CN1384119A - 抗禽类病毒性疫病的复合卵黄抗体及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有抗体活性的抗禽流感、新城疫的鸡卵黄抗体(抗－ANIgY)、制备该抗体的方法及其在制备用于治疗因禽流感、新城疫单一和/或它们的混合感染引起的相关禽类病毒性疫病的药物或保健品中。上述抗体经抗－ANIgY体外拮抗毒素生物活性检测,呈现对AIV、NDV的中和或灭活作用,经IgY纯度检查:用PAGE电泳检测纯化的卵黄抗体的纯度,电泳中只出现一条电泳带;上述方法为:制备AIV、NDV抗原,将该抗原免疫健康母鸡,收集其所产的卵,再从卵中提取抗－ANIgY。
Description
技术领域
本发明涉及了一种具有抗体活性的复合卵黄抗体物质——抗禽类病毒性疫病复合卵黄抗体(抗-ANIgY)产品，并涉及其制备工艺和应用。
技术背景
禽流感(AI)、新城疫(ND)是严重危害养禽业的烈性病毒性传染病。引起禽流感(AI)的病原为禽流感病毒(AIV)，该病毒属正粘病毒科流感病毒属。新城疫(ND)至今仍是世界各地广泛流行的主要禽病，是一种高度致病的传染病，它导致肠道充血，严重的呼吸困难，神经症状，产蛋下降，死亡率很高，(NDV)是副粘病毒的代表种，被命名为副粘病毒I型(PMVI)。禽流感和新城疫具有一个共同特点，即其病原因子(病毒)的毒力都有极大的变异。禽流感病毒和新城疫病毒都有能引起感染却不产生明显临床症状的毒株，它们是危害最为严重的两大病毒性疾病，而且往往合并发生。
有关鸡病毒混合感染的防治，饲养者通常用金毒克、病毒双效、正泰欣等抗生素药物进行疫苗接种，靠该类药物防治禽类病毒性疾病虽对鸡群的成活率有一定的帮助，却直接导致肉禽类食品抗生素残留、激素残留、重金属残留和农药残留大大超过我国自订的绿色无污染标准和国际出口标准；另有部分养殖企业采用中药制剂方式对鸡群进行该类疫病的防治，但由于种种原因，禽用中药制剂的效果不甚理想，其主要原因是禽类对中药药剂的吸收不好，药效在鸡体上得不到良好的体现，因而疫病在鸡群中无法从根本上得到控制。以上几点是我国现行禽类病毒性感染疫病的的主要防治方式，均各有弊端，不利于我国肉禽蛋类产品的质量得到确切有效的提高。长期食用这样的肉食品，将给人们的身体健康带来严重的损害。
近年来许多国家都逐渐在使用包括活菌苗、灭活苗、益生菌等生物制剂来控制病毒性感染禽类疫病，这种生物制剂防治鸡病毒感染的效果多数情况下是单一的，相当于药物预防的水平，对混合感染的疾病无能为力，单靠疫苗预防，免疫效果不理想。疫苗对健康动物传染病的预防是根本，但对临床上一定比例发病群体和混合感染的治疗至今是一个难题。在提高禽类生产率的总体措施中，具有重要意义的是利用各种生物制剂预防禽病，除疫苗外，高免血清的应用在接种疫苗产生免疫力之前、免疫失败时紧急预防接种、提高幼禽抗病能力及促进其生产方面都具有重要意义。
鸡卵黄抗体(IgY)是来自鸡血清的IgG(免疫球蛋白G)，IgY的结构与IgG相似，具有典型的免疫球蛋白的空间构象。研究表明IgY具有高度的稳定性，对热、酸、碱环境中具有优良的耐受性，同时IgY还具有成本低、易于形成规模化生产的优点。
现有技术中未见有通过采用联合鸡新城疫多价毒株(标准毒株+地方毒株)和禽流感毒株为抗原，免疫健康母鸡，收集其所产的卵，再从卵中提取的抗-ANIgY及其制备方法和应用的报道。
发明的内容
本发明根据禽兽药类生物制剂这一发展方向进行研究，针对禽流感、新城疫等病毒性疫病主要靠抗生素药物进行防治的而存在的不足，采用鸡新城疫多价毒株(标准毒株+地方毒株)和禽流感毒株制备复合抗原接种产蛋鸡后，诱导其体液免疫***产生高效价免疫球蛋白。通过改良水溶法精提(纯度达到95％以上)的免疫球蛋白。
本发明能够解决以往生物制剂禽兽类药物杂质含量过高，免疫球蛋白效用不明显，受制条件多，无法真正进行产业化生产的难点，有效提高了免疫球蛋白的纯度，使其直接作用于鸡体，其同源性及效用性均高于其它的生物制剂；同时解决了抗生素药物对肉禽蛋类产品残留物的问题，为提高了该类产品的质量提供了有利的保证。
本发明针对以上问题，研制出一种方便、高效、无毒副作用的非抗生素生物禽药，用于因鸡AIV、NDV感染所引起的禽类病毒性感染疾病的防治。因其制备免疫球蛋白的方法较以往的要简单、快速、易于掌握，提取回收率理想，经济效益可观，适于产业化制作。
本发明通过以鸡新城疫多价毒株(标准毒株+地方毒株)和禽流感毒株为抗原，免疫健康产蛋母鸡，提取活性成分(抗-ANIgY)。为治疗禽混合病毒感染提供一条新思路和新方法，并为进一步制备抗AI、ND混合感染的免疫生物制剂奠定基础。因此：
本发明所要解决的技术问题之一是：针对现有技术存在的上述不足，提供一种具有抗体活性的抗AI、ND等禽类病毒性疫病的复合卵黄抗体(抗-ANIgY)。
本发明所要解决的技术问题之二是：提供上述复合卵黄抗体(抗-ANIgY)的制备方法。
本发明所要解决的技术问题之三是：提供上述复合卵黄抗体(抗-ANIgY)在制备用于禽类因AI、ND单一和或混合感染引起的鸡瘟、禽流感病毒性疾病的预防或治疗的生物药物制剂、饲料添加剂及其相关产品应用。
本发明解决上述技术问题之一所提供的抗禽类病毒性疫病的复合卵黄抗体(抗-ANIgY)，其特征在于：所述抗-ANIgY按YSDS-PAGE电泳(7.5％分离胶)检测，图谱呈现单一区带；经电泳考马斯亮兰R250染色呈蓝色；免疫印记Western-blotting检测中高分子量带处出现清晰单一的特异性酶染条带；经抗-ANIgY体外拮抗病毒生物活性检测，表现出对AIV、NDV的灭活作用，效价测定中AIV琼脂扩散抗体效价在1∶64以上，NDV红细胞凝集抑制试验抗体效价达1∶320-1∶1084。
本发明解决上述技术问题之二是通过采用这样的技术方案实现的，即一种制备抗AI、ND复合卵黄抗体(抗-ANIgY)的方法，其特征在于采用如下的步骤完成：
1.制备复合抗原
(1)、鸡新城疫病毒(NDV)毒株即F48E8及自主分离株HR98的培养：a、采用组织培养法，将新城疫病毒接种于鸡胚培养后，收取羊膜尿囊液，加入***或β-丙酸内脂使之灭活后制成抗原，再加入矿物油或氢氧化铝胶作为佐剂，乳化制成油乳剂灭活抗原；(2)将禽流感株H7接种于鸡胚培养后，收取羊膜尿囊液，加入***制成灭活抗原；然后将两种抗原按1∶1混合得复合抗原，免疫前复合抗原与完全福氏佐剂按1∶1混合。
2.将复合抗原按以下的步骤制备抗体：
(1).对产卵母鸡的免疫：A.基础免疫；选用产卵母鸡(健康)隔离饲养。进行鸡皮下多点注射鸡复合抗原，0.5ml/只。B.强化免疫：基础免疫7天后，进行强化免疫，注射不完全福氏佐剂复合抗原0.5ml/只。C.超强化免疫：21天后需超强化免疫1-3次。注射量2.5ml/只，以保持抗体滴度。
于7天后开始收集鸡蛋，4℃储存备用。
(2).卵黄抗体的提取
①.采用水溶法提取卵黄抗体。从免疫鸡卵中分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，调整适当PH值4℃静置8h，离心取上清浓缩、冷冻干燥，得到抗-ANIgY。或②采用膜过滤法提取卵黄抗体。分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，4℃静置12h后，以分子量为200KD和150KD的膜分别过滤，收集150KD-200KD的蛋白物质，冷冻干燥得到抗-ANIgY。
本发明所提供的上述抗-ANIgY产品由鸡AI、ND免疫产卵母鸡而得，具有特异性，对防治禽类因AI、ND单一和或混合感染引起的消化道传染病具有良好的效果。本发明采用母鸡所产鸡卵为载体，安全无毒，易于产业化。
附图的说明
附图给出了本发明制备方法的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作进一步的说明本：
实施例1：具有抗体活性的AI、ND复合卵黄抗体的产品，可以通过以下步骤获得：制备AI、ND抗原，将抗原免疫健康母鸡，然后收集其所产卵，再从其所产卵中提取抗-ANIgY。
实施例2：鸡新城疫病毒(NDV)毒株为F48E8及自主分离株HR98，采用组织培养法培养，将新城疫强毒接种于鸡胚培养后，收取羊膜尿囊液，加入***或β-丙酸内脂使之灭活后制成，再加入矿物油或氢氧化铝胶作为佐剂，乳化制成油乳剂灭活抗原；禽流感株H7接种于鸡胚培养后，收取羊膜尿囊液，加入***制成灭活抗原；两种抗原按1∶1混合得复合抗原。
