CN1346290A - 运送大分子进入细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明目标是提供一种将大分子运送至生物细胞,例如病人表皮(20)中的朗格汉斯细胞(22)中的方法,其步骤包括以待运送的固相大分子,如DNA、和/或RNA疫苗或基于蛋白质的疫苗,包覆电极组(12)中的电极(16),将含有已包覆的电极(16)的电极组(12)与电极组支架(13)连接,提供一个定形信号发生器(15),在电极(16)和定形信号发生器(15)之间建立导电通路,通过例如将针状电极(16)刺入表皮基板层上部的表皮(20)中而将电极(16)定位以使生物细胞位于其间,产生从定形信号发生器(15)到电极(16)的脉冲波,从而使电极(16)上的大分子脱离电极(16),被运送至生物细胞,如朗格汉斯细胞(22)中。

Description

运送大分子进入细胞
相关应用的交叉参考
本发明要求基于1999年1月28日提交的共同未决的美国临时申请60/117,755的优先权。
                           技术领域
本发明主要涉及用于运送大分子进入细胞的方法和装置。更具体地，本发明提供的方法和装置用于在感觉减弱(痛苦减轻)的情况下运送物质，例如大分子，如多核苷酸疫苗(DNA疫苗和/或RNA疫苗)和基于蛋白的疫苗，进入表皮组织中的所选细胞。
                           背景技术
在现有技术中，第一个DNA接种方法称为裸露DNA接种，这是因为其将DNA的液体溶液注射进小鼠的肌肉，没有添加剂来增强转染。此方法确实转染了少数细胞并且确实诱发小鼠中对所表达抗原的免疫应答。但是在人类和灵长类中，此方法效果不佳。
现有技术中，通过利用生物弹射(biolistic)方法运送DNA获得了对DNA疫苗效力的改进。生物弹射方法是以DNA包覆金属微粒，再将这些微粒加速到选定的速度后射入皮肤中。此方法效果要比裸露DNA法好得多。部分原因是DNA包覆的微粒被注射入皮肤达一定深度，可以提高转染朗格汉斯细胞的机会。但是，生物弹射方法有一些不足之处。首先，它造成皮肤的损伤有可能在一些个体上留下疤痕。其次，虽然有效性得到提高，但还嫌不够。再次，这些发射的颗粒在治疗后留在了患者体内。因此，希望有这样的方法，它可以运送DNA到生物细胞而不会造成可以留下疤痕的皮肤损伤。同样，希望有这样的方法，它可以运送DNA到生物细胞而不会在所治疗的细胞中留下所发射颗粒的残留物。有兴趣的话，可参看公开了生物弹射方法的美国专利5,036,006和5,478,744。
现有技术中公开了几种运送大分子到生物细胞的其它方法，以下美国专利和其他出版物。
Weaver等的美国专利5,019,034公开了对组织进行电穿孔的方法，其中将电极置于组织表面，例如患者的皮肤表面。将用于处理皮肤的分子置于皮肤表面上方的容器中，用于处理的分子必须以经皮的方式穿入皮肤。即用于处理的分子要从皮肤外侧穿到皮肤内。不仅皮肤的表层相对不易渗透，而且如果要处理的皮肤层接近表皮基板层，处理分子必须穿过相当的皮肤组织才能到达待处理细胞。此类处理方法不足以处理接近基板层的细胞。相较于采用置于皮肤表面，使处理分子穿过皮肤以处理接近表皮基板层的生物细胞的电极，更希望提供一种电穿孔方法用于运送分子到接近基板层的表皮中的生物细胞，而不必使处理用分子以经皮的方式穿过皮肤。
Hofmann的美国专利5,273,525公开了一种用于使药物和遗传物质通过电穿孔方式进入组织的装置，它借助一个中空的皮下针头将药物和遗传物质置于要进行电穿孔的组织附近。只要在组织上使用中空的皮下针头，此组织就要被中空的皮下针头切出环形切口。于是，患者在接受皮下注射时，有较大的痛苦。为避免这类环形切口以及由此带来的较大的痛苦，希望有一种不借助皮下针头而运送分子到生物细胞的方法。
Hoffmann的美国专利5,318,514公开了一个可将药物和基因借助电穿孔至细胞内的注药机。该注药机包括许多可刺入患者皮肤的针状电极。要通过电穿孔进入皮肤的物质被置于一个盛液体的容器中，所述液体将一个开放小室泡沫橡胶基座湿润，由于要进行电穿孔的物质保留在所述容器中和开放小室泡沫橡胶的液体里，所以很难仔细控制电极表面该物质的量。很难控制有多少流体从所述容器和开放小室泡沫橡胶向下流到针状电极的表面，因此，在对患者进行电穿孔处理时就难于控制在电极16表面处理分子的实际量。而且流体介质对要进行电穿孔的组织有冲刷或冲洗作用，其使电穿孔过程受到干扰。考虑到这些方面，希望有这样一种用于运送分子到生物细胞的电穿孔方法，它对患者实施电穿孔过程中不采用流向电极的液体介质。
涉及借助电穿孔引导运送基因进入表皮细胞的其它公开内容在以下文件中可以找到：Relss等，“利用电穿孔将基因通过DNA介导而转移入表皮细胞”，生物化学与生物物理学研究通讯，卷137，1期，(1986)，244-249页；Titomirov，“利用质粒DNA进行的新生鼠皮肤细胞体内电穿孔和稳定转染”，在Biochim.Biophys.Acta.，卷1088.1期.(1991).131-134页。
Weaver的美国专利No.5,389,069公开了一种对组织实施体内电穿孔的方法和装置，它利用一个中空圆柱形针使要处理的物质深入组织。如上述，希望能不使用中空的圆柱形针以避免因此造成的疼痛。
Felgner等的美国专利No.5,580,859和5,589,466公开了一种通过注射方式运送大分子进入患者肌肉和皮肤的方法。他们的方法没有采用电穿孔。
Eriksson的美国专利5,697,901公开了利用含有基因的流体介质运送基因进入组织，此流体介质与中空微针一起被加压。采用流体时的控制和冲洗问题在上文已经讨论过。在Eriksson专利中没有采用电穿孔步骤。有意思的是，Eriksson在两方面涉及了疼痛的问题。有一种说法是中空微针***能用于治疗疼痛。有一种说法认为冷却可以缓解伤口的疼痛。在此本发明人要强调的是Eriksson并没有就他的治疗方法本身作为一种消除或减轻疼痛的方法而进行讨论。本发明人推论，Eriksson应用的加压流体注射方法并不是会导致无痛或减轻疼痛的治疗方法。因此原因，希望提供一种利用显微级针，但并不采用加压流体注射步骤来将流体注射入患者体内的基因治疗方法。
Henry等，“显微构造的显微针：经皮药物运送的新方法”，药学科学杂志(Journal of Pharmaceutical Sciences)，卷87，8期，1998年8月，922-925页中公开了利用显微针穿刺表皮而留下显微孔径的孔，以利于促进流体所含的治疗剂进入带微孔的表皮的经皮通透性。由于所述显微针只***表皮一段极小的距离，应用显微针很可能是无痛的。未公开将显微针用作电极。同样，在Henry等的文章中没有公开电穿孔步骤。
关于减少疼痛的处理，还需指出在电穿孔中的两个重要电参数与体内的穿刺痛感密切相关。一个参数是体内组织经受的绝对电压。另一个是体内组织经受的脉冲宽度。就这些方面而言，希望有运送分子到生物细胞的电穿孔方法，它对经受电穿孔的细胞采用相对较低的绝对电压，而且必要时可对经受电穿孔的细胞采用相对较短脉冲宽度的脉冲。
在运送大分子进入表皮细胞的方法和装置中还有几个希望具有的特点。例如，当电极刺入表皮时，导电性基部电极部分和导电性电极尖部部分会表现出电学特性，就整个电穿孔过程和具体待处理的生物细胞而言，这些特性是不希望具有的。由此，希望有用于运送大分子到表皮细胞但使电极的基部和尖部不导电的方法和装置。
一旦具有多个针状电极的电极组应用于患者，很难对它们进行清洗消毒以备再次使用。基于此，希望有用一次性电极组运送大分子进入细胞的方法和装置。
使用一次性电极组时，希望它们无菌包装。
因此，上述现有技术指出采用电穿孔运送分子到生物细胞是已知的，但上述现有技术没有指教或建议用于运送大分子到生物细胞的具有如下所需特点之组合的方法和装置，具有如下希望的大部分特点：(1)不会引起可留下疤痕的皮肤损伤；(2)不会在接受处理的细胞中留下所弹射颗粒的残余物；(3)提供一种运送分子到接近表皮基板层的生物细胞的电穿孔方法，而不使处理分子以经皮方式通过皮肤；(4)不使用皮下注射用针头；(5)不采用在患者进行电穿孔时，流到电极上的流体介质；(6)不使用加压流体注射步骤将液体注射入患者体内；(7)对进行电穿孔的细胞采用相对较低的绝对电压；(8)如果需要，可对进行电穿孔的细胞采用相对较短脉冲宽度的脉冲；(9)使电极的基部和尖部不导电；(10)提供一次性的电极组；(11)提供无菌包装的电极组。本发明可以给出独创的方法和装置满足上述希望具有的特点而运送大分子进入细胞，其在下文中将予以阐明。本发明相对现有技术的其它优势也将予以证明。
                        发明内容
本发明提供了运送分子进入生物细胞的方法，其包括以下步骤：
(a)用要运送的分子包覆电极组中的电极；
(b)将具有已包覆的电极的电极组与电极组支架相连；
(c)提供一个定形信号发生器；
(d)在电极和定形信号发生器之间建立导电通路；
(e)将电极定位，使生物细胞位于其间，接着
(f)提供从定形信号发生器到电极的脉冲波，从而使电极上的分子自所述电极脱落并被运送进入生物细胞中。
脉冲波可以通过应用一组至少三个单独的，操作者控制的，独立编程的，直流电脉冲来提供而作用在生物细胞上，此含有至少三个直流电脉冲的组有下述特征中的一个，二个或三个：(a)此至少三个脉冲中至少有两个在脉冲振幅上彼此不同；(b)此至少三个脉冲中的至少两个在脉冲宽度上彼此不同；(c)此至少三个脉冲中第一组的两个之间的第一个脉冲间隔与此至少三个脉冲中第二组的两个之间的第二个脉冲间隔不同。
此外，该方法包括一个在电极组支架上建立电极组和定形信号发生器间的电通路的步骤。
另外，该方法包括一个提供无菌包装电极组的步骤。这样，在使用前要从无菌包装中将电极组取出。
而且，该方法包括使电极尖部和基部的外表面均电绝缘的过程。
电极表面包覆的分子可以是固体状态。电极包层中的分子优选是大分子。电极包层中的大分子可以包含多核苷酸疫苗(DNA疫苗和/或RNA疫苗)或基于蛋白的疫苗。
在本发明方法的一个变通法中，可以在患者感觉减弱(减小痛苦或几乎不痛或无疼痛)的情况下，运送分子到患者表皮组织中的朗格汉斯细胞。为提供将分子运送至患者的感觉减弱式运动，需保持如下条件(a)脉冲波绝对外加电压范围0.1～300伏特；(b)相反极性电极间的分隔距离为50～500微米；(c)电极***表皮组织的距离直达或稍稍超出表皮组织的基板层。
驱使包层分子自电极脱落的脉冲波是电泳波。运送脱离下来的分子进入生物细胞的脉冲波是电穿孔波。一般地，通用脉冲波既驱使包覆的分子从电极上脱落，又运送脱落下来的分子进入生物细胞。
生物细胞可以是体内的，来自体内的或体外的。更特定地，生物细胞可以是在表皮组织中或可以是其中的朗格汉斯细胞。
本发明另一方面提供用于运送分子进入生物细胞的装置，其包括一个可产生脉冲波的定形信号发生器。还提供一个电极组支架，电极组是由其进行机械支撑的。电极组支架也通过导电通路与定形信号发生器相连。电极组包括包覆了要运送进入生物细胞的分子的电极。
电极组可以从电极组支架中取出和替换。基于此，电极组包含电极-组件-导电带。电极组支架包括支架导线，在电极组与电极组支架机械性连接时，该导线与电极-组件-导电带是对齐套准的。同样，电极组支架也包括支架导线和定形信号发生器间的导电通路。
对此装置，可以提供电极组的无菌包装。在电极组由电极组支架机械支撑并与定形信号发生器电连接后，可以除去无菌包装。
需要时可利用此装置使定形信号发生器提供作用于生物细胞的脉冲波，所述脉冲波包括一组至少三个单独的，操作者控制的，独立编程的，直流电脉冲，此含有至少三个直流电脉冲的组有下述特征中的一个，二个或三个：(a)此至少三个脉冲中至少有两个在脉冲振幅上彼此不同；(b)此至少三个脉冲中的至少两个在脉冲宽度上彼此不同；(c)此至少三个脉冲中第一组的两个之间的第一个脉冲间隔与此至少三个脉冲中第二组的两个之间的第二个脉冲间隔不同。
电极可包括电绝缘性质的尖部和基部的外表面。电极上包覆了大分子，所述分子中可能包含多核苷酸疫苗(DNA疫苗和/或DNA疫苗)和/或基于蛋白的疫苗。多核苷酸疫苗或基于蛋白的疫苗可以是固相形式，在对患者使用电极前包覆所述电极。
本发明另一方面提供无菌包装的电极组，其包含一个无菌的电极组，其中的电极包覆了要运送进入生物细胞的分子。电极组包括电极-组件-导电带以便连接通向定形信号发生器的补偿性导电通路。此外，一个内部无菌包装封存了所述无菌的电极组。
此无菌包装的电极组中，电极可包括电绝缘性质的尖部和基部的外表面。
此无菌包装的电极组中，电极包覆了大分子，分子中含有固相的多核苷酸(DNA疫苗和/或RNA疫苗)和/或固相的基于蛋白的疫苗。
根据本发明，采用电场介导转染以DNA进行的体内细胞转染是一种有效的方法。电场可用于运送其它大分子，如RNA和蛋白质进入细胞。当前技术下，电场运送有一个缺点，就是转染所需高压电脉冲会引起痛感。对比之下，如本文所述本发明用于运送大分子(DNA，RNA和蛋白质)到体内组织的细胞的方法是利用无痛(或几乎无痛)并有效的电场介导运送。
电场介导的经电穿孔方式进行的DNA转染所需电场为100V/cm到20,000V/cm。根据本发明，采用最大电极间距500μm(0.5mm)，可将该范围转换为绝对电压范围5～1,000V。用于驱使DNA由电极脱离的电泳电压的绝对电压范围为0.1到1,000V。
由电刺激引起的痛感有赖于几个因素。其中有电压，电流强度，脉冲上升时间，脉冲宽度，和脉冲频率。在直接作用于体内组织的临界值以上，提高电压或增大脉冲宽度会造成痛苦增加。
在无痛体内电场介导的大分子传送中，两个临界值是重要的。一个是对于痛感的临界值。在痛感临界值之下，希望可以减小直接作于用体内组织的绝对电压(和，如果需要，减小脉冲宽度)。但是相反的第二个临界值是电场介导的大分子运送所需的最小电场强度。通常，提高脉冲各参数至超过该第二临界值会提高大分子运送的效力。提高过多会导致细胞死亡。
幸运地是，用于电场介导的大分子运送的重要电场参数是每厘米的电压值，而不是绝对电压。在电极间距离减小时，为保持电场固定不变，需要减小绝对电压。相似地，当电极间距离减小时，如果绝对电压不变，电场会增强。因此减小电极间距会降低直接作用于体内组织的绝对电压。
除绝对电压外，脉冲宽度也是重要的。非常窄的脉冲宽度极大提高了痛感所需的临界电压值。电穿孔有效性，在一定限度内，正比于脉冲电压与脉冲宽度之积。这意味着如果电压升高，脉冲宽度可以减小。因此，电极间距的减小也可以允许所用脉冲宽度减小。
由于电极的一部分会穿过表皮进入真皮，所以减小电极间距的另一优点是位于电极间的皮肤神经会更少。对一个给定的外加电压，电极间神经越少，感觉到的痛苦越少。
另一个影响痛感的因素是电场对神经末稍的接近程度。皮肤中，神经和神经末稍布满真皮，但在表皮中却没有。但是在真皮上部的乳突层，神经相对较少且相隔较远。这意味着电极如果只穿过表皮或表皮及上层真皮(真皮乳突层)，附近就不会有很多神经。这样，很短的电极在***时将几乎不会产生疼痛，施加电场时也不会引发疼痛，这是由于电场的大部分位于电极之间，而电极是位于表皮中的。
本发明涉及运送大分子进入细胞的方法和装置的多种应用。简言之，这些应用包括多核苷酸接种，蛋白质接种和基因疗法。
对于DNA接种，有两个最重要的要求。一个是体内基因表达，另一个是表达抗原的细胞至少部分是抗原提呈细胞。最易接近的抗原提呈细胞的最大浓度存在皮肤中，称为朗格汉斯细胞。这此细胞是称为树状细胞的高效抗原提呈细胞组别的一部分。电穿孔是体内转染所选细胞的另一种可行方法。
蛋白质也可采用电场介导的运送被引入细胞中。在传统的接种中，采用皮下注射用针头将蛋白质送达细胞外。这种运送不足以诱导细胞介导的细胞毒性淋巴细胞的免疫应答。一些传染病需要细胞毒性淋巴细胞应答作为用于有效去除感染的免疫应答的一部分。运送蛋白质进入细胞促进了对该应答的诱导。
运送治疗性基因药物进入细胞以使这些细胞表达一种缺失的蛋白，这是基因疗法的基础。本发明方法和装置可用于运送治疗用DNA进入除皮肤外任意可接近的器官表面的细胞。本发明的方法无痛苦，可有效运送大分子进入体内组织以便接种(或治疗)，DNA接种，基因疗法，或为其它目的。用至少有下述两个特点之一的电极运送大分子进入组织中细胞。其中一个特点是电极长度很短，以至它刺入组织中的深度接触不到神经末梢。另一特点是电极间距很小，小到可以使用无痛感的脉冲参数(电压和脉冲宽度)。在任一给定的应用中，只需要这些特点中的一个或另一个，但是，它们可以一起应用。
以上相当广泛地简述了本发明的更为重要的特点，目的是使随后的有关详述更易于理解，也为了更好理解本发明对本领域的贡献。当然，本发明还有其它特征，它们将在后文描述并作为本文所附权利要求的主体。
为此，在详细解释本发明的优选实施方案之前，需理解本发明在应用上并不受限于在随后的描述或附图说明中阐述的构建物的细节以及构件的排布。本发明适用于其它实施方案并能以多种形式进行实施和实现。同样地，应理解在此使用的用语和术语是用于描述，不应视作限制。
同样地，本领域的技术人员可以理解，本文所基于的概念可以容易地用于为实现本发明的几个目的，设计其它的结构、方法和***。因此，重要的是认定权利要求包括这类等价构建物，前提是它们没有偏离本发明的精神和范围。
综上所述，本发明的一个目的是提供新的和改进的方法及装置，用于运送大分子进入细胞，而不会产生可以留下疤痕的皮肤损伤。
本发明的另一目的是提供新的和改进的方法及装置，用于运送大分子进入细胞，而不会在被处理的细胞中留下弹射颗粒的残余物。
本发明的再一个目的是提供新的和改进的方法及装置，用于运送大分子进入细胞，其提供一种经电穿孔而运送分子进入靠近表皮基板层的生物细胞，而不使处理分子以经皮方式穿过皮肤的方法。
本发明的一个进一步目的是提供新的和改进的方法及装置，用于运送大分子进入细胞而不采用皮下针头。
本发明的再一目的是提供新的和改进的方法及装置，用于运送大分子进入细胞而不使用在对患者电穿孔的过程中会向下流到电极上的流体介质。
本发明的再一目的是提供新的和改进的方法及装置，用于运送大分子进入细胞而不采用加压的液体注射步骤给患者注射液体。
本发明的再一目的是提供新的和改进的方法及装置，用于运送大分子进入细胞，其中对进行电穿孔的细胞施加相对低的绝对电压。
本发明的再一目的是提供新的和改进的方法及装置，用于运送大分子进入细胞，其在需要时可对进行电穿孔的细胞施加脉冲宽度相对较短的脉冲。
本发明的再一目的是提供新的和改进的方法及装置，用于运送大分子进入细胞，其使电极基部和尖部均不导电。
本发明的再一目的是提供新的和改进的方法及装置，用于运送大分子进入细胞，其提供一次性的电极组。
本发明的再一目的是提供新的和改进的方法及装置，用于运送大分子进入细胞，其中电极组采用无菌包装。
这些及本发明的其它目的，与本发明特有的多种新颖特点都在 中予以特别指出，此权利要求附加于此公开内容，并成为其一部分。为更好理解本发明，及其操作上的优点和通过其应用可得到的特别目的，要参考附图和描述性文字，其中有本发明的带插图的优选实施方案。
                        附图简述
在研究了下面的详细描述后，可以更好理解本发明，并且上述目的及除上述以外的其它目的将会更加明确。这些描述在此可作为附图的参考。在附图中：
图1是本发明的装置的整体示意图。
图2示本发明的预先包覆好的电极穿刺至表皮层，并通过脉冲波将大分子运送进入表皮细胞。
图3是电极尖部的示意图。
图4是电极组的侧视图。
图5是图4所示电极组的底视图。
图6是图5所示电极组的部分边缘视图，表示电极的两种极性按行交错排列。
图7是图4所示电极组的放大俯视图，表示与电极的交错行接触的导线。
图8是无菌包装中的电极组的示意图。
图9是用于使大分子包覆电极的装置的示意图。
                      本发明实施模式
本发明提供一种方法和装置用于运送大分子进入细胞，参照图示，该方法和装置描述如下。运送大分子进入生物细胞的方法使用了所述的装置，并包括以下步骤(a)用要运送的分子包覆电极组12中的电极16，(b)将具有包覆好的电极16的电极组12连接到电极组支架13上，(c)提供定形信号发生器15，(d)建立电极16和定形信号发生器15间的导电通路，(e)将电极16定位，从而使生物细胞位于其间，和(f)提供从定形信号发生器15到电极16的脉冲波，导致电极16上的分子从电极16上脱离并被运送进入生物细胞。
在本方法的一种变更方法中，在患者痛感减小的情况下，将分子运送到患者表皮20中的朗格汉斯细胞22。脉冲波绝对外加电压范围为0.1～300伏特。相反极性的电极16间隔距离50～500微米。电极16刺入表皮组织直到且微微超出表皮组织的基板层。
驱使包层分子自电极16脱落的脉冲波是电泳波。电泳波范围为0.1～100伏特/cm。运送脱落下的分子进入生物细胞的脉冲波是电穿孔波。电穿孔波范围100～10,000伏特/cm。通用脉冲波既驱使包层分子自电极16上脱落，又运送脱落分子进入生物细胞。
运送分子到达的生物细胞可以是体内的，来自体内的，或体外的。更特定地，生物细胞可位于表皮20(表皮组织)中，可以是表皮组织中的朗格汉斯细胞22。
受电泳电脉冲驱使而自电极脱离的分子经电穿孔脉冲运送进入细胞。根据一个方案实例，脉冲波由定形信号发生器15通过利用一组至少三个单独的，操作者控制的，独立编程的，直流电脉冲的产生并作用于生物细胞，此含有至少三个直流电脉冲的组有下述特征中的一个，二个或三个：(a)此至少三个脉冲中至少有两个在脉冲振幅上彼此不同；(b)此至少三个脉冲中的至少两个在脉冲宽度上彼此不同；(c)此至少三个脉冲中第一组的两个之间的第一个脉冲间隔与此至少三个脉冲中第二组的两个之间的第二个脉冲间隔不同。
电极组支架13带有导电通道，其包括在电极组12和定形信号发生器15之间的导线21。
电极组12可提供在无菌包装24中，在使用前要使电极组12除去无菌包装24。
优选地，电极16具有圆锥形尖端，由此它们被称作针状电极。电极16的电极尖部17和基部19的外表面为电绝缘。在施加脉冲电压时，外表面绝缘的电极基部19可以使流过皮肤上表面的电流最少。而且在电极基部19的绝缘的外表面，DNA难以附着。在外表面电绝缘的电极基部17和外表面电绝缘的电极尖部19之间的电极16的外表面没有外绝缘层，是适于DNA附着的良好表面。在外表面绝缘的基部19和尖部17之间的此外表面区域是导电的，可以认为是一个活跃的电极区域。外表面绝缘的电极尖部17可以防止产生可导致组织灼伤的大的局部电场强度。
适于运送DNA疫苗到前臂表皮20的朗格汉斯细胞22的电极组12有以下特点：
(a)电极长度-130微米
(b)电极材料电阻率-小于0.1ohm-cm
(c)尖部绝缘-从尖端向上延伸10微米
(d)基部绝缘-从电极基座向下延伸55微米
(e)电极尖端平面-小于1平方微米
(f)电极基部直径-43微米
(g)在一个导电行中的电极间距-130微米
(h)在一个导电行中的电极数量-35
(i)导电行距-260微米(2×130)
(j)导电行数量-25
对于表皮应用，电极16的长度由表皮20的厚度决定。表皮20的厚度在身体各部分不一样。例如，位于前臂中部或三角肌上部的侧上臂的表皮20厚度要比脚跟或脚底的表皮20薄很多。
电极包层中的分子是固相，优选是大分子18。电极包层中的大分子18可包含DNA疫苗和/或基于蛋白的疫苗。DNA疫苗和基于蛋白的疫苗可以以固相形式应用于电极16。
优选地，电极组12可以从电极组支架13中取出和替换。电极组12含有电极-组件-导电带26。电极组支架13包含支架导线，当电极组12机械性联接在电极组支架13上时，该导线与电极-组件-导电带26对齐套准。电极组支架13包括在支架导线和定形信号发生器15之间的导电通路。
如上所述，运送大分子进入组织中的细胞需要三个主要部件。它们是定形信号发生器15，电极组支架13，电极组12。定形信号发生器提供在组织中产生电场所必需的电脉冲。电极组12包含电极16，DNA或蛋白质大分子均应用于电极16上。电极组支架13将电极组12与定形信号发生器15相连。
电极组12可以是电极阵列的形式，可以是可抛弃的，一次性的电极阵列，其中所述电极上已预先加载了大分子。为此，预先加载好的电极阵列可以采用无菌包装。使用此类电极阵列时，打开无菌包装，将电极阵列与电极阵列支持物相连。一人握住电极组支架，将电极组按压在患者皮肤上，使之压入患者皮肤，从而使电极组刺入皮肤角质层。优选的，电极组中电极尖部位于朗格汉斯细胞区域，这些细胞是表皮的树突细胞。
然后，从定形信号发生器发出脉冲波，其穿过电极组支架，到达电极组。脉冲波使已包覆的大分子从所述电极组上脱落并进入表皮。在表皮中，脉冲波对所靶定的表皮细胞实施电渗透，从而使大分子进入该靶细胞。
如图2所示，电极组12包括一个不导电的电极基座14和由该电极基座14支撑的多个独立的针状电极16。电极16的活性区域29包覆大分子，其表示为电极16表面的小“x′s”18。在脉冲波影响下，电泳电压使部分大分子18从电极16上脱离下来，进入表皮20，被电穿孔电压运送到表皮20中基板层25上面的活性表皮中的树突状朗格汉斯细胞22和活性上皮细胞23中。
定形信号发生器15为本方案提供脉冲。定形信号发生器的输出可以是常规的，伴有对脉冲参数，如电压，脉冲宽度，脉冲间隔，脉冲数量和脉冲矢量的单选择。或者，定形信号发生器输出可以是能程序控制的，其能改变脉冲至脉冲的任一参数(电压，脉冲宽度，脉冲间隔，脉冲数量)。优化性能需要可变输出，因为使大分子脱离电极16的电场不同于介导大分子运送到细胞的电场。一种合适的可编程脉冲发生器是PulseAgile(美国专利和商标局注册)的PA-4000型电穿孔***，制造商：Cyto Pulse Sciences，Inc.，P.O.Box609，Columbia，MD 21045。需注意PA-4000型运送的是不同振幅(电压)，宽度，和间隔的矩形波。
除可程序化控制电压，脉冲宽度，脉冲间距和脉冲数量以外，希望对另外两种参数进行程序化控制。一个是控制所施加电场的方向或矢量。另一个是控制电极的选择。在一应用中，电场可以反向以确保大分子更好地分布。在另一应用中，可以按次序选择单对电极阵列。
对于电极选择和电场方向选择的一个合适装置是可编程的脉冲开关，它是上述PA-4000电穿孔***的可选配件。
电极组12有两种作用。它运送大分子到需要的位点，另外，它可以将电场传递到组织。
电极组12的组成：
1.一个不导电电极基座14。
2.装配在电极基座14上的针状电极16的一个阵列。
3.电极-组件-导电带26，用于电连接至电极组支架13的支架导线上以与定形信号发生器15电连接。
在本发明方法的实行中，将针状电极16的尖端压向患者的表皮20，使电极针刺入角质层27，直至进入表皮20和上层真皮31，如图2所示。
参照图4、5和6，针列由导电的N行组成。每行中每一针状电极16都与行中其它电极针连接。各行由电脉冲驱动，可以：
1.独立地
2.成对地
3.所有行在某一时刻激活，其中一行阴极，下一行阳极，再下一行阴极，以此类推。
经电场介导的运送大分子(就DNA转染和蛋白运送而言)到表皮20中朗格汉斯细胞22所需的电极组(阵列)有以下特征：
1.每个阵列有多个导电行，同一导电行中的每一个针状电极被电连接在一起。
2.相邻行间相互电隔离。
3.每个导电行有2到100个针状电极。
4.选择电极针长度以符合待处理区域中的表皮厚度。
5.针状电极的绝缘行的间距根据采用的电压和被穿刺组织的机电性质来选择。
6.电连接针状电极间最近距离的选择是使组织伤害最小和使电场最大。
7.对电极可按照单个，成行，或几行一组进行电编址。
电极针可以采用多种形状，例如：圆柱形针，扁型针，锥形针，刀刃形针。电极针可以是尖的或钝的。每种形状在每个电极行中可以是单个或多个。
电极组支架的目的是建立定形信号发生器和电极组间的电连接，并在对患者使用电极组时为电极组提供支撑。它为应用于患者提供机械连接。它也提供了一种传递电极组到患者组织，同时保持电极组的无菌状态的方法。
电极组可以有下列可选特征。它可以有在电极组上针对组织提供正确压力的方式。它可以有正确施加压力，电传递正在进行和完成电传递的指示。它可以有一个脉冲程序的启动开关。当对电极组支架施以正确压力时，它可以有一种用于自动启动脉冲程序的方式。
如上所述，大分子，包括DNA和蛋白质大分子需要通过电泳电压驱使从包覆的电极16脱离，以便它们可以在使用电穿孔脉冲将大分子运送进入组织中的目标生物细胞中之前，通过组织的细胞外空间而脱离。
如上所述，首先大分子附着在电极16的外表面。在一种用大分子18包覆电极16的机械方法中，相对高浓度的大分子18溶解或悬浮在溶剂或液相载体中。电极16然后浸入该溶液或悬浮液中。然后，使该溶剂或液相载体蒸发，在电极16上会留下大分子18的固体包层。备选地，电极16可以采用喷雾包覆。也可采用其它一些机械方法包覆电极16。
大分子，如DNA，可以有效地附着在许多表面上。材料的物质和化学性质可用于增强对电极表面的附着。
所述分子倾向于通过各具有不同附着强度的互不相同的分子间作用而相互结合。这些力在固体物质和可溶性分子之间以及在溶液中的分子间同样起作用。分子的相互作用有：
1.溶剂化：溶剂结合。在分子组份和溶剂分子间的相互作用。
2.疏水相互作用：由于不能与溶剂作用而产生的溶质-溶质相互作用；一种排斥相互作用。
3.范德华力是存在于所有分子间的弱吸引力。它只在短距离下有效，如果形状互补作用力会更强。
4.氢键，是在氢原子和其它分子如氮和氧间形成的化学键。
5.离子键，是分子的相反电性部分间的吸引力。
6.共价键，是最强的分子键。
考虑到DNA，更特定地，DNA水溶性小并带电。核苷酸内的有机环赋子DNA疏水性。DNA聚合物中的磷酸分子产生净负电荷。
在电极表面和DNA之间最强的键是疏水键。当电极带正电时，DNA朝电极移动，这样增强了DNA和导电的疏水表面的相互作用。为运送，电性要相反。只要由相同电荷产生的排斥力超过了疏水力和分子间其它作用力，就会发生远离电极表面的迁移。
让DNA与金属(如电极表面)或另一种导电材料通过使用正电荷而结合，可使DNA包覆在特定位点上。所以，为促使DNA从电极表面脱离并随后运送DNA到生物细胞，同一表面会通以负电。DNA由于带负电荷，会在电场中向正极迁移。此现象称为电泳。如果正极如大多数金属是疏水表面，正电和疏水作用将会一起作用使DNA留在该表面。
多数大分子在一个非等电点的pH下的溶液中会带净电荷。例如DNA在生理pH下带负电。这意味着DNA分子会向正极移动。此性质用于使大分子与电极相接触，通过所列分子间其它作用力而相互结合。例如DNA可因为其疏水性而结合。
电包覆利用了大分子的电性。如上所述，DNA是带负电的，因此向带正电的电极迁移。参照图9，它展示了一种用于包覆电极16的器具，在包覆过程中，将DNA加入缓冲液，接着放入一个带负极的小池中。优选地，此电极通过一层凝胶界面与缓冲液分隔开，以阻止阴极的金属与DNA接触。将电极装置***该液体中，对该电极装置施加正电，将DNA拉向该电极装置表面。DNA通过疏水或其它作用附着在电极装置的表面，直到被相反电性驱使离开。在有或没有保护剂，如糖类，和有或没有其它载体分子的情况下使DNA在该装置上干燥。一些物质可以加入到电极的包层中以有利于处理物质被吸收进入目标细胞。
电极组上的大分子数量随应用不同而不同。例如对于DNA免疫，电极组上可以负载0.01～100微克质粒DNA。
可将无菌材料和局部无菌环境用于带大分子的电极组的制造。备选地，电极组可以在制成后灭菌。
采用本发明方法和装置，将大分子18送达患者的典型步骤依次如下。在临床中，将定形信号发生器15连接在电极组支架13上。就个体应用而言，挑选一个电极组12，其中电极16已加载了所需大分子。接着，使电极组12机械连接在电极组支架13上。一名操作者握住电极组支架13，同时将电极16压在患者组织(一般为皮肤)上。电极16刺入表皮20，基本只刺入到基板层。在电极16如此定位在表皮20中之后，开始运送大分子的过程，并启动电场的选择模式。在运送程序完成后，从表皮20移去电极16，将电极组12丢弃。
如上所述，电程序被设计用于驱使大分子从电极16脱离而进入组织，随后运送大分子进入组织中的细胞。对于DNA，一个典型的电脉冲次序如下所示。首先，对电极16施加一系列低电压(电泳)脉冲，使DNA从所有带负电的电极上脱离。通常，隔行电极带负电。接着，将更高的电穿孔脉冲电压加载在电极16上以驱动DNA进入细胞。然后，使电极极性反转，反转了极性的低电压脉冲使剩余电极上的DNA脱离。接着应用高电压电穿孔脉冲使DNA进入细胞。
此大分子运送***的一个重要应用是运送大分子到皮肤。为此，挑选电极针长度使电极穿透到基底层和基底膜(基板层)。可能会稍稍刺入真皮。对于在患者手臂上的此类应用，选择电极长度为130微米。该长度可处理表皮细胞。对于DNA接种或基因疗法，用此运送方法转染的细胞是树状细胞(皮肤朗格汉斯细胞22)和上皮细胞。
除将大分子给药至表皮中生物细胞外，本发明的方法和装置可用于其它生物学环境，例如手术和移植的组织。
可采用多种方法制造本发明的电极组12。下面举几个例子。
根据本发明，可采用标准的微芯片制造工艺在非导电支持物上制作导电的微针。在一个例子中，使用了包括一个硅层或其它不导电层和一个金属层的空白板。模板可设计为行间比行内有更多的蚀刻(etching)，这样就产生了电极的导电行，行间是不导电的间隔。
电极组的另一种制作方法是采用已知的挤压微加工(extrusion micro-fabrication)技术，举例如下。电极材料和相邻的绝缘材料的制备是将陶瓷松，金属粉或其它粉末与热塑性粘合剂混合。装配单个组分，热压使之相互粘合。对产生的棒进行挤压减小其尺寸。挤压后，若干经过挤压的棒再装配成新的棒。此最新产生的棒再通过挤压减小尺寸，直到所述多个棒的整体大小与第一次挤压的棒相同。待减至所需大小后，所述部分经加热除去粘合剂。第二例，利用更高的热度将金属粉或陶瓷粉烧结在一起。在烧结前或烧结后，棒被切成圆盘。采用差异(differential)喷砂或其它机械或化学技术，使绝缘体的表面上出现针状物。
另一种制作方法是采用激光铣削技术，从由导电层和不导电层组成的夹心中除去材料。
部分的电极阵列中，电极间距大到足以进行机构装配。这类装配实例如下。所需金属组成和直径的线绕在卷轴上用于装配。将所述线盛入一种装置，使线按正确的间隔距离排列。将陶瓷或塑料材料注入一个流通***，使电极间空隙得以完全填充，并且使电极的外部边框成形。塑料或陶瓷硬化后切割成圆盘。得到的圆盘利用较软的基质进行不同程度的侵蚀。可采用机械，化学或各种方法的组合进行侵蚀。表面侵蚀导致支持基质上突出竖直的所需长度的针状物。
另一种制作技术描述如下。得到长度30mm，直径120微米的不锈钢针。一个来源是一家针灸针供应公司。例如Seirin No.02针。针从手柄(如果有)上切割下来。要为该装置的每一行挑选许多针。本例中每行有35针。将这些针仔细地挨个排列，针尖成一线。此步骤需要细心，可使用一种夹具帮助排列，此夹具是将一块显微镜载玻片成90。粘在另一块载玻片顶端。载玻片也用于在显微镜上检查排列。针列(针束)用50μm厚的带子捆在一起。两个或更多针束排在一起形成一个电极针列，每束的尖端与下一束成对比排列。针用银焊在线上，针束每隔一个电连接在一起。为针束的电极阵列提供一个完整的支持结构。
明显地从上面所述可以看出，本发明完成了提出的所有目标，方式是通过提供一种方法和装置用于运送大分子进入细胞而不产生会留下疤痕的皮肤损伤。根据本发明，用于运送大分子进入细胞的方法和装置不会在被处理的细胞里遗留弹射颗粒。根据本发明，用于运送分子到表皮中接近基板层的生物细胞的电穿孔方法不会使处理分子通过经皮方式穿过皮肤。根据本发明，用于运送大分子进入细胞的方法和装置不会借助于皮下注射用针头。根据本发明，运送大分子进入细胞的方法和装置没有采用在对患者进行电穿孔步骤时会向下流到电极上的液体介质。
根据本发明，用于运送大分子进入细胞的方法和装置没有采用加压液体注射步骤对患者进行液体注射。根据本发明，在进行电穿孔的细胞上施以相对低的绝对电压。根据本发明，施加于细胞的脉冲可以对经历电穿孔的细胞采用，如果需要，相对短的脉冲宽度。根据本发明，用于运送大分子进入细胞的方法和装置可以采用，如果需要，基部和尖部均不导电的电极。根据本发明，用于运送大分子进入细胞的方法和装置采用一次性电极组。根据本发明，用于运送大分子进入细胞的方法和装置采用无菌包装的电极组。

Claims (61)

1.一种将分子运送至生物细胞内的方法，包括如下步骤：
用将要运送的分子包覆电极组中的电极，
将具有已包覆的电极的电极组与电极组支架相连，
提供一种定形信号发生器，
在电极和定形信号发生器间建立导电通路，
将电极定位，从而使生物细胞位于其间，和
提供从定形信号发生器到电极的脉冲波，从而使电极上的分子脱离电极并被运送进入生物细胞。
2.权利要求1的方法，其中电极为针状电极形式。
3.权利要求1的方法，其中利用脉冲波将所述分子运送进入生物细胞，该脉冲波的绝对电压范围为0.1～1000伏特。
4.权利要求1的方法，其中在患者感觉减弱的情况下将所述分子运送至患者表皮组织的朗格汉斯细胞，其中脉冲波的绝对外加电压范围为0.1到300伏特，其中相反极性电极间的距离为50～500微米，且其中电极刺入表皮组织达到或稍稍超出表皮组织的基板层。
5.权利要求1的方法，其中使包覆的分子脱离电极的脉冲波为电泳波。
6.权利要求1的方法，其中使包覆的分子脱离电极的脉冲波为0.1～100伏特/cm的电泳波。
7.权利要求1的方法，其中运送脱落分子进入生物细胞的脉冲波是电穿孔波。
8.权利要求1的方法，其中运送脱落分子进入生物细胞的脉冲波是100～20,000伏特/cm的电穿孔波。
9.权利要求1的方法，其中通用的脉冲波既促使包覆的分子脱离电极又运送脱落分子进入生物细胞。
10.权利要求1的方法，其中生物细胞是体内的。
11.权利要求1的方法，其中生物细胞是来自活体的。
12.权利要求1的方法，其中生物细胞是体外的。
13.权利要求1的方法，其中生物细胞是在表皮组织中。
14.权利要求1的方法，其中生物细胞是在表皮组织中的朗格汉斯细胞。
15.权利要求1的方法，其中通过依次应用一组，至少三个单独的，操作者控制的，独立编程的，直流电脉冲而向生物细胞提供脉冲波，此含有至少三个直流电脉冲的组有下述特征中的一个，二个或三个：(a)此至少三个脉冲中至少有两个在脉冲振幅上彼此不同；(b)此至少三个脉冲中的至少两个在脉冲宽度上彼此不同；(c)此至少三个脉冲中第一组的两个之间的第一个脉冲间隔与此至少三个脉冲中第二组的两个之间的第二个脉冲间隔不同。
16.权利要求1的方法，进一步包括：提供在电极组和定形信号发生器间有导电通路的电极组支架。
17.权利要求1的方法，进一步包括：提供无菌包装的电极组，在使用前，将无菌包装除去。
18.权利要求1的方法，进一步包括：提供电极且其尖部外表面绝缘。
19.权利要求1的方法，进一步包括：提供电极且其基部外表面绝缘。
20.权利要求1的方法，其中电极包层中的分子是处于固相。
21.权利要求1的方法，其中电极包层中的分子是大分子。
22.权利要求1的方法，其中电极包层中的大分子包含多核苷酸疫苗。
23.权利要求1的方法，其中电极包层中的大分子包含固相的多核苷酸疫苗。
24.权利要求1的方法，其中电极包层中的大分子包含DNA疫苗。
25.权利要求1的方法，其中电极包层中的大分子包含固相的DNA疫苗。
26.权利要求1的方法，其中电极包层中的大分子包含RNA疫苗。
27.权利要求1的方法，其中电极包层中的大分子包含固相的RNA疫苗。
28.权利要求1的方法，其中电极包层中的大分子包括基于蛋白的疫苗。
29.权利要求1的方法，其中电极包层中的大分子包括固相的基于蛋白的疫苗。
30.权利要求1的方法，其中将电极组中的电极用待运送至生物细胞的分子包覆通过以下步骤实施：
配制液体介质，其中含有一定量的所述分子，
将电极与配制好的介质接触，
从介质中取出电极并使之干燥，以使电极形成分子包层。
31.权利要求1的方法，其中将电极组中的电极用待运送至生物细胞的分子包覆通过以下步骤实施：
配制液体介质，其中含有一定量的所述分子，
将电极与配制好的介质接触，
在电极上施以脉冲波，从而使所述分子的一部分附着在电极上，且
从介质中取出电极并使之干燥，以使电极形成分子包层。
32.一种将多核苷酸疫苗运送进入患者表皮中的朗格汉斯细胞中的方法，包括以下步骤：
用固相多核苷酸疫苗包覆电极组中的电极，
将具有包覆了的电极的电极组与电极组支架相连，
提供一个定形信号发生器，
在电极和定形信号发生器间建立导电通路，
将电极定位以使朗格汉斯细胞位于其间，
产生从定形信号发生器到电极的脉冲波，以使电极上的多核苷酸疫苗从该电极脱落下来，被送入朗格汉斯细胞中。
33.一种用于运送分子进入生物细胞的装置，包括：
一个能产生脉冲波的定形信号发生器，
一个电极组支架，
一个电极组，由所述电极组支架进行机械支撑，并通过导电通路与该定形信号发生器连接，其中该电极组中包括电极，所述电极包覆了要运送进入生物细胞的分子。
34.权利要求33的装置，其中该电极组是可从所述电极组支架上拆卸的和替换的。
35.权利要求33的装置，其中
该电极组包括电极-组件-导电带，且
该电极组支架包括支架导线，当所述电极组机械连接至所述电极组支架时，所述支架导线与所述电极-组件-导电带对齐套准，而且所述电极组支架包括在所述支架导线和所述定形信号发生器之间的导电通路。
36.权利要求33的装置，还包括：
所述电极组的无菌包装，其在所述电极组获得电极组支架的支撑并且建立了到所述定形信号发生器的电连接之后，可以除去。
37.权利要求33的装置，其中所述定形信号发生器可产生脉冲波，所述脉冲波包括一组至少三个单独的，操作者控制的，独立编程的，直流电脉冲作用在生物细胞上，此含有至少三个直流电脉冲的组有下述特征中的一个，二个或三个：(a)此至少三个脉冲中至少有两个在脉冲振幅上彼此不同；(b)此至少三个脉冲中的至少两个在脉冲宽度上彼此不同；(c)此至少三个脉冲中第一组的两个之间的第一个脉冲间隔与此至少三个脉冲中第二组的两个之间的第二个脉冲间隔不同。
38.权利要求33的装置，其中所述电极是针状电极形式。
39.权利要求33的装置，其中所述电极尖部外表面和基部外表面均电绝缘。
40.权利要求33的装置，其中所述电极包覆了若干大分子。
41.权利要求40的装置，其中的大分子包括多核苷酸疫苗。
42.权利要求40的装置，其中的大分子包括固相的多核苷酸疫苗。
43.权利要求40的装置，其中的大分子包括DNA疫苗。
44.权利要求40的装置，其中的大分子包括固相DNA疫苗。
45.权利要求40的装置，其中的大分子包括RNA疫苗。
46.权利要求40的装置，其中的大分子包括固相RNA疫苗。
47.权利要求40的装置，其中的大分子包括基于蛋白的疫苗。
48.权利要求40的装置，其中的大分子包括固相基于蛋白的疫苗。
49.一种用于运送分子进入生物细胞的装置，包括：
一个可产生脉冲波的定形信号发生器；
一个电极组支架，和
一个电极组，其由所述电极组支架机械支撑，并通过导电通路与所述定形信号发生器连接，其中该电极组包括包覆了要运送至生物细胞内的分子的电极，其中所述电极由固相DNA疫苗包覆。
50.包装好的无菌电极组，其包括：
一个无菌电极组，其中的电极包覆了要运送进入生物细胞的分子，其中该电极组包括用于连接到所述定形信号发生器的导电通路的电极-组件-导电带，和
一个内部无菌包装，用于封存所述无菌电极组于其中。
51.权利要求50的包装的无菌电极组，其中所述电极包括电绝缘的尖部外表面和电绝缘的基部外表面。
52.权利要求50的包装好的无菌电极组，其中所述电极是针状电极形式。
53.权利要求50的包装好的无菌电极组，其中所述电极以大分子包覆。
54.权利要求53的包装好的无菌电极组，其中的大分子包含多核苷酸疫苗。
55.权利要求53的包装好的无菌电极组，其中的大分子包含固相的多核苷酸疫苗。
56.权利要求53的包装好的无菌电极组，其中的大分子包含DNA疫苗。
57.权利要求53的包装好的无菌电极组，其中的大分子包含固相的DNA疫苗。
58.权利要求53的包装好的无菌电极组，其中的大分子包含RNA疫苗。
59.权利要求53的包装好的无菌电极组，其中的大分子包含固相的RNA疫苗。
60.权利要求53的包装好的无菌电极组，其中的大分子包含基于蛋白的疫苗。
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