CN1351661A - 新化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了CASB619多肽和多核苷酸以及通过重组技术生产这种多肽的方法。本发明还公开了在诊断中应用CASB619多肽和多核苷酸的方法,预防和治疗癌症,特别是卵巢癌和结肠癌,自身免疫病和相关病症的疫苗。

Description

新化合物
                   发明领域
本发明涉及多核苷酸，这里指“CASB619多核苷酸，它们编码的多肽(这里称为“CASB619多肽”)、重组物质以及它们的制备方法。在另一个方面，本发明涉及使用这种多肽和多核苷酸包括治疗癌症特别是结肠癌和自身免疫病及其它相关病症的方法。再一方面，本发明涉及使用本发明提供的材料鉴定激动剂和拮抗剂/抑制剂的方法，以及用鉴定的化合物治疗与CASB619多肽失衡有关的病症的方法。再一方面，本发明涉及检测与CASB619多肽活性或水平异常有关的病症的诊断试验。
据信，本发明的多肽和多核苷酸是抗肿瘤的特异性预防或治疗免疫的重要病原体，因为，相对于正常细胞，它们在肿瘤中特异性表达或高度过表达，因此，可以通过抗原特异性免疫机制被寻靶，导致肿瘤细胞的破坏。它们也可以用来诊断肿瘤细胞的出现。此外，它们在某些情况下的异常表达会引起自身免疫的诱导、异常免疫应答，这可以通过使用相同的多肽或多核苷酸进行免疫接种矫正。在这方面，最重要的生物活性是本发明多肽的抗原和免疫原活性。本发明的多肽也可以具有CASB619多肽的至少一种其它生物活性，这使之可以作为不同于免疫应答的治疗或预防干预的靶。
在本发明一方面涉及CASB619多肽。这种多肽包括含有以下氨基酸序列的分离多肽：与SEQ ID NO：2全长序列至少有70％的同一性，优选至少80％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少97-99％的同一性的氨基酸序列。这种多肽包括含有SEQ ID NO：2的氨基酸的多肽。
本发明的多肽还包括其氨基酸序列与SEQ ID NO：2全长序列至少有70％的同一性，优选至少80％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少97-99％的同一性的分离多肽。这种多肽包括SEQ ID NO：2的多肽。
本发明的多肽还包括由包括SEQ ID NO：1所含的序列的多核苷酸编码的分离多肽。
本发明还提供CASB619多肽的一种免疫原性片段，即CASB619多肽的一个连续的部分，它与含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽具有相同或基本上相同的免疫原性活性。也就是说，该片段(必要时可与一种载体偶联)能够产生能识别CASB619多肽的免疫应答。这种免疫原性片段可包括诸如缺少N-末端前导序列、跨膜区域或C-末端锚定区域的CASB619多肽。在一个优选的方面，根据本发明的CASB619的免疫原性片段基本上包括一种多肽的所有胞外结构域，其中该多肽与SEQ ID NO：2在SEQ ID NO：2的整个长度上至少有70％的同一性，优选至少80％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少97-99％的同一性。
包括CASB619表位的肽片段一般包括SEQ ID NO：2的至少7个，优选9或10个连续氨基酸。优选的表位示于SEQ ID NO：5到SEQID NO：68。
包括这些表位的肽是本发明的一个优选方面。与这些表位具有相同特性的模拟表位(mimotope)和含有产生与CASB619分子中的表位交叉反应的免疫应答的这些模拟表位的免疫原也是本发明的部分。
因此，本发明包括含有这些表位本身和其模拟表位的分离肽。模拟表位是指与天然CASB619表位足够相似从而能够被识别天然分子的抗体识别的实体；(Gheysen，H.M.等，1986，“作为抗原的合成肽”，Wiley，Chichester，Ciba基金研讨会119，p130-149；Gheysen，H.M.，1986，Molecular Immunology，23，7，709-715)，或者是在与合适载体偶联时能够产生与天然分子交叉反应的抗体的实体。
上述表位的肽模拟表位可通过添加、缺失或取代所选择的氨基酸用于特别的目的。因此，本发明的肽可被修饰以易于与一种蛋白载体连接。例如，对于某些化学结合方法，表位中需要包括一个末端半胱氨酸。此外，对于肽与一种蛋白载体结合，需要包括一个远离肽结合末端的疏水末端，使肽的未结合的游离末端保持与载体蛋白表面的结合。这降低了肽的构象自由度，使肽更有可能呈现与肽在整个天然分子结构中具有的构象非常相似的构象。例如，肽可被修改成具有一个N末端半胱氨酸和一个C末端疏水的酰胺化尾巴。另外，可以进行一种或多种氨基酸的D立体异构体的添加或取代，来制备一种有用的衍生物，用来例如增强肽的稳定性。本领域技术人员知道，这些修饰肽或模拟表位可以是全部或部分非肽的模拟表位，其中组成的残基不限于20种天然氨基酸。此外，可以使用本领域已知的技术使之环化，从而限制肽的构象，使之类似于肽序列在整个分子中时的形状。环化肽的优选方法包括加入一对半胱氨酸残基以形成二硫桥。
并且，本领域技术人员会意识到，本发明的模拟表位或免疫原可以大于上述表位，因而可以包括本文公开的序列。因此，本发明的模拟表位可以通过在一个或两个末端加入一定数目其它天然残基的N和/或C末端延伸来形成。肽模拟表位也可以是天然序列的反向序列，其序列方向相反；或者序列可以全部或至少部分由D-立体异构体氨基酸组成(反转序列，inverso sequence)。并且，肽序列也可以是反向反转序列，其中序列方向是相反的，氨基酸是D-立体异构体形式。这些反向或反向-反转肽的优势是其为非自身的，因此可以克服免疫***中的自身耐受问题。
此外，肽模拟表位可通过诸如噬菌体显示技术(EP 0 552 267 B1)使用能与本发明的多肽结合的抗体来鉴定。这种技术产生大量的模拟天然肽的结构的肽序列，这些肽序列因此能够结合抗天然肽的抗体，但不一定与天然多肽具有明显的序列同源性。这种方法的显著优势是可以鉴定具有较强免疫原特性的肽，或可以克服使用天然肽序列时可能出现的潜在自身抗原耐受问题。此外，该技术根据识别的模拟表位序列中的共有化学特性可以鉴定各个天然肽的识别特征。
肽与免疫原性载体的共价偶联可以按本领域众所周知的方式进行。因此，例如对于直接共价偶联，可以利用碳二亚胺、戊二醛或N-[γ-马来酰丁酰氧]琥珀酰亚胺酯，利用常用商用异源双功能接头，如CDAP和SPDP(按照厂商说明)。偶联反应后，免疫原可以通过透析法、凝胶过滤法和分级分离法等方便地除去并纯化。
用于本发明免疫原的载体是本领域技术人员熟知的。载体的功能是提供细胞因子辅助，以便帮助诱导抗肽的免疫应答。可用于本发明的载体的非限制性实例包括：匙孔血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、灭活细菌毒素如破伤风或白喉毒素(TT和DT)或其重组片段(如TT片段C的1区或DT的转运区)或结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)。或者，模拟表位或表位可以直接与脂质体载体辍合，它还可以包括能够提供T细胞辅助的免疫原。优选模拟表位对载体的比例为1∶1到20∶1，优选每个载体负载3-15个肽。
在本发明的一个实施方案中，优选的载体是流感嗜血杆菌的蛋白D(EP 0 594 610 B1)。蛋白D是流感嗜血杆菌的IgD结合蛋白，已由Forsgren申请专利(WO 91/18926，授权号EP 0 594 610 B1)。在某些情况下，例如重组免疫原表达***中，可能需要使用蛋白D的片段，例如蛋白D 1/3rd(包括蛋白D的N末端100到110个氨基酸(GB9717953.5))。
呈递本发明肽的另一种优选方法是在重组融合分子中。例如EP 0421 635 B介绍了使用嵌合嗜肝DNA病毒核心抗原颗粒以病毒样颗粒呈递外源多肽。这样，本发明的免疫原可以包括在由乙肝病毒核心抗原组成的嵌合颗粒中呈递的肽。此外，重组融合蛋白可以包括本发明的模拟表位和载体蛋白，如流感病毒NS1。对于组成本发明部分的任何重组表达蛋白，编码这些免疫原的核酸可以也可以是本发明的一方面。
本发明中所用的肽可以通过本领域众所周知的固相方法方便地合成。合适的合成可以利用T-boc或F-boc方法进行。环化肽可以在全自动仪器中利用众所周知的F-moc方法和聚酰胺树脂通过固相法合成。或者，本领域技术人员会知道人工进行该方法必需的实验室步骤。固相合成的技术和方法可参见“固相肽合成：实用方法”，E.Atherton和R.C.Sheppard，牛津大学出版社IRL出版(1989)。或者，肽可以通过重组方法制备，包括在细菌或哺乳动物细胞系中表达编码模拟表位的核酸分子，然后纯化表达的模拟表位。重组表达肽和蛋白的技术在本领域是已知技术，可参见Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook等《分子克隆实验室指南，第二版》Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)。
本发明的多肽或免疫原性片段可以是“成熟”蛋白形式，或者可以是一种较大蛋白如前体或融合蛋白的一部分。通常优选包括含有分泌或前导序列、前序列、能协助纯化的序列如多组氨酸残基，或能在重组制备过程中起稳定作用的额外序列。而且，还考虑到加入外源性多肽或脂类尾巴或多核苷酸序列以增加最终分子的免疫原性能力。
在一个方面，本发明涉及遗传工程制备的可溶性融合蛋白，这种融合蛋白含有本发明的一种多肽或其片段以及各亚类免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE)的重链或轻链的恒定区的各种部分。优选的是，免疫球蛋白是人IgG特别是IgG1的恒定区部分，而融合发生在铰链区。在一个特别的实施方案中，Fc部分可简单地通过引入一个切割序列而去除，这种切割序列可用血凝因子Xa切割。而且，本发明涉及通过遗传工程制备这些融合蛋白的方法，以及涉及它们在药物筛选、诊断和治疗中的应用。本发明的一个进一步的方面还涉及编码这种融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技术的例子可在国际专利申请Nos.WO94/29458和WO94/22914中发现。
蛋白质可通过化学方法接合，或以重组融合蛋白的形式表达，这种融合蛋白形式能以较非融合蛋白高的水平在一种表达***中制备。融合配体可帮助提供T辅助表位(免疫性融合配体)，优选的是能被人识别的T辅助表位；或者能帮助蛋白比原来的重组蛋白以较高产量进行表达的T辅助表位(表达增强子)。融合配体优选既是一种免疫性融合配体，又是表达增强子配体。
融合配体包括来自流感嗜血杆菌的蛋白D和来自流感病毒的非结构蛋白NS1(血凝素)。另一种融合配体是被称为LytA的蛋白。优选使用该分子的C末端部分。LytA来自肺炎链球菌，它合成一种N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶---LytA酰胺酶(由lytA基因编码{《基因》43(1986)265-272页})，后者是一种自溶素，它特异性地降解肽聚糖骨架中的某些键。LytA蛋白的C末端区域负责与胆碱或某些胆碱类似物如DEAE的亲和性。这种特性已被用于发展能用于融合蛋白表达的大肠杆菌C-LytA表达质粒。在其氨基端含有C-LytA片段的杂合蛋白的纯化已经有介绍{《生物技术》10卷(1992)795-798页}。可以使用LytA分子中在C末端发现的重复部分，从残基178开始，例如残基188-305。
本发明还包括前面提到的多肽的变体，即通过保守性氨基酸取代与参照物不同的多肽，其中一种残基被另一种具有相似特征的残基取代。典型的这种取代在如下氨基酸之间：Ala、Val、Leu和Ile；Ser和Thr；酸性残基Asp和Glu；Asn和Gln；碱性残基Lys和Arg；或芳族残基Phe和Tyr。特别优选的是其中几个、5-10、1-5、1-3、1-2或1个氨基酸以任何组合方式置换、缺失或增加的变体。
本发明的多肽可以任何合适的方式进行制备。这种多肽包括分离的天然产生的多肽、重组制备的多肽、合成制备的多肽、或用这些方法的组合制备的多肽。制备这种多肽的方法在本领域是熟知的。
另一方面，本发明涉及CASB619多核苷酸。这些多核苷酸包括含有编码以下多肽的核苷酸序列的分离多核苷酸：这些多肽与SEQ IDNO：2全长氨基酸序列有至少70％同一性，优选至少80％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性。具有至少97％的同一性的多肽是高度优选的，而具有至少98-99％同一性的多肽是更加高度优选的，具有至少99％同一性的多肽是最高度优选的。这些多核苷酸包括含有编码SEQ ID NO：2的多肽的SEQ ID NO：1所含的核苷酸序列的多核苷酸。
本发明多核苷酸还包括含有与编码SEQ ID NO：2多肽的核苷酸序列的全部编码区具有至少70％同一性，优选至少80％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性的核苷酸序列的分离多核苷酸。具有至少97％的同一性的多核苷酸是高度优选的，而具有至少98-99％同一性的多核苷酸是更加高度优选的，具有至少99％同一性的多核苷酸是最高度优选的。
本发明的多核苷酸还包括含有以下核苷酸序列的分离多核苷酸：所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1全长序列有至少70％同一性，优选至少80％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性。具有至少97％的同一性的多核苷酸是高度优选的，而具有至少98-99％同一性的多核苷酸是更加高度优选的，具有至少99％同一性的多核苷酸是最高度优选的。这些多核苷酸包括含有SEQ ID NO：1多核苷酸的多核苷酸以及SEQ ID NO：1的多核苷酸。这些多核苷酸可以***合适的质粒或重组微生物载体中，用来免疫(参见例如Wolffet al.，Science 247：1465-1468(1990)；Corr et al.，J.Exp.Med.184：1555-1560(1996)；Doe et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.93：8578-8583(1996))。本发明还提供与上述多核苷酸互补的多核苷酸。
本发明还提供CASB619多核苷酸片段，将其给予受试者时其具有与SEQ ID NO：1的多核苷酸相同的免疫原特性。
本发明也提供编码以上定义的CASB619多肽的免疫原性片段的多核苷酸。