实施例3：采用如下方式分离提取抗-ANIgY：从免疫鸡卵中分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，调整适当PH值4℃静置8h，离心取上清浓缩、冷冻干燥，得到抗-ANIgY。
实施例4：分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，4℃静置12h后，以分子量为200KD和150KD的膜分别过滤，收集150KD-200KD的蛋白物质，用正压微孔过滤器进行过滤除菌。滤膜为混合纤维酯滤膜，孔径为0.22μm，过滤压力＜1.0kg/cm2。将无菌检验和安全检验合格后的提纯抗体分装于100mL玻璃瓶中，冷冻干燥得到抗-ANIgY，置4℃冰箱保存或-15℃冻结保存备用。
实施例5：取实施例1、3、4中的产品进行IgY纯度检查：用PAGE电泳检测纯化的卵黄抗体的纯度，电泳中只出现一条电泳带，即为提纯的卵黄抗体。
实施例6：取实施例1、3、4中的产品进行IgY浓度检查：将提取的抗-ANIgY用0.01mol/L PH7.2 PBS作5-10倍的稀释，然后用采用双缩脲生化法测定蛋白浓度。
实施例7：将卵黄提纯抗体直接接种硫乙醇酸盐培养基(T.G)小管，酪胨琼脂(G.A)斜面各2支，1支置36±1℃，1支置25±1℃，另用1支葡萄糖蛋白胨汤〔G.P〕小管，接种0.2mL，置25±1℃，均培养5d，均无菌生长。
实施例8：安全检验取30日龄健康小鸡5只，每只皮下注射0.5mL观察1周，均无异常反应。
实施例9：效价测定：取制备好的卵黄抗体液，充分摇匀，分别用琼脂扩散试验和红细胞凝集抑制试验测定AIV和NDV抗体。其中AIV琼脂扩散抗体效价在1∶64以上，NDV红细胞凝集抑制试验抗体效价达1∶320-1∶1084。
实施例10：采集抗-ANIgY免疫蛋50个，分离得到800ml蛋黄，加水稀释至5000ml，离心得到清液4000ml，采用中空纤维超滤提取，最后浓缩至400ml待用，其中含有精提(即指纯度在95％以上的IgY抗-ANIgY)12克。将麦芽糖10克加入50ml水溶解，100℃灭菌30分钟，将处理过的辅料与50ml超滤液混合均匀，冷冻干燥，无菌粉碎包装成袋，每小袋内含0.5克，用于治疗因AI、ND单一和或混合感染引起的禽类病毒性传染病。
实施例11：采集抗-ANIgY免疫蛋50个，分离得到800ml蛋黄，加水稀释至5000ml，离心得到清液4000ml，采用中空纤维超滤提取，最后浓缩至400ml待用，其中含有精提(即指纯度在99.5％以上的IgY抗-ANIgY)10克。超滤液按5-10％加入甘露醇，混合均匀，分装0.1克/瓶，冷冻干燥。用于治疗因AIV、NDV单一和或混合感染引起的烈性传染病。
实施例12：体外实验：
①.分子量检测：SDS-PAGE电脉，分离胶长度8％，浓缩胶浓度5％，稳流11mA电脉5h，Marker采用低相对分子质量标准蛋白质，取下凝胶用于常规银染色法和转移电泳，测得分子量为180KD。
②.纯度分析：免疫印迹(参照文献进行)，纯度为95％。
③.活性检测：ELISA间接试验，操作方法参照常规ELISA间接法，所用抗原、抗-ANIgY、酶标抗体均按棋盘滴定法确定工作浓度，病毒抗原浓度为100μg/ml，包被板每孔加样100μl，被测抗-ANIgY每孔加样100μl，辣根过氧化物酶标抗兔抗鸡IgG(Sigma公司)工作稀释度为1∶10000，底物为OPD，2ml/浓硫酸终止反应，酶标仪492nm下测定OD值。结果表明抗-ANIgY对两种病毒的滴度范围在1∶64-1∶1080之间。
实施例13：抗-ANIgY体外拮抗毒素生物活性检测：
抗-ANIgY(10μg～200μg/ml)与ND毒株(10～30μg/ml)在无菌条件下1∶1混合。37℃2h后，取0.1ml上清加入鸡呼吸道上皮细胞培养中，发现IgY浓度在100～200μg/ml可完全阻断ND对鸡呼吸道上皮细胞的毒性作用；其后的系列稀释，其保护活性亦随之减低，显微镜形态学观察亦获得相同结果：正常鸡呼吸道上皮细胞呈贴壁的多形性生长，细胞内无颗粒，且折光良好。ND作用后，细胞球形变，胞浆内出现多颗粒，当浓度＞50μg/ml时，IEC细胞多以裂解，残余细胞体积明显皱缩；拮抗病毒后，细胞的形态改变减轻。说明抗-ANIgY在体外能阻断ND对鸡呼吸道上皮细胞的毒性，起到保护细胞的作用。
实施例14：鸡在体保护试验：取健康的40日龄小鸡15只，随机分成3组，第1组每只皮下注射鸡新城疫病毒强毒液和卵黄提纯抗体1ml，(强毒∶卵黄抗体＝1∶4混合后，置37℃作用1h).第2组先注射卵黄提取液1ml，1h后注射NDV强毒液0.5ml，对照组皮下注射0.5ml NDV强毒株。第1组观察14d均无发病和死亡，每2组观察14d均无发病和死亡，对照组4d后发病，5d后开始死亡，7d后全部死亡。说明抗-ANIgY在体能拮抗ND，显著改善鸡的发病症状，提高存活率。
实施例15：鸡在体保护试验：取健康的40日龄小鸡15只，随机分成3组，第1组每只皮下注射鸡禽霍乱病毒液和卵黄提纯抗体1ml，(毒液∶卵黄抗体＝1∶3混合后，置37℃作用1h)。第2组先注射卵黄提取液1ml，1h后注射AIV强毒液0.5ml，对照组皮下注射0.5ml AIV强毒液。第1组观察14d均无发病和死亡，每2组观察14d 1只发病，无死亡。对照组3d后发病，6d后开始死亡，9d后全部死亡。说明抗-ANIgY在体能拮抗AI，显著改善鸡的发病症状，提高存活率。
实施例16：口服抗-ANIgY在体生物学活性观察：参照相关文献建立鸡细菌感染的模型，试验分为治疗组〖低剂量(10mg/kg)、中剂量(20mg/kg)、高剂量(40mg/kg)抗-ANIgY〗，对照组；口服治疗3、5、7天后，观察动物的精神及呼吸道症状等指标。结果发现：中、高剂量组在服用7天后动物的精神及呼吸道症状有明显改善。说明口服抗体(20mg/kg)即可起到改善临床症状，提高生存率的作用。
Claims (3)
1、一种抗禽类病毒性疫病的复合卵黄抗体(抗-ANIgY)，其特征在于：所述抗-ANIgY按YSDS-PAGE电泳(7.5％分离胶)检测，图谱呈现单一区带；经电泳考马斯亮兰R250染色呈蓝色；免疫印记Western-blotting检测中高分子量带处出现清晰单一的特异性酶染条带；经抗-ANIgY体外拮抗病毒生物活性检测，表现出对AIV、NDV的灭活作用，效价测定中AIV琼脂扩散抗体效价在1∶64以上，NDV红细胞凝集抑制试验抗体效价达1∶320-1∶1084。
2、一种制备抗AI、ND鸡卵黄抗体，即抗-ANIgY的方法，其特征在于：采用如下的工艺步骤：
1.制备复合抗原
(1)、鸡新城疫病毒(NDV)毒株即F48E8及自主分离株HR98的培养：a、采用组织培养法，将新城疫病毒接种于鸡胚培养后，收取羊膜尿囊液，加入***或β-丙酸内脂使之灭活后制成抗原，再加入矿物油或氢氧化铝胶作为佐剂，乳化制成油乳剂灭活抗原；(2)将禽流感株H7接种于鸡胚培养后，收取羊膜尿囊液，加入***制成灭活抗原；然后将两种抗原按1∶1混合得复合抗原，免疫前复合抗原与完全福氏佐剂按1∶1混合；
(2)再将所得抗原按以下的步骤制备抗体：
①.对产卵母鸡的免疫：A.基础免疫；选用产卵母鸡(健康)隔离饲养。进行鸡皮下多点注射鸡复合抗原，0.5ml/只；B.强化免疫：基础免疫7天后，进行强化免疫，注射复合抗原0.5ml/只；C.超强化免疫：21天后需超强化免疫1-3次。注射量2.5ml/只，以保持抗体滴度；
于7天后开始收集鸡蛋，4℃储存备用。
②.卵黄抗体的提取
A.采用水溶法提取卵黄抗体；从免疫鸡卵中分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，调整适当PH值4℃静置8h，离心取上清浓缩、冷冻干燥，得到抗-ANIgY；
或B.采用膜过滤法提取卵黄抗体：分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，4℃静置12h后，以分子量为200KD和150KD的膜分别过滤，收集150KD-200KD的蛋白物质，冷冻干燥得到抗-ANIgY；
3、权利要求1、2所述的复合卵黄抗体(抗-ANIgY)在制备用于治疗禽类因AIV、NDV单一和或混合感染引起的相关疾病的禽类药物和饲料添加剂中的应用。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |