衍生的单倍体细胞系。
36.一种通过核转移产生的二倍体胚胎,其中所述的核转移方法包括将单倍体基因组或按照权利要求1方法产生的细胞用作核转移供体的步骤。
37.权利要求36所述的二倍体胚胎,其中所述的核转移方法包括移植雄性和雌性单倍体基因组二者或按照权利要求1方法产生的细胞的步骤。
38.由单倍体胚胎产生的胚胎干细胞样细胞或分化的细胞。
39.一种用于产生克隆的胚胎、胎儿或动物的改进的核转移方法,其中所述的改进包括将由单倍体胚胎产生的胚胎干细胞样细胞或分化的细胞用作核转移供体。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US16308699P | 1999-11-02 | 1999-11-02 | |
US60/163,086 | 1999-11-02 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1387401A true CN1387401A (zh) | 2002-12-25 |
Family
ID=22588424
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN00815283A Pending CN1387401A (zh) | 1999-11-02 | 2000-11-02 | 单倍体基因组用于遗传诊断、修饰和增殖 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US20040146865A1 (zh) |
EP (1) | EP1227719A4 (zh) |
JP (1) | JP2003512848A (zh) |
CN (1) | CN1387401A (zh) |
AU (1) | AU1581001A (zh) |
BR (1) | BR0015264A (zh) |
CA (1) | CA2388510A1 (zh) |
IL (1) | IL149201A0 (zh) |
MX (1) | MXPA02004333A (zh) |
WO (1) | WO2001032015A1 (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102533970A (zh) * | 2011-11-14 | 2012-07-04 | 江苏迈健生物科技发展有限公司 | 一种反转录pcr分析ivf单个植入前胚胎的基因表达方法 |
CN108697068A (zh) * | 2015-09-17 | 2018-10-23 | 瑞泽恩制药公司 | 对用于产生能生育的xy雌性小鼠的多能细胞的选择 |
CN109689894A (zh) * | 2016-06-19 | 2019-04-26 | 耶路撒冷希伯来大学伊萨姆研发有限公司 | 在人单倍体细胞中筛选化学疗法抗性 |
CN112375829A (zh) * | 2020-11-25 | 2021-02-19 | 苏州赛美科基因科技有限公司 | 使用家系wes数据识别upd的方法、装置及电子设备 |
Families Citing this family (31)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB0025088D0 (en) * | 2000-10-13 | 2000-11-29 | Univ Edinburgh | Stem cells |
AU2001297880B2 (en) * | 2000-11-30 | 2007-05-31 | Stemron Inc. | Isolated homozygous stem cells differentiated cells derived therefrom and materials and methods for making and using same |
EP1356035B1 (en) * | 2000-12-22 | 2011-03-16 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Methods for cloning non-human mammals using reprogrammed donor chromatin or donor cells |
US20020142397A1 (en) * | 2000-12-22 | 2002-10-03 | Philippe Collas | Methods for altering cell fate |
US7491534B2 (en) * | 2000-12-22 | 2009-02-17 | Kirin Holdings Kabushiki Kaisha | Methods for altering cell fate to generate T-cells specific for an antigen of interest |
JP4223284B2 (ja) * | 2001-01-02 | 2009-02-12 | ステムロン インコーポレイテッド | 予め選抜されたイムノタイプおよび/またはジェノタイプを有するホモ接合性幹細胞群の製造方法、該細胞由来の移植に適切な細胞、並びにこれらを用いた材料および方法 |
EP2679671B1 (en) * | 2002-05-24 | 2019-12-11 | Advanced Cell Technology, Inc. | A bank of stem cells for producing cells for transplantation having HLA antigens matching those of transplant recipients, and methods for making and using such a stem cell bank |
US20040091936A1 (en) | 2002-05-24 | 2004-05-13 | Michael West | Bank of stem cells for producing cells for transplantation having HLA antigens matching those of transplant recipients, and methods for making and using such a stem cell bank |
WO2006041910A2 (en) * | 2004-10-05 | 2006-04-20 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Stem cells derived from uniparental embryos and methods of use thereof |
US20080215353A1 (en) * | 2006-08-31 | 2008-09-04 | Akin James W | Method of Frozen Donor Egg Banking |
US20080167851A1 (en) * | 2007-01-08 | 2008-07-10 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Systems for genome selection |
US8012740B2 (en) * | 2007-01-08 | 2011-09-06 | The Invention Science Fund I, Llc | Systems for genome selection |
US7947455B2 (en) * | 2007-01-08 | 2011-05-24 | The Invention Science Fund I, Llc | System for genome selection |
US8003371B2 (en) | 2007-01-08 | 2011-08-23 | The Invention Science Fund I, Llc | Systems for genome selection |
US7985578B2 (en) | 2007-01-08 | 2011-07-26 | The Invention Science Fund I, Llc | Systems for genome selection |