SEQ ID NO：1的核苷酸序列与人染色体1克隆RP4-641D22图p13.1-13.3(入藏号AL157901)具有同源性。SEQ ID NO：1的核苷酸序列是cDNA序列，包括编码1013个氨基酸的SEQ ID NO：2的多肽的序列(核苷酸1到3043)。编码SEQ ID NO：2的多肽的核苷酸序列可以与SEQ ID NO：1所含的多肽编码序列相同，或者它可以是不同于SEQ ID NO：1所含序列的序列，由于遗传密码的冗余(简并)，它也编码SEQ ID NO：2的多肽。SEQ ID NO：2的多肽不与任何已知蛋白相关。
预期本发明优选的多肽和多核苷酸也与其同源多肽和多核苷酸具有类似生物功能/特性。并且，本发明的优选多肽、免疫片段和多核苷酸具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的至少一种活性。
本发明也涉及部分或其它不完整多核苷酸和多肽序列，它们在确定相应全长SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2序列前首先被鉴定。
因此，本发明一方面提供分离的多核苷酸，它：
(a)包括与SEQ ID NO：3的全长序列至少有70％的同一性，优选至少80％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少97-99％的同一性的核苷酸序列；
(b)具有与SEQ ID NO：3的全长序列至少有70％的同一性，优选至少80％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少97-99％的同一性的核苷酸序列；
(c)SEQ ID NO：3的多核苷酸；或
(d)编码与SEQ ID NO：4的全长氨基酸序列至少有70％的同一性，优选至少80％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少97-99％的同一性的多肽的核苷酸序列；以及SEQ ID NO：3的多核苷酸。
本发明还提供一种多肽，它：
(a)包括与SEQ ID NO：2的全长序列至少有70％的同一性，优选至少80％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少97-99％的同一性的氨基酸序列；
(b)具有与SEQ ID NO：2的全长氨基酸序列至少有70％的同一性，优选至少80％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少97-99％的同一性的氨基酸序列；
(c)包括SEQ ID NO：4的氨基酸；和
(d)是SEQ ID NO：4的多肽；
以及由包括SEQ ID NO：3所含序列的多核苷酸编码的多肽。
SEQ ID NO：3的核苷酸序列和其编码的肽序列来自EST(已表达序列标志)序列。本领域技术人员知道，在EST序列中不可避免有某些核苷酸序列阅读错误(见Adama，M.D.et al.，Nature 377(supp)3，1995)。因此，SEQ ID NO：3的核苷酸序列和由其编码的肽序列在序列准确度方面有同样的内在限制。此外，SEQ ID NO：3编码的肽序列包括与最同源或结构相似蛋白相同或密切同源和/或结构极类似(如保守氨基酸差异)的区域。
本发明的多核苷酸可以使用标准克隆和筛选技术由人结肠癌细胞mRNA衍生cDNA文库获得(例如见Sambrook等《分子克隆实验室指南，第二版》Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York(1989)。本发明的多核苷酸也可以获自基因组DNA文库等天然来源或可以使用熟知的商用技术合成。
当本发明的多核苷酸用于重组生产本发明的多肽时，多核苷酸可以包括成熟多肽的编码序列本身；或与其它编码序列位于同一读框内的成熟多肽编码序列，其它编码序列的例子为编码一种前导或分泌序列、前-、原-或前原-蛋白的序列或其它任何肽部分。例如，可以编码一种能促进融合多肽纯化的标记序列。在本发明这方面的优选实施方案中，标记序列是一种6组氨酸肽，由pQE载体提供(Qiagen，Inc.)，见Gentz等《美国科学院院刊》86：821-824，(1989)中的介绍；或是一种HA肽尾巴。该多核苷酸还可以含有非编码5′和3′序列，如转录、非翻译序列、剪接和聚腺苷化信号、核糖体结合位点和序列稳定mRNA的序列。
本发明进一步的实施方案包括编码多肽变体的多核苷酸，所述变体包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中有几个例如5到10、1到5、1到3、1到2或1个氨基酸残基以任何组合方式置换、缺失或增加。
与SEQ ID NO：1所含核苷酸序列相同或足够相同的多核苷酸可以用作cDNA和基因组DNA的杂交探针或作为核酸扩增(PCR)反应的引物，以分离编码本发明多肽的全长cDNA和基因组克隆，并分离与SEQ ID NO：1具有高序列相似性的其它基因(包括编码来源于人的共生同源物(paralogs)和来自非人物种的直向同源物(orthologs)和共生同源物的基因)的cDNA和基因组克隆。一般，这些核苷酸序列与参照物序列70％相同，优选80％相同，更优选90％相同，最优选95％相同。探针或引物一般包括至少15个核苷酸，优选至少30个核苷酸，可以有至少50个核苷酸。特别优选的探针有30到50个核苷酸。特别优选的引物有20到25个核苷酸。具体而言，来源于同源动物序列的多肽或多核苷酸可以用作免疫原，获得对人基因交叉反应性免疫应答。
编码本发明多肽的多核苷酸包括来源于非人物种的同源物可以通过包括以下步骤的方法获得：在严紧杂交条件下用具有SEQ ID NO：1的序列或其片段的标记探针筛选合适文库；分离含有所述多核苷酸序列全长cDNA和基因组克隆。这种杂交技术是本领域技术人员熟知的。优选的严紧杂交条件包括42℃在含有如下成分的溶液中温育过夜：50％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5x Denhardt’s溶液、10％葡聚糖硫酸酯和20微克/ml的变性剪切鲑精DNA，接着在0.1x SSC中在约65℃时洗涤滤膜。因此，本发明也包括用具有SEQ ID NO：1的序列或其片段的标记探针在严紧杂交条件下筛选合适的文库获得的多核苷酸。
本领域技术人员会意识到，在很多情况下，分离的cDNA序列是不完整的，其中缺少cDNA 5′末端的多肽编码区。
对本领域的技术人员来说，有几种方法是可以使用和熟知的，可以用来获得全长DNAs或延伸短的DNAs，例如以cDNA末端快速扩增(RACE)方法为基础的方法(见诸如Frohman等，《美国科学院院刊》85：8998-9002，1988)。这种技术的最近修改，例如MarathonTM技术(Clontech Laboratories Inc.)，明显简化了对较长cDNAs的寻找。在MarathonTM技术中，cDNAs用从一种选择的组织中抽提的mRNA制备，并在每个末端连上一种“接头”序列。然后使用基因特异的和接头特异的寡核苷酸组合进行核酸扩增(PCR)来扩增“丢失”的DNA的5’末端。然后使用“巢式”引物重复PCR反应，巢式引物即设计来与扩增产物的内部退火的引物(通常为与接头序列的3’退火的一种接头特异性引物和与所选择的基因序列的5’退火的一种基因特异性引物)。然后用DNA测序对该反应的产物进行分析，通过将产物直接与已有的DNA连接产生一个完整的序列，或者使用设计5’引物的新序列信息进行一个单独的全长PCR，来构建一个全长的DNA。
本发明的重组多肽可以通过本领域熟知的方法由包括表达***的遗传工程改造宿主细胞制备。因此，另一方面，本发明涉及包括本发明多核苷酸的表达***，涉及用该表达***遗传改造的宿主细胞，和通过重组技术生产本发明的多肽。无细胞翻译***也可用于生产这些蛋白，利用衍生自本发明的DNA构建体的RNA。
为进行本发明的多肽的重组制备，宿主细胞可通过遗传工程改造来整合本发明多核苷酸的表达***或其部分。将多核苷酸导入宿主细胞可通过多种标准实验室手册介绍的方法来完成，例如Davis等《分子生物学基本方法》(1986)和Sambrook等《分子克隆实验室指南，第二版》Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1989)。优选的这种方法包括例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转位(transvection)、显微注射、阳离子脂介导的转染、电穿孔、转导、划痕接种、轰击导入或感染。
优选本发明的蛋白与反式硫氧还蛋白(TIT)共表达。与顺式共表达相比，反式硫氧还蛋白共表达是优选的，因为它可以使抗原中无硫氧还蛋白，无需蛋白酶。硫氧还蛋白共表达使得本发明蛋白容易溶解。硫氧还蛋白共表达也对蛋白纯化率、纯化蛋白溶解性和质量有显著影响。
合适宿主的代表性例子包括细菌细胞如链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、链霉菌、枯草芽孢杆菌细胞；真菌细胞如酵母细胞和曲霉细胞；昆虫细胞如果蝇S2和草地夜蛾Sf9的细胞；动物细胞如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293、CV-1和Bowes黑素瘤细胞；以及植物细胞。
可以使用多种表达***，例如染色体、附加体和病毒衍生***，例如由细菌质粒、细菌噬菌体、转座子、酵母附加体、***元件、酵母染色体元件、病毒如杆状病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病毒和逆转录病毒衍生的载体或由它们的组合物衍生的载体，例如由质粒和噬菌体遗传元件衍生的载体，如粘粒和噬菌粒。表达***可含有调节以及引起表达的控制区域。一般来说，任何适合于维持、增殖或表达多核苷酸在宿主中产生多肽的***或载体都可使用。合适的核苷酸序列可通过任何熟知的和常规的技术***到表达***中，例如Sambrook等《分子克隆实验室指南》(上文)中列出的技术。可将合适的分泌信号整合到目标多肽中，使翻译蛋白分泌到内质网腔中、周质空间或胞外环境中。这些信号对多肽来说可以是内源性的，或者也可以是异源性的。
表达***也可是一种重组的活微生物，例如一种病毒或细菌。目标基因可***到活的重组病毒或细菌的基因组中。接种和体内感染这种活的载体将导致抗原的体内表达和免疫应答诱导。用于此目的的病毒和细菌是诸如痘病毒(例如痘苗病毒、禽痘病毒、金丝雀禽痘病毒)、甲病毒(辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒)、腺病毒、腺伴随病毒、微小RNA病毒(脊髓灰质炎病毒、鼻病毒)、疱疹病毒(水痘带状疱疹病毒等)、李斯特氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、BCG。这些病毒和细菌可以是毒性的、或用各种方法减毒来获得一种活疫苗。这种活疫苗也是本发明的一个部分。
本发明的多肽可通过熟知的技术从重组细胞培养物中回收和纯化，这些技术包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。最优选将金属离子亲和层析(IMAC)用于纯化。当多肽在胞内合成、分离和/或纯化过程中变性时，可使用熟知的用于蛋白重新折叠的技术再生活性构象。
本发明的另一重要方面涉及在哺乳动物中诱导、强化或调节免疫应答的方法，包括用本发明的多肽或多核苷酸或其片段接种哺乳动物，其量足以产生预防或治疗癌症和自身免疫病及相关病症的抗体和/或T细胞免疫应答。本发明另一方面涉及在哺乳动物中诱导、强化或调节免疫应答的方法，包括通过指导编码本发明多肽的多核苷酸体内表达的载体或细胞给予本发明的多肽，从而诱导免疫应答，产生预防或治疗哺乳动物所述疾病的免疫应答。
本发明的一个进一步的方面涉及一种免疫/疫苗制剂(组合物)，将其导入哺乳动物宿主时，诱导、强化或调节哺乳动物中针对本发明多肽的免疫应答，其中组合物包括本发明的多肽或多核苷酸或本文定义的其免疫片段。疫苗制剂还可以包括合适的载体。因为多肽可以在胃中降解，优选将其经肠道外途径给药(如皮下、肌肉、静脉内或皮内注射)。适于胃肠外给药的制剂包括水性和非水性无菌注射液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抗菌剂和使制剂与接受者血液等渗的溶质；以及可包含悬浮剂或增稠剂的水性和非水性无菌悬液。制剂可置于单剂量或多剂量的容器内，例如密封的安瓶和小瓶，并可贮存于冷冻干燥的环境，只需在使用前加入无菌的液体载体。
本发明另一方面涉及体外诱导针对本发明多肽或多核苷酸或其片段或含有本发明多肽或多核苷酸的分子的免疫应答，使用哺乳动物免疫***细胞，将这些活化免疫细胞再输入哺乳动物以治疗疾病。免疫***细胞的活化可以通过在各种免疫调节分子存在或不存在时，体外温育本发明的完整多肽或多核苷酸或含有本发明多肽或多核苷酸的分子实现。本发明另一方面涉及通过给予抗原呈递细胞来免疫哺乳动物，该抗原呈递细胞通过体外负荷本发明多肽或其部分或含有本发明多肽的分子被修饰，并以免疫原性途径体内给药。或者，抗原呈递细胞可以用含有本发明多核苷酸或片段或含有本发明多核苷酸的载体体外转染以表达相应多肽，并以免疫原方式体内给药。
本发明的疫苗制剂也可包括佐剂***，用来增强制剂的免疫原性。优选佐剂***优先引发TH1型应答。
免疫应答大体上可分为两个典型的种类，即体液或细胞介导的免疫应答(一般分别用起保护作用的抗体和细胞效应机制来区分)。这些应答种类被称为TH1型应答(细胞介导的应答)和TH2型免疫应答(体液应答)。
典型的TH1型免疫应答的特征是产生抗原特异的单元型限制的细胞毒T淋巴细胞和自然杀伤型细胞应答。在小鼠中，TH1型应答的特征通常是产生IgG2a亚型的抗体，而在人中，它们的对应物是IgG1型抗体。TH2型免疫应答的特征是产生广谱的免疫球蛋白同种型，在小鼠中包括IgG1、IgA和IgM。
可以想象得到，这两种类型的免疫应答之后的驱动力是细胞因子。高水平的TH1型细胞因子优先诱导针对所给抗原的细胞介导的免疫应答，而高水平的TH2型细胞因子优先诱导针对抗原的体液免疫应答。
TH1和TH2型免疫应答的区分不是绝对的。事实上，一个个体可以支持一种被描述为TH1优势或TH2优势的免疫应答。但是，通常方便地按照Mosmann和Coffman在鼠CD4+ve T细胞克隆中的介绍来考虑细胞因子的家族(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)，TH1和TH2细胞：淋巴因子的不同分泌模式导致不同的功能特性。《免疫学年鉴》7卷，145-173页)。通常，TH1型应答与T淋巴细胞产生INF-γ和IL-2细胞因子相关。其他通常直接与TH1型免疫应答诱导有关的细胞因子如IL-12不由T细胞产生。相反，TH2型应答与IL-4、IL-5、IL-6和IL-13的分泌有关。
