CN1343775A - 用于棉花雄性不育的启动子和含有该启动子的载体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种由A6、A9、TA29的功能区构建的能在植物花药中特异表达的启动子3P。本发明还提供了一种由启动子3P与BN基因构建的植物雄性不育嵌合基因和含有该雄性不育嵌合基因的雄性不育表达载体。
Description
本发明涉及一种用于棉花雄性不育的启动子和含有该启动子的载体。
植物杂种优势的利用是植物育种学的重要成就之一。产生植物雄性不育是制造杂交种的重要步骤，这通常是通过人工去雄来实现的，但人工去雄存在着雄蕊难以去尽，且费时费力等诸多不利。重组DNA工艺的发展，为产生雄性不育提供了一种有效的手段。通过基因工程人工创建植物雄性不育系现已在烟草油菜等作物上获得成功；且转基因油菜雄性不育系在国外已开始应用，而通过基因工程创建棉花雄性不育系的研究，国内外还未见报道，也无专利保护。
植物雄性不育的人工创建可以通过在植物中利用在特异启动子控制下选择性地在植物雄性生殖器官中表达一些细胞毒性产物(如RNA酶)来实现。现已经克隆了许多在植物雄性器官中表达的特异启动子，其中烟草花药特异启动子TA29已经被证明用于此目的尤为有效(Mariani etal.，1990，Nature 347：737，EP0,344,029)。另外，A6、A9等花药特异启动子也已被描述(WO92/13956，WO92/13957)
用作产生雄性不育的细胞毒性基因以核酸酶Barnase较为有效，其抑制剂Barstar的基因可用作恢复基因。一些实验表明Barstar基因可完全恢复由Barnase引起的雄性不育系的育性(EP0,412,911 Mariani etal，.1991)。然而，由TA29、A6、A9启动子构建的植物雄性不育基因易受环境温度、基因***的位置效应所影响。
本发明的目的是提供一种克服了上述缺点的用于植物雄性不育的启动子。
本发明的另一个目的是提供一种由本发明的启动子和BN基因组成的用于植物雄性不育的嵌合基因。
本发明的在一个目的是提供一种含有本发明的嵌合基因的雄性不育表达载体。
本发明提供了一种由A6、A9、TA29的功能区构建的能在植物花药中特异表达的启动子3P，它依次由Seq ID No.6的34-449的序列和Seq IDNo.11的7-1087的序列组成。
本发明还提供了一种由启动子3P与BN基因构建的植物雄性不育嵌合基因。
本发明还提供了一种雄性不育表达载体，它含有本发明的嵌合基因。
本发明的雄性不育表达载体可以是本发明中构建的pBin19-3PBN。也可以是含有由LB、NPTII、Bxn、3P-BN-Nos、RB组成的基本单位的质粒pROK II、pBI121、或者pCAMBIA。
将本发明的载体利用农杆菌介导法转化棉花，通过胚状体途径、再生株嫁接繁殖，获得了雄性不育转基因植株，该植株表现出了花丝变短、柱头相对突出、花药干瘪、花粉败育、自交不结实等明显的雄性不育性状。经T1、T2代生物学性状观察表明，这些性状可以稳定遗传。并经回交转育获得了稳定遗传的T1、T2代雄性不育植株。
在本发明中，以TA29、A6、A9三个启动子的功能区片段串联，构建成新的启动子3P。以新启动子3P串联核酸酶BN的基因以及除草剂抗性基因Bxn，连接到植物表达载体pBin19(Gen Bank Accession No.U 12540)上，构建成植物雄性不育表达载体pBin19-3PBN。利用pBin19-3PBN载体由农杆菌介导转化棉花下胚轴，诱导愈伤并产生胚状体后产生再生植株，经嫁接繁育后得到雄性不育系，经分子生物学检测证明目的基因已经***到棉花基因组中，获得阳性转化子。转基因雄性不育系棉花表现出了花丝变短、柱头相对突出、花药干瘪、花粉败育、自交不结实等明显的雄性不育性状。
实施例：
1.核酸酶Barnase(BN)基因及花药特异表达启动子的克隆
(1)核酸酶BN基因的克隆
根据Paddon，C.J等人的资料，以PBN-I(Seq.ID No.1)和PBN-II(Seq.ID No.2)为引物，以HindIII酶切的Bacillus amyloliquefaciens基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR产物经HindIII和SacI双酶切处理后，与pGEM7Z-f(+)载体连接，转化E.coli DH5α后得到带有BN基因的载体pGEM7Z-BN，其多克隆位点ApaI-NsiI间的序列如Seq.ID No.3所示。
(2)烟草花药特异启动子TA29的克隆
根据Seunick，J等人的资料，以PTA29-I(Seq.ID No.4)和PTA29-II(Seq.ID No.5)为引物、EcoRI和HindIII酶切的沙拇逊烟草基因组DNA为模板进行PCR扩增。回收特异性扩增的DNA片段。回收片段经BamHI和KpnI双酶切处理后，与pGEM-7Z载体连接，转化大肠杆菌E.coli DH5α后得到带有TA29的载体pGEM7Z-TA29，其多克隆位点ApaI-NsiI间的序列如Seq.ID No.6所示。
(3)拟南芥花药特异启动子A6(E)、A9(E)的克隆
根据Diane，L.H等人(1993)和Wyatt，P等人(1992)报道的拟南芥花药特异表达启动子A6和A9功能区的序列，以PA6(E)-I(Seq.ID No.7)和PA6(E)-II(Seq.ID No.8)为A6(E)的引物；以PA9(E)-I(Seq.ID No.9)和PA9(E)-II(Seq.ID No.10)为A9(E)的引物；提取的拟南芥WS生态型(Arabidopsis thaliana)总DNA分别用上述两对引物进行PCR扩增。A6(E)、A9(E)的PCR产物分别由KpnI和BglII，以及BamHI和XbaI双酶切后与经KpnI、XbaI的pBluescript KS三片段相连接，转化E.coli DH5α后得到带有A6(E)-A9(E)的载体pBlue-A6(E)-A9(E)，其多克隆位点KpnI-SacI间的序列如Seq.ID No.11所示。
2.雄性不育表达载体的构建
(1)3P启动子植物雄性不育表达载体的构建
以SacI和EcoRI双酶切质粒pROKII回收约0.3Kb的Nos片段，与pUC19连接后构建成pUC19-Nos载体。以BamHI和KpnI从pGEM7Z-TA29上切下约0.4Kb的TA29片段，与pUC19-Nos连接后pUC19-TA29-Nos。以NcoI和SacI从pGEM7Z-BN切下BN片段，与pUC19-TA29-Nos连接后构建成pUC19-TA29-BN-Nos(简写为pUC19-TN)。
以BglII和KpnI从pBlue-A6(E)-A9(E)载体上切下A6(E)-A9(E)片段，BamHI和EcoRI从pUC19-TN载体上切下TA29-BN-Nos片段与经EcoRI和KpnI酶切的pBin19载体三片段连接，转化E.coli DH5α得到pBin19-A6(E)A9(E)TA29-BN-Nos载体；以BamHI和EcoRI从pBin19-A6(E)A9(E)TA29-BN-Nos载体上切下约2Kb的A6(E)A9(E)TA29-BN-Nos片段，BamHI和HindIII从pBluescript KS-Bxn上切下Bxn片段与经EcoRI和HindIII双酶切质粒pBin19，三片段连接后转化E.coli DH5α得到pBin19-A6(E)A9(E)TA29-BN-Nos-Bxn载体，即含有由A6、A9、TA29组成的新启动子3P的植物雄性不育表达载体pBin19-3PBN。
植物雄性不育表达载体pBin-3PBN的图谱如图1所示。
3.棉花的遗传转化和再生植株的繁育
(1)供转化棉花品种和菌株：
用于转化的农杆菌菌株为LBA4404，供试棉花品种为晋棉7号、柯字312、柯字201以及ZMJI、ZMJ2、ZMJ3、ZMJ4、ZMJ6。
(2)外植体的准备：
棉花种子经硫酸脱绒后，用70％的酒精浸泡1分钟，再放入30％的过氧化氢中消毒2～3小时，用无菌水冲洗3遍后，浸泡在三角瓶中过夜。次日种子露白后接种于种苗培养基上(1/2MS无机盐，0.22％的Phytogel，pH6.5)。在25℃，2000LX的光照强度下培养5～7天，得到供试的无菌苗，以无菌苗的下胚轴作为转化的外植体。
(3)外源基因的转化与植株再生：
取5天苗龄的无菌苗的下胚轴，切成5～10毫米的切段，浸泡于从液体培养基里悬浮的OD0.4左右的菌液中10～15分钟，接种到MS固体培养基上，共培养48小时后，再把其转到诱导与筛选愈伤组织培养基(MS无机盐，10毫克/升VB1，1毫克/升VB6，1毫克/升VPP，0.1毫克/升2，4-D，0.1毫克/升KT，30克/升葡萄糖，0.22％的Phytogel 50毫克/升卡那霉素，500毫克/升头孢霉素，pH6.5)上，在28℃，光强2000LX的条件下培养。
外植体在诱导与筛选培养基上得到的转化愈伤组织长到蚕豆大小时可转入分化培养基(MS无机盐，10毫克/升VB1，1毫克/升VB6，1毫克/升VPP，1.9克/升KNO3，30克/升葡萄糖，0.22％的Phytogel pH6.5)，在分化培养基上继代数次后，可看到胚的形成。将分化良好的胚状体转到成苗培养基(将分化培养基中的NH4NO3去掉，另加1克/升谷氨酰胺，0.5克/升天冬素)上，继续发育得到再生植株。
(4)再生株的嫁接繁育：
采用劈接法，大田推广品种为砧木，转化再生株为接穗。选5～6厘米高、并具有6～7片真叶的转化株作为接穗，用手术刀片将其茎基部削成马蹄型。同时将长有4～5片真叶的砧木削去其顶端部分，只保留2～3片真叶，然后从中间纵向切开1～2厘米，将削成马蹄型的接穗直接***，使接穗和砧木对齐。并用细塑料绳缠紧。最后将花盆一次浇足水，并扣上2升烧杯，周围用土埋严，避免阳光直射。7天后将烧杯打开2公分通气，10天后完全去掉烧杯，锻炼2周后直接将盆移入大田。
4转基因棉花的分子生物学检测：
(1)棉花总DNA的提取：
取100mg棉花叶片，加20μl巯基乙醇，加液氮研磨，迅速将植物组织粉末装于1.5ml Eppendorff管中，加入600μl 2×CTAB提取液，摇匀，置于65℃水浴中30分钟，期间不时摇动。加入700μl酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，并摇动至溶液呈乳化状态，12000rpm离心5分钟。加入2倍体积无水乙醇，混匀后于-20℃沉淀过夜，12000rpm离心1分钟收集沉淀，70％的乙醇洗沉淀，空气干燥，溶于50μl TE中备用。
(2)PCR检测：
将提取的棉花总DNA稀释100-1000倍，取1μl按标准PCR扩增反应方法进行检测，其结果表明目的基因已经整合到棉花基因组中。
(3)Southern检测：
将提取的植物总DNA加入等体积的0.8M的NaOH/20mM EDTA中，100℃煮沸10分钟后通过真空点膜器点到Zeta-prob尼龙膜上，6 watt的紫外灯相距1厘米照射湿膜15秒钟使DNA片段固定。将用地高辛标记的探针与膜上DNA杂交，之后和抗地高辛的抗体反应，清洗后进行ISPD化学发光检测(具体操作见Roche公司的DIG-High Prime DNA Labeling andDetection Starter Kit II试剂盒说明书)，其结果再次证明目的基因已经整合到棉花的基因组中。
5.转基因棉花的生物学测定
(1)抗溴苯腈检测：
将除草剂溴苯腈配成5×10-5mol/L的溶液涂抹棉花叶片，对照植株的叶片在三天后，其涂抹了除草剂的部位变黄并枯死，呈典型的药害症状；而转基因抗性植株的叶片保持墨绿色。这表明与雄性不育基因偶联的抗除草剂基因Bxn也已经整合到棉花基因组中。
(2)育性检测：
雄性不育棉花植株表现出了花丝变短、柱头相对突出，花药干瘪等明显的雄性不育花的特征。花粉的碘化钾染色结果表明其花粉的代谢活力很低，并表现出了明显的自交不结实现象。其在高于30℃的气温下表现出了稳定的雄性不育的性状，转化pBin-3PBN雄性不育载体的棉花获得的94株不育株中只有两株恢复了育性，而由TA29单启动子控制的雄性不育嵌合基因转化棉花所得到的24株转基因植株中有20株恢复了育性。
6.转基因棉花雄性不育系的保持与恢复
通过本专利获得的转基因棉花雄性不育系已通过与常规品种杂交得到了保持，其杂交后代通过喷洒5×10-5mol/L的溴苯腈可除去非转基因植物使转基因雄性不育系得以保留。获得的转基因棉花雄性不育系已与带有BN抑制剂的Barstar基因的转基因棉花杂交得到了恢复。
相关序列：
Seq.ID No.1
PBN-I：5′-GCAAGCTTCCATGGCACAGGTTATCAACACG-3’
Seq.ID No.2
PBN-II：5′-CGGAGCTCTTATCTGATCTTTGTAAAGGT-3’
Seq.ID No.3
1 gggcccgacg tcgcatgctc ctctagactc gaggaattcg gtacccccgg gttcgaaatc
61 gataagcttc catggcacag gttatcaaca cgtttgacgg ggttgcggat tatcttcaga
121 catatcataa gctacctgat aattacatta caaaatcaga agcacaagcc ctcggctggg
181 tggcaaaagg gaaccttgca gacgtcgctc cggggaaaag catcggcgga gacatcttct
241 caaacaggga aggcaaactc ccgggcaaaa gcggacgaac atggcgtgaa gcggatatta
301 actatacatc aggcttcaga aattcagacc ggattcttta ctcaagcgac tggctgattt
361 acaaaacaac ggaccattat cagaccttta caaagatcag ataagagctc ccaacgcgtt
421 ggatgcat
注：1～71 pGEM7Z-f(+)多克隆位点序列
72～404核酸酶Barnase序列
405～428 pGEM7Z-f(+)多克隆位点序列Seq.ID No.4
PTA29-I：5′-CGCGGATCCTACTCGAATTAAAGCGAC-3’Seq.ID No.5
PTA29-II：5′-CGCGGTACCATGGTAGCTAATTTCTTTAAG-3’Seq.ID No.6
1 atgcatccaa cgcgttggga gctctccgga tcctactcga attaaagcga cataggctcg
61 aagtatgcac atttagcaat gtaaattaaa tcagtttttg aatcaagcta aaagcagact
121 tgcataaggt gggtggctgg actagaataa acatcttctc taccacagct tcataatgta
181 atttccataa ctgaaatcag ggtgagacaa aattttggta ctttttcctc acactaagtc
241 catgtttgca acaaattaat acatgaaacc ttaatgttac cctcagatta gcctgctact
301 ccccattttc ctcgaaatgc tccaacaaaa gttagttttg caagttgttg tgtatgtctt
361 gtgctctata tatgcccttg tggtgcaagt gtaacagtac aacatcatca ctcaaatcaa
421 agtttttact taaagaaatt agctaccatg gtaccgaatt cctcgagtct agaggagcat
481 cggacgtcgg gccc
注：1～33 pGEM7Z-f(+)多克隆位点序列
34～449修饰的启动子TA29序列
450～495 pGEM7Z-f(+)多克隆位点序列Seq.ID No.7
PA6(E)-I：5′-CGGGTACCACACAAAGCAATTAACAAAG-3’Seq.ID No.8
PA6(E)-II：5′-CGTCTAGATCTAAGAGTATGGTGTAGTGTAG-3’Seq.ID No.9
A9(E)-I：5′-CGGGATCCATGTGTTACCGTCAAATC-3’Seq.ID No.10
A9(E)-II：5′-CGTCTAGATCTGTAAATAGTTTTGGGCTTCG-3’Seq.ID No.11
1 ggtaccacac aaagcaatta acaaagttaa ccaaatccca aattcgaatt tggttcccta
61 ttctacagcc taaccgtatt ctgagatctg attcagagtc atgaacagaa aataccaacc
121 tcgagctgac cggagcggca cgattttgac tcgtcgagcg tgtaaaagaa ggaagtacca
181 ttgttccatt caaggtcgta ggtaatacca ccgagctgct ccttgatgat attgaaatta
241 cgaccgttgg tccagtcgta ccaaaggtcg atcatcgaga gatcgccgga gtaattcatg
301 aacatgagcg cgtggaactt gtgtggccat ggcgtcggca ccggctcatc cgcggcggca
361 ttttcacgcc ggcggttata taaatgaaga taacgattac tatgagtggt cgtctaaaag
421 ccatgtgtat cagtgttgta ctgaagtttt ggttcgtgca cggaagataa attaaaatac
481 tatatagtat acagttcttt taaattctac ataaattgtt atcatcgaaa catacatttt
541 agtccattag tctactaaac tcattattga tgtataatct ctcaatctac aatcagaaat
601 gtatttgcaa aattaacaac aatattgggg aaagtgtttc ttggttcaaa atttgaacca
661 tccaaccaac aatcctttta aaatcatagc acaaaagaac tatgagagtt tcaaaaagaa
721 aatcaaaagc caaaacaaag cttttcttgc atgactcaat aaacctacac tacaccatac
781 tcttagatcc atgtgttacc gtcaaatcaa tgtgtttaaa agatgttaac cactaatcaa
841 gcatttacgt gtaaccggat caaccggatt tgggttttga atatgttgtg gagatgtata
901 taaatgataa attaattgaa tatcttaatt aatctgtgaa agaaactaca tcacacactt
964 tgttatttcc cctagctttt agttttttta tcatgcaaaa cttatgaagt aactagatca
1021 agatcacaaa aaaaaagcat cacttcactt catgacctaa ttattctcga agcccaaaac
1081 tatttacaga tctagagcgg ccgccaccgc ggtggagctc
注：1～6 pBluescriptKS多克隆位点序列
7～787修饰的启动子A6(E)序列
788～1087修饰的启动子A9(E)的序列
1088～1120 pBluescriptKS多克隆位点序列
Claims (5)
1.一种由A6、A9、TA29的功能区构建的能在植物花药中特异表达的启动子3P，它依次由Seq ID No.6的34-449的序列和Seq ID No.11的7-1087的序列组成。
2.一种由启动子3P与BN基因构建的植物雄性不育嵌合基因。
3.一种雄性不育表达载体，它含有权利要求2所述的嵌合基因。
4.按照权利要求3所述的雄性不育表达载体，它是pBin19-3PBN。
5.按照权利要求3所述的雄性不育表达载体，它是含有由LB、NPTII、Bxn、3P-BN-Nos、RB组成的基本单位的质粒pROK II、pBI121、或者pCAMBIA。
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