CN1331469C - 一种苯酞类二聚体的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种苯酞类二聚体化合物Levistolide A(LA)在制备抗肿瘤药物组合物中的用途，该化合物具有广谱逆转肿瘤细胞对抗癌药物的多药耐药性，能有效增强抗癌药物杀伤瘤体细胞，并且对心血管和免疫***毒副作用小。

Description

一种苯酞类二聚体的用途

技术领域

本发明涉及一种苯酞类二聚体，化合物Levistolide A(LA)在制备抗肿瘤药物组合物中的应用。

背景技术

肿瘤多药耐药(multidrug resistance，MDR)的产生是化疗失败的重要原因。多药耐药是指肿瘤细胞能对多种化学结构、功能和作用机制不同的抗癌药物产生交叉耐药。从某种意义上说，90％死于肿瘤的病例都与原发性或获得性耐药有关。

引起MDR的机制比较复杂，但肿瘤细胞膜上的主要“药泵”P-gp蛋白的过表达是MDR产生的重要原因。mdr1基因产物P-gp(p-glycoprotein)是一种跨膜糖蛋白，通过能量依赖机制，降低细胞毒药物在细胞内的积聚，获得多药耐药性。包括结肠癌、肾癌、肝癌、非小细胞肺癌、神经角质瘤和kaposis肉瘤等实体瘤，常被认为是抗药性的肿瘤，甚至可能在刚诊断时就有耐药性存在。这些肿瘤细胞有高水平的P-gp表达。如象急性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌等化疗敏感肿瘤，诊断时仅低水平表达P-gp，但治疗复发时会有P-gp的表达增加。针对P-gp的逆转剂是当前MDR研究的重点(参见Hilary Thomas et al.，Cancer Control，March/April 2003，Vol：10，No.2；Reuter CW et al.，Blood.2000；96(5)：1655-1669)。

目前具有代表性的P-gp逆转剂有Verapamil，CsA，三氟拉螓、三苯氧胺等。根据对MDR逆转剂的研究，有效的MDR逆转剂分子均带有杂环结构，带正电荷，疏水性达logp≥-1。同时，具有较好的抗肿瘤作用的MDR逆转剂更为理想。但已知逆转剂在有效体内逆转浓度时，均存在着明显的毒副作用，临床应用十分受限。因此国内外自1981年以来一直致力于探寻临床有效但毒副作用小的MDR逆转剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种化合物Levistolide A(LA)在制备抗肿瘤应用。

本发明化合物LA如式I所示：

式I

该式I化合物LA是一种苯酞(Phthalide，PA)衍生物的二聚体。

本发明式I化合物制备的抗肿瘤药物组合物优选是一种抗肿瘤细胞多药耐药性的药物组合物，即式I化合物作为肿瘤细胞多药耐药性逆转剂。本发明的抗肿瘤药物组合物还可以优选是一种抗肿瘤血管生成的药物组合物。

本发明的抗肿瘤药物组合物包含有效量的式I化合物以及至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明制得的药物既可以单独作为抗肿瘤药使用，也可以和其它抗肿瘤药物联合使用。

本发明式I化合物制备的抗肿瘤细胞多药耐药性的药物组合物，可与至少一种其它逆转剂联合使用，以达到提高逆转作用的目的；该逆转剂优选阿霉素、柔红霉素和长春新碱。

优选本发明的抗肿瘤药物组合物是针对实体瘤的。

本发明的式I化合物可按本领域已知方法配成肠道或非肠道组合药的制剂，如片剂、胶囊、颗粒剂、注射液等。

根据本发明原理，化合物LA还可以制备成用于肿瘤化疗的辅助保健品。

本发明的化合物具有广谱逆转肿瘤细胞对抗癌药物的多药耐药性(multidrug resistance，MDR)，它能有效增强抗癌药物杀伤瘤体细胞。LA与抗癌药物竞争性结合P-gp蛋白，从而抑制P-gp对药物分子的外排达到逆转目的。实验证明，它在对ADR(adriamycin，阿霉素)、DNR(daunorubicin，柔红霉素)等抗癌药作用于耐药肿瘤细胞具有类似于Verapamil的逆转效果，对VCR(Vincristine，长春新碱)的效果甚至比Verapamil高2-5倍以上。同时，LA类化合物没有Verapamil等已知逆转剂的心血管和免疫***毒副作用。该化合物可使肿瘤细胞多药耐药性大为降低5-50倍，且效应快。在给予有效剂量时，无论是体外培养的原代正常细胞，还是体内喂养小鼠都无明显的毒副作用。