已知特定的疫苗佐剂特别适合于刺激TH1或TH2型细胞因子应答。疫苗接种或感染后免疫应答的TH1∶TH2平衡的最佳指标通常包括在体外用抗原再刺激后直接测量T淋巴细胞产生的TH1或TH2细胞因子，和/或测量抗原特异的抗体应答的IgG1∶IgG2a比率。
因此，TH1型佐剂是在体外用抗原再刺激时优先刺激分离的T细胞群体产生高水平的TH1型细胞因子和促进CD8+细胞毒T淋巴细胞和与TH1型同种型相关的抗原特异的免疫球蛋白应答产生的佐剂。
能够优先刺激TH1细胞应答的佐剂在国际专利申请No.WO94/00153和WO95/17209中介绍。
3 De-O-酰化单磷酰类脂A(3D-MPL)是一种这样的佐剂。这可由GB2220211(Ribi)知道。它在化学上是3 De-O酰化单磷酰类脂A与4、5或6酰基链的混合物，并由Ribi Immunochem，Montana制造。3 De-O-酰化单磷酰类脂A的一种优选形式在欧洲专利0 689 454(SmithKline Beecham Biologicals SA)中公开。
3D-MPL颗粒优选小到足以通过一个0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌(欧洲专利0 689 454)。
3D-MPL以每剂10μg-100μg，优选是20-25μg的范围存在，而抗原通常以每剂2-50μg的范围存在。
另一个优选的佐剂包含QS21，它是一种来自Quillaja SaponariaMolina的茎的Hplc纯化的无毒组分。它可选地用来与3 De-O-酰化单磷酰类脂A(3D-MPL)混合，并可选地与一种载体一起使用。
制备QS21的方法在美国专利No.5,057,540中公开。
含有QS21的非反应性的佐剂制剂在以前已有介绍(WO96/33739)。含有QS21和胆甾醇的这种制剂在与抗原一起配制时已显示是成功的TH1刺激佐剂。
优先刺激TH1型细胞应答的进一步的佐剂包括免疫调节性的寡核苷酸，例如非甲基化的CpG序列，如WO 96/02555中的公开。
不同TH1刺激性佐剂如上文所介绍的佐剂的组合也被认为是能提供一种优先刺激TH1型细胞应答的佐剂。例如，QS21可与3D-MPL组合配制。OS21∶3D-MPL的比率通常为1∶10至10∶1，优选为1∶5至5∶1，并且通常为大约1∶1。优选的最佳组合范围是2.5∶1至1∶1的3D-MPL∶QS21。
根据本发明，疫苗组合物还优选含有一种载体。载体可以是一种水包油乳剂，或一种铝盐如磷酸铝或氢氧化铝。
水包油乳剂优选包含一种可代谢的油，例如角鲨烯、α-生育酚和Tween 80。在一个特别优选的方面，根据本发明，疫苗组合物中的抗原与QS21和3D-MPL在这样一种乳剂中组合。另外，该水包油乳剂可以含有span 85和/或卵磷脂和/或三辛精。
在对人给药时，疫苗中QS21和3D-MPL的范围是每剂1μg-200μg，例如10-100μg，优选是10μg-50μg。水包油通常含有2至10％的角鲨烯、2至10％的α-生育酚和0.3至3％的Tween 80。在以更稳定的乳剂形式提供时，角鲨烯∶α-生育酚∶Tween 80的比例优选相同或少于1。还可包含1％水平的Span85。在某些情况下，本发明的疫苗优选进一步含有一种稳定剂。
非毒性的水包油乳剂优选在一种水载体中含有一种非毒性的油如角鲨烷或角鲨烯、一种乳化剂如Tween 80。水载体可以是例如磷酸缓冲盐水。
WO 95/17210中介绍了一种特别强有力的佐剂制剂，它含有在一种水包油乳剂中的QS21、3D-MPL和生育酚。
本发明还提供一种多价的疫苗组合物，它含有本发明的疫苗制剂以及其他抗原，特别是对治疗癌症、自身免疫疾病和相关病症有用的抗原。这样一种多价疫苗组合物可包括一种如前所述的TH1诱导型佐剂。
本发明也涉及多核苷酸和多肽作为诊断试剂的用途，多核苷酸为衍生自本发明的多核苷酸的引物形式，多肽为本发明的多肽特异的抗体或试剂形式。
血液或组织中能够检测癌发生途径极早期变化的遗传或生化标志的鉴定可以帮助确定患者的最佳治疗。替代肿瘤标志如多核苷酸表达可用于诊断癌症的不同形式和状态。鉴定本发明多核苷酸的表达水平可以用来区分癌症的阶段并对癌组织的性质分级。区分癌症阶段是监测癌症的进展，根据在活组织检查区域是否存在恶性组织来确定。本发明的多核苷酸通过鉴定癌症侵袭性标志如在体内不同区域的存在，可以帮助完善区分阶段的方法。癌症分级表明肿瘤与其同类正常组织的近似程度，是由细胞形态和其它分化标志来评定的。本发明的多核苷酸可以用来确定肿瘤级别，因为它们可以帮助确定肿瘤细胞的分化状态。
诊断实验通过包括确定来自受试者的样品中异常降低或增加的多肽或mRNA水平的方法的诊断，提供了诊断或确定对癌症、自身免疫病和相关病症的易感性的方法。该诊断方法已知是分化表达。比较病态组织和正常组织中特定基因的表达。两种组织中多核苷酸相关基因、mRNA或蛋白在分子量、氨基酸或核苷酸序列或相对丰度方面的差异，表明在怀疑患病的人的组织中基因或调控它的基因的变化。
降低或增加的表达可以在RNA水平测定。首先从两种组织中分离PolyA RNA，然后使用含有Poly A+mRNA的RNA印迹或任何其它直接或间接RNA检测法，通过例如组织切片原位杂交、逆转录酶PCR等，可以检测相当于差异表达的本发明多核苷酸的基因编码的mRNA。与正常组织相比病态组织中给定RNA的表达增加或降低，表明转录本和/或表达的蛋白在疾病中起作用。因此，检测到较正常组织高或低水平的相应于SEQ ID NO：1或3的mRNA表明在患者中存在癌症。
样品中mRNA表达水平可以通过产生来自样品的已表达序列标志(EST)文库来确定。在文库中EST的相对出现可以用来评价在起始样品中基因转录本的相对出现。该EST分析实验可以与参考样品的EST分析相比较，从而确定目标多核苷酸的相对表达水平。
其它mRNA分析可以使用基因表达系列分析(SAGE)法(Velculescu et al.，Science(1995)270-484)、差示法(例如US5,776,683)或依赖于核苷酸相互作用特异性的杂交分析来进行。
或者，比较可以在蛋白水平进行。两种组织中的蛋白大小可以使用抗体比较，在来自两种组织的蛋白提取物的蛋白质印迹实验中检测多肽。表达水平和亚细胞定位也可以使用针对相应蛋白的抗体免疫测定。本领域技术人员熟知其它可以用来测定来自一个宿主的样品中的蛋白如本发明多肽水平的实验技术。与正常组织相比病态组织中多肽表达水平升高或降低表明表达的表达可能与疾病有关。
在本发明的实验中，诊断可以通过测定SEQ ID NO：1或3所示至少一个序列编码的基因产物的表达水平来确定。病态和正常组织中的mRNA或蛋白水平的比较也可以用来追踪疾病进程或消退。
样品中的多种多核苷酸序列可以使用多核苷酸阵列分析。这些可用来揭示基因的差异表达并确定基因功能。例如，SEQ ID NO：1或3的多核苷酸序列阵列可以用来确定正常和癌变组织中是否有任何多核苷酸表达差异。在一个实施方案中，可以构建含有SEQ ID NO：1或3的核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探针阵列，以便有效筛选遗传突变。阵列技术是众所周知的，可以广泛应用，可以用来解决分子遗传学中的多种问题，包括基因表达、遗传连锁和遗传可变性(参见例如M.Chee et al.，Science，Vol 274，pp610-613(1996))。
“诊断”在本发明中包括确定受试者对疾病的易感性，确定受试者是否患病，以及确定患者的预后。
本发明还涉及进行诊断实验的诊断试剂盒，它包括：
(a)本发明的多核苷酸，优选SEQ ID NO：1或3的核苷酸序列或其片段；
(b)与(a)互补的核苷酸序列；
(c)本发明的多肽，优选SEQ ID NO：2或4的多肽或其片段；或
(d)本发明多肽的抗体，优选SEQ ID NO：2或4的多肽的抗体。
本发明的核苷酸序列对染色体定位也有价值。该序列特异性靶向人染色体上特定位置并与其杂交。根据本发明对染色体相关序列的作图是将这些序列与基因相关疾病联系起来的重要第一步。序列被作图到染色体上的准确位置后，序列在染色体上的物理位置可以与遗传图谱数据联系起来。这些数据可参见例如V.McKusick，MendelianInheritance in Man(通过Jhon Hopkins University Welch医学图书馆在线获得)。然后已经被作图的澳相同染色体区域的基因和疾病的关系可以通过连锁分析(物理相邻基因的共遗传)鉴定。也可以确定受影响和未受影响个体之间cDNA或基因组相邻的差异。
本发明多肽和其片段或类似物或表达该多肽的细胞也可以用作免疫原，产生对本发明多肽免疫特异性的抗体。“免疫特异性”是指抗体对本发明多肽的亲和力明显大于其对现有技术其它相关多肽的亲和力。
本发明另一方面提供对本发明多肽或本文中限定的其免疫片段免疫特异性的抗体。优选该抗体是单克隆抗体。
针对本发明多肽的抗体也可以通过常规途径向动物优选是非人动物给予多肽或具有表位的片段、类似物或细胞获得。为了制备单克隆抗体，提供通过连续细胞系培养物产生的抗体的任何技术均可使用。实例包括杂交瘤技术(Kohler，G.和Milstein，C.《自然》256：495-497(1975))、三瘤(trioma)技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等《今日免疫学》4：72(1983))和EBV杂交瘤技术(Cole等《单克隆抗体和癌症治疗》，77-96页，Alan R.Liss，Inc.，1985)。
制备单链抗体的技术(美国专利No.4,946,778)可修改来制备针对本发明的多肽的单链抗体。转基因鼠或其他生物体或动物包括其他哺乳动物也可用来表达人源化抗体。
上述抗体可以用来分离或鉴定表达多肽的克隆或通过亲和层析纯化多肽。本发明的抗体也可以用来防止或治疗癌症，特别是卵巢癌和结肠癌、自身免疫病和相关病症。
本发明其它方面涉及在哺乳动物中诱导或调节免疫应答的方法，包括用本发明的多肽接种哺乳动物，其量足以产生保护或缓解疾病症状或进程的抗体和/或T细胞免疫应答。本发明的另一方面涉及在哺乳动物中诱导或调节免疫应答的方法，包括通过体内指导本发明多核苷酸表达和编码多肽的载体给予本发明的多肽，以诱导免疫应答产生抗体保护该动物免于该疾病。
因此，应当意识到，本发明提供一种治疗与CASB619多肽活性存在、过量或低下有关的异常病症如癌症和自身免疫病特别是卵巢癌和结肠癌的方法。
本发明还提供一种筛选化合物鉴定刺激或抑制CASB619多肽功能的化合物的方法。一般，激动剂或拮抗剂可以用于上述疾病的治疗和预防目的。可以从多种来源鉴定化合物，例如细胞、无细胞制备物、化学文库和天然产物化合物。这样鉴定的激动剂、拮抗剂或抑制剂根据情况可以是多肽的天然或修饰底物、配体、受体、酶等；或者可以是其结构或功能模拟物(见Coligan et al《当代免疫学方法》1(2)第5章(1991))。筛选方法是本领域技术人员熟知的。其它筛选方法可参见例如D.Bennett et al.，J Mol Recognition，8：52-58(1995)；and K.Johanson et al.，J Biol Chem，270916)：9459-9471(1995)及其中的参考文献。
因此，本发明提供一种筛选方法以鉴定刺激或抑制本发明多肽功能的化合物，包括选自以下的方法：
(a)通过直接或间接与候选化合物结合的标记，测定候选化合物对多肽(或负载多肽的细胞或膜)或其融合蛋白的结合；
(b)在标记竞争物的存在下测定候选化合物对多肽(或负载多肽的细胞或膜)或其融合蛋白的结合；
(c)使用对负载多肽的细胞或细胞膜合适的检测***，测试候选化合物是否导致多肽活化或抑制产生的信号；
(d)将候选化合物与含有权利要求1的多肽的溶液混合，形成混合物，测定混合物中多肽的活性，比较混合物与标准品的活性；或
(e)使用如ELISA实验等测定候选化合物对细胞中编码该多肽的mRNA和该多肽的产生的影响。
本发明的多肽可以用来通过本领域标准的受体结合技术鉴定膜结合或可溶的受体。熟知的筛选方法也可以用来鉴定竞争与本发明多肽受体结合的本发明多肽的激动剂和拮抗剂。
因此，另一方面，本发明涉及鉴定本发明多肽的激动剂、拮抗剂、配体、受体、底物、酶等或降低或提高这些多肽产生的化合物的筛选试剂盒，其包括：
(a)本发明的多肽；
(b)表达本发明多肽的重组细胞；
(c)表达本发明多肽的细胞膜；或
(d)本发明多肽的抗体；
该多肽优选是SEQ ID NO：2的多肽。
本领域技术人员容易意识到，本发明的多肽也可以用于基于结构设计多肽激动剂、拮抗剂或抑制剂的方法，具体如下：
(a)首先确定多肽的三维结构；
(b)推测激动剂、拮抗剂或抑制剂的类似反应或结合位点的三维结构；
(c)合成预期与推测的结合或反应位点结合或反应的候选化合物；
(d)测试候选化合物是否确实是激动剂、拮抗剂或抑制剂。
基因治疗也可以用来影响通过受试者相关细胞的CASB619多肽的内源产生。基因治疗的概述参见《人类分子遗传学》第20章基因治疗和其它基于分子遗传学的治疗途径(及其中的参考文献)，TStrachan和A P Read，BIOS Scientific Publishers Ltd(1996)。
疫苗制剂的一般描述见《药物生物技术》61卷，疫苗设计-亚单位和佐剂途径，Powell and Newman编，Plenum Press，1995。疫苗新趋势和发展，Voller等编，University Park Press，Baltimore，Maryland，USA。包囊在脂质体中可参见例如Fullerton美国专利4,235,877。蛋白辍合到大分子参见例如Likhite美国专利4,372,945和Armor等美国专利4,474,757。
选定每剂疫苗中蛋白量为在典型疫苗接受者中诱导免疫保护应答而没有明显的副作用。这个量取决于使用的具体免疫原。一般，预期每剂含有1-1000μg蛋白，优选2-100μg，最优选4-40μg。特定疫苗的最适量可以通过涉及观察抗体滴度和受试者中其它应答的标准研究确定。初始接种后，受试者一般在约4周内接受加强免疫。
“分离的”表示“通过人工”改变其天然状态，即如果“分离的”组合物或物质在自然界中存在，则它已经从其原始环境改变或取出或者已经取出并改变。例如，在本文中使用该术语时，在活动物体内存在的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但已经与天然状态下共存的物质分开的同样多核苷酸或多肽就是“分离的”。
“多核苷酸”一般指任何聚核糖核苷酸或聚脱氧核糖核苷酸，它可以是修饰或非修饰的RNA或DNA，包括单链和双链区域。
“变体”指不同于参照多核苷酸或多肽但保留了基本特性的多核苷酸或多肽。一般多核苷酸变体的核苷酸序列与参照多核苷酸不同。变体核苷酸序列的变化可能改变或不改变由参照多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。如下所述，核苷酸改变可能导致参照序列编码的多肽中氨基酸的置换、添加、缺失、融合和截短。一般多肽变体的氨基酸序列与参照多肽不同。通常，差异有限，因此参照多肽和变体的序列在总体上是极其近似的，在许多区域是相同的。变体和参照多肽在氨基酸序列上可以有任何组合形式的一个或多个置换、添加、缺失的区别。置换或***的氨基酸残基可以是或不是遗传密码编码的氨基酸。多核苷酸或多肽的变体可以是天然存在的，如等位变体，或者是非天然存在的。非天然存在的多核苷酸和多肽变体可以通过诱变技术或直接合成制备。
“同一性”如同本领域所熟知的，是两种或多种多肽序列或两种或多种多核苷酸序列之间的相关性，根据具体情况，可通过序列比较来确定。在本领域，“同一性”还指多肽或多核苷酸序列之间序列相关的程度，根据具体情况，可通过这些序列的链的匹配来确定。“同一性”可使用已知的方法方便地计算，包括但不限于(《计算分子生物学》，Lesk，A.M.编辑，Oxford University Press，New York，1988；《生物计算机：信息和基因组计划》Smith，D.W.编辑，Academic Press，New York，1993；《序列数据的计算机分析》I部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑，HumanaPress，New Jersey，1994；《分子生物学中的序列分析》von Heine，G.，Academic Press，1987；和《序列分析引物》Gribskov，M.和Devereux，J.编辑，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H.和Lipman，D.，《SIAM J.Applied Math》48：1073(1988)。测定同一性的方法被设计来给出检测序列之间的最大匹配。而且，测定同一性的方法在公众可获得的计算机程序中编码。用来测定两种序列之间的同一性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包中的GAP程序(Devereux，J.等《核酸研究》12(1)：387(1984)、BLASTP、BLASTN(Altschul，S.F.等《分子生物学杂志》215：403-410(1990)以及FASTA(Pearson和Lipman《美国科学院院刊》85：2444-2448(1988)。BLAST程序家族可从NCBI和其他来源获得(《BLAST手册》Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.等《分子生物学杂志》215：403-410(1990)。著名的Smith Waterman算法也可用来测定同一性。
优选使用的算法是FASTA。使用该算法进行多肽或多核苷酸序列比较的优选参数包括以下：
缺口补偿：12
缺口延伸补偿：4
单字大小：2，最大6
用其它方法进行多肽序列比较的优选参数包括以下：
1)算法：Needleman和Wunsch，《分子生物学杂志》48：443-453(1970)
比较矩阵：BLOSSUM62，见Henikoff和Henikoff，《美国科学院院刊》89：10915-10919(1992)
缺口补偿：12
缺口长度补偿：4
使用这些参数的程序可以从Genetics Computer Group，Madison WI以“缺口”程序的形式获得。上述参数是多肽比较的缺省参数(对末端缺口无补偿)。
多核苷酸序列比较的优选参数包括以下：
1)算法：Needleman和Wunsch，《分子生物学杂志》48：443-453(1970)
比较矩阵：匹配＝+10，不匹配＝0
缺口补偿：50
缺口长度补偿：3
来源：Genetics Computer Group，Madison WI的“缺口”程序。
使用这些参数的程序可以从Genetics Computer Group，Madison WI以“缺口”程序的形式获得。上述参数是多核苷酸比较的缺省参数。
例如，本发明的多核苷酸序列可以与SEQ ID NO：1的参照序列相同，即同一性为100％，或者与参照序列相比包括一定数量的核苷酸改变。这种改变可以选自至少一个核苷酸缺失、置换(包括转换和颠换)或***，其中所述改变可以发生在参照多核苷酸序列的5′或3′末端或两个末端之间的任何位置，分别散布在参照序列的核苷酸之间，或者以一个或多个毗连群散布在参照序列中。核苷酸改变的数量如下确定：SEQ ID NO：1中的总核苷酸数乘以相应同一性百分数(除以100)，然后将其结果从SEQ ID NO：1的总核苷酸数中减除，或者：
nn≤xn-(xn·y)
其中nn是核苷酸改变的数目，xn是SEQ ID NO：1中的核苷酸总数，y对70％来说是0.70，对80％来说是0.80，对85％来说是0.85，对90％来说是0.90，对95％来说是0.95，依此类推，其中如xn和y的结果不是整数，则将其四舍五入取最近的整数，再从xn中减除。编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸的改变可能在该编码序列中产生无义、错义或移码突变，因此改变后的多核苷酸编码的多肽会发生变化。
类似地，本发明的多肽序列可以与SEQ ID NO：2的参照序列相同，即同一性为100％，或者与参照序列相比包括一定数量的氨基酸改变，因此同一性小于100％。这种改变可以选自至少一个氨基酸缺失、置换(包括保守和非保守置换)或***，其中所述改变可以发生在参照多肽序列的氨基或羧基末端或两个末端之间的任何位置，分别散布在参照序列的氨基酸之间，或者以一个或多个毗连群散布在参照序列中。同一性百分数一定时氨基酸改变的数量如下确定：SEQ IDNO：2中的总氨基酸数乘以相应同一性百分数(除以100)，然后将其结果从SEQ ID NO：2的总氨基酸数中减除，或者：
na≤xa-(xa·y)
其中na为氨基酸改变数量，xa为SEQ ID NO：2的总氨基酸数，y值在70％时为0.70，在80％时为0.80，在85％时为0.85，依此类推，其中若xa和y的结果不是整数，则将其四舍五入取最近的整数，再从xa中减除。
“同系物”是本领域的通用术语，表示与目标序列具有高度序列相关性的多核苷酸或多肽序列。这种相关性可以通过确定以上所述待比较的序列之间的同一性和/或类似性程度来定量。属于该通用术语范围内的术语是“直向同源物”和“共生同源物”，前者是其它物种中多核苷酸或多肽的功能等价物的多核苷酸或多肽，后者是指在相同物种内考虑时的功能类似序列。
                         实施例
实施例1：实时RT-PCR分析
实时RT-PCR(U.Gibson，1996.Genome Research：6,996)用来比较来自多个患者的相应的肿瘤和正常结肠组织中候选抗原mRNA转录本的丰度。此外，一系列正常组织中候选基因的mRNA水平也通过该方法进行了评价。
正常和癌变结肠总RNA使用TriPure试剂(Boehringer)由速冻活检样品中提取。正常组织总RNA购自InVitrogen或使用TriPure试剂由速冻活检样品中提取。DNA酶处理后使用oligo-dT磁性珠(Dynal)从总RNA中纯化PolyA+mRNA。使用SybrII染料(MolecularProbes)通过分光荧光测定法(VersaFluor，BioRad)进行mRNA的定量。实时PCR扩增的引物采用Perkin-Elmer Primer Express软件使用TaqMan扩增条件的缺省选择设计。
实时反应根据标准PCR方法组合，每一反应使用2ng纯化mRNA。实时检测时加入SybrI染料(Molecular Probes)至最终稀释度为1/75000。扩增(40个循环)和实时检测在Perkin-Elmer BiosystemsPE7700***中使用常规仪器设置进行。Ct值使用PE7700序列测定软件计算。获得每一个患者的两个Ct值：肿瘤Ct(CtT)和相应正常结肠Ct(CtN)。实时PCR获得的Ct值与靶模板拷贝数是对数-线性相关。因为在常规实验条件下PCR扩增的效率与理论扩增效率接近，由2(CtN-CtT)可估计两种组织中相对转录水平(即肿瘤中mRNA过表达倍数)。对24个患者的活检样品进行实时PCR反应。计算每个患者的mRNA过表达水平。然后由该数据集计算候选抗原的平均mRNA过表达水平和患者过表达候选抗原的比例。单个值相对相同样品中的肌动蛋白标准化(比例)，如图1所示。该值为1相当于与肌动蛋白表达水平相同。结果以对数标尺示出。
代表28种不同组织的48个正常组织样品也通过同样方法测定。候选抗原的Ct值与相同组织样品中获得的肌动蛋白的值比较。结果相对于肌动蛋白标准化，示于图2。
结肠癌/正常结肠样品中的实时PCR结果总结
结肠癌中CASB619过表达的患者(％) 结肠癌中平均过表达水平(倍)
16/24(67％) 208
结论：相对于邻近正常结肠，CASB619在67％结肠癌样品中过表达，平均水平为近200倍。正常组织中的表达限于其它消化道组织以及主要的气管和睾丸。
实施例2：DNA微阵列
DNA微阵列用来检查多个样品中大量基因的mRNA表达图谱。该信息用来弥补实时PCR得到的数据，提供了肿瘤和正常组织中基因表达水平的独立度量。
目前产生DNA微阵列技术的实例包括1)Affymetrix“基因芯片(GeneChip)”阵列，其中寡核苷酸使用光能无机图形法(photolithographicprocess)在芯片表面合成2) DNA斑点技术，其中少量DNA溶液通过机器人沉积然后固定在固相表面(如玻璃)。两种情形下，芯片均以自目标组织(如正常组织、肿瘤等)中提取的cDNA或cRNA杂交并以放射活性或以荧光报告分子标记。标记的材料与芯片杂交，结合在芯片上各个序列的探针的量使用特制的扫描仪确定。实验可以使用单荧光报告分子(或放射活性)进行，或者可以用两种报告分子进行。后一种情形下，两种样品中的每一个均以一种报告分子标记。两种标记样品然后竞争与DNA芯片上的序列杂交。确定芯片上每个序列的两种荧光信号的比例。该比例用来计算两种样品中转录本的相对丰度。详细方法可获自多种来源，包括“DNA微阵列：实用方法，SchenaM.Oxford University Press 1999”和互联网(http：//cmgm.stanford.edu/pbrown/protocols/index.html，http：//arrayit.com/DNA-Microarray-Protocols/)和特定销售商(如Affymetrix)
实施例3
EST图谱
对实验抗原组织表达鉴定的补充途径是探测人“已表达序列标志(EST)”数据库。EST是由特定组织或细胞系提取的多种mRNA制备的cDNA的小片段。这些数据库目前提供来自数百种cDNA组织文库包括各类肿瘤组织和疾病状态的大量EST(106)。通过检索工具(Blast)，进行CASB616序列的比较检索，以便进一步探索组织表达。
CASB619的EST分布
     DbEST入藏号     ATGI Iib ID               描述
NCBI：1202616     937 NCI_CGAP_Co2(结肠绒毛)
NCBI：1202659     937 NCI_CGAP_Co2(结肠绒毛)
NCBI：1208269     935 NCI_CGAP_Pr4.1(***上皮内赘生物)
NCBI：1152744     888 NCI_CGAP_Pr6(***上皮内赘生物)
NCBI：157532     910 NCI_CGAP_Pr22(正常***)
NCBI：1178873     882 NCI_CGAP_Co3(12个合并的结肠癌)
NCBI：1040601     628 睾丸NHT
NCBI：1056221     628 睾丸NHT
NCBI：1298131     910 NCI_CGAP_Pr22(正常***)
NCBI：976517     715 附睾
NCBI：1618753     417 甲状旁腺瘤
NCBI：1737305     895 NCI_CGAP_Br2(合并的乳腺癌组织)
NCBI：1738600     895 NCI_CGAP_Br2(合并的乳腺癌组织)
NCBI：1767617     628 睾丸NHT
NCBI：1889992     424 牛心
NCBI：1907671     628 睾丸NHT
NCBI：2074937     1076 NCI_CGAP_Lu5 View stats
NCBI：2147596     1461 NCI_CGAP_Ut1
NCBI：2147632     1461 NCI_CGAP_Ut1
NCBI：2308815     1462 NCI_CGAP_Ut2
NCBI：2441896     1410 NCI_CGAP_Pr28
NCBI：2447648     1463 NCI_CGAP_Ut3
NCBI：2381271     1461 NCI_CGAP_Ut1
NCBI：2582781     1461 NCI_CGAP_Ut1
NCBI：2583713     1461 NCI_CGAP_Ut1
NCBI：2585593     1410 NCI_CGAP_Pr28
NCBI：2587322     1463 NCI_CGAP_Ut3
NCBI：2601136     1461 NCI_CGAP_Ut1
NCBI：2824305     1463 NCI_CGAP_Ut3
NCBI：3007221     1461 NCI_CGAP_Ut1
NCBI：3078572     2301 NCI_CGAP_Pt1
NCBI：3086989     1461 NCI_CGAP_Ut1
NCBI：3087235     1461 NCI_CGAP_Ut1
NCBI：3045696     1661 NCI_CGAP_Lu19
NCBI：3218161     2467 NCI_CGAP_Co20
NCBI：3291383     2508 NCI_CGAP_Sub3
NCBI：3028913     2107 BT130
NCBI：3655706     1447 NCI_CGAP_Co14
NCBI：2553046     1728 Soares_Dieckgraefe_结肠_NHCD
NCBI：979345     781 子宫内膜瘤
NCBI：3289738     2508 NCI_CGAP_Sub3
NCBI：614598     464 ？
NCBI：978076     781 子宫内膜瘤
NCBI：979060     781 子宫内膜瘤
NCBI：1616799     417 甲状旁腺瘤
NCBI：978445     781 子宫内膜瘤
总之，与CASB619匹配的93％EST来源于肿瘤组织、牛组织或正常生殖器官。这表明该基因在该组织的表达更常见。
实施例4
RNA-DNA印迹分析
通过Advantage PCR(见上)扩增限定量的混合肿瘤和相应的正常结肠cDNA。多个正常组织的信使RNA也使用相同的方法扩增。扩增的cDNA(1μg)在1.2％琼脂糖凝胶上电泳，并转移到尼龙膜上。该膜与用候选TAA cDNA片段制备的探针杂交(AlkPhos DirectSystem)。RNA-DNA分析提供了转录本大小、剪接变体存在和肿瘤和正常组织中转录本丰度的信息。
实施例5
RNA印迹分析
RNA印迹使用1μg polyA+mRNA根据标准方法制备。放射活性探针使用Ready-to-Go***(Pharmacia)制备。
实施例6
鉴定全长cDNA序列
结肠癌cDNA文库使用λZap II***(Stratagene)由5微克polyA+mRNA构建。按照提供的方法，但在逆转录步骤使用SuperscriptII(LifeTechnologies)。构建Oligo-dT引发的和随机引发的文库。筛选每一文库时涂布约1.5×106独立噬菌体。嗜菌斑转移到尼龙滤膜上，与用AlkPhos Direct标记的cDNA探针杂交。阳性噬菌体通过化学发光检测。由琼脂平板上切下阳性噬菌体，在500微升SM缓冲液中洗脱，通过基因特异性PCR证实。洗脱的噬菌体通过体内切除转变成单链M13噬菌体。噬菌体然后通过感染大肠杆菌转变成双链质粒DNA。感染的细菌铺板，然后用cDNA探针进行第二轮筛选。由阳性细菌克隆纯化质粒DNA并对双链测序。当全长基因不能直接由cDNA文库获得时，缺失的序列使用RACE技术分离(Marathon Kit，ClonTech)。该方法依赖于逆转录mRNA成双链cDNA，将接头连接到cDNA的末端，并使用基因特异性引物和一个接头寡核苷酸扩增所需cDNA的末端。Marathon PCR产物克隆进质粒(pCRII-TOPO)中并测序。
获得的序列(SEQ ID NO：1)具有一个1013氨基酸的推测开放读框(SEQ ID NO：2)。对推测的蛋白序列进行了细胞定位预测计算(PSORT：http：//psort.nibb.ac.jp/and TopPred：http：//www.biokemi.su.se/～sever/toppred2/toppred_source.html)。CASB619似乎具有肽信号，和一到三个跨膜区(低置信度预测)。未发现其它基元或结构域。
实施例7：
7.1肿瘤特异性抗原的表达和纯化
在微生物宿主中的表达或体外转录/翻译***被用于产生用作疫苗目的的本发明抗原，或产生通过免疫组织化学鉴定天然表达蛋白所需的抗体的快速纯化和生成或进一步纯化所需的蛋白片段或完整蛋白。
重组蛋白可在两种微生物宿主大肠杆菌和酵母(如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)中表达。这可以选择对于特定抗原产生最有利特性的表达***。一般，重组抗原将在大肠杆菌中表达，试剂蛋白在酵母中表达。
表达策略首先涉及重组抗原的一级结构。一般，表达融合配偶体(EFP)被置于N末端，以提高表达水平，在N末端还可以包括用来调节抗原的免疫原特性的区域、免疫融合配偶体(IFP)。此外，亲和用来帮助进一步纯化的融合配偶体(AFP)被置于C末端。
当获得了重组菌株，通过评价表达水平鉴定重组产物，通过分析粗提取物的行为预测蛋白的进一步溶解性。
在合适的生长培养基中生长和诱导重组蛋白表达后，通过SDS-PAGE分析全部提取物。重组蛋白在染色凝胶上显色，使用特异性抗体通过蛋白印迹分析鉴定。
不同型式表达抗原的比较可以选择出最有希望的候选者，它将用于进一步纯化和免疫分析。
纯化方案使用重组蛋白中存在His亲和尾时的常规方法。在典型的实验中，过滤破碎细胞，将无细胞提取物上样到特异性保留重组蛋白的离子金属亲和层析(IMAC；Ni++NTA，来自Qiagen)上。
保留的蛋白通过磷酸缓冲液中的0-500mM咪唑梯度(可能存在变性剂)洗脱。
7.2抗体制备和免疫组织化学
少量相对纯化的蛋白可被用于产生免疫工具，以便
a)通过正常或癌症组织切片的免疫组织化学检测表达；
b)检测表达并在纯化过程中跟踪蛋白(ELISA/蛋白印迹)；或
c)鉴定/定量纯化蛋白(ELISA)。
7.2.1多克隆抗体：
免疫
用100μg蛋白通过肌肉内途径免疫2-3只兔子3次，每次间隔3周，蛋白配制在佐剂3D-MPL/QS21中。每次免疫3周后取血样，使用作为包被抗原的蛋白按照标准方法通过ELISA测定血清中的抗体滴度。
ELISA
96孔微量板(maxisorb Nunc)用5μg蛋白4℃包被过夜。37℃用PBS NCS 1％饱和1小时后，加入兔血清的系列稀释液(1/10开始)，37℃ 1H 30。PBS Tween洗涤3次后，加入抗兔生物素化抗血清(Amersham)(1/5000)。洗涤平板，加入过氧化物酶偶联的链亲和素(1/5000)，37℃ 30分钟。洗涤后，加入50μl TMB(BioRad)7分钟，然后用硫酸终止反应。在450nm测定OD，通过SoftmaxPro计算中点稀释度。
7.2.2单克隆抗体：
免疫
用5μg纯化蛋白以3周的间隔免疫5只BALB/c小鼠3次。第2次后14天和第3次后1周取血。以纯化蛋白作为包被抗原通过Elisa测定血清。根据这些结果(中点稀释度＞10000)，选择1只小鼠用于融合。
融合/HAT选择
根据标准方法使用PEG 40％和DMSO 5％将脾细胞与SP2/0骨髓瘤融合。细胞接种96孔板，每孔2.5×104-105细胞，在HAT培养基上选择抗性克隆。检测杂交瘤的上清中特异性抗体的含量，如结果为阳性，将杂交瘤进行2轮有限稀释。2轮筛选后，选择3个杂交瘤用于腹水生成。
7.2.3免疫组织化学
当得到抗体后，在正常和癌变组织切片上进行免疫染色，以便确定：
◇癌变与正常组织中本发明抗原水平或
◇表达抗原的一定类型癌症的比例
◇如果其它癌症类型也表达抗原
◇在癌变组织中包括抗原的细胞的比例
组织样品制备
切开后，组织样品置于OCH化合物中的软木盘中，在已在液氮(一160℃)中深度冷冻的异戊烷中速冻。将样品保存在-70℃待用。在低温室(-20℃、-30℃)中切出7-10μm切片。
染色
组织切片在室温干燥5分钟，室温下在丙酮中固定l0分钟，再次干燥，用PBS 0.5％BSA 5％血清饱和。室温下30分钟后，使用抗原特异性抗体进行直接或间接染色。直接染色特异性更好，但染色较弱，而间接染色染色更强，但特异性较差。
7.3针对本发明抗原的人细胞免疫应答分析
本发明抗原的免疫关联可以通过体外引发人T细胞来评价。所有T淋巴细胞系和树突细胞来源于健康供体(优选HLA-A2亚型)PBMC(外周血单核细胞)。HLA-A2.1/Kb转基因小鼠也用于筛选HLA-A2.1肽。
通过每周体外刺激产生和维持新发现的抗原特异性CD8+T细胞系。CD8细胞系针对抗原和抗原衍生肽的裂解活性和
Figure A0080559700341
IFN产生使用标准方法测定。
使用两种策略产生抗原特异性CD8+T细胞：基于肽的途径和基于完整基因的途径。两种途径均需要新发现抗原的全长cDNA，以准确读框克隆在合适的传递***中，或者用来预测HLA结合肽序列。
基于肽的途径
HLA-A2结合肽序列太古Parker算法(Parker，K.C.，M.A.Bednarek，and J.E.Coligan.1994基于单独肽侧链的独立结合将潜在HLA-A2结合肽分级的方案。免疫学杂志，152：163和http：//bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)或Rammensee方法(Rammensee，Friede，Stevanovic，MHC配体和肽基元：表1，免疫遗传学41，178-228，1995；Rammensee，Bachmann，Stevanovic：MHC配体和肽基元。Landes Bioscience 1997，和http：134.2.96.221/scriptsh/laserver.dll/home.htm)。然后在HLA-A2.1/Kb转基因小鼠模型(Vitiello et al)中筛选肽。
a)预测的结合HLA A0201基因座的表位
a.1)HLA-A*0201九聚体
位置   1  2  3  4  5  6  7  8  9  Rammensee计分  Parker计分°   SEQIDNO
  848   F  L  W  E  S  A  A  A  C   777.681     68
  24   R  L  W  R  L  L  L  W  A   521.615     5
  761   S  L  A  D  R  L  I  G  V     30   655.875     6
  893   S  L  P  E  Q  R  V  T  I     26     7
  886   K  L  C  S  G  G  I  S  L     25     8
  853   A  A  A  C  P  L  C  S  V     25     9
  674   S  A  L  A  N  T  V  T  L     24     10
  499   F  V  F  E  T  L  C  S  V     24   976.762     11
  129   E  L  P  H  G  F  A  S  L     23     12
  973   L  I  F  T  S  K  K  S  L     22     13
  936   K  L  E  Y  K  Y  S  K  L     22     14
  903   K  T  I  D  F  W  L  K  V     22     15
  860   S  V  A  D  Y  H  A  I  V     22     16
  830   L  L  L  P  G  T  C  S  D     22     17
  675   A  L  A  N  T  V  T  L  A     22     18
  503   T  L  C  S  V  N  C  E  L     22     19
  169   N  T  D  E  C  T  A  T  L     22     20
  81   S  L  P  D  P  V  K  G  T     22     21
  980   S  L  F  G  K  I  K  S  F     21     22
  918   C  T  A  I  L  L  T  V  L     21     23
  867   I  V  S  S  C  V  A  G  I     21     24
  710   K  M  S  V  C  T  D  N  V     21     25
  259   V  L  V  R  N  I  A  I  T     21     26
  234   E  L  N  R  G  N  N  V  L     21     27
  175   A  T  L  M  Y  A  V  N  L     21     28
  70   V  A  V  P  H  T  P  G  L     21     29
  24   R  L  W  R  L  L  L  W  A     21     30
  914   S  A  G  T  C  T  A  I  L     20     31
  891   G  I  S  L  P  E  Q  R  V     20     32
  824   K  T  V  P  G  S  L  L  L     20     33
  765   R  L  I  G  V  T  T  D  M     20     34
  681   T  L  A  G  G  P  S  F  T     20     35
  539   Y  I  I  E  E  N  T  T  T     20     36
  264   I  A  I  T  G  V  A  Y  T     20     37
  38   V  T  Q  G  T  G  P  E  L     20     38
°含有该亚序列的分子估计解离半时间
a.2)HLA A02_01十聚体
位置  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  Rammensee计分   Parker计分°   SEQIDNO
  980  S  L  F  G  K  I  K  S  F  T   151.648     39
  866  A  I  V  S  S  C  V  A  G  I     25     40
  852  S  A  A  A  C  P  L  C  S  V     24     41
  786  H  L  E  S  L  G  I  P  D  V     24     42
  571  K  I  Y  S  I  N  V  T  N  V     24   246.353     43
  761  S  L  A  D  R  L  I  G  V  T     23     44
  626  I  L  K  A  H  Q  P  Y  G  V     23     5
  485  V  M  A  D  T  E  N  K  E  V     23   350.117     46
  29  L  L  W  A  G  T  A  F  Q  V     23   5691.997     47
  916  G  T  C  T  A  I  L  L  T  V     22     48
  778  I  T  S  P  A  E  L  F  H  L     22     49
  766  L  I  G  V  T  T  D  M  T  L     22     50
  428  T  L  P  T  N  M  E  T  T  V     22     51
  350  L  M  Y  K  W  A  K  P  K  I     22     52
  972  D  L  I  F  T  S  K  K  S  L     21     53
  692  G  L  K  Y  F  H  H  F  T  L     21     54
  644  G  T  K  N  N  K  I  H  S  L     21     55
  465  S  D  N  D  F  M  I  L  T  L     21     56
  260  L  V  R  N  I  A  I  T  G  V     21     57
  77  G  L  C  T  S  L  P  D  P  V     21     58
  949  T  L  K  D  C  D  L  P  A  A     20     59
  795  V  I  F  F  Y  R  S  N  D  V     20     60
  733  S  I  T  A  Y  V  C  Q  A  V     20     61
  712  S  V  C  T  D  N  V  T  D  L     20     62
  702  S  L  C  G  N  Q  G  R  K  M     20     63
  432  N  M  E  T  T  V  L  S  G  I     20     64
  263  N  I  A  I  T  G  V  A  Y  T     20     65
  121  G  I  R  F  D  E  W  D  E  L     20     66
°含有该亚序列的分子估计解离半时间
HLA_A0205
位置  1  2  3  4  5  6  7  8  9   Parker  计分°   SEQIDNO
 499  F  V  F  E  T  L  C  S  V  216     11
HLA A0203
 位置   1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  Rammensee计分   SEQIDNO
 846   F  H  F  L  W  E  S  A  A  A   27     67
简而言之，用佐剂配制的HLA-A2肽免疫转基因小鼠，不能诱导CD8应答的肽(定义为有效裂解肽脉冲处理的自体同源脾细胞)在人***中进一步处理。
人树突细胞(根据Romani等培养)用肽脉冲处理并用于刺激CD8-分选的T细胞(Facs)。刺激几周后，CD8细胞系首先在肽脉冲处理的自体同源BLCL(EBV-B转化细胞系)上测试。为了确证肽的准确体内加工，CD8细胞系将在cDNA转染的肿瘤细胞(HLA-A2转染的LnCaP，Skov3或CAMA肿瘤细胞)上测试。
基于全基因的途径
用基因枪转染的树突细胞、逆转录病毒转导的B7.1转染的成纤维细胞、重组痘病毒(Kim等)或腺病毒(Butterfield等)感染的树突细胞引发和刺激CD8+T细胞系。病毒感染细胞可非常有效地呈递抗原肽，因为抗原以高水平表达，但只能使用一次，以避免病毒T细胞系的过度生长。
交替刺激后，CD8+细胞系在如上所述的cDNA转染的肿瘤细胞系上测试。确定肽特异性和身份以证实免疫有效性。
参考文献
Vitiello等(L.Sherman)，实验医学杂志1991，173：1007-1015。
Romani等，实验医学杂志，1994，180：83-93。
Kim等，免疫治疗，1997，20：276-286。
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本申请书中引用的所有出版物和参考文献，包括但不限于专利和专利申请，在这里都全文引入作为参考，如同它们各自都特别地和个别地在此全文列出。序列信息SEQ ID NO：1atggctgagcctgggcacagccaccatctctccgccagagtcaggggaagaactgagaggcgcataccccggctgtggcggctgctgctctgggctgggaccgccttccaggtgacccagggaacgggaccggagcttcatgcctgcaaagagtctgagtaccactatgagtacacggcgtgtgacagcacgggttccaggtggagggtcgccgtgccgcataccccgggcctgtgcaccagcctgcctgaccccgtcaagggcaccgagtgctccttctcctgcaacgccggggagtttctggatatgaaggaccagtcatgtaagccatgcgctgagggccgctactccctcggcacaggcattcggtttgatgagtgggatgagctgccccatggctttgccagcctctcagccaacatggagctggatgacagtgctgctgagtccaccgggaactgtacttcgtccaagtgggttccccggggcgactacatcgcctccaacacggacgaatgcacagccacactgatgtacgccgtcaacctgaagcaatctggcaccgttaacttcgaatactactatccagactccagcatcatctttgagtttttcgttcagaatgaccagtgccagcccaatgcagatgactccaggtggatgaagaccacagagaaaggatgggaattccacagtgtggagctaaatcgaggcaataatgtcctctattggagaaccacagccttctcagtatggaccaaagtacccaagcctgtgctggtgagaaacattgccataacaggggtggcctacacttcagaatgcttcccctgcaaacctggcacgtatgcagacaagcagggctcctctttctgcaaactttgcccagccaactcttattcaaataaaggagaaacttcttgccaccagtgtgaccctgacaaatactcagagaaaggatcttcttcctgtaacgtgcgcccagcttgcacagacaaagattatttctacacacacacggcctgcgatgccaacggagagacacaactcatgtacaaatgggccaagccgaaaatctgtagcgaggaccttgagggggcagtgaagctgcctgcctctggtgtgaagacccactgcccaccctgcaacccaggcttcttcaaaaccaacaacagcacctgccagccctgcccatatggttcctactccaatggctcagactgtacccgctgccctgcagggactgaacctgctgtgggatttgaatacaaatggtggaacacgctgcccacaaacatggaaacgaccgttctcagtgggatcaacttcgagtacaagggcatgacaggctgggaggtggctggtgatcacatttacacagctgctggagcctcagacaatgacttcatgattctcactctggttgtgccaggatttagacctccgcagtcggtgatggcagacacagagaataaagaggtggccagaatcacatttgtctttgagaccctctgttctgtgaactgtgagctctacttcatggtgggtgtgaattctaggaccaacactcctgtggagacgtggaaaggttccaaaggcaaacagtcctatacctacatcattgaggagaacactaccacgagcttcacctgggccttccagaggaccacttttcatgaggcaagcaggaagtacaccaatgacgttgccaagatctactccatcaatgtcaccaatgttatgaatggcgtggcctcctactgccgtccctgtgccctagaagcctctgatgtgggctcctcctgcacctcttgtcctgctggttactatattgaccgagattcaggaacctgccactcctgcccccctaacacaattctgaaagcccaccagccttatggtgtccaggcctgtgtgccctgtggtccagggaccaagaacaacaagatccactctctgtgctacaatgattgcaccttctcacgcaacactccaaccaggactttcaactacaacttctccgctttggcaaacaccgtcactcttgctggagggccaagcttcacttccaaagggttgaaatacttccatcactttaccctcagtctctgtggaaaccagggtaggaaaatgtctgtgtgcaccgacaatgtcactgacctccggattcctgagggtgagtcagggttctccaaatctatcacagcctacgtctgccaggcagtcatcatccccccagaggtgacaggctacaaggccggggtttcctcacagcctgtcagccttgctgatcgacttattggggtgacaacagatatgactctggatggaatcacctccccagctgaacttttccacctggagtccttgggaataccggacgtgatcttcttttataggtccaatgatgtgacccagtcctgcagttctgggagatcaaccaccatccgcgtcaggtgcagtccacagaaaactgtccctggaagtttgctgctgccaggaacgtgctcagatgggacctgtgatggctgcaacttccacttcctgtgggagagcgcggctgcttgcccgctctgctcagtggctgactaccatgctatcgtcagcagctgtgtggctgggatccagaagactacttacgtgtggcgagaacccaagctatgctctggtggcatttctctgcctgagcagagagtcaccatctgcaaaaccatagatttctggctgaaagtgggcatctctgcaggcacctgtactgccatcctgctcaccgtcttgacctgctacttttggaaaaagaatcaaaaactagagtacaagtactccaagctggtgatgaatgctactctcaaggactgtgacctgccagcagctgacagctgcgccatcatggaaggcgaggatgtagaggacgacctcatctttaccagcaagaagtcactctttgggaagatcaaatcatttacctccaagaggactcctgatggatttgactcagtgccgctgaagacatcctcaggaggcccagacatggacctgtgaGAGGCACTGCCTGCCTCACCTGCCTCCTCACCTTGCATAGCACCTTTGCAAGCCTGCGGCGATTTGGGTGCCAGCATCCTGCAACACCCACTGCTGGAAATCTCTTCATTGTGGCCTTATCAGATGTTTGAATTTCAGATCTTTTTTTATAGAGTACCCAAACCCTCCTTTCTGCTTGCCTCAAACCTGCCAAATATACCCACACTTTGTTTGTAAAAaaaAAAAAAAAAAAAAAAAASEQ ID NO：2MAEPGHSHHLSARVRGRTERRIPRLWRLLLWAGTAFQVTQGTGPELHACKESEYHYEYTACDSTGSRWRVAVPHTPGLCTSLPDPVKGTECSFSCNAGEFLDMKDQSCKPCAEGRYSLGTGIRFDEWDELPHGFASLSANMELDDSAAESTGNCTSSKWVPRGDYIASNTDECTATLMYAVNLKQSGTVNFEYYYPDSSIIFEFFVQNDQCQPNADDSRWMKTTEKGWEFHSVELNRGNNVLYWRTTAFSVWTKVPKPVLVRNIAITGVAYTSECFPCKPGTYADKQGSSFCKLCPANSYSNKGETSCHQCDPDKYSEKGSSSCNVRPACTDKDYFYTHTACDANGETQLMYKWAKPKICSEDLEGAVKLPASGVKTHCPPCNPGFFKTNNSTCQPCPYGSYSNGSDCTRCPAGTEPAVGFEYKWWNTLPTNMETTVLSGINFEYKGMTGWEVAGDHIYTAAGASDNDFMILTLVVPGFRPPQSVMADTENKEVARITFVFETLCSVNCELYFMVGVNSRTNTPVETWKGSKGKQSYTYIIEENTTTSFTWAFQRTTFHEASRKYTNDVAKIYSINVTNVMNGVASYCRPCALEASDVGSSCTSCPAGYYIDRDSGTCHSCPPNTILKAHQPYGVQACVPCGPGTKNNKIHSLCYNDCTFSRNTPTRTFNYNFSALANTVTLAGGPSFTSKGLKYFHHFTLSLCGNQGRKMSVCTDNVTDLRIPEGESGFSKSITAYVCQAVIIPPEVTGYKAGVSSQPVSLADRLIGVTTDMTLDGITSPAELFHLESLGIPDVIFFYRSNDVTQSCSSGRSTTIRVRCSPQKTVPGSLLLPGTCSDGTCDGCNFHFLWESAAACPLCSVADYHAIVSSCVAGIQKTTYVWREPKLCSGGISLPEQRVTICKTIDFWLKVGISAGTCTAILLTVLTCYFWKKNQKLEYKYSKLVMNATLKDCDLPAADSCAIMEGEDVEDDLIFTSKKSLFGKIKSFTSKRTPDGFDSVPLKTSSGGPDMDLSEQ ID NO：3TTTTTTAATTTACAAACAAAGTGTGGGTATATTTGGCAGGTTTGAGGCAAGCAGAAAGGAGGGTTTGGGTACTCTATAAAAAAAGATCTGAAATTCAAACATCTGATAAGGCCACAATGAAGAGATTTCCAGCAGTGGGTGTTGCAGGATGCTGGCACCCAAATCGCCGCACGTTGCAAAGGTGCTATGCAAGGTGAGGAGGCAGGTGAGGCAGGCAGTGCCTCTCACAGGTCCATGTCTGGGCCTCCTGAGGATGTCTTCAGCGGCACTGAGTCAAATCCATCAGGAGTCCTCTTGGAGGTAAATGATTTGATCTTCCCAAAGAGTGACTTCTTGCTGGTAAAGATGAGGTCGTCCTCTACATCCTCGCCTTCCATGATGGCGCAGTGTCAGCTGCTGGCAGGTCACAGTCCTTGAGAGTAGCATTCATCACCAGCTTGGAGTACTTGTACTCTAGTTTTTGATTCTTTTTCCAAAAGTAGCAGGTCAAGACGGTGAGCAGGATGGCAGTACAGGTGCCTGCAGAGATGCCCACTTTCAGCCAGAAATCTATGGTTTTGCAGATGGTGACTCTCTGCTCAGGCAGAGAAATGCCACCAGAGCATAGCTTGGGTTCTCGCCACACGTAAGTAGTCTTCTGGATCCCAGCCACACAGCTGCTGACGATAGCATGGTAGSEQ ID NO：4YHAIVSSCVAGIQKTTYVWREPKLCSGGISLPEQRVTICKTIDFWLKVGISAGTCTAILLTVLTCYFWKKNQKLEYKYSKLVMNATLKDCDLPAADTAPSWKARM
                  序列表
 <110>Smithkline Beecham Biologicals S.A.
 <120>新化合物
 <130>BC45226
 <160>68
 <170>FastSEQ for Windows Version 3.0
 <210>1
 <211>3280
 <212>DNA
 <213>人
 <400> 1atggctgagc ctgggcacag ccaccatctc tccgccagag tcaggggaag aactgagagg     60cgcatacccc ggctgtggcg gctgctgctc tgggctggga ccgccttcca ggtgacccag    120ggaacgggac cggagcttca tgcctgcaaa gagtctgagt accactatga gtacacggcg    180tgtgacagca cgggttccag gtggagggtc gccgtgccgc ataccccggg cctgtgcacc    240agcctgcctg accccgtcaa gggcaccgag tgctccttct cctgcaacgc cggggagttt    300ctggatatga aggaccagtc atgtaagcca tgcgctgagg gccgctactc cctcggcaca    360ggcattcggt ttgatgagtg ggatgagctg ccccatggct ttgccagcct ctcagccaac    420atggagctgg atgacagtgc tgctgagtcc accgggaact gtacttcgtc caagtgggtt    480ccccggggcg actacatcgc ctccaacacg gacgaatgca cagccacact gatgtacgcc    540gtcaacctga agcaatctgg caccgttaac ttcgaatact actatccaga ctccagcatc    600atctttgagt ttttcgttca gaatgaccag tgccagccca atgcagatga ctccaggtgg    660atgaagacca cagagaaagg atgggaattc cacagtgtgg agctaaatcg aggcaataat    720gtcctctatt ggagaaccac agccttctca gtatggacca aagtacccaa gcctgtgctg    780gtgagaaaca ttgccataac aggggtggcc tacacttcag aatgcttccc ctgcaaacct    840ggcacgtatg cagacaagca gggctcctct ttctgcaaac tttgcccagc caactcttat    900tcaaataaag gagaaacttc ttgccaccag tgtgaccctg acaaatactc agagaaagga    960tcttcttcct gtaacgtgcg cccagcttgc acagacaaag attatttcta cacacacacg    1020gcctgcgatg ccaacggaga gacacaactc atgtacaaat gggccaagcc gaaaatctgt    1080agcgaggacc ttgagggggc agtgaagctg cctgcctctg gtgtgaagac ccactgccca    1140ccctgcaacc caggcttctt caaaaccaac aacagcacct gccagccctg cccatatggt    1200tcctactcca atggctcaga ctgtacccgc tgccctgcag ggactgaacc tgctgtggga    1260tttgaataca aatggtggaa cacgctgccc acaaacatgg aaacgaccgt tctcagtggg    1320atcaacttcg agtacaaggg catgacaggc tgggaggtgg ctggtgatca catttacaca    1380gctgctggag cctcagacaa tgacttcatg attctcactc tggttgtgcc aggatttaga    1440cctccgcagt cggtgatggc agacacagag aataaagagg tggccagaat cacatttgtc    1500tttgagaccc tctgttctgt gaactgtgag ctctacttca tggtgggtgt gaattctagg    1560accaacactc ctgtggagac gtggaaaggt tccaaaggca aacagtccta tacctacatc    1620attgaggaga acactaccac gagcttcacc tgggccttcc agaggaccac ttttcatgag    1680gcaagcagga agtacaccaa tgacgttgcc aagatctact ccatcaatgt caccaatgtt    1740atgaatggcg tggcctccta ctgccgtccc tgtgccctag aagcctctga tgtgggctcc    1800tcctgcacct cttgtcctgc tggttactat attgaccgag attcaggaac ctgccactcc    1860tgccccccta acacaattct gaaagcccac cagccttatg gtgtccaggc ctgtgtgccc    1920tgtggtccag ggaccaagaa caacaagatc cactctctgt gctacaatga ttgcaccttc    1980tcacgcaaca ctccaaccag gactttcaac tacaacttct ccgctttggc aaacaccgtc    2040actcttgctg gagggccaag cttcacttcc aaagggttga aatacttcca tcactttacc    2100ctcagtctct gtggaaacca gggtaggaaa atgtctgtgt gcaccgacaa tgtcactgac    2160ctccggattc ctgagggtga gtcagggttc tccaaatcta tcacagccta cgtctgccag    2220gcagtcatca tccccccaga ggtgacaggc tacaaggccg gggtttcctc acagcctgtc    2280agccttgctg atcgacttat tggggtgaca acagatatga ctctggatgg aatcacctcc    2340ccagctgaac ttttccacct ggagtccttg ggaataccgg acgtgatctt cttttatagg    2400tccaatgatg tgacccagtc ctgcagttct gggagatcaa ccaccatccg cgtcaggtgc    2460agtccacaga aaactgtccc tggaagtttg ctgctgccag gaacgtgctc agatgggacc    2520tgtgatggct gcaacttcca cttcctgtgg gagagcgcgg ctgcttgccc gctctgctca    2580gtggctgact accatgctat cgtcagcagc tgtgtggctg ggatccagaa gactacttac    2640gtgtggcgag aacccaagct atgctctggt ggcatttctc tgcctgagca gagagtcacc    2700atctgcaaaa ccatagattt ctggctgaaa gtgggcatct ctgcaggcac ctgtactgcc    2760atcctgctca ccgtcttgac ctgctacttt tggaaaaaga atcaaaaact agagtacaag   2820tactccaagc tggtgatgaa tgctactctc aaggactgtg acctgccagc agctgacagc   2880tgcgccatca tggaaggcga ggatgtagag gacgacctca tctttaccag caagaagtca   2940ctctttggga agatcaaatc atttacctcc aagaggactc ctgatggatt tgactcagtg   3000ccgctgaaga catcctcagg aggcccagac atggacctgt gagaggcact gcctgcctca   3060cctgcctcct caccttgcat agcacctttg caagcctgcg gcgatttggg tgccagcatc   3120ctgcaacacc cactgctgga aatctcttca ttgtggcctt atcagatgtt tgaatttcag   3180atcttttttt atagagtacc caaaccctcc tttctgcttg cctcaaacct gccaaatata   3240cccacacttt gtttgtaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa                         3280
<210>2
<211>1013
<212>PRT
<213>人
<400> 2Met Ala Glu Pro Gly His Ser His His Leu Ser Ala Arg Val Arg Gly1                5                  10                  15Arg Thr Glu Arg Arg Ile Pro Arg Leu Trp Arg Leu Leu Leu Trp Ala
        20                  25                  30Gly Thr Ala Phe Gln Val Thr Gln Gly Thr Gly Pro Glu Leu His Ala
    35                  40                  45Cys Lys Glu Ser Glu Tyr His Tyr Glu Tyr Thr Ala Cys Asp Ser Thr
50                  55                  60Gly Ser Arg Trp Arg Val Ala Val Pro His Thr Pro Gly Leu Cys Thr65                  70                  75                  80Ser Leu Pro Asp Pro Val Lys Gly Thr Glu Cys Ser Phe Ser Cys Asn
            85                  90                  95Ala Gly Glu Phe Leu Asp Met Lys Asp Gln Ser Cys Lys Pro Cys Ala
        100                 105                 110Glu Gly Arg Tyr Ser Leu Gly Thr Gly Ile Arg Phe Asp Glu Trp Asp
    115                 120                 125Glu Leu Pro His Gly Phe Ala Ser Leu Ser Ala Asn Met Glu Leu Asp
130                 135                 140Asp Ser Ala Ala Glu Ser Thr Gly Asn Cys Thr Ser Ser Lys Trp Val145                 150                 155                 160Pro Arg Gly Asp Tyr Ile Ala Ser Asn Thr Asp Glu Cys Thr Ala Thr
            165                 170                 175Leu Met Tyr Ala Val Asn Leu Lys Gln Ser Gly Thr Val Asn Phe Glu
        180                 185                 190Tyr Tyr Tyr Pro Asp Ser Ser Ile Ile Phe Glu Phe Phe Val Gln Asn
    195                 200                 205Asp Gln Cys Gln Pro Asn Ala Asp Asp Ser Arg Trp Met Lys Thr Thr
210                 215                 220Glu Lys Gly Trp Glu Phe His Ser Val Glu Leu Asn Arg Gly Asn Asn225                 230                 235                 240Val Leu Tyr Trp Arg Thr Thr Ala Phe Ser Val Trp Thr Lys Val Pro
            245                 250                 255Lys Pro Val Leu Val Arg Asn Ile Ala Ile Thr Gly Val Ala Tyr Thr
        260                 265                 270Ser Glu Cys Phe Pro Cys Lys Pro Gly Thr Tyr Ala Asp Lys Gln Gly
    275                 280                 285Ser Ser Phe Cys Lys Leu Cys Pro Ala Asn Ser Tyr Ser Asn Lys Gly
290                 295                 300Glu Thr Ser Cys His Gln Cys Asp Pro Asp Lys Tyr Ser Glu Lys Gly305                 310                 315                 320Ser Ser Ser Cys Asn Val Arg Pro Ala Cys Thr Asp Lys Asp Tyr Phe
            325                 330                 335Tyr Thr His Thr Ala Cys Asp Ala Asn Gly Glu Thr Gln Leu Met Tyr
        340                 345                 350Lys Trp Ala Lys Pro Lys Ile Cys Ser Glu Asp Leu Glu Gly Ala Val
    355                 360                 365Lys Leu Pro Ala Ser Gly Val Lys Thr His Cys Pro Pro Cys Asn Pro
370                 375                 380Gly Phe Phe Lys Thr Asn Asn Ser Thr Cys Gln Pro Cys Pro Tyr Gly385                 390                 395                 400Ser Tyr Ser Asn Gly Ser Asp Cys Thr Arg Cys Pro Ala Gly Thr Glu
            405                 410                 415Pro Ala Val Gly Phe Glu Tyr Lys Trp Trp Asn Thr Leu Pro Thr Asn
        420                 425                 430Met Glu Thr Thr Val Leu Ser Gly Ile Asn Phe Glu Tyr Lys Gly Met
    435                 440                 445Thr Gly Trp Glu Val Ala Gly Asp His Ile Tyr Thr Ala Ala Gly Ala
450                 455                 460Ser Asp Asn Asp Phe Met Ile Leu Thr Leu Val Val Pro Gly Phe Arg465                 470                 475                 480Pro Pro Gln Ser Val Met Ala Asp Thr Glu Asn Lys Glu Val Ala Arg
            485                 490                 495Ile Thr Phe Val Phe Glu Thr Leu Cys Ser Val Asn Cys Glu Leu Tyr
        500                 505                 510Phe Met Val Gly Val Asn Ser Arg Thr Asn Thr Pro Val Glu Thr Trp
    515                 520                 525Lys Gly Ser Lys Gly Lys Gln Ser Tyr Thr Tyr Ile Ile Glu Glu Asn
530                 535                 540Thr Thr Thr Ser Phe Thr Trp Ala Phe Gln Arg Thr Thr Phe His Glu545                 550                 555                 560Ala Ser Arg Lys Tyr Thr Asn Asp Val Ala Lys Ile Tyr Ser Ile Asn
            565                 570                 575Val Thr Asn Val Met Asn Gly Val Ala Ser Tyr Cys Arg Pro Cys Ala
        580                 585                 590Leu Glu Ala Ser Asp Val Gly Ser Ser Cys Thr Ser Cys Pro Ala Gly
    595                 600                 605Tyr Tyr Ile Asp Arg Asp Ser Gly Thr Cys His Ser Cys Pro Pro Asn
610                 615                 620Thr Ile Leu Lys Ala His Gln Pro Tyr Gly Val Gln Ala Cys Val Pro625                 630                 635                 640Cys Gly Pro Gly Thr Lys Asn Asn Lys Ile His Ser Leu Cys Tyr Asn
            645                 650                 655Asp Cys Thr Phe Ser Arg Asn Thr Pro Thr Arg Thr Phe Asn Tyr Asn
        660                 665                 670Phe Ser Ala Leu Ala Asn Thr Val Thr Leu Ala Gly Gly Pro Ser Phe
    675                 680                 685Thr Ser Lys Gly Leu Lys Tyr Phe His His Phe Thr Leu Ser Leu Cys
690                 695                 700Gly Asn Gln Gly Arg Lys Met Ser Val Cys Thr Asp Asn Val Thr Asp705                 710                 715                 720Leu Arg Ile Pro Glu Gly Glu Ser Gly Phe Ser Lys Ser Ile Thr Ala
            725                 730                 735Tyr Val Cys Gln Ala Val Ile Ile Pro Pro Glu Val Thr Gly Tyr Lys
        740                 745                 750Ala Gly Val Ser Ser Gln Pro Val Ser Leu Ala Asp Arg Leu Ile Gly
    755                 760                 765Val Thr Thr Asp Met Thr Leu Asp Gly Ile Thr Ser Pro Ala Glu Leu
770                 775                 780Phe His Leu Glu Ser Leu Gly Ile Pro Asp Val Ile Phe Phe Tyr Arg785                 790                 795                 800Ser Asn Asp Val Thr Gln Ser Cys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Thr Ile
            805                 810                 815Arg Val Arg Cys Ser Pro Gln Lys Thr Val Pro Gly Ser Leu Leu Leu
        820                 825                 830Pro Gly Thr Cys Ser Asp Gly Thr Cys Asp Gly Cys Asn Phe His Phe
    835                 840                 845Leu Trp Glu Ser Ala Ala Ala Cys Pro Leu Cys Ser Val Ala Asp Tyr
850                 855                 860His Ala Ile Val Ser Ser Cys Val Ala Gly Ile Gln Lys Thr Thr Tyr865                 870                 875                 880Val Trp Arg Glu Pro Lys Leu Cys Ser Gly Gly Ile Ser Leu Pro Glu
            885                 890                 895Gln Arg Val Thr Ile Cys Lys Thr Ile Asp Phe Trp Leu Lys Val Gly
        900                 905                 910Ile Ser Ala Gly Thr Cys Thr Ala Ile Leu Leu Thr Val Leu Thr Cys
    915                 920                 925Tyr Phe Trp Lys Lys Asn Gln Lys Leu Glu Tyr Lys Tyr Ser Lys Leu
930                 935                 940Val Met Asn Ala Thr Leu Lys Asp Cys Asp Leu Pro Ala Ala Asp Ser945                 950                 955                 960Cys Ala Ile Met Glu Gly Glu Asp Val Glu Asp Asp Leu Ile Phe Thr
            965                 970                 975Ser Lys Lys Ser Leu Phe Gly Lys Ile Lys  Ser Phe Thr Ser Lys Arg
        980                 985                  990Thr Pro Asp Gly Phe Asp Ser Val Pro Leu Lys Thr Ser Ser Gly Gly
    995                 1000                1005Pro Asp Met Asp Leu
1010
<210>3
<211>677
<212>DNA
<213>人
<400> 3ttttttaatt tacaaacaaa gtgtgggtat atttggcagg tttgaggcaa gcagaaagga    60gggtttgggt actctataaa aaaagatctg aaattcaaac atctgataag gccacaatga   120agagatttcc agcagtgggt gttgcaggat gctggcaccc aaatcgccgc acgttgcaaa   180ggtgctatgc aaggtgagga ggcaggtgag gcaggcagtg cctctcacag gtccatgtct   240gggcctcctg aggatgtctt cagcggcact gagtcaaatc catcaggagt cctcttggag   300gtaaatgatt tgatcttccc aaagagtgac ttcttgctgg taaagatgag gtcgtcctct   360acatcctcgc cttccatgat ggcgcagtgt cagctgctgg caggtcacag tccttgagag   420tagcattcat caccagcttg gagtacttgt actctagttt ttgattcttt ttccaaaagt   480agcaggtcaa gacggtgagc aggatggcag tacaggtgcc tgcagagatg cccactttca   540gccagaaatc tatggttttg cagatggtga ctctctgctc aggcagagaa atgccaccag   600agcatagctt gggttctcgc cacacgtaag tagtcttctg gatcccagcc acacagctgc   660tgacgatagc atggtag                                                  677
<210>4
<211>105
<212>PRT
<213>人
<400>4Tyr His Ala Ile Val Ser Ser Cys Val Ala Gly Ile Gln Lys Thr Thr1                5                  10                  15Tyr Val Trp Arg Glu Pro Lys Leu Cys Ser Gly Gly Ile Ser Leu Pro
        20                  25                  30Glu Gln Arg Val Thr Ile Cys Lys Thr Ile Asp Phe Trp Leu Lys Val
    35                  40                  45Gly Ile Ser Ala Gly Thr Cys Thr Ala Ile Leu Leu Thr Val Leu Thr
50                  55                  60Cys Tyr Phe Trp Lys Lys Asn Gln Lys Leu Glu Tyr Lys Tyr Ser Lys65                  70                  75                  80Leu Val Met Asn Ala Thr Leu Lys Asp Cys Asp Leu Pro Ala Ala Asp
            85                  90                  95Thr Ala Pro Ser Trp Lys Ala Arg Met
        100                 105
<210>5
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>5Arg Leu Trp Arg Leu Leu Leu Trp Ala1               5
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>6Ser Leu Ala Asp Arg Leu Ile Gly Val1               5
<210>7
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>7Ser Leu Pro Glu Gln Arg Val Thr Ile1               5
<210>8
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>8Lys Leu Cys Ser Gly Gly Ile Ser Leu1               5
<210>9
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>9Ala Ala Ala Cys Pro Leu Cys Ser Val1               5
<210>10
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>10Ser Ala Leu Ala Asn Thr Val Thr Leu1               5
<210>11
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>11Phe Val Phe Glu Thr Leu Cys Ser Val1               5
<210>12
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>12Glu Leu Pro His Gly Phe Ala Ser Leu1               5
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<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>13Leu Ile Phe Thr Ser Lys Lys Ser Leu1               5
<210>14
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>14Lys Leu Glu Tyr Lys Tyr Ser Lys Leu1               5
<210>15
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>15Lys Thr Ile Asp Phe Trp Leu Lys Val1               5
<210>16
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>16Ser Val Ala Asp Tyr His Ala Ile Val1               5
<210>17
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
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<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
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<210>19
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>19Thr Leu Cys Ser Val Asn Cys Glu Leu1               5
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<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
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<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
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<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>22Ser Leu Phe Gly Lys Ile Lys Ser Phe1               5
<210>23
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>23Cys Thr Ala Ile Leu Leu Thr Val Leu1               5
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<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
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<210>25
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>25Lys Met Ser Val Cys Thr Asp Asn Val1               5
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<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
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<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
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<210>28
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>28Ala Thr Leu Met Tyr Ala Val Asn Leu1               5
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<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
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<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
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<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
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<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
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<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>33Lys Thr Val Pro Gly Ser Leu Leu Leu1               5
<210>34
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>34Arg Leu Ile Gly Val Thr Thr Asp Met1               5
<210>35
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
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<210>36
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>36Tyr Ile Ile Glu Glu Asn Thr Thr Thr1               5
<210>37
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
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<210>38
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>38Val Thr Gln Gly Thr Gly Pro Glu Leu1               5
<210>39
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>39Ser Leu Phe Gly Lys Ile Lys Ser Phe Thr1               5                  10
<210>40
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>40Ala Ile Val Ser Ser Cys Val Ala Gly Ile1               5                  10
<210>41
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>41Ser Ala Ala Ala Cys Pro Leu Cys Ser Val1               5                  10
<210>42
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>42His Leu Glu Ser Leu Gly Ile Pro Asp Val1               5                  10
<210>43
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>43Lys Ile Tyr Ser Ile Asn Val Thr Asn Val1               5                  10
<210>44
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>44Ser Leu Ala Asp Arg Leu Ile Gly Val Thr1               5                  10
<210>45
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>45Ile Leu Lys Ala His Gln Pro Tyr Gly Val1               5                  10
<210>46
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>46Val Met Ala Asp Thr Glu Asn Lys Glu Val1               5                  10
<210>47
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>47Leu Leu Trp Ala Gly Thr Ala Phe Gln Val1               5                  10
<210>48
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>48Gly Thr Cys Thr Ala Ile Leu Leu Thr Val1               5                  10
<210>49
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>49Ile Thr Ser Pro Ala Glu Leu Phe His Leu 1               5                  10
<210>50
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>50Leu Ile Gly Val Thr Thr Asp Met Thr Leu1               5                  10
<210>51
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>51Thr Leu Pro Thr Asn Met Glu Thr Thr Val1               5                  10
<210>52
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>52Leu Met Tyr Lys Trp Ala Lys Pro Lys Ile1               5                  10
<210>53
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>53Asp Leu Ile Phe Thr Ser Lys Lys Ser Leu1               5                  10
<210>54
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>54Gly Leu Lys Tyr Phe His His Phe Thr Leu1               5                  10
<210>55
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>55Gly Thr Lys Asn Asn Lys Ile His Ser Leu1               5                  10
<210>56
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>56Ser Asp Asn Asp Phe Met Ile Leu Thr Leu1               5                  10
<210>57
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>57Leu Val Arg Asn Ile Ala Ile Thr Gly Val1               5                  10
<210>58
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>58Gly Leu Cys Thr Ser Leu Pro Asp Pro Val1               5                  10
<210>59
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>59Thr Leu Lys Asp Cys Asp Leu Pro Ala Ala1               5                  10
<210>60
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>60Val Ile Phe Phe Tyr Arg Ser Asn Asp Val1               5                  10
<210>61
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>61Ser Ile Thr Ala Tyr Val Cys Gln Ala Val1               5                  10
<210>62
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>62Ser Val Cys Thr Asp Asn Val Thr Asp Leu1               5                  10
<210>63
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>63Ser Leu Cys Gly Asn Gln Gly Arg Lys Met1               5                  10
<210>64
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>64Asn Met Glu Thr Thr Val Leu Ser Gly Ile1               5                  10
<210>65
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>65Asn Ile Ala Ile Thr Gly Val Ala Tyr Thr1               5                  10
<210>66
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>66Gly Ile Arg Phe Asp Glu Trp Asp Glu Leu1               5                  10
<210>67
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>67Phe His Phe Leu Trp Glu Ser Ala Ala Ala1               5                  10
<210>68
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>68Phe Leu Trp Glu Ser Ala Ala Ala Cys1               5

Claims (37)

1.含有如下氨基酸序列的分离多肽，该氨基酸序列与SEQ IDNO：2的氨基酸序列的全长序列具有至少70％的同一性。
2.权利要求1的分离多肽，其中氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少95％的同一性。
3.权利要求1的分离多肽，含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
4.SEQ ID NO：2的分离多肽。
5.含有权利要求1-4任一项的多肽的免疫原性片段的多肽，其中所述免疫原性片段的免疫原活性基本上与SEQ ID NO：2的多肽相同。
6.权利要求1-5任一项的多肽，其中所述多肽是更大融合蛋白的一部分。
7.权利要求1-6任一项的多肽，与载体蛋白化学辍合。
8.编码权利要求1-6任一项的多肽的分离多核苷酸。
9.含有编码与SEQ ID NO：2的氨基酸序列的全长序列具有至少70％同一性的多肽的核苷酸序列的分离多核苷酸或与该分离多核苷酸互补的核苷酸序列。
10.含有与编码SEQ ID NO：2的多肽的核苷酸序列的全部编码区具有至少70％同一性的核苷酸序列的分离多核苷酸或与该分离多核苷酸互补的核苷酸序列。
11.含有与SEQ ID NO：1的核苷酸序列的全长序列具有至少70％同一性的多肽的核苷酸序列的分离多核苷酸或与该分离多核苷酸互补的核苷酸序列。
12.权利要求8-11任一项限定的分离多核苷酸，其中同一性为至少95％。
13.一种分离的多核苷酸，选自：
(a)含有编码SEQ ID NO：2的多肽的核苷酸序列的多核苷酸；
(b)SEQ ID NO：1的多核苷酸；和
(c)通过在严紧杂交条件下用标记探针筛选合适的文库获得的多核苷酸，所述探针具有SEQ ID NO：1的序列或其片段，所述多核苷酸编码一种与SEQ ID NO：2的蛋白具有相似免疫原特性的蛋白，
或者是与所述多核苷酸互补的核苷酸序列。
14.含有权利要求8-13任一项的分离多核苷酸的表达载体或重组活微生物。
15.含有权利要求14的表达载体或权利要求8-13任一项的分离多核苷酸的宿主细胞。
16.生产权利要求1-7的多肽的方法，包括在足以产生所述多肽的条件下培养权利要求15的宿主细胞并由培养基中回收该多肽。
17.含有有效量的权利要求1-7任一项的多肽和可药用载体的疫苗。
18.含有有效量的权利要求8-13任一项的多核苷酸和可药用载体的疫苗。
19.含有有效量的抗原呈递细胞和可药用载体的疫苗，所述细胞通过体外负载权利要求1-7任一项的多肽而被修饰或在体外被遗传修饰以表达权利要求1-7的多肽。
20.权利要求17-19任一项的疫苗，还包括TH-1诱导佐剂。
21.权利要求20的疫苗，其中TH-1诱导佐剂选自：3D-MPL、QS21、QS21和胆固醇的混合物以及CpG寡核苷酸。
22.对权利要求1-5任一项的多肽或免疫片段免疫特异性的抗体。
23.鉴定刺激或抑制权利要求1-5任一项的多肽功能的化合物的筛选方法，包括选自以下的方法：
(a)通过直接或间接与候选化合物结合的标记，测定候选化合物与所述多肽(或负载该多肽的细胞或膜)或其融合蛋白的结合；
(b)在标记竞争物存在时，测定候选化合物与所述多肽(或负载该多肽的细胞或膜)或其融合蛋白的结合；
(c)使用对负载该多肽的细胞或细胞膜合适的检测***，测定候选化合物是否导致该多肽激活或抑制产生的信号；
(d)将候选化合物与含有权利要求1-7任一项的多肽的溶液混合形成混合物，测定混合物中的多肽活性，比较混合物与标准品的活性；或
(e)使用如ELISA实验测定候选化合物对细胞中编码所述多肽的mRNA和所述多肽的产生的影响。
24.通过免疫预防或治疗治疗受试者的方法，包括将权利要求1-7任一项的多肽或权利要求8-13任一项的多核苷酸与哺乳动物免疫***的细胞体外温育，体外诱导针对权利要求1-5任一项的分子的免疫应答，然后将这些活化的免疫细胞再输入哺乳动物中以治疗疾病。
25.权利要求24的方法，其中治疗是针对卵巢癌或结肠癌。
26.权利要求1-5的多肽的激动剂或拮抗剂。
27.一种化合物，其为：
(a)权利要求1-5的多肽的激动剂或拮抗剂；
(b)权利要求8-13的分离多核苷酸；或
(c)调节编码权利要求1-5任一项的多肽的核苷酸序列表达的核酸分子；
其用于治疗。
28.诊断受试者中与权利要求1-5任一项的多肽活性或表达有关的疾病或对疾病的易感性的方法，包括分析来自该受试者的样品中所述多肽的存在或其量。
29.诊断受试者中与权利要求8-13任一项的多核苷酸活性或表达有关的疾病或对疾病的易感性的方法，包括分析来自该受试者的样品中所述多核苷酸的存在或其量。
30.诊断受试者中与权利要求1-5任一项的多肽活性或表达有关的结肠癌或对结肠癌的易感性的方法，包括分析来自该受试者的样品中所述多肽的存在或其量。
31.诊断受试者中与权利要求8-13任一项的多核苷酸活性或表达有关的疾病或对疾病的易感性的方法，包括分析来自该受试者的样品中所述多核苷酸的存在或其量。
32.一种分离的多核苷酸，选自：
(a)含有与SEQ ID NO：3的全长序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的分离多核苷酸；
(b)含有SEQ ID NO：3的多核苷酸的分离多核苷酸；
(c)SEQ ID NO：3的多核苷酸。
33.含有权利要求14的表达载体或重组活微生物的活疫苗组合物。
34.权利要求8-13任一项的多核苷酸在制备治疗癌症的药物中的用途。
35.权利要求8-13任一项的多核苷酸在制备治疗结肠癌的药物中的用途。
36.权利要求1-7任一项的多肽在制备治疗癌症的药物中的用途。
37.权利要求1-7任一项的多肽在制备治疗结肠癌的药物中的用途。
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