CN1364910A - L－薄荷醇的制备方法 - Google Patents

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Abstract

通过对映选择酶催解离自D,L－基衍生物制备L－薄荷醇。

Description

L-薄荷醇的制备方法
技术领域
本发明涉及通过D，L-基衍生物的对映选择性酶催解离制备L-薄荷醇的方法。
背景技术
薄荷醇的合成制备方法已为众所周知(普通香料和食用香料(Common Fragrance and Flavor Materials)；Bauer，K.，Garbe，D.和Surburg，H.，Verlag VCH，Weinheim，1990，第二版，第44-46页)。如果所得产品是外消旋混合物，则其气味和味道均明显劣于天然存在的L-薄荷醇，例如来自薄荷油的。所以，对D，L-薄荷醇分离方法很有兴趣。
诸如采用物理方法能够实现所述分离。这些方法包括，例如，旋光性胺与外消旋邻苯二甲酸氢甲酯或琥珀酸氢甲酯的盐的分级结晶。另外，D-或L-薄荷醇能够自外消旋薄荷醇混合物分离出来，方法是采用诸如氧基乙酸的旋光性酸酯化所述混合物，并通过结晶分离非对映化合物的混合物。D-或L-薄荷醇通过非对映酯的皂化得到。
工业应用的自D，L-薄荷醇混合物分离光学纯D-和L-薄荷醇的另一种方法(DE-A 2 109 456)借助于羧酸基酯作中间体来进行。优选使用苯甲酸或者六氢苯甲酸的酯，还有4-甲基苯甲酸、3，5-二硝基苯甲酸和4-乙氧基苯甲酸的酯。该方法是旋光对映体的选择性结晶，所得对映体的纯度如此之高，以致于能够在不进行进一步提纯操作的条件下实施进一步的处理。
此外，L-薄荷醇能够通过使用酶或微生物从D，L-薄荷醇混合物中分离出来。
还已知脂肪酶水解含水介质中的酯，并且具有高的专一性和选择性。另外，在某些有机溶剂中，一些脂肪酶具有催化逆反应的能力，从而自相应的酸和醇合成酯。
已经使用各种策略自外消旋D，L-薄荷醇混合物制备纯L-薄荷醇。因此，例如，四面体通讯(Tetrahedron Letters)27，(1986)29公开了皱摺假丝酵母(Candida rugosa)的脂肪酶自外消旋月桂酸基酯通过在含水介质中水解有选择性地释放L-薄荷醇(对映体过量(ee)：70％)。在外消旋薄荷醇与月桂酸的酯化中也显现该对映选择性优势，以高对映体纯度(对映体过量：86％)形成L-月桂酸基酯。在非水介质中，外消旋薄荷醇能够采用脂肪酶与月桂酸对映选择地酯化，再一次有选择性地形成L-月桂酸基酯(对映体过量：95％)。10小时之后该反应实质上完成。D，L-薄荷醇与甘油三月桂酸酯的酯交换反应，或者D，L-月桂酸基酯与异丁醇的酯交换反应以相似的高对映选择性进行，但是反应极其缓慢(反应时间15天或更长)。
还已知，如果物质在水中只有差的溶解性，那么在非水介质中在酶催化下进行反应。作为有机溶剂的替代品，可以应用超临界流体，特别是超临界二氧化碳。因此Chemie Ingenieur Technik，69，(1986)29还公开了其用于D，L-薄荷醇外消旋体拆分，更确切地说，通过各种醋酸酯与外消旋薄荷酸的对映选择性酯交换来进行。采用烯醇酯醋酸异丙烯酯得到最好的结果。这类酯的好处是，在反应完成之后，通过水解形成的醇，在这种情况下是异丙烯醇，立即异构化形成相应的酮，所以不为任何逆反应所利用。所研究的酶是自皱摺假丝酵母的脂肪酶AY、自Burkholderia cepacia(旧称葱头假单胞菌(Pseudomonas cepacia))的脂肪酶PS、自Candida antarctica B的Novozyme435、自Rhizomucor miehei的脂酶(lipozyme)IM60和自划界假单胞菌(Pseudomonas marginata)的酯酶EP10。
酯酶EP10能够得自含有EP10酯酶的基因的重组体E.coli菌株。酯酶EP10在体系中显示无疑地最高的对映选择性。Novozyme435，在所选择的条件下，在采用各种醋酸酯的酯交换中实质上没有产生转化。
根据生物技术进展(Biotechnol.Prog.)11，(1995)270报导，通过采用非离子表面活性剂对脂肪酶进行目标处理可以显著增加自皱摺假丝酵母的脂肪酶(脂肪酶AY)对外消旋薄荷醇的对映选择性。这些研究清楚说明，在有机介质中L-薄荷醇与月桂酸的酯化的有效性很大程度上取决于酶。自皱摺假丝酵母的脂肪酶在这个反应中的有效性显著高于自Rhizopus sp.、Burkholderia cepacia、Pseudomonassp.、Mucor javanicus、Aspergillus niger以及自猪胰脏的脂肪酶。另外，已经发现，用非离子表面活性剂处理的结果是，自皱摺假丝酵母的脂肪酶的有效性增加到约5倍。
Tetrahedron Letters39，(1998)4333公开了采用微波辐射，在猪胰脏脂肪酶的情况下，不引起外消旋薄荷醇与棕榈酸的酯化反应的反应速度或对映选择性的变化。
脂肪酶也能接受羧酸酐作为酰基给体。羧酸酐，正如在烯醇酯的情况下已经叙述的，其优点是酰基转移是准不可逆的。根据酶和微生物技术(Enzyme and Microbial Technology)18，(1996)536，自皱摺假丝酵母的脂肪酶AY-30能够在外消旋薄荷醇与乙酸酐、丙酸酐和丁酸酐的反应中实现一定的对映选择性。这种酶的最好结果得于：在正己烷溶剂中与丁酸酐反应48小时之后(对映体过量：所形成的L-丁酸基酯的86％)。
反应的对映选择性一般取决于所用的脂肪酶和所用的酸酐两者。因此，微生物生物工艺学(Microbiol.Biotechnol)43，(1995)639公开自皱摺假丝酵母的脂肪酶OF360和丙酸酐赋予所形成的L-丙酸基酯很高的光学纯度(对映体过量：95％)。
自D，L-薄荷醇混合物制L-薄荷醇的另一个可能的方法是对映选择地酶催解离外消旋酯混合物。因此，Dechema Biotechnol.Conf.(1989)141公开采用自皱摺假丝酵母的脂肪酶使D，L-醋酸基酯进行水解反应，所释放出的L-薄荷醇说明酶的对映选择性相当低。
发明内容
本发明的目的在于以高的绝对对映选择性拆分出适于工业应用的D，L-薄荷醇，或其衍生物，以获得纯的L-薄荷醇或D-薄荷醇，或者纯的L-薄荷醇酯或D-薄荷醇酯。
已发现制备D-或L-薄荷醇和其衍生物的方法，其特征在于采用脂肪酶对映选择地酶催解离D，L-基衍生物。
具体实施方式
按照本发明方法，令人惊异地以对映体过量(ee值)大于99％、选择性(E值)＞100得到了对映体。
用于本发明方法的D，L-基衍生物是，例如下式化合物其中：
R代表氢、未支化或支化的C1-C20-烷基、C3-C8-环烷基、C6-C14-芳基、C7-C15-芳基烷基、C1-C20-烷氧基、C1-C20-烷基氨基，其中上述烃基能够任选由羟基、甲酰基、氧基、C1-C6-烷氧基、羧基、巯基、磺基、氨基、C1-C6-烷基氨基或硝基或卤素，优选氯单取代或多取代。
优选的D，L-基衍生物是D，L-薄荷醇与脂族或芳族羧酸的酯。例如，可以述及以下酯：D，L-醋酸基酯、D，L-苯甲酸基酯、D，L-异戊酸基酯。
特别是优选D，L-苯甲酸基酯。
用于本发明方法的D，L-基衍生物本身是已知的。
通常，对于本发明方法而言，使用自皱摺假丝酵母的脂肪酶。
已知脂肪酶也能通过重组体DNA技术(EP A 238 023)来生产。其中脂肪酶编码基因通过本领域技术人员已知的方法从所选择的菌株转移到接受生物体。这种接受生物体产生脂肪酶。
在最优选的实施方案中，使用固定在载体材料上的重组脂肪酶。适宜的载体材料是，例如，塑料如聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氨酯、聚丙烯酸酯、胶乳、尼龙或聚四氟乙烯，多糖如琼脂糖或葡聚糖，离子交换树脂(阳离子和阴离子两者)，硅氧烷聚合物如聚硅氧烷，或硅酸盐如玻璃。酶的固定方法已为本领域技术人员知晓(K.Mosbach，“Immobilized Enzymes”，Methods in Enzymology44，Academic Press，New York，1976)，并且包含交联、吸附或共价键合到载体材料上。
自皱摺假丝酵母的脂肪酶也已市售，例如脂肪酶AY(销售商：Amano，Nagoya，日本)。
令人惊奇的是，在本发明优选形式中，已经发现，采用自皱摺假丝酵母的重组脂肪酶(WO99/14338)的D，L-苯甲酸基酯的水解以很高的对映选择性(E＞100)和(-)-薄荷醇的对映体过量＞99.9％来进行。该结果由气相色谱分析、NMR光谱和旋光测定法来证实。
两种皱摺假丝酵母脂肪酶(市售和重组体)的不同水解行为能够以下述事实来解释，市售制剂不仅能含有所需要的酶，而且含有大量的性能稍有不同的同工酶。SDS-PAGE研究发现，所使用的重组脂肪酶仅显示一种蛋白谱带(见WO99/14338)，而脂肪酶AY则显示许多蛋白谱带。
习惯上，本发明方法所用的溶剂能够是水、含水缓冲液和有机溶剂。优选使用的有机溶剂是己烷、环己烷、庚烷、环庚烷、甲苯、二氯甲烷、乙腈、二甲基甲酰胺、二噁烷、四氢呋喃或乙醇。优选应用的含水缓冲液是磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。
对于本发明方法，一般应用1-10000单位(U)脂肪酶，优选10-1000单位(U)脂肪酶，以0.01mmol基衍生物为基准计。
按照本发明方法的解离一般在0-90℃下，优选在20-60℃的温度下实施。
按照本发明方法的解离一般在pH1-12下，优选在约pH7下实施。
本发明方法能够按下述实施，例如：第一步在发醇桶中以与WO99/14338(参见实施例1)相似的方式生成酶；在第二步中，提纯所得脂肪酶(参见实施例1)；在第三步中使基衍生物进行酶催解离(参见实施例3)。
如此制备的纯薄荷醇对映体符合高分析和感官要求。
实施例
实施例1
分批进料发酵Pichia pastoris
媒介物：pGAP(Invitrogen)
质粒：Lip1(自皱摺假丝酵母的脂肪酶)
表达：组成性发酵
分批进料发酵在42升生物反应器(生物工程)中在复合介质中30℃和pH6下实施。介质包含1％酵母提取液、2％胨、1％甘油和0.1M K磷酸盐缓冲液pH6。进料溶液，对于纯葡萄糖进料，由20％葡萄糖组成，对于混合进料，由20％葡萄糖/5％甘油组成。生物反应器采用OD600为2-3的500ml震荡过夜培养物在上述介质中进行接种。搅拌速度为400rpm，通气速度15升(STP)/分钟。在发酵期间，测定在600nm下的光密度、生物量湿物质(BWM)、生物量干物质(BDM)和上层清液的解脂活度。在24小时之后进行第一次进料，此后每隔12小时加料300-600ml进料溶液。混合进料开始在72小时。在170-190小时之后完成发酵。
在下述处理之后，活度为40,000U/g冻干浓缩物。总收率为21g干物质。
在复合介质中培养的CRL(皱摺假丝酵母脂肪酶)的提纯
尽管通过Pichia pastoris向介质中分泌活性形式的成熟皱摺假丝酵母脂肪酶，所制备的SDS凝胶分析发现，在上层清液中仍存在污染性蛋白质。所以，为提纯重组脂肪酶制定了提纯方案。
在交叉流过滤(Sartorius，Gttingen，Sartocon Cassette：0.2μm)之后，渗析50ml发酵上层清液(Spectra/Por渗析管)，以便除去干扰下一提纯步骤的盐。然后通过采用30kD膜(Pall，OmegaMinisette，MW：30,000)的超滤进一步浓缩脂肪酶溶液。以DEAE-Sepharose填充FPLC柱，该柱用25mM三羟甲基氨基甲烷(tris)-HCl缓冲液(pH7.5)平衡，并施用脂肪酶溶液。在使用平衡缓冲液的洗涤步骤之后，采用NaCl梯度来洗脱脂肪酶。采用pNPP快速检测(参见下述)测试各级分的脂肪酶活度。将黄色的级分合并、超滤、冷冻干燥(Finn Aqua Lyovac GT2)，并借助pH计测定解脂活度。提纯方案总结于表1。表1
自复合介质中的Pichia pastoris的培养上层清液中提纯CRL的表。
脂肪酶溶液体积[ml]     提纯步骤   总活度[U]*   比活度[U mg-1] 总收率(每个提纯步骤收率)[％]
    50 - 213,500     52     -
    270 渗析 197,100     146     92(92)
    37 超滤 185,000     166     87(94)
    50 采用DEAE-Sepharose的离子交换色谱法 89,600     5978     42(49)
*活度借助pH计相对于三丁酸甘油酯进行测定酶的检定
采用pH计(Metrohm)在pH7.2常规地检测活度。
将66mM甘油三丁酸酯采用20mg/ml***树胶稳定剂乳化，并采用Ultraturrax(T25，Janke&Kunkel)在最大速度下均化7min。
加入20ml检定溶液，并加入10-100μl酶溶液。然后采用pH计检测活度。将一个单位定义为每分钟释放1μmol脂肪酸的酶的量。pNPP快速试验
为了能够快速检验大量样品，使用快速试验。溶液A由溶解在异丙醇中的棕榈酸对硝基苯酯(pNPP，10mm)组成。溶液B由三羟甲基氨基甲烷缓冲液(100mM，pH7.5)、胆酸盐(0.8％(w/v))和***树胶(1％(w/v))组成。反应混合物由9份溶液B和1份溶液A组成，并且必须总是新鲜配制。将待试验溶液(50μl)吸移到微量滴定板上，并加入反应混合物(200μl)。通过底物解离形成的黄色以目测评估或者光谱法定量。
实施例2苯甲酸基酯的萃取的初步试验
使D，L-苯甲酸基酯在含有***树胶(0.2％(m/v))作为加溶剂的磷酸钠缓冲液(pH7.2，100mM)中进行水解。然后，需要将反应混合物用适于气相色谱分析的溶剂进行萃取。
为了确定适宜的溶剂，将等摩尔量D，L-苯甲酸基酯和D，L-薄荷醇溶解在异辛烷中，以便得到信号面积比的基准(苯甲酸基酯/薄荷醇)。气相色谱测定得到信号面积比〔苯甲酸基酯/薄荷醇〕为1.7。
然后用旋转蒸发器除去溶剂，残余物在10ml磷酸钠缓冲液(pH7.2，100mM)中溶解，加入***树胶(0.2％(m/v))，将混合物均化10min，并在每种情况下向塑料反应器中加入1ml等分部分。在40℃下培育1小时之后，将混合物以一层不同的溶剂(每种500μl)盖上，并振动萃取1小时。表2示出按照GC测定得到的信号面积比〔苯甲酸基酯/薄荷醇〕。表2
萃取用溶液
    溶剂     信号面积〔苯甲酸基酯/薄荷醇〕
    异辛烷     0.2
    己烷     0.1
    甲苯     1.4
    氯仿     1.2
    醋酸乙酯     1.7
    ***     1.1
    异丙醚     1.4
如此发现，醋酸乙酯是萃取苯甲酸基酯和薄荷醇的最适宜溶剂。
实施例3
采用自皱摺假丝酵母的重组脂肪酶(rec.CRL)进行D，L-苯甲酸基酯的水解
在每种情况下，反应均在1ml磷酸钠缓冲液中(pH7.2，100mM)在40℃下采用0.2％(m/v)***树胶作加溶剂来进行。在每种情况下，所用的酶的量为每0.01mmol D，L-苯甲酸基酯为400U提纯的皱摺假丝酵母脂肪酶。采用气相色谱测定薄荷醇的对映体过量，并以信号面积为基准计算苯甲酸基酯的对映体过量。表3
采用rec.CRL进行D，L-苯甲酸基酯水解。
 反应时间〔h〕     对映体过量 转化率 对映选择性
[％ees] [％eep] [％]
在40℃下反应
    2     2     ＞99     2     ＞100
    4     11     ＞99     10     ＞100
    6     28     ＞99     22     ＞100
    8     82     ＞99     45     ＞100
表3说明，对于在所选择反应条件下D，L-苯甲酸基酯的水解而言，自皱摺假丝酵母的重组脂肪酶显示很高的对映选择性(E＞100)。
实施例4
确定对D，L-苯甲酸基酯水解最佳的温度
表4总结了在不同温度下进行D，L-苯甲酸基酯的结果。反应均在含0.2％(m/v)***树胶加溶剂的1ml磷酸钠缓冲液(pH7.2，100mM)中进行。为了确定最佳温度，选择反应温度30℃、40℃、50℃和60℃。在每种情况下，所用的酶的量为每0.01mmol D，L-苯甲酸基酯800U提纯的皱摺假丝酵母脂肪酶。采用气相色谱测定薄荷醇的对映体过量，并计算苯甲酸基酯的对映体过量。表4
采用rec.CRL进行D，L-苯甲酸基酯水解
反应时间〔h〕     对映体过量 转化率 对映选择性
[％ees] [％eep]     [％]
在30℃下反应
    2     19     ＞99     16     ＞100
    4     30     ＞99     23     ＞100
    6     37     ＞99     27     ＞100
    8     42     ＞99     30     ＞100
在40℃下反应
    2     22     ＞99     18     ＞100
    4     35     ＞99     26     ＞100
    6     45     ＞99     31     ＞100
    8     84     ＞99     46     ＞100
在50℃下反应
    2     63     ＞99     39     ＞100
    4     99     ＞99     50     ＞100
在60℃下反应
    2     69     ＞99     41     ＞100
    4     99     ＞99     50     ＞100
表4说明D，L-苯甲酸基酯水解的最佳温度为50℃。在60℃下进行反应的情况下，未发现反应性有进一步增加。在两个温度下，在所用条件下-经过4小时之后，发现转化率为50％，所以完成了所需要的苯甲酸基酯对映体的转化。
实施例5
重组体皱摺假丝酵母脂肪酶和市售脂肪酶之比较
迄今为止，在Stuttgart大学工业生物化学学院，采用经重组体技术制造并提纯过的皱摺假丝酵母脂肪酶(Brocca 1998)进行了D，L-苯甲酸基酯水解试验。
另外，深入研究了下述市售脂肪酶对于外消旋苯甲酸基酯的立体选择性：自皱摺假丝酵母(Amano AY)、Burkholderia cepacia(旧称葱头假单胞菌；Roche Diagnostics，Penzberg；ChirazymeL-1)、Rhyzomucor miehei(Roche Diagnostics，Penzberg；ChirazymeL-9)和Rhizopus oryzae(Amano F)的市售脂肪酶。表5示出采用自Rhizomucor miehei的脂肪酶在40℃和反应时间16小时时使D，L-苯甲酸基酯进行反应的结果。产物的对映体过量仅2％，意味着对映选择性很低。表5
采用RML进行D，L-苯甲酸基酯水解
    对映体过量 转化率[％] 对映选择性
[％ees] [％eep]
Rhizomucor miehei脂肪酶 未检测     2     2     2
自Burkholderia cepacia和米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶在反应时间达16小时之后仍未产生转化。
表6说明采用Amano Pharmaceutical Co.，Ltd.(Nagoya Japan)的市售皱摺假丝酵母脂肪酶进行的D，L-苯甲酸基酯的水解。反应在40℃和50℃下进行。表6
采用市售CRL(Amano AY)进行D，L-苯甲酸基酯水解
反应时间〔h〕 对映体过量 转化率 对映选择性
    [％eep]     [％]
在40℃下反应
    2     70     20     7
    4     69     65
    6     69     78
    8     68     91
在50℃下反应
    2     69     47     10
    4     59     50     7
表6说明，虽然市售皱摺假丝酵母脂肪酶有高活性，但是也具有对苯甲酸基酯很低的对映选择性。
实施例6
采用皱摺假丝酵母重组脂肪酶进行D，L-苯甲酸基酯水解-分批制备
反应方程式
Figure A0210180100141
步骤：
将2.1g(8mmol)D，L-苯甲酸基酯悬浮在500ml圆底烧瓶中的250ml磷酸钠缓冲液(pH7.0，100mM)中，加入5g提纯重组体皱摺假丝酵母脂肪酶。
反应在40℃下进行20小时，同时进行剧烈搅拌。反应过程之后是薄层色谱法。然后，反应混合物用甲苯萃取(250ml，2×100ml)，合并的有机相经Na2SO4干燥，以旋转蒸发器进行浓缩。
采用柱色谱法(硅胶)提纯其余的浅黄色反应混合物。应用比例为10∶1的石油醚/醋酸乙酯作流动相。产量：
得到了产量为255mg(1.6mMol，20.0％)(-)-薄荷醇和421mg(1.6mmol，20.0％)苯甲酸基酯。表征：
旋光角的测定：
薄荷醇
〔α〕20 D＝-51.3(c＝1.00，CH2Cl2)    〔α〕20 D＝-50±1
苯甲酸基酯
〔α〕20 D＝+86.3(c＝1.00，CH2Cl2)    〔α〕20 D＝+84.5
                                       (c＝1.00，CH2Cl2)
NMR波谱：
薄荷醇：1H-NMR(CDCl3，500.1MHz)δ相对TMS ：0.81(d；J＝6.9；3H)；0.92(2d；6H)；0.97(d，1H)；1.10(d；J＝10.2；1H)；1.40-1.47(m；2H)；1.59-1.67(m；2H)；1.96(d，1H)；2.17(m；1H)；3.42(dt；J＝10.4，4.1；1H).13C-NMR(CDCl3，125.8MHz)δ相对TMS：16.10；21.03；22.23；23.15；25.83；31.66；34.56；45.06；50.15；71.54.苯甲酸基酯：1H-NMR(CDCl3，500.1MHz)δ相对TMS：0.80(d；J＝7.0；3H)；0.92(2d；J＝5.2，4.7；6H)；1.08-1.19(m；2H)；1.53-1.58(m；2H)；1.70-1.75(m；2H)；1.93-2.00(m；1H)；2.11-2.15(m；1H)；4.94(dt；J＝10.9，4.4；1H)；7.41-7.56(m；3H)；8.04(t；2H).13C-NMR(CDCl3，125.8MHz)δ相对TMS：16.52；20.78；22.05；23.64；26.50；31.45；34.34；40.98；47.29；74.82；128.29；129.56；130.88；132.68；166.09.气相色谱：薄荷醇：≥99.9％ee
实施例7
D，L-醋酸基酯的水解
表7总结了D，L-醋酸基酯的水解结果。反应在含有0.2％(m/v)***树胶加溶剂的磷酸钠缓冲液(pH7.2，100mM)中进行。为确定最佳温度，选择反应温度40℃、50℃和60℃。在每种情况下，所用的酶量为每0.01mmol D，L-醋酸基酯800U提纯皱摺假丝酵母脂肪酶。对映体过量通过气相色谱进行测定。表7
采用rec.CRL(ITB)进行D，L-醋酸基酯的水解
反应时间〔h〕 对映体过量 转化率 对映选择性
[％ees] [％eep]     [％]
在40℃下反应
    2     54     ＞99     35     ＞100
    4     78     ＞99     44     ＞100
    6     89     ＞99     47     ＞100
    8     93     ＞99     48     ＞100
在50℃下反应
    2     74     ＞99     43     ＞100
    4     93     ＞99     48     ＞100
    6     98     ＞99     49     ＞100
    8     98     ＞99     50     ＞100
在60℃下反应
    2     84     ＞99     46     ＞100
    4     92     ＞99     48     ＞100
    6     96     ＞99     49     ＞100
    8     96     ＞99     49     ＞100
表7说明自皱摺假丝酵母的重组脂肪酶对于在所选择的反应条件下进行D，L-醋酸基酯水解显示出高的对映选择性。
为了进行比较，采用Amano Pharmaceutical Co.，Ltd.(NagoyaJapan)市售的皱摺假丝酵母(Amano AY)进行D，L-醋酸基酯水解(表8)。该表清楚说明，相对D，L-醋酸基酯而言，这些市售制剂与皱摺假丝酵母重组脂肪酶相比，具有显著低的对映选择性。表8
采用市售CRL(Amano AY)进行D，L-醋酸基酯水解
反应时间〔h〕     对映体过量    转化率 对映选择性
[％ees] [％eep]     [％]
在40℃下反应
    6     84     48     53     7
    14     76     33     67     4
实施例8
D，L-异戊酸基酯的水解
表9总结了进行D，L-异戊酸基酯水解的结果。反应在含有0.2％(m/v)***树脂加溶剂的磷酸钠缓冲液(pH7.2，100mM)中进行。为确定最佳温度，选择反应温度为40℃、50℃和60℃。在每种情况下，所使用的酶的量为每0.01mmol D，L-异戊酸基酯800U提纯皱摺假丝酵母脂肪酶。采用气相色谱测定对映体过量。表9
采用rec.CRL(ITB)进行D，L-异戊酸基酯水解
反应时间〔h〕       对映体过量 转化率 对映选择性
[％ees] [％eep]     [％]
在40℃下反应
    2     5     ＞99     5     ＞100
    4     12     ＞99     11     ＞100
    6     22     ＞99     18     ＞100
    8     31     ＞99     24     ＞100
在50℃下反应
    2     9     ＞99     8     ＞100
    4     20     ＞99     17     ＞100
    6     40     ＞99     29     ＞100
    8     63     ＞99     39     ＞100
在60℃下反应
    2     10     ＞99     9     ＞100
    4     20     ＞99     17     ＞100
    6     30     ＞99     23     ＞100
    8     31     ＞99     24     ＞100
表9说明，在采用皱摺假丝酵母重组脂肪酶进行的D，L-异戊酸基酯水解中，得到的产物对映体过量为＞99％ee。反应的最佳温度为50℃。在60℃下，在6小时之后，发现酶的活性损失，其原因在于反应停滞，这是由于酶在高温下变性之故。
实施例9
D，L-邻氨基苯甲酸基酯的水解
在所选择的标准条件下(磷酸钠缓冲液pH7.2，100mM，30℃、40℃、50℃和60℃，反应时间24小时)，D，L-邻氨基苯甲酸基酯的水解反应未显示出转化。
实施例10
自皱摺假丝酵母的游离脂肪酶的固定化
确定适宜的载体材料
为了固定化自皱摺假丝酵母的提纯天然脂肪酶，试验了各种载体材料。在Celite545(Fluka)、EP100(聚丙烯粉末200-400μm，Akzo Nobel)、Hyflo Super Cell(Fluka)、SiO2(Fluka)和Al2O3(Fluka)上的固定化以脂肪酶的疏水吸附为基础，而键合到DEAE-Sepharose(Pharmacia Biotech)上是由于离子相互作用。取决于载体材料，应用每克载体2000-3000单位提纯的脂肪酶。
在进行固定化之后，过滤样品，以pH计(pH7.2，30℃)测定在滤液和固定化物(immobilizate)中相对甘油三丁酸酯的活性。表10示出在各种载体材料上的固定效率。表10
在滤液和固定化物中固定化之后的活性
    载体材料     滤液中的活性〔％〕   固定化物中的活性〔％〕
    Celite     91     4
    EP100     16     43
    Hyflo     64     8
    SiO2     48     20
    Al2O3     -     -
    DEAE     69     7
因为采用载体材料EP100和SiO2得到活性、固定化皱摺假丝酵母脂肪酶的最高收率，所以这些固定化物应用在D，L-苯甲酸基酯的水解中。
实施例11
采用固定在EP100和SiO2上的重组体皱摺假丝酵母脂肪酶的D，L-苯甲酸基酯的水解
在每种情况下，反应均在使用0.2％(m/v)***树胶作加溶剂的15ml磷酸钠缓冲液(pH7.2，100mM)中在50℃下进行。所使用的固定化物的量在每种情况下均为每0.1mmol D，L-苯甲酸基酯1200单位。反应时间8小时。采用气相色谱测定对映体过量。表11
采用固定化的rec.CRL进行D，L-苯甲酸基酯的水解
  载体材料   对映体过量[％eep]     转化率〔％〕   对映选择性
    EP100     ＞99     43     ＞100
    SiO2     ＞99     45     ＞100
表11说明，自皱摺假丝酵母的固定化脂肪酶对于D，L-苯甲酸基酯的水解显示出很高的对映选择性(E＞100)。其结果相当于采用自皱摺假丝酵母的游离脂肪酶得到的结果。
虽然在上文中为了说明的目的详述了本发明，能够理解该详述仅仅为此目的，并且本领域技术人员在不偏离本发明精神和范围的条件下能够对本发明作出变更方案，除非受权利要求书所限制。

Claims (9)

1.一种制备D-或L-薄荷醇或其衍生物的方法，包括通过脂肪酶以对映选择的方式酶催解离D，L-基衍生物的步骤。
2.按照权利要求1的方法，其中所述D，L-基衍生物具有式式中：
R代表氢、未支化或支化的C1-C20-烷基、C3-C8-环烷基、C6-C14-芳基、C7-C15-芳基烷基、C1-C20-烷氧基、C1-C20-烷基氨基，其中上述烃基能够任选由羟基、甲酰基、氧基、C1-C6-烷氧基、羧基、巯基、磺基、氨基、C1-C6-烷基氨基或硝基或卤素单取代或多取代。
3.按照权利要求2的方法，其中D，L-基衍生物是脂族或芳族D，L-基酯。
4.按照权利要求3的方法，其中D，L-基衍生物是D，L-苯甲酸基酯。
5.按照权利要求1的方法，其中所述脂肪酶是皱摺假丝酵母。
6.按照权利要求1的方法，其中所述脂肪酶是重组脂肪酶。
7.按照权利要求6的方法，其中所述脂肪酶是皱摺假丝酵母的重组脂肪酶1。
8.按照权利要求1的方法，其中反应在约pH7的含水介质中在10-70℃的温度下进行。
9.按照权利要求1的方法，其中所述脂肪酶是固定化脂肪酶。
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