附图说明

图1为从川芎或当归中分离纯化化合物LA的工艺流程

图2A为实施例1中川芎提取物294nm检测的的HPLC图.

图2B为川芎提取物294nm检测的的质谱图

图3A为MTT法检测不同浓度(ug/ml)的LA对不同细胞系的毒性

图3B为台盼兰拒染法检测LA对淋巴细胞和骨髓细胞的毒性

图4A为FCM检测DNR在k562/adr中的积聚

图4B为HPLC检测k562/adr对ADR的外排

图5为不同浓度LA与3H-azidopine竞争性结合P-gp后放射自显影的结果

其中1：空白对照，无P-gp，加³H-azidopine；

2：阳性对照，有P-gp，加³H-azidopine；

3：有P-gp，加³H-azidopine和0.5ug/ml LA；

4：有P-gp，加³H-azidopine和2ug/ml LA；

5：有P-gp，加³H-azidopine和6ug/ml LA；

6：有P-gp，加³H-azidopine和8ug/ml LA。

图6A为LA腹腔给药的药代动力学结果

图6B为LA尾静脉给药的药代动力学曲线

具体实施方式

实施例1：LA的分离和鉴定

从川芎或当归中分离纯化化合物LA的工艺步骤可参见图1的流程图。

LA的分离方法可以参见wang PS等的文章(Phytochemistry 1984；23；2033-8和Chinese Pharmaceutical Industry 1988；19：553-9)或Kaouadji M等(J Nat Prod 1986；49：872-7)和Naito T等(Heterocycles1991；32：2433-42)两篇文章。

本发明按图1的工艺步骤从川芎中所获物质为无色透明结晶，经LC-MS和HNMR鉴定。川芎提取物294nm检测的LC-MS的实时色谱数据见图2A和图2B。

实施例2-7是对化合物LA的细胞学效用评价

其中，所用的细胞系为k562(人慢粒髓性白血病细胞系)及k562/adr(k562经低剂量阿霉素长期诱导产生的耐阿霉素等化疗药的细胞系)；kb(人口腔上皮细胞系)及kbv200(kb经低剂量长春新碱长期诱导产生的耐长春新碱等化疗药的细胞系)。k562和k562/adr由浙江大学肿瘤研究所提供，kb和kbv200取自中国医学科学院血液学研究所药物室。

k562/adr多药耐药细胞系以P-gp升高为主要耐药机制。对阿霉素耐药20倍，对长春新碱、柔红霉素、米托蒽醌、紫杉醇等交叉耐药。

kbv200多药耐药细胞系，亦以P-gp表达升高为主要耐药机制。对长春新碱耐药100倍，对阿霉素、柔红霉素、紫杉醇等交叉耐药。

所用的试剂和仪器如下：

LA溶液：单晶用DMSO溶解，配成5mg/ml的工作液，用RPMI 1640配成工作液。阿霉素(ADR)，长春新碱(VCR)，RPMI 1640，MTT，小牛血清，柔红霉素(DNR)，Verapamil(Ver)，培养板，二氧化碳培养箱，酶标仪，高效液相色谱仪(HPLC)，流式细胞仪(FACS)，P-gp荧光抗体试剂盒UIU2(购自Immunotech A Coulter Company，France)。

实施例2：测定各耐药株主要耐药机理

分别收集培养的5×10⁶个k562、k562/adr、kb、kbv200细胞，PBS洗两次，按P-gp荧光抗体试剂盒(UIU2)的说明操作，进行FACS检测P-gp的表达，每个样本计数10,000个细胞。

各耐药株主要耐药机理的测定结果：

k562：P-gp表达1.02％；  k562/adr：P-gp高表达至83.6％；

kb：P-pg表达0.87％；    kbv200：P-gp高表达至76.3％。

上述实验证明k562/adr和kbv200两种耐药细胞株主要的耐药机制都是过表达P-pg，其敏感株p-gp的表达均呈阴性。

实施例3：测定各耐药株对阿霉素和长春新碱的耐药倍数

1).k562/adr细胞系

取对数生长期细胞，用含10％小牛血清的RPMI1640培养液配成细胞悬液，每孔100ul加至96孔塑料培养板，使每孔细胞数为2×10⁴个，30分钟后按浓度梯度0、0.01、0.1、0.5、1、5、10、20ug/ml分别加入100ul化疗药物阿霉素和长春新碱，每梯度设三个平行复孔，每孔终体积200ul，不足部分以RPMI 1640补足，置二氧化碳培养箱中，37℃，饱和湿度，5％CO₂条件下培养，CO₂条件下培养68小时。每孔加MTT50ul(2mg/ml)去上清，每孔加入DMSO 120ul，微量振荡器振荡，充分溶解药物，Elisa检测590nm波长OD值。

2).kbV200细胞系

每孔加100ul 1×10⁴ kbV200细胞至96孔板，6-8小时细胞贴壁后分组加50ul 6ug/ml Ver、10ug/ml LA，半小时后按1)中的浓度梯度分别加入化疗药物阿霉素和长春新碱，其余步骤同1)k562/adr细胞系。

3).计算方法

IC50＝抑制率为50％时的药物浓度.

耐药倍数(RF)＝耐药细胞IC50/敏感细胞IC50

测定结果：

k562/adr和kbV200对ADR/VCR的耐药倍数(IC50ug/ml)

	k562	k562/adr	RF	kb	kbV200	RF
							ADR	0.215±0.152	4.06±0.35	18.88	0.490	7.28	19.2
VCR	0.018±0.01	＞20	＞1120	0.090	＞20	＞222

耐药株对ADR和VCR的耐药性均高出敏感株许多，具有交叉耐药性。

实施例3：体外细胞毒性实验

测定LA对各细胞系的毒性，选择对细胞生长抑制率10％(IC90)左右的浓度作增敏实验。

1).材料

选取原代培养的细胞：人血液淋巴细胞，人成纤维细胞(Fibroblast)，人肝细胞(HL7702)，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，人骨髓细胞(D5P3).

细胞系：k562，k562/adr，kb，kbv200，ECV304(人内皮细胞系).

2).方法

MTT法和台盼兰拒染法

MTT法：接种细胞于96孔板中，k562、k562/adr细胞每孔5×10⁴细胞，人淋巴细胞每孔1×10⁶细胞，人成纤维细胞、人肝脏上皮细胞、HUVEC、kb和kbv200按每孔接种1×10⁵细胞。悬浮细胞接种后直接加LA，分为5个浓度梯度：0，10，20，40，80ug/ml。非悬浮细胞贴壁后按上述浓度加LA，每组设3个平行复孔，培养24小时后加50ul 2mg/ml的MTT，再37℃孵箱培养4小时检测。

台盼兰拒染法：按MTT同样方法接种细胞并分组加LA，24小时后每孔加5ul 4mg/ml的台盼兰，3分钟后显微镜下镜检，每孔计数500个细胞，染成蓝色的为死细胞，计算存活率。

3).计算方法：

存活率＝1-死细胞(蓝色)/500.

细胞生长抑制率IR＝1-(试验组OD值-调零孔OD值)/(对照组OD值-调零孔OD值).

实验结果：

a.MTT法检测不同浓度(ug/ml)的LA对不同细胞系的毒性(见图3A)

b.台盼兰拒染法检测LA对淋巴细胞和骨髓细胞的毒性(见图3B)

体外细胞毒性实验表明LA对正常的原代培养细胞相对毒性均较小，对肿瘤细胞系或内皮细胞系均具有一定的杀伤作用。LA从5ug/ml至40ug/ml作用于人原代成纤维细胞，扣除MTT本身的误差，基本上无任何毒副作用，而对ECV304在10ug/ml时就有半数以上的杀伤。对直接用filcol液分离培养的人淋巴细胞，LA浓度大于80ug/ml时亦无多少细胞调亡。对肝细胞和骨髓细胞，LA在高浓度时有一定的抑制作用。k562/adr和kbv200在10ug/ml时均为IC90范围左右，k562和kb的毒性反应于前两者相似，说明LA的细胞毒作用不受P-gp调控。

实施例4：LA对血管生成的抑制活性

由于LA较低浓度就对内皮细胞系ECV304和HUVEC的毒性很强，远高于对原代培养的人成纤维细胞系fibroblast的毒性，表明是具有选择性抗血管生成抑制活性的物质(见图3A)。

实施例5：测定化合物LA分别与阿霉素、长春新碱、柔红霉素等联合应用时的增敏效果

1).取对数生长期细胞k562/adr或kbv200，用含10％小牛血清的RPMI1640培养液配成细胞悬液，每孔100ul加至96孔塑料培养板，使每孔细胞数为2×10⁴个，细胞贴壁后，分三组对照组、Ver组、LA组加入50ul空白培养基、Ver(6ug/ml).LA(10ug/ml)，30分钟后按浓度梯度0、0.01、0.1、0.5、1、5、10、20ug/ml分别加入50ul ADR，VCR，DNR等化疗药物，每梯度设三个平行复孔，每孔终体积200ul，不足部分以RPMI 1640补足，置二氧化碳培养箱中，37℃，饱和湿度，5％CO₂条件下培养68小时。每孔加MTT 50ul(2mg/ml)去上清，每孔加入DMSO120ul，微量振荡器振荡，充分溶解结晶，Elisa检测590nm波长OD值。

2).药敏曲线拟合和增敏倍数计算：

药敏曲线拟合软件：IC50采用GraphPad Prism software(San Diego，CA)软件，使用sigmoldal药物反应非线形衰退模型分析。

增敏倍数＝无增敏剂时耐药倍数/有增敏剂时耐药倍数

实验结果：

表1.化疗药物与LA或VER联用后对k562/adr细胞杀伤作用IC50(ug/ml)

	抗肿瘤药物
				增敏剂	ADR	VCR	DNR
无VERLA	2.288±0.2890.152±0.0210.189±0.015	＞＞2019.48±0.35512.04±0.209	0.367±0.0160.075±0.0100.105±0.005

表2.化疗药物与LA或VER联用后对kbv200细胞杀伤作用IC50(ug/ml)

	抗肿瘤药物
				增敏剂	ADR	VCR	DNR
无VERLA	1.970±0.1080.056±0.0190.040±0.013	＞209.171±0.5361.514±0.393	0.450±0.0630.028±0.004＜0.01

表3.LA和VER对k562/adr和kbv200的逆转效果比较：增敏倍数(RF)

	RF(k562/adr)			RF(kbv200)
							增敏剂	ADR	VCR	DNR	ADR	VCR	DNR
VERLA	15.03212.122	1.0266＞＞1.661	4.89333.4952	35.17849.250	2.180713.210	16.07145.000

上述实验结果表明：LA对阿霉素、长春新碱、柔红霉素等均有较强的对多药耐药肿瘤细胞具有明显的逆转作用。其中LA的作用效果相对突出。另外，从实验数据看LA对kbv200细胞的杀伤效果要好于k562/adr，推测这是因为LA协同作用于kbv200的其它促逆转机制(如促调亡等)。

实施例6：细胞内药物积聚和外排的检测

细胞内药物积聚浓度的减少使得药物不能达到有效的与受体结合的浓度，从而导致耐药性的产生。所以一个有效的逆转剂必须能减少药物的外排，增加细胞内药物的积聚。我们采用的分析方法是流式细胞仪(FACS)和高效液相色谱法(HPLC)。

1).积聚实验：

1×10⁶/ml浓度的细胞分四组，1组为k562细胞(k562为对照)加等量于10ug/ml LA体积的DMSO，2组为k562/adr细胞(k562/adr ctrl)加等量于10ug/ml LA体积的DMSO，3组为k562/adr加终浓度6ug/ml Ver，4组为孔k562/adr加终浓度10ug/ml LA，每组6ml置于10ml玻璃离心管，37℃水浴箱孵育。孵育半个小时后加5ug/ml的柔红霉素(DNR)共同孵育，按0’、15’、30’、60’、，90’、120’分别取样1ml，每次取样前先混匀。1000rpm×10’离心，弃上清，加PBS洗涤2次，冰上操作，立即用流式细胞仪检测柔红霉素的荧光强度，以荧光强度反映细胞内柔红霉素的相对含量。

2).外排实验：

1×10⁶/ml浓度的细胞分四组，1组为k562细胞(k562对照)加等量于10ug/ml LA体积的DMSO，2组为k562/adr细胞(k562/adr为对照)加等量于10ug/ml LA体积的DMSO，3组为k562/adr加终浓度6ug/mlVer，4组为孔k562/adr加终浓度10ug/ml LA，每组6ml置于10ml玻璃离心管，37℃水浴箱孵育。各组先与10ug/ml阿霉素共育120min，PBS洗涤两次，3和4组分别与6ug/ml ver、10ug/ml LA共育，1组和2组均与等量与加入4组与LA等量的DMSO。分别于0’，15’，30’，60’，90’，120’时点，同前取样，冻于-20℃，留于HPLC在254nm检测，以峰面积反映柔红霉素的相对含量。

FCM检测DNR在k562/adr中的积聚(结果见图4A)和HPLC检测k562/adr对ADR的外排(结果见图4B)。

该实验证明了LA(10ug/ml)能有效地在P-gp高表达的肿瘤细胞系中积聚抗肿瘤药，大幅延缓化疗药的外排，从而增加耐药细胞对药物的敏感性。同时，此实验亦一定程度表明LA的作用机制与P-gp的功能抑制有关。肿瘤细胞可随肿瘤细胞种类和分化阶段的不同、诱导药物的不同，表现不同的耐药表型，可以是某一耐药基因表达，也可是多种耐药基因同时表达，主要涉及多种依赖ATP的膜转运蛋白，如P-gp、MRP(multidrug resistance protein，多药耐药蛋白)、LRP(lung resistanceprotein，肺耐药蛋白)、BCRP(breast cancer resistance protein，乳腺癌耐药蛋白)等。另外，胞浆中的GSH/GSTs解毒功能增强、细胞核内Topo-II含量减少和活性下降，DNA修复机制发生变化等，亦被认为与肿瘤耐药的产生有关。

降低细胞内药物浓度或改变细胞内药物分布，是导致MDR的主要原因之一。LA及其类似物拮抗MDR的机制就是作用于P-gp或其基因表达，从而降低药物外排，提高了化疗药物的细胞内浓度，使肿瘤耐药细胞对低剂量化疗药物高度敏感。

实施例7：LA与P-gp的分子作用机理研究

1)LA对P-gp表达的影响

6孔板每孔加入5×10⁵个k562/adr细胞，分对照组、LA1(5ug/ml)、LA2(10ufg/ml)三组，各两个平行复孔。对照组加等量于5ug/ml LA的DMSO，LA1组加5ug/ml LA，LA2组加10ug/ml LA，37℃5％CO₂孵箱培养48小时后收集细胞。随后，按P-gp荧光抗体试剂盒(UIU2)的说明操作，进行FACS检测P-gp的表达，每个样本计数10,000个细胞。

试验结果：LA对P-gp表达的影响

	对照	LA(5ug/ml)	LA(10ug/ml)
				k562/adr	79.8％	76.7％	77.8％
kbv200	87.76％	82.5％	79.8％

数据显示LA对两种耐药细胞系的P-gp表达无任何明显的影响，LA不能下调P-gp的表达。

2)亲和成像检测P-gp与³H-azidopine的关系

材料：³H-azidopine购自Amasham公司，Kodak放射胶片，聚丙烯酰铵电泳用品和装置

方法：按H.Okumura等(Mol.Pharmacol.58(2000)1563-1569)方法，制备含蛋白100ug的kbv200细胞的膜囊泡，室温下膜囊泡分别与不同浓度LA(0ug/ml，0.5ug/ml，2ug/ml，6ug/ml，8ug/ml)共育，同时每组加1um³H-azidopine孵育20min。25℃366nm波长连续曝光20min，样品溶在5×SDS缓冲液中，7.5％聚丙烯酰铵电泳并固定，曝光6-24h后放射自显影。

实验结果：

3H-azidopine是P-gp特异性底物，加入不同浓度的LA后，亲和成像(photoaffinity labelling)检测P-gp与³H-azidopine的关系：放射自显影的结果是条带越来越小(图5)，说明了LA能竞争性结合到P-gp，从而阻断化疗药物与P-gp的结合，增加药物浓度，减少外排。

实施例8：动物模型实验评价

1)药代动力学分析

动物：Balb/C小鼠，4-6周，雌性，体重18±1g，购自浙江大学医学院实验动物中心；

2)腹腔给药的药代动力学

a.LA溶液溶于PEG400：Tween20(9∶1体积比)，120ug LA/只腹腔注射；

b.分别于5’，10’，20’，30’，60’，2h，4h，8h，12h，24h时点剪尾取血，肝素抗凝，2000rpm×4’低温离心，取上清，-20℃保存。

c.Rp-HPLC在245nm检测。

3)尾静脉给药的药代动力学

a.LA溶液溶于PEG400：5％葡萄糖(7∶3体积比)，120ul/只(含500ug LA)施行尾静脉给药。

b.以下步骤同实施例7的2)中的b-c。

4)LA对荷瘤小鼠整体实验的逆转作用

实验用Balb/c小白鼠，体重18±1g，4-5周龄。

方法：皮下接种2×10⁷/ml kbv200细胞0.2ml后五日分组，1组为对照组，长春新碱i.p.(腹腔注射)4ug/鼠/天组，长春新碱i.p.4ug/鼠/天加LA i.p.10ug/鼠/天组，长春新碱i.p.4ug/鼠/天加LA i.p.20ug/鼠/天组。药物注射5天为一个疗程，休息两天，再用药3个疗程后活杀取瘤.

结果：腹腔给药的药代动力学结果见图6A；尾静脉给药的药代动力学曲线见图6A。

LA在腹腔给药时在小鼠体内30min左右血药浓度达到最高，尾静脉注射时在小鼠体内20min左右血药浓度达到最高，在2-4h后LA血药浓度降低一半，24h基本检测不到。

LA对荷瘤小鼠整体实验的逆转作用：

组别	瘤重(g)
		对照	0.958±0.324
VCR	0.779±0.267
		VCR+LA1(6ug/ml)	0.631±0.174a
VCR+LA2(10ug/ml)	0.519±0.246b

每组N＝8；a和b与对照组相比p值＜0.01；a和b与VCR组相比p值＜0.05；

上述实验中长春新碱组的瘤体生长比对照组缓慢，长春新碱对kbv200所致实体瘤有一定的抑制作用，但作用效果不是很明显。当长春新碱与LA1(10ug/鼠/天)共同作用时，瘤体的抑制率明显升高，说明LA可明显提高Vin的抗瘤效果。Vin与LA(20ug/鼠/天)作用时，瘤体生长极为缓慢，进一步说明LA的有效增敏作用。但当提高LA至20ug/鼠/天时，LA除了有效增敏外可能亦参与了抗肿瘤、抑制血管生成等作用。

Claims (5)

1.一种式I所示的化合物LA

式I

在制备抗肿瘤药物组合物中的应用，其中所述组合物含有有效量的式I化合物和抗肿瘤药物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物组合物是抗肿瘤细胞多药耐药性的药物组合物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物组合物包含至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物选自阿霉素、柔红霉素和长春新碱。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为实体瘤。

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