US8521440B2 (en) * | 2007-01-08 | 2013-08-27 | The Invention Science Fund I, Llc | Systems for genome selection |
US7713728B2 (en) * | 2007-01-08 | 2010-05-11 | The Invention Sciencefund I, Llc | Systems for genome selection |
US7709244B2 (en) * | 2007-01-08 | 2010-05-04 | The Invention Science Fund I, Llc | Systems for genome selection |
US7648823B2 (en) * | 2007-01-08 | 2010-01-19 | Searete Llc | Systems for genome selection |
US7709245B2 (en) * | 2007-01-08 | 2010-05-04 | The Invention Science Fund I, Llc | Systems for genome selection |
US7718418B2 (en) | 2007-01-08 | 2010-05-18 | The Invention Science Fund I, Llc | Systems for genome selection |
US7947457B2 (en) * | 2007-01-08 | 2011-05-24 | The Invention Science Fund I, Llc | Systems for genome selection |
US20090111184A1 (en) * | 2007-10-24 | 2009-04-30 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Chromosome selection |
US20090111764A1 (en) * | 2007-10-25 | 2009-04-30 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Mitochondrial selection |
US20090111185A1 (en) * | 2007-10-26 | 2009-04-30 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Female genome selection |
WO2012071393A2 (en) * | 2010-11-23 | 2012-05-31 | The New York Stem Cell Foundation | Method for producing pluripotent stem cells |
WO2012117254A1 (en) * | 2011-03-02 | 2012-09-07 | Cambridge Enterprise Limited | Mammalian haploid embryonic stem cells |
EP2599859A1 (en) | 2011-11-30 | 2013-06-05 | IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH | Haploid cells |
IL293110B2 (en) | 2015-03-23 | 2023-11-01 | Astellas Inst For Regenerative Medicine | Improved assays for the potential of retinal pigment epithelium (RPE) cells and photoreceptor progenitors |
EP3421593A1 (en) * | 2017-06-30 | 2019-01-02 | Centre National De La Recherche Scientifique | Method for obtaining haploid cells |
BR112021016011A2 (pt) * | 2019-02-20 | 2021-10-05 | The Semex Alliance | Uso de células embrionárias haploides para gerar descendentes com genomas predeterminados |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5480772A (en) * | 1993-02-03 | 1996-01-02 | Brandeis University | In vitro activation of a nucleus |
US5843780A (en) * | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
US5749169A (en) * | 1995-06-07 | 1998-05-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Use of the indeterminate gametophyte gene for maize improvement |
US5932418A (en) * | 1996-04-08 | 1999-08-03 | Naiad Systems, Inc. | Fish embryo screening test for genotoxic agents using three different developmental life stages |
US5945577A (en) * | 1997-01-10 | 1999-08-31 | University Of Massachusetts As Represented By Its Amherst Campus | Cloning using donor nuclei from proliferating somatic cells |
CN100497598C (zh) * | 1999-10-28 | 2009-06-10 | 马萨诸塞大学 | 多能细胞和细胞系的单雌生殖或单雄生殖产生,及其产生分化细胞和组织的用途 |
-
2000
- 2000-11-02 EP EP00978337A patent/EP1227719A4/en not_active Withdrawn
- 2000-11-02 IL IL14920100A patent/IL149201A0/xx unknown
- 2000-11-02 MX MXPA02004333A patent/MXPA02004333A/es not_active Application Discontinuation
- 2000-11-02 WO PCT/US2000/030202 patent/WO2001032015A1/en active Application Filing
- 2000-11-02 CA CA002388510A patent/CA2388510A1/en not_active Abandoned
- 2000-11-02 CN CN00815283A patent/CN1387401A/zh active Pending
- 2000-11-02 AU AU15810/01A patent/AU1581001A/en not_active Abandoned
- 2000-11-02 JP JP2001534231A patent/JP2003512848A/ja active Pending
- 2000-11-02 BR BR0015264-1A patent/BR0015264A/pt not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-02-14 US US10/344,724 patent/US20040146865A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-05-02 US US11/743,613 patent/US20080085517A1/en not_active Abandoned
