CN1353306A - 在环境扫描电镜中直接观察含水生物样品的装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种在环境扫描电镜中直接观察含水生物样品装置及其方法,该装置包括在电镜的样品室门盖内安装的三维样品移动部件、门盖外安装的预抽室和进样部件、及样品冷却部件。使用该装置观察含水生物样品能在不打开样品室门盖情况下,将样品经由预抽室,迅速地放入样品台;并能在X、Y、Z三方向进行调节,使样品迅速地进入电镜的可观察位置,并在1分钟左右内获得未失水的生物样品的自然状态图象。

Description

在环境扫描电镜中直接观察含水生物样品的装置及方法

本发明涉及一种环境扫描电子显微镜用的生物样品台装置，特别是涉及一种用于直接观察含水生物样品的环境扫描电子显微镜的生物样品台的装置及方法。

扫描电子显微镜(以下简称扫描电镜或电镜)是现代化的大型精密仪器，作为研究微观世界的有力工具，它在物理、化学、材料科学和生命科学等领域有着广泛的应用。环境扫描电子显微镜(Enviromental Scanning Electron Microscope-ESEM，以下简称环境扫描电镜)是一种新型的扫描电镜，它优于常规扫描电镜(Scanning Electron Microscope-SEM)之处在于：可在通气环境下直接观察不经表面处理(喷金或冷冻制样等)的非导体及含水样品。

如果用常规的扫描电镜(样品室真空度10^-2～10^-3托，1托＝1mmHg＝1/760大气压)对非导体样品进行观察，由于入射电子的作用，电子会在非导体样品表面上不断聚集，引起充放电现象，不能清楚地观察表面图像。所以，观察前必须对非导体的表面进行金属化处理(喷金等)。目前，在常规的扫描电镜中观察含水的生物样品有两种方法：(1)样品经干燥并喷金后放入扫描电镜观察，例如：文献[1](“扫描电子显微镜分析技术”杜子礼、徐子昂，化学工业出版社，1984)中所描述的：为了使含水的生物样品能在高真空下喷金，并在高真空样品室内观察，必须先用戊二醛和锇酸固定细胞的骨架，再用乙醇梯度脱水和二氧化碳临界点干燥后才能喷金。这样的制备方法不但费时(一般制备一个样品需要2-3天)、费钱，而且会使样品失去原来的自然面貌(我们将在本说明书的最后部分用对比照片给出其区别)。(2)样品深度冷冻后使用冷冻样品台放入扫描电镜观察。为常规扫描电镜配置的商品冷冻样品台装置使用液氮作冷源，使样品温度下降至-150℃左右。由于样品必须深度冷冻制备，生物样品中的液体部分冷冻成固体，样品将会失去原来的状态。而且此样品台装置结构复杂，为了使深冷的样品在进样时不至于结霜，在电镜样品室另开了一个进样窗口，又增加了一套冷冻进样装置，因此价格昂贵，操作复杂。

采用环境扫描电镜进行观察时，情况发生根本的变化。样品室真空度为0.1～20托，通入的环境气体在入射电子和信号电子的碰撞下产生大量的电子和正离子，这些正离子会与样品表面积累的电子迅速作用，消除了充放电现象，使不导电的样品(包括生物样品)不经表面金属化处理而直接观察成为可能。

在环境扫描电镜中，样品室的真空度虽然是可以调节的。然而，样品室的真空度较大地影响着电镜的分辨率，真空度越低，分辨率越低，图象越模糊。在环境扫描电镜使用中，样品室的真空度一般都不能太低(不超过5托)。从水的物性数据中我们可以知道：0℃时水的饱和蒸汽压为4.6托；室温20℃时水的饱和蒸汽压为17.5托。因此，在室温和不低于水的饱和蒸汽压(17.5托)下观察含水的生物样品时，水仍然处于气态，含水的生物样品仍然存在着失水问题。

当在环境扫描电镜中使用普通样品台进样时，必须打开样品室大门，放好样品，关闭样品室，再打开电镜的真空***，当样品室达到一定的高真空度后，才能通入气体，使样品室达到预定的低真空，最后打开电子枪，观察样品，这个过程大约需要十多分钟，含水的生物样品在这样的过程中必然会很快地失水。

我们所采取的解决失水问题的方法是：适当降低温度，降低真空度并缩短样品在低真空的样品室里的观察时间，以减少含水的生物样品的失水量。

本发明的目的在于：解决现有的环境扫描电镜在样品室的一般低真空度中进样速度慢和室温观察所导致的含水样品失水的问题；提供一种价格便宜、结构简单，机械部件配合紧凑，操作方便、灵活且精确的专用于直接观察含水生物样品的环境扫描电镜的生物样品台装置；以及使用该装置在短时间内拍摄出未被失水的生物样品的自然状态图象的方法。

本发明的目的是这样实现的：在扫描电镜样品室的大门上，不但带有能在XYZ三个方向迅速地移动样品的部件(就如常规的电镜样品台上的部件一样)；而且还装有带有进样部件的预抽室；同时还有冷却功能。从而可以在不打开电镜样品室大门的情况下，通过预抽室使样品迅速地进入电镜室内(可以同时被冷却或进入电镜室后被冷却)，也就是使生物样品不经过高真空阶段，直接进入低真空的环境状态，从而避免了样品在高真空中的快速失水，达到缩短时间并降低温度的要求，最后实现在短时间内拍摄出未被失水的生物样品的自然状态图象的目的。

本发明提供的一种用于直接观察含水生物样品的环境扫描电镜的生物样品台装置，包括：(1)预抽室：预抽室位于样品室的门盖上方，预抽室外口上有一密封盖；预抽室内侧与样品室通过一个小窗口连通，窗口上(样品室门盖外侧)装有一个闸阀，闸阀是隔开样品室与预抽室的闸板阀门；预抽室顶部有一真空通道，与样品室相通，通道上装有一个电动阀，控制真空通道的开通与关闭，当电动阀打开时，预抽室内的气压就能与样品室的相同，以保证在短时间(几秒钟)内预抽完毕；预抽室侧面装有一个放气阀，当预抽室气压为真空时，打开放气阀，可使电镜外部的空气流入预抽室，当预抽室内气压与周围的大气压相同时，密封的预抽室门盖就能打开。(2)进样部件：进样部件主要包括一根送样杆，它位于预抽室密封盖中心的密封圈内，它可以自由地抽送而不漏气；送样杆头部带有螺纹；被观察的样品可以用多种方法固定在不同形状的样品杯的顶盖上，样品杯底部有一根小杆，小杆被***样品杯座顶部的小孔中，并用小螺钉固定；样品杯座侧面开有螺纹孔，它可以把送样杆头部带有的螺纹拧入。当预抽室预抽完毕，闸阀打开时，带有样品和样品杯的样品杯底座可以穿过预抽室的小窗口，被送样杆送入位于样品台上的样品杯座定位槽中。这样，在不打开电镜样品室大门的情况下，通过进样部件，样品被迅速地送入了电镜的样品室内。(3)冷却部件：它可以有多种形式，例如带冰块的冷却样品杯、半导体冷却部件等，它能使样品冷却至0-4℃。(4)样品移动部件：在样品室门盖上有三个旋把，每个旋把分别通过一组齿轮和螺杆驱动着一个朝单一方向(X方向、或Y方向、或Z方向)移动的滑块，滑块又带动样品台主体移动，样品坐落在样品台主体中央的样品杯座定位槽中，从而三个旋把能在X、Y、Z三个方向迅速地移动样品，以使样品能迅速地进入可观察的位置。

本发明提供的在环境扫描电镜中使用的样品台装置进行含水生物样品的直接观察方法，包括样品送入与观察等以下步骤：

1.先将样品室门盖关闭，再打开电镜真空***，当样品室达到一定的高真空度后，通入气体，使样品室达到预定的低真空度；

2.把预抽室门盖盖在预抽室上，打开预抽室真空通道上的电动阀，预抽室就与低真空的样品室连通，几秒钟后预抽室达到样品室的低真空度；

3.打开闸阀和样品室内的小灯，把带有样品、样品杯和样品杯座的送样杆穿过样品室门盖的窗口，将样品杯座送入样品台的样品杯座定位槽中，拧开送样杆；

4.抽出送样杆，关闭闸阀，同时小灯熄灭；

5.打开电镜的所有观察样品的电子枪、扫描线圈、消象散器等部件，准备观察样品；

6.调节X、Y、Z三个方向的旋把，使样品能迅速地进入可观察位置，拍摄下未被失水的生物样品的自然状态图象；

7.当要取出样品时，可进行以上程序的逆操作：打开闸阀，伸入送样杆，把送样杆顶部的螺纹拧入样品杯座，抽出带样品杯座和样品杯的送样杆，关闭闸阀，打开预抽室放气阀，当预抽室的气压与周围的大气压相同时，就可以打开预抽室密封盖，取出样品。

本发明的生物样品台利用预抽室连接环境扫描电镜的低真空样品室，再加上简单的冷却样品杯及精密的机械结构，同时满足了真空度、温度和观察时间的要求，达到了直接观察含水样品的目的。对于含水的样品来说，在足够的气压下，水的蒸发速度降低，潮湿样品不会很快地失去水分和变形，能够不经冷冻制样而直接观察其原来的自然形貌。本生物样品台由于结构简单，价格只是一般冷冻样品台的一半。

本生物样品台装置送样时间小于20秒，定位时间小于1分钟；冷却样品杯可放入冰块，样品最低温度为4～10℃。本生物样品台可用于环境扫描电镜中固定和冷却样品，以供在通气状态下直接观察含水样品(动植物细胞、植物茎根切片、湿的NaCl晶体等)的形貌和结构，也可供观察和研究含水样品的脱水(动物、植物等)或干燥(湿水泥等)过程。

本发明的优点在于：扫描电镜的生物样品台装置结构简单，机械部件配合紧凑，操作方便、灵活且精确；特别是添加了与环境样品室相通的预抽室后，能在短时间(1分钟左右)内拍摄出未被失水的生物样品的自然状态图象。

下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。

图1为本发明的扫描电镜的生物样品台装置结构示意图。

图2是在常规的扫描电镜中所观察到的经过样品制备(干燥与喷金)的非洲绿猴的肾细胞(Vero细胞)形貌。

图3是使用本发明的生物样品台装置在环境扫描电镜中所观察到的Vero细胞的形貌。

图1的图面说明如下：

预抽室-[1]           样品台主体-[2]     样品杯-[3]

样品杯座-[4]         预抽室门盖-[5]     送样杆-[6]

闸阀-[7]             真空通道-[8]       预抽室电动阀-[9](图中未示出)

预抽室放气阀-[10]    样品台座-[11]      样品室门盖-[12]

XYZ方向旋把-[13]、[14]、[15]            X、Y、Z方向滑块-[16]、[17]、[18]

样品杯座定位槽-[19]                     窗口-[20]

实施例1

按图1的结构制作一扫描电镜用的生物样品台装置，以下详细叙述以使用冷却样品杯为例的扫描电镜的生物样品台装置的结构：

预抽室1位于通常的扫描电镜的样品室门盖12的外侧上方，预抽室密封盖5带有送样杆6，送样杆可以在密封盖中心前后抽送并且密封(即在预抽室处于真空状态时，当送样杆前后抽送时都不漏气)；送样杆顶部有螺纹，可以把样品杯座4拧在上面。闸阀7是隔开样品室与预抽室的闸板阀门，关闭时位于样品室门盖12的窗口20上。预抽室的真空通道8与样品室相连，通道上装有控制开通和关闭的电动阀9。冷却样品杯3用铜或铝制成，圆筒型带有杯盖，内可放冰块；杯底有一根小杆，将其***样品杯座4的小孔，用螺钉固定。被测样品可用双面胶带固定在冷却样品杯杯盖上，同时得到冷却。样品台主体2装在样品室门盖12上，样品台主体带有样品台座11，当把样品台座11的底部***样品室内的道轨后，就能把整个样品台推入样品室，并关上样品室门盖12。在样品室门盖上除有预抽室1外，还有三个旋把：X方向旋把13、Y方向旋把14、Z方向旋把15，它们通过齿轮和螺杆移动三个滑块-X方向滑块16、Y方向滑块17、Z方向滑块18。滑块又带动样品台主体2移动，样品坐落在样品台主体2中央的样品杯座定位槽19中，从而样品能被用以上三组部件在X、Y、Z三个方向进行调节，迅速地进入电镜的可观察位置。

实施例2

在实施例1所制做的装冷却样品杯的生物样品台装置中，进行含水的Vero细胞观察和拍摄的具体方法和步骤如下：

1.先将样品室门盖12关闭，再打开电镜真空***，当样品室达到一定的高真空度后，通入气体，使样品室达到预定的低真空度；

2.把预抽室密封盖5盖在预抽室1上，打开预抽室真空通道8上的电动阀9，预抽室就与低真空的样品室连通，几秒钟后预抽室达到样品室的低真空度；

3.打开闸阀7，此时，样品室内的小灯被打开，通过预抽室门盖12的玻璃窗口，我们可以清楚地看到样品室内部情况。把带有样品、样品杯3和样品杯座4的送样杆6穿过样品室门盖12的窗口20，并可立即将样品杯座4送入电镜样品室内的样品台主体2上的样品杯座定位槽19中，拧开送样杆6，这样，把带有样品的样品杯3和样品杯座4留在了样品室内的样品杯座定位槽19中；

4.抽出送样杆6，关闭闸阀7，同时小灯熄灭。这样，在不打开样品室门盖12情况下，样品经由预抽室1，迅速地放入了样品台的样品杯座定位槽19中；

5.打开电镜的所有观察样品的各个部件(电子枪、扫描线圈、消象散器等)，准备观察样品；

6.调节X、Y、Z三个方向的旋把13、14、15，使样品能迅速地进入可考察位置，拍摄下未被失水的生物样品的自然状态图象；

7.当要取出样品时，可进行以上程序的逆操作：打开闸阀7，伸入送样杆6，把送样杆顶部的螺纹拧入样品杯座4，抽出带样品杯座4和样品杯3的送样杆6，关闭闸阀7，打开预抽室放气阀10，当预抽室的气压与周围的大气压相同时，就可以打开预抽室门盖5，取出样品。

图2是经过常规的生物样品制备(两次固定、脱水、干燥和喷金)后的Vero细胞的形貌图象。图3是未经样品制备的Vero细胞的图象，它是使用本发明的生物样品台装置和方法，在环境扫描电镜中所观察到的Vero细胞的形貌。此时，样品不需要制备：带细胞的微载体可以从培养液中取出后，用滤纸吸干，就直接固定在本生物样品台的样品杯上，并可立即送入电镜观察。比较图3与图2，我们可以从图3中清楚地看到未失水细胞的自然形貌，它们的细胞皮互相连接，在微载体上贴附生长。经过预处理的Vero细胞(图2)失去了生物水，每个细胞如小球，它们堆积在微载体上，形成一个个小球的集合体，它们的形貌与未失水细胞的自然形貌(图3)有很大的不同。所以，在生命科学的研究中环境扫描电镜及其生物样品台装置是研究含水生物样品微观世界的必要工具。

Claims (5)

1.一种在环境扫描电镜中直接观察含水生物样品的装置，包括：样品杯、样品移动部件，它在样品室门盖上有三个旋把[13][14][15]，每个旋把分别通过一组齿轮和螺杆驱动一个向X、Y、Z三方向中的单一方向移动的滑块[16][17][18]，且滑块与样品台主体[2]组合在一起；其特征在于：还包括一预抽室[1]、进样部件和冷却部件，其中所述的预抽室[1]位于样品室的门盖[12]上，预抽室[1]外口上有一密封盖[5]；预抽室[1]内侧与样品室通过一个小窗口[20]连通，窗口[20]内壁装有一个用来隔开样品室与预抽室[1]的闸阀[7]；预抽室[1]顶部有一真空通道[8]，与样品室相通，真空通道[8]上装有一个控制真空通道[8]的开通与关闭的电动阀[9]，预抽室[1]侧面装有一个放气阀[10]；所述的进样部件包括一根送样杆[6]，送样杆[6]头部带有用于固定样品杯座[11]的螺纹，送样杆[6]***在预抽室[1]的密封盖[5]中心的密封圈内；样品杯[3]的底部有一根小杆，小杆被***样品杯座[11]顶部的小孔中，并用小螺钉固定；所述的冷却部件包括冷却样品杯或固定在样品台主体[2]中心上的半导体冷却部件。

2.按权利要求1所述的一种在环境扫描电镜中直接观察含水生物样品的装置，其特征在于：所述的样品台主体[2]还包括样品杯座定位槽[19]，它位于样品台主体[2]的中心。

3.按权利要求1所述的一种在环境扫描电镜中直接观察含水生物样品的装置，其特征在于：所述的送样杆[6]可以穿过样品室门盖[12]上的小窗口[20]，当闸阀[7]打开时，在预抽室[1]和样品室之间自由地抽送，能在不打开样品室门盖[12]情况下，将样品经由预抽室迅速地放入样品台中心的样品杯定位槽[19]内。

4.按权利要求1所述的一种在环境扫描电镜中直接观察含水生物样品的装置，其特征在于：所述的冷却样品杯[3]，其内放置冰块，样品杯[3]口上盖有杯盖。

5.一种应用权利要求1所述的在环境扫描电镜中直接观察含水生物样品的装置的直接观察方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)先使样品室达到预定的低真空度；

(2)把预抽室密封盖[5]盖在预抽室[1]上，打开预抽室真空通道[8]上的电动阀[9]，预抽室与低真空的样品室连通，几秒钟后预抽室达到样品室的低真空度；

(3)打开闸阀[7]和样品室内的小灯，把带有样品、样品杯[3]和样品杯座[4]的送样杆[6]穿过样品室门盖[12]的窗口，将样品杯座[4]送入样品台的样品杯座定位槽[19]中，拧开送样杆；抽出送样杆，关闭闸阀，同时小灯熄灭；

(4)打开电镜的所有观察样品的电子枪、扫描线圈、消象散器等部件，准备观察样品；

(5)调节X、Y、Z三个方向的旋把，使样品能迅速地进入可观察位置，拍摄下未被失水的生物样品的自然状态图象。

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