-
2011
- 2011-01-28 US US13/015,968 patent/US8551705B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102533970A (zh) * | 2011-11-14 | 2012-07-04 | 江苏迈健生物科技发展有限公司 | 一种反转录pcr分析ivf单个植入前胚胎的基因表达方法 |
CN108697068A (zh) * | 2015-09-17 | 2018-10-23 | 瑞泽恩制药公司 | 对用于产生能生育的xy雌性小鼠的多能细胞的选择 |
US10893666B2 (en) | 2015-09-17 | 2021-01-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Production of fertile XY female animals by silencing of genes on the Y chromosome |
CN108697068B (zh) * | 2015-09-17 | 2022-02-11 | 瑞泽恩制药公司 | 对用于产生能生育的xy雌性小鼠的多能细胞的选择 |
CN109689894A (zh) * | 2016-06-19 | 2019-04-26 | 耶路撒冷希伯来大学伊萨姆研发有限公司 | 在人单倍体细胞中筛选化学疗法抗性 |
CN112375829A (zh) * | 2020-11-25 | 2021-02-19 | 苏州赛美科基因科技有限公司 | 使用家系wes数据识别upd的方法、装置及电子设备 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20110287429A1 (en) | 2011-11-24 |
JP2003512848A (ja) | 2003-04-08 |
US8551705B2 (en) | 2013-10-08 |
IL149201A0 (en) | 2002-11-10 |
AU1581001A (en) | 2001-05-14 |
BR0015264A (pt) | 2002-10-15 |
EP1227719A1 (en) | 2002-08-07 |
MXPA02004333A (es) | 2004-04-21 |
US20040146865A1 (en) | 2004-07-29 |
CA2388510A1 (en) | 2001-05-10 |
EP1227719A4 (en) | 2003-01-15 |
WO2001032015A1 (en) | 2001-05-10 |
US20080085517A1 (en) | 2008-04-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1387401A (zh) | 单倍体基因组用于遗传诊断、修饰和增殖 | |
Chang et al. | Blastocyst formation, karyotype, and mitochondrial DNA of interspecies embryos derived from nuclear transfer of human cord fibroblasts into enucleated bovine oocytes | |
CN106535630B (zh) | 多重基因编辑 | |
Denning et al. | New frontiers in gene targeting and cloning: success, application and challenges in domestic animals and human embryonic stem cells | |
sang Lee et al. | Production of transgenic cloned piglets from genetically transformed fetal fibroblasts selected by green fluorescent protein | |
JP3739652B2 (ja) | 成体の体細胞核を再構成した被核除去卵母細胞からの動物の満期の成長 | |
US20210130849A1 (en) | Human gene correction | |
Lin et al. | Electroporation-mediated genome editing of livestock zygotes | |
Bowles et al. | Nuclear transfer: preservation of a nuclear genome at the expense of its associated mtDNA genome (s) | |
Lee et al. | Generation of mtDNA homoplasmic cloned lambs | |
Kremenskoy et al. | DNA methylation profiles of donor nuclei cells and tissues of cloned bovine fetuses | |
Fan et al. | Gene knockouts in goats using CRISPR/Cas9 system and somatic cell nuclear transfer | |
Li et al. | Progress toward generating a ferret model of cystic fibrosis by somatic cell nuclear transfer | |
Takebayashi et al. | Gene editing in porcine embryos using a combination of electroporation and transfection methods | |
WO2001084920A1 (en) | The production of agricultural animals from embryonic stem (es) cells | |
Li et al. | Production of genetically engineered porcine embryos by handmade cloning | |
Xing et al. | Gene expression and development of early pig embryos produced by serial nuclear transfer | |
EP3760727A1 (en) | Method for preparing non-human primate somatic cell cloned animal | |
US20110277049A1 (en) | Production of cloned offspring from cooled carcasses | |
Cho et al. | Identification of abnormal gene expression in bovine transgenic somatic cell nuclear transfer embryos | |
Lin | Scalable Production of Genome-Edited Livestock Embryos | |
AU2006203223A1 (en) | Use of haploid genomes for genetic diagnosis, modification and multiplication | |
CN113186189A (zh) | 一种用于敲除猪NPHS2基因的gRNA及其相关应用 | |
US20030229909A1 (en) | Cloning cats by nuclear transplantation | |
WO2005060740A2 (en) | An improved method for embryo and animal production |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |