CN1327228C - 鉴定样品中的n-末端前bnp的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及到一种方法,该方法用于通过至少两种抗体来鉴定样品中的N-末端前BNP,这些抗体检测N-末端前BNP的不同表位。该方法用于对健康个体和NYHA I至IV级患者的样品进行区分或归类。本发明进一步涉及到重组N-末端前BNP,该N-末端前BNP作为标准在鉴定N-末端前BNP的方法中的应用,用于检测重组N-末端前BNP的抗体及它们的生产。
Description
技术领域
本发明涉及到一种方法,该方法用于通过至少两种抗体来鉴定样品中的N-末端前BNP(N-terminalem pro BNP),这些抗体检测N-末端前BNP的不同表位。该方法用于对健康个体和NYHA I至IV级患者的样品进行区分或归类。本发明进一步涉及到重组N-末端前BNP,该N-末端前BNP作为标准在鉴定N-末端前BNP的方法中的应用,用于检测重组N-末端前BNP的抗体及它们的生产。
背景技术
心力衰竭是一种广泛的现象,特别是在西方世界中。根据罗氏(Roche)医学字典(1993,Urban&Schwarzenberg),心力衰竭是在进行身体运动或甚至在静息时心脏产生代谢所需的血流的能力或确保静脉回流的能力的急性或慢性衰退(退行性或进行性衰竭)。因此,该心脏的泵血功能是脆弱的。心力衰竭的起因十分复杂。除其它原因之外,本文提及心肌的炎症和衰退变性,冠状动脉灌注失调(coronaryperfusion disorder),冠状动脉硬化和伤损。这导致了外周血流的改变,呼吸紊乱,肾功能紊乱和电解质代谢失调(水肿),并且导致骨骼肌***性能降低。
根据纽约心脏联合会(NYHA),经过在运动后的身体测试,心力衰竭被分为以下的NYHA级别:I指的是在正常身体运动后完全无痛苦,II指的是体力活动轻度受限,III指的是体力活动明显受限,IV指的是随着每一次身体活动机能不足的症状均有所增加,该机能不足的症状在静息时多数时间仍存在。
对于通过糖苷、血管扩张剂、ACE抑制剂和/或β-阻断剂进行的对心力衰竭的有效医疗来说,心力衰竭的精确诊断和在可能的情况下根据严重程度进行分类以及在治疗期间进行额外的监测是最为必要的。
根据本领域的现状,一些用于心力衰竭的血清标记已经过研讨,例如ANP(N-末端心房利尿钠肽激素)和前ANP,CNP(C-利尿钠肽),adrenomedulin,神经肽Y,endotheline和BNP(脑利尿钠肽)。ANP和前ANP一般适用于心力衰竭的诊断用标记;但它们在血液中不稳定或仅有短暂的半寿期,这对诊断测试是一个障碍(Clin.Sci.95(3)(1998),235-239;Clenland et al.,Heart 75(1996),410-413).
BNP是一种经常被引用并很有意义的标记(脑利尿钠肽)。BNP最初在猪脑中被鉴定.它是一种心脏激素,在结构和功能上类似于ANP(心钠素)(Sudoh et al.,Nature 332(1988),78-81)。人类BNP由32个氨基酸组成,它主要由心室分泌并在人类血浆中进行循环。已知的BNP作为诊断标记的应用的例子来自EP-A-0 542 255。BNP具有分子内的二硫键并且作为一种分析物不很稳定,这据估计是由于BNP作为激素发挥生理功能,因而必须被迅速分解的原因.。因此,它作为一种诊断标记的应用仅仅是有限的(Masuta et al.,Clin.Chem.Vol.44 No.6 Supplement A(1998),130;Tsuji et al.,Clin.Chem.40(1994),672)。
BNP的前体分子,即前BNP,由108个氨基酸组成,该前体分子中的上述32个C-末端氨基酸被称为BNP,它产生实际的激素效应。从该前体中释放的N-末端氨基酸1-76被称为N-末端前BNP.除BNP(77-108)外N-末端前BNP以及进一步裂解的产物(1-76)也在血浆中进行循环(Hunt et al.,Biochem.Biophys.Res.Com.214(1995),1175-1183),这样N-末端前BNP作为心力衰竭的标记也是相关的。是否该前体分子前BNP也在血浆中存在尚未完全明确。然而据描述(Hunt et al.,Peptides,Vol.18,No.10(1997),1475-1481)在血浆中可以检测到较低量的前BNP(1-108)的释放,但由于N-末端的迅速部分降解,所以缺少一些氨基酸。在该文献中该分子被称为高分子量BNP。
WO 93/24531(US5,786,163)描述了一种鉴定N-末端前BNP的免疫学方法及该方法所使用的抗体。为获得这些抗体,本文使用了合成产生的单一一种肽,该肽来自N-末端前BNP的序列。通过肽免疫来进行的抗体生产在原则上是可行的,但对完整分子的亲和性通常很低而达不到测试过程所必需的灵敏度。另外,当使用该肽时还有这样的危险,所获得的抗体可以识别该肽的C-末端并且因此只能结合完整分子的这一片段。根据这一结果,这些抗体不能结合完整的分子或仅在较低的程度上结合。在WO 93/24531中产生了抗单一一种肽的多克隆抗体,该肽来自N-末端前BNP。据显示,所产生的抗体以竞争测试模式同该免疫肽(氨基酸47-64)结合。然而没有显示读抗体可以结合样品中作为完整分子的天然N-末端前BNP。另外,在WO 93/24531中所描述的样品中的三明治测试无法如其所迷进行,这是因为没有适当的标准材料以及没有抗两种不同表位的抗体。
本领域中的一个更进一步的问题是测试的灵敏度。在WO 93/24531中进行的竞争性测试中,在标记状态的肽47-64作为追踪物同样品或未标记肽标准47-64竞争结合来自兔血清的多克隆抗体的情况下,温育48小时后仅达到非常温和的竞争,从读竞争仅仅能产生约250fmol/ml的检测低限。这无论对于区分健康个体和患有心力衰竭的患者还是根据心力衰竭的严重程度对患者样本进行分级都是不够的。另外,竞争性测试的长温育时间也是为自动化实验室的样品常规测试所不能接受的。
Hunt等人(Clinical Endocrinology 47(1997),287-296)还描述了一种用于N-末端前BNP检测的竞争性测试。对于该测试,在测试进行前必须对血浆样品进行复杂的抽提;这可能导致被测试物的破坏和测量误差。所使用的抗血清类似于WO 93/24531通过以合成肽进行免疫来产生。Hunt等人通过以N-末端前BNP氨基酸1-13进行免疫产生抗血清,并且氨基酸1-21的肽被用作标准。长温育时间也是该测试所必需的。温育24小时后达到1.3fmol/ml的检测低限。
因此,本领域中没有检测N-末端前BNP的方法能在短温育期间对天然N-末端前BNP进行可靠灵敏的检测。
因此,提供一种在样品中鉴定N-末端前BNP的方法是一个目标,该方法尽可能避免上述的本领域的缺点。特别应当达到一个高测试灵敏度以对健康个体和NYHA I至IV级患者的样品进行区分。
发明内容
通过一种在样品中鉴定N-末端前BNP的方法该目标已经达到,该方法在权利要求中被更详尽地解释。该方法的特征在于其利用识别N-末端前BNP的不同表位并能同时与N-末端前BNP结合的至少两种抗体,通过三明治方式进行,其中对N-末端前BNP的检测低限低于每ml所述样品lfmol。
在本发明的方法中,天然的N-末端前BNP在样品中被检测十分重要。这意味着该抗体必须能够鉴定并且特异性地结合样品中的完整的分子和可能产生的未切割前BNP(1-108),如果可能还结合样品中的蛋白部分消化片段。对于该方法,至少两种不同的抗体被使用,这些抗体结合该N-末端前BNP的不同表位。该表位可以是线性的或所谓的构象表位。在优选的情况下这些表位的定位方式允许这两种抗体同时结合并且相去不远。
由于本发明的方法不能区分N-末端前BNP,前BNP和亲本(naheverwandten)肽(裂解产物),NT-前BNP指的是以下所有在测试过程中被鉴定的肽,特别是已知的N-末端前BNP(1-76)。
根据本发明,术语“表位”指的是在一个免疫结合配体,如抗原上的结合位点,一种抗体对其特异性地结合。通常一种表位被6-8个氨基酸清晰地定义。根据本发明,该结合配体对应于N-末端前BNP或其部分序列。抗体结合在表位上,表位构成了结合配体的部分区域,该表位可以是线性形式或构象表位。
通过具有不同的特异性的两种抗体的方法,对被分析物进行一种较快速的鉴定方法是可行的,该方法无需目前本领域的长时间竞争性测试过程。本发明的检测方法可通过均相或多相的测试过程的手段进行。在优选的情况下使用了多相的测试过程,在特另别优选的情况下使用了专家所知的三明治过程。
在优选的情况下,这样的确定N-末端前BNP的方法根据以下步骤进行:
a)将样品同N-末端前BNP特异性第一抗体相混合,该抗体携带有适于同固相结合的基团,通过该基团,可以结合在固相上,或者将样品同N-末端前BNP特异性第一抗体混合,该抗体已经结合于一种固相
b)将该溶液同第二种抗体相混合,该抗体识别NT-前BNP的一种表位并携带一种标记,该表位不同于第一种抗体所识别的表位
c)使该免疫混合物同一种固相相结合,该固相可以在步骤a)中便已存在
d)将固相同液相分离
e)在一种或两种相内检测标记。
在一种定量检测中,以一定量的N-末端前BNP作为标准物进行了相同的测量,并且在确定样品后进行了步骤e),即,将标准物测量值同样品测量值相比较,随后进行定量化。
术语“抗体”意指——根据本发明——单克隆或多克隆,嵌合或人源化或其它可通过遗传工程修饰获得的抗体以及为专家所知的所有片段,例如,F(ab′)2,Fab′或Fab片段。只是必须保证对N-末端前BNP有免疫特异结合能力。
对N-末端前BNP特异的第一抗体可以直接结合于固相或通过一种特异的结合***结合于固相。该抗体同固相的直接结合根据专家所知的方法进行,例如通过吸附。如果该结合为通过一种特异的结合***的间接结合,该第一种抗体为一种偶联物,该偶联物由N-末端前BNP的抗体和一种特异性结合***的配偶体组成。一种特异性结合***在此处指的是两种可以互相特异性反应的配体。该结合能力可以基于一种免疫反应或一种不同的特异反应。在优选的情况下,生物素和亲合素或生物素与链亲合素的组合被用作特异性结合***。进一步优选的组合为生物素和抗生物素,半抗原和抗半抗原,一种Fc-片段和抗该Fc片段的抗体,或者糖类与外源凝集素。该特异性结合***的反应配偶体的一种为该偶联物的一部分。
在该特异性结合***的第一种结合配偶体的另一种反应配偶体为固相的一层。链亲合素或亲合素被优选使用。该特异性结合***的另一种反应配偶体同可溶载体材料的结合可以根据专家所知的通常方法来进行。在此一种共价结合以及一种吸附结合是适合的。
试管或微滴度板适于作为固相,该微滴度板由聚苯乙烯或类似的合成材料制成,该固相在其内表面覆盖有该特异结合***的一种反应配偶体。适合并且特别优选的进一步物质为颗粒材料,如乳胶颗粒,磁性颗粒,分子筛材料,玻璃珠,塑料管或其它。多孔层状载体如纸或纤维素也可以被用作载体。覆盖有上述特异性结合***的相关结合配偶体的磁珠被特别地优选使用。测试反应完成之后,这些微粒可以从液相中被分离以用于检测反应过程,分离手段如过滤,离心或在使用磁珠的情况下通过一磁体。
第二种特异性抗体识别N-末端前BNP的一个表型,与第一种抗体所识别表型的相比该表型与之不同。这两个表型在分子上的距离必须足够远以使N-末端前BNP的两种抗体可以无保留地同时结合;否则不能形成三明治复合物。
在N-末端前BNP抗体同N-末端前BNP之间的特异结合反应的检测可以通过不同的方法进行。在通常情况下,第二种抗体被标记。通常的标记为生色原,荧光基团,适于化学或电化学发光的物质,放射性同位素,半抗原,酶标记或能够形成特异结合组合的物质如生物素/链亲合素。该免疫复合物随即通过该标记所发射的信号来检测。例如,该第二种抗体可被半抗原洋地黄毒苷所标记。该半抗原再同一个洋地黄毒苷特异性抗体相结合。该洋地黄毒苷特异性抗体本身被一种酶所标记,例如过氧化物酶。随后通过加入该过氧化物酶的一种特异性底物所产生的颜色或消光来进行最后的检测。
专家已知的所有生物液体可以被用作用于鉴定N-末端前BNP的方法过程的样品。优选的样品为体液如全血,血清,血浆,尿或唾液。使用血清和血浆是特别优选的。
除使用在液相中的测试试剂进行的所谓的湿测试外,还可使用所有适于检测抗原、半抗原、肽、蛋白、抗体等等的常见的干测试模式。如在EP-A-0 186 799中所描述,这些干测试或测试条将所有的测试组分合并入一个单一载体——待分析样品除外。当测试条与该液体样品接触时测试反应开始。
本发明的方法的特征在于其对于N-末端前BNP的低检测限制,该限制低于1fmol/ml(对应于1pmol/l)。根据本发明的<1fmol/ml的高灵敏度无需长的温育期间便可达到。一次微滴度测试的总时间低于2小时,在优选的情况下,以诸如电化学发光这样的更灵敏的方法该时间约为15分钟。对于该检测方法,待测浓度所造成的的上限几乎并不存在。该技术上限通常是所用的测量手段所造成的。该方法原则上还能检测非常高浓度的N-末端前BNP。
本发明的方法的一个进一步的优点是通过所获得的测量数值对患有和未患有心力衰竭的患者样品的良好分辨力。该检测手段十分灵敏以至于可以将没有冠状动脉疾病的个体同患有程度轻微的或仅仅处于慢性发病的NYHA I和II级心力衰竭患者进行区分。初期心力衰竭的这样的早期确定可以影响开始以药物进行一种早期治疗的决定,并且因此较容易延长该患者的存活几率。
本发明的另一个内容是重组产生的N-末端前BNP。N-末端前BNP为N-末端部分,该部分由氨基酸1-76组成并从由108个氨基酸组成的前体分子N-末端前BNP中释放。N-末端前BNP还包括其本身的一部分,该部分可能由于该分子的切断反应而在血液中出现。
迄今为止本领域没有已知的重组N-末端前BNP,这是由于氨基酸序列较短导致其生产比较困难。就多于30个氨基酸的较大肽而言,其化学合成无法作为宿主有机体的重组生产的替代方法,这是由于所产生的错误序列和每个合成循环中强烈减少的产量的缘故。
然而,对于一种诊断检测,一种标准物或参比材料经常是必需的。如果需要定量化,必须使用一个标准物系列进行一个确定的定量校准。但是,只有在被用作标准物的材料在免疫测试中与该被分析物性能相同或相似的情况下,这样的校准才是有用的。该标准物与被分析物具有充分的结构相似性以及特别具有免疫相似性是十分重要的,这样可使标准物同检测抗体的结合类似于样品中天然分子与检测抗体的结合。
用于检测N-末端前BNP的方法的这种标准并不能由本领域来给出。被描述的只有短的合成肽。根据本发明,在遗传合成的帮助下,现在首次可以产生编码N-末端前BNP的DNA序列并且可以在E.coli中获得该N-末端前BNP的重组表达。实施例1描述了实验过程。
因此,本发明的一个进一步的内容是重组N-末端前BNP在鉴定样品中的N-末端前BNP的方法中作为标准物的使用,该检测通过至少两种识别N-末端前BNP的不同表位的抗体进行。
出于免疫化的原因,本领域只使用了来自N-末端前BNP的合成短肽。肽免疫化的缺点是多数时间只能获得非常低亲和力的抗体或者所获得的抗体只与线性表位反应,该缺点还在于样品中的天然折叠的抗原不能被发现见实施例3。
因此,免疫化以制备一种免疫原的抗体并使用之是十分重要的,这种免疫原与待测的分析物有足够的一致性。只有这样才能保证,抗体与样品中的天然分析物有高度的亲和力.
因此,本发明的一个内容是重组N-末端前BNP在抗N-末端前BNP抗体的生产中作为免疫原的使用。
本发明的一个进一步的内容是抗N-末端前BNP的抗体。该术语抗体的定义对应于关于测试过程的段落中所给出的定义。在优选情况下,本发明的抗体特异地识别76氨基酸的大N-末端前BNP的N-末端部分,优选情况下在氨基酸区域10-66,特别优选的情况下在氨基酸区域10-50或10-38.当甚至在样品中末端经蛋白酶消化的N-末端前BNP仍含有该表位时,该被抗体识别的表位的定位是有效的。这样该被分析物的稳定性就或多或少地成为次要的。在N-末端前BNP的优选区域中的表位可以是线性形式或构象表位。
因此,本发明的一个优选的内容为由细胞系MAK M10.1.1和MAK M13.4.14所产生的单克隆抗体,该细胞系由DSMZ于1999年1月26日收到并保存,Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen,GmbH,Brunschweig,Germany.这两个细胞系产生的抗体为IgG型抗体.细胞系M 10.1.1和13.4.14也是本发明的一个内容。
本发明的一个进一步内容为与细胞系M 10.1.1和M13.4.14所产生的抗体等效的方式产生,并且适于同N-末端前BNP结合的抗体.措辞“以等效方式产生的抗体”的意思是该抗体通过以重组N-末端前BNP进行免疫化来产生。
本发明的内容还有用于产生特异结合N-末端前BNP的抗体的方法。
在优选情况下,多克隆抗体的产生根据以下步骤进行:以重组产生的N-末端前BNP对一种适当的生物,如绵羊进行免疫,分离抗体,检出最具反应性的表位并且经过适当的肽的免疫吸附对抗体进行纯化。该方法在实施例2中有描述。
在优选情况下,单克隆抗体的产生根据以下步骤进行:以重组产生的N-末端前BNP对一种适当的生物,如小鼠进行免疫化,根据抗体对不同患者血清库中的天然N-末端前BNP反应性选择克隆。该方法在实施例3中有描述。
具体实施方式
本发明在下列实施例中有更详细的描述:
实施例1
重组N-末端前BNP(1-76)的生产方法
1.
重组N-末端前BNP的克隆
N-末端前BNP(氨基酸序列1-76)的核苷酸序列通过遗传合成手段来产生。为获得该基因在大肠杆菌中的最佳表达,该序列被适配以在大肠杆菌中最常用的密码子。用于产生该基因的寡核苷酸序列如下:
Pro5′(SEQ ID NO 1).
5′CCGGATCCCACCCGCTG3′
Pro1hum(SEQ ID NO 2):
5′CGGGATCCCACCCGCTGGGTTCCCCGGGTTCCGCTTCCGACCTGGAAACCT
CCGGTCTGCAGGAACAGCGTAACCACCT3′
Pro2hum(SEQ ID NO 3).
5 ′CGGTTCCAGGGAGGTCTGTTCAACCTGCAGTTCGGACAGTTTACCCTGCAG
GTGGTTACGCTGTTCCTGC3′
Pro3hum(SEQ ID NO 4)
5′CAGACCTCCCTGGAACCGCTGCAGGAATCCCCGCGTCCGACCGGTGTTTGG
AAATCCCGTGAAGTTGCTAC3′
Pro4hum(SEQ ID NO 5):
5′CCCAAGCTTAACGCGGAGCACGCAGGGTGTACAGAACCATTTTACGGTGA
CCACGGATACCTTCGGTAGCAACTTCACGGGATTTCC3′
Pro3′(SEQ ID NO 6):
5′CCCAAGCTTAACGCGGAGC3′
该基因的产生是通过以这些引物使用PCR(聚合酶链反应)来进行的。被扩增的基因被克隆入诸如pUC19这样的适当载体并随后测序。为将该基因克隆入表达载体pQE8,该基因通过限制性酶切位点BamHI和HindIII从载体pUC19上被切下并且连接入载体pQE8并转化入E.coli M15[pREP4],该载体pQE8可以表达具有N-末端组氨酸标记的蛋白。
2.
N-末端前BNP在E.coli中的表达
为进行该基因在E.coli中的表达,将一个重组E.coli克隆的过夜培养物以1/60转入Luria-Broth(含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素)并且在OD550为1时以IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷;终浓度1mM)进行诱导。诱导后培养物在37℃下继续培养4小时。随后对该培养物进行离心,收集细胞沉淀于pH8.0含300mMNaCl的50mM磷酸钠缓冲液中。经超声裂解该细胞悬浮物后,将悬浮物进行离心并将上清加入Ni-NTA(三乙酸次氮酯)柱。以含300mMNaCl和20mM咪唑的pH8.050mM磷酸钠缓冲液进行洗涤后,组氨酸标记的N-末端前BNP以pH8.0含300mMNaCl和300mM咪唑的50mM磷酸钠缓冲液进行洗脱。收集该洗脱流分并以50mM pH8.0的NaCl进行透析。透析产物被加至Q-sepharose以分离杂质.通过MALDI-TOF确定主要的纯化N-末端前BNP。
实施例2
抗N-末端前BNP的多克隆抗体的产生
1.
免疫化
以完全弗氏佐剂中的重组N-末端前BNP(1-76)对绵羊进行免疫化。该剂量为0.1mg每只动物.在10个月的期间内以4周为间隔重复进行免疫化。在第一次免疫化后6周开始,每一个月取一次血清并且测定其灵敏度和滴度。
2.
多克隆抗体从绵羊血清中的纯化
从以N-末端前BNP免疫化的绵羊的粗制血清开始,脂成分通过以气溶胶进行的去脂过程而除去。随后以硫酸铵(2M)分离免疫球蛋白。以pH7.0的15mM的KPO4,50mM NaCl对经过溶解的沉淀进行透析并经DEAE sepharose层析。IgG流分,PAK<rec.NT-前BNP>S-IgG(DE)存在于洗脱组分中。
3.
用于产生NT-前BNP特异性多克隆抗体的连续亲和层析
为纯化针对氨基酸1-21,PAK<rec.NT-前BNP>M-IgG(IS,1-21)的NT-前BNP特异性多克隆抗体而使用了C-末端生物素化的肽HPLGSPGSASDLETSGLQEQR-Bi(1-21-Bi,序列号NO 7)。亲和基质通过向10ml链亲和素覆层的丙烯酸脂聚合物颗粒加入1mg肽(1-21-Bi)而产生。
以10ml亲和基质填装成一根柱子,以50mMKPO4,150mMNaCl,pH7.5(PBS)进行平衡。为进行连续亲和层析的第一步,将850mg PAK<NT-前-BNP>S-IgG(DE)与柱结合。保留该洗脱物以用于第二步(见后)。以PBS和20mMKPO4,500mMNaCl,0.1%Triton X-100,0.5%脱氧胆酸钠,pH7.5对柱进行洗涤。与该亲和基质特异结合的IgG被ImmunoPureGentle Ag/Ab洗脱缓冲液(Pierce产品号21013)洗脱.以1M丙酸再生该柱并在PBS/NaN3中保存。
通过与上述相同的途径,肽Bi-ELQVEQTSL(Bi-30-38序列号8)被用于产生一种亲和基质以用于纯化抗氨基酸30-38的NT-前BNP特异免疫球蛋白。从第一次亲和纯化的洗脱液中收集PAK<rec.NT-前-BNP>M-IgG(IS,30-38)。
4.
PAK<NT-前BNP>S-IgG(IS,1-21)的生物素化
以生物素化缓冲液(100mM KPO4,70mM NaCl pH8.0)对亲和纯化的抗体进行透析并且随后该溶液被调至蛋白浓度1mg/ml。将溶于DMSO的D-生物素基-氨基己酸-N-羟基丁二酰亚胺酯以摩尔比为1∶7.5加至抗体溶液中。通过加入L-细胞溶素终止该反应,通过透析除去多余的标记试剂。
5.
PAK<NT-前BNP>S-IgG(IS,30-38)的洋地黄毒苷化
以洋地黄毒苷缓冲液(100mM KPO4,70mM NaCl pH7.6)对亲和纯化的抗体进行透析,随后该溶液被调至蛋白浓度1mg/ml。将溶于DMSO的洋地黄毒苷-3-CME-N-羟基丁二酰亚胺酯以摩尔比为1∶5加至抗体溶液中。通过加入L-细胞溶素终止该反应,通过透析除去多余的标记试剂。
实施例3
抗N-末端前BNP(1-76)的单克隆抗体的产生和检测
1.
获得抗NT-前BNP(1-76)的单克隆抗体
以100μg重组N-末端前BNP抗原同弗氏佐剂对8-12周大的Balb/c小鼠给药以进行腹膜内免疫化。6周后,以4周为间隔进行3次进一步的免疫化。最后一次免疫化后一周取血并测定测试动物的血清中的抗体滴度。从阳性反应小鼠的脾脏中获得B-淋巴细胞并将其同永生的骨髓瘤进行融合。该融合根据Khler和Millstein(Nature256,1975,p.495-497)的已知方法进行。此处构建的杂交细胞原代培养物通过常用途径进行克隆,例如,通过使用可购得的细胞分选仪或通过“限制性稀释”。只有这些克隆,在适当的测试过程中,如酶免分析(ELISA-方法)同重组N-末端前BNP发生阳性反应并且识别患者血清中的天然N-末端前BNP的克隆,接受加工(见第2点)。通过这一途径收集了产生本发明的单克隆抗体的几个杂交瘤细胞系。
为产生腹水,5×106的杂交瘤细胞经腹膜内注射入Bal/c小鼠,该小鼠在此之前已经过Pristan处理1至2次。2-3周后在小鼠的腹部内获得腹水。该抗体从该腹水内通过常用途径分离。这些单克隆抗体特异地抗人类N-末端前BNP。此后它们被称为MAK M 10.1.11或MAKM 13.4.14。这些抗体均属于IgG1,κ亚类。
通过这一方法可以分离杂交瘤细胞系克隆M 10.1.11和M13.4.14,它们如上所述保存于DSMZ中。
2.
抗前BNP肽和重组NT-前BNP的抗体的检测测试
为在被免疫化的小鼠血清,杂交瘤细胞的培养物上清或腹水中鉴定抗NT-前BNP的抗体的存在及其特异性,该克隆根据下列测试原则进行估测:
a)对重组N-末端前BNP的反应
以2.5μg/ml作为抗原的重组NT-前BNP按100μl/孔在室温下同微滴度板(Nunc,Maxisorb)搅拌结合1小时,该重组NT-前BNP处于加样缓冲液中(Beohringer,0.2M碳酸钠/重碳酸钠,pH9.3-9.5,产品序列号No.726 559)。随后的加样在PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液,Oxid,Code-BR14a)和1%Byco C中进行30分钟。随后以洗涤缓冲液(0.9氯化钠溶液,0.05%吐温20)进行洗涤。抗体样品的温育以100μl/孔在室温搅拌下进行1小时。随后以洗涤溶液进行两次进一步的洗涤。随后,以检测抗体PAK<M-Fcy>S-Fab-过氧化物酶偶联物(Boehringer Mannheim,产品序列号No.1500 686)100mU/ml,100μl/孔在室温搅拌下进行进一步的温育。以洗涤缓冲液进行进一步洗涤后,通过通常的途径(例如,以ABTS,在室温下进行30分钟,以ELISA酶标仪在405nm测出以mE为单位的消光差异)测定该过氧化物酶的活性。
b)对N-末端前BNP肽的反应性:
在该过程中,经链生物素处理的的微滴度板同作为抗原的序列中1-10,8-18,1-21,16-30,30-38,39-50,50-63或64-76位的NT-前BNP-肽生物素偶联物结合,该偶联物以250ng/ml溶于含0.5%Byco C的PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液,Oxid,Code-BR 14a),结合以100μl/孔在室温下搅拌进行1小时。随后,以洗涤缓冲液(0.9氯化钠溶液,0.05%吐温20)进行洗涤。该抗体样品的温育和检测反应如a)所描述进行。根据同特定的NT-前BNP肽的反应性可以确定表位的位置。
c)对患者样品中的天然N-末端前BNP的反应性:
以5μg/ml的PAK<人类前BNP>S-IgG(IS,(1-21)或(30-38)S-IgG按100μl/孔在室温下同微滴度板(Nunc,Maxisorb)搅拌结合1小时,该重组NT-前BNP处于加样缓冲液中(Beohringer,0.2M碳酸钠/重碳酸钠,pH9.3-9.5,产品序列号No.726 559)。随后的加样在PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液,Oxid,Code-BR14a)和1%Byco C中进行30分钟。随后以洗涤缓冲液(0.9氯化钠溶液,0.05%吐温20)进行洗涤。以100μl/孔在室温下同稀释于PBS缓冲液的患者血浆天然抗原在搅拌下进行温育1小时。随后以洗涤溶液进行两次进一步的洗涤并且以检测抗体PAK<M-Fcy>S-Fab-过氧化物醇偶联物(BoehringerMannheim,序列号No.1500 686)100mU/ml,100μl/孔在室温搅拌下进行进一步的温育。以洗涤缓冲液进行进一步洗涤后,通过通常的途径(例如,以ABTS,在室温下进行30分钟,以ELISA酶标仪在405nm测出以mE为单位的消光差异)测定读过氧化物酶的活性。
3.
结果:单克隆和多克隆抗体对N-末端前BNP的反应模式
a)来自以N-末端前BNP进行的免疫化的MAKs(c=5μg/ml)的反应性
表1:
MAK | 免疫原 | 对前BNP肽的反应性 | 重组前BNP | 天然BNP | |||||||
1-10 | 8-18 | 1-21 | 16-30 | 30-38 | 39-50 | 50-63 | 64-76 | ||||
5.2.27 | 1-10 | 1.42 | 0.04 | 1.48 | 0.05 | 0.03 | 0.04 | 0.04 | 0.04 | 1.16 | 0.30 |
2.1.4 | 16-30 | 0.04 | 0.04 | 0.04 | 1.86 | 0.004 | 0.04 | 0.04 | 0.04 | 0.1 | 0.02 |
1.2.6 | 39-50 | 0.04 | 0.04 | 0.03 | 0.04 | 0.03 | 1.23 | 0.03 | 0.04 | 0.44 | 0.06 |
通过以不同的肽进行免疫化而获得的这些单克隆抗体同相对应的肽反映强烈。只有2个单克隆抗体被发现对重组N-末端前BNP的反应性,没有发生对患者库中的天然N-末端前BNP的反应(见表1)。
b)来自以重组N-末端前BNP进行的免疫化的单克隆抗体(MAKs)的反应性
表2:
MAK | 对前BNP肽的反应性 | 重组前BNP | 天然BNP | |||||||
1-10 | 8-18 | 1-21 | 16-30 | 30-38 | 39-50 | 50-63 | 64-76 | |||
10.1.11 | 0.04 | 0.97 | 1.03 | 0.04 | 0.04 | 0.06 | 0.04 | 0.04 | 1.61 | 1.70 |
10.3.19 | 0.04 | 0.04 | 0.04 | 0.04 | 0.04 | 0.05 | 0.04 | 0.03 | 1.24 | 0.91 |
10.3.30 | 0.04 | 0.04 | 0.03 | 0.04 | 0.04 | 0.06 | 0.04 | 0.03 | 1.43 | 0.79 |
13.4.14 | 0.04 | 0.04 | 0.04 | 0.04 | 0.04 | 0.05 | 0.03 | 0.04 | 1.65 | 1.83 |
13.1.18 | 0.04 | 0.04 | 0.03 | 0.04 | 1.14 | 0.03 | 0.04 | 0.04 | 1.47 | 0.56 |
13.2.22 | 0.04 | 0.04 | 0.04 | 0.04 | 0.04 | 0.03 | 0.04 | 0.04 | 1.82 | 1.61 |
通过以重组的N-末端前BNP进行免疫化而获得的这些单克隆抗体只同肽零星地进行反应,但同重组N-末端前BNP或患者库中的天然N-末端前BNP反应强烈。单个单克隆抗体同肽不反应表明了其对所谓的构象表位的识别(见表2)。
c)来自以重组N-末端前BNP进行的免疫化的PAKs的反应性:
表3:
PAK | 免疫吸附 | 对前BNP肽的反应性 | 重组前BNP | 天然BNP | |||||||
1-10 | 8-18 | 1-21 | 16-30 | 30-38 | 39-50 | 50-63 | 64-96 | ||||
S-9212 | 无 | 0.13 | 1.81 | 1.98 | 1.16 | 2.99 | 0.83 | 1.22 | 0.06 | 0.89 | - |
S-9212 | 1.21 | 0.99 | 2.99 | 2.99 | 1.00 | 0.20 | 0.13 | 0.20 | 0.15 | 1.98 | 1.41 |
S-9212 | 30-38 | 0.08 | 0.07 | 0.07 | 0.07 | 2.99 | 0.06 | 0.17 | 0.06 | 2.99 | 1.41 |
所获得的PAK对肽1-21和30-38表现出最强的反应.出于该原因选择了这些表位并且在这些肽的辅助下对该PAK进行了正性免疫吸附。以肽1-21免疫吸附的PAK对区域8-20表现出了最强的反应,而以N-末端序列1-10免疫吸附的PAK的反应明显降低。该方法免疫吸附的PAKs同重组N-末端前BNP反应十分强烈,而以PAK/PAK三明治模式的PAK同天然样品反应强烈(见表3)。
实施例4
NT-前BNP测定的高灵敏免疫分析
通过使用实施例2和3产生的抗体可以建立一种高灵敏的免疫分析。在一般情况下,应用具不同表位识别的两种抗体是适当的。作为例子描述了所谓的三明治-ELISA。
一种经链亲合素覆层的微滴度板(MTP)被用作固相。10μl未处理样品或校准物同100μl含两种表位特异性抗体的缓冲液一起被加入MTP孔,随即在室温下温育1小时。1μg/ml生物素化的PAK<rec.NT-前BNP>S-IgG(IS,1-21)和0.5μg/ml的洋地黄毒苷化PAK<rec.NT-前BNP>S-IgG(IS,30-38)作为抗体被使用。随后吸出该溶液并以350μl洗涤缓冲液洗涤3次。随后以微量取液器加入100μl偶联溶液并在室温下再温育1小时。一种抗地高辛抗体-POD偶联物作为偶联物被使用,其浓度为100mIU/ml。随后吸出该偶联溶液并以350μl洗涤缓冲液洗涤3次。最后向孔内加入ABTS底物溶液在室温下测量30分钟。底物反应达到30分钟后在MTP酶标仪中在405nm的波长下以495nm为参照直接测量该微滴度板。
为测定灵敏度而建立了一条校准曲线并且测定了零标准的精度(n=21)。人类EDTA血浆被用作校准物,该校准物随即通过在要求浓度下的重组N-末端前BNP而建立。牛血浆被用作零标准。该结果见表4。
表4:
消光值(平均) | 标准偏差(n=21) | |
校准物a:0fmol/ml | 131mU | 5.7mU |
校准物b:5.04fmol/ml | 268mU | |
校准物c:19.9fmol/ml | 746mU | |
校准物d:50.5fmol/ml | 1500mU | |
校准物e:100.9fmol/ml | 2401mU |
在22.5mU×ml/fmol的校准曲线梯度和SD5.7mU的基础上,根据Kaiser公式给出了较低检测限制:
UNG=3SD零标准/Ek梯度=3×5.7/22.5=0.76fmol/ml。
实施例5
N-末端前BNP稳定性的测定
在实施例4中所描述的三明治ELISA的帮助下测量了N-末端前BNP的分析物稳定性。为此目的,对4名II-III级NYHA患者进行取血并加入含EDTA的收集容器在室温下保存3天。每天取出一个样品测量其N-末端前BNP含量。用于测定稳定性的EDTA血浆中的样品及参照直接在4-8℃下冰冷并且在15分钟内进行离心。在4℃和室温下保存该EDTA血浆并随即在24小时胁迫期间在不同时间点进行测量。结果见表5。
表5:
胁迫时间 | 收率(%) |
EDTA-全血,室温 24h | 98.8 |
48h | 98.0 |
72h | 100.5 |
EDTA-血浆,4℃ 2h | 97.5 |
4h | 98.5 |
6h | 102.0 |
24h | 103.0 |
EDTA-血浆,室温 2h | 103.0 |
4h | 104.8 |
6h | 102.0 |
24h | 96.0 |
这些数据证明N-末端前BNP在被测试期间完全稳定,因此可以被用作常规参量。该结果与文献不一致(Hunter et al.,ClinicalEndocrinology,47,287(1997))并且证实了通过以两种特异抗体进行的测试模式的选择和设计可以影响被分析物的稳定性的设想,该特异性抗体的表位并不位于该被分析物的远末端。
实施例6
该N-末端前BNP分析的诊断灵敏度的测定
在实施例4中所描述的测试被再次使用以测定诊断灵敏度。为此目的,114个健康个体和235个I到IV级NYHA患者接受了测量。通常地,将健康个体同I级NYHA患者区分通常特别重要。
通过这一高灵敏度的分析在110个健康个体中测得平均值为6.6fmol/ml,其标准偏差为7.3fmol/ml。测得的最低值为0.2fmol/ml。这清楚地表明<1.0fmol/ml的灵敏度对于精确检测参考区域是必要的。对于这一分布,所测定的上限正常值区域(97.5%)为26.6fmol/ml。
假定指标区域(Referenzwertbereiches)为0-26.6fmol/ml,233名I到IV级NYHA患者中只有16名所表现的数值在该正常区域内。这对应的临床灵敏度为93.3%。如果只考虑I级NYHA患者,37名患者中有30名被测为阳性,其对应的灵敏度为81.1%。
该结果证实通过高灵敏的N-末端前BNP分析,对患有I级NYHA心力衰竭的患者同健康正常的群体进行清晰地区分是可能的。在此之前,本技术领域的分析(Dagubatti et al.,Cardiovascular Research36(1997),246)不能达到这一点。
序列表
<110>Rocne Diagnostics GmbH
<120>鉴定N-末端前BNP的方法
<130>51810AWO-SZ
<140>
<141>
<160>6
<170>PatentIn Vet.2.1
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>E.coli
<214>大肠杆菌
<400>1
ccggatccca cccgctg 17
<210>2
<211>79
<212>DNA
<213>E.coli
<214>大肠杆菌
<400>2
cgggatccca cccgctgggt tccccgggtt ccgcttccga cctggaaacc cccggtctgc 60
aggaacagcg taaccacct 79
<210>3
<211>70
<212>DNA
<213>E.coli
<214>大肠杆菌
<400>3
cggttccagg gaggtctgtt caacctgcag ttcggacagt ttaccctgca ggtggttacg 60
ctgttcctgc 70
<210>4
<211>71
<212>DNA
<213>E.coli
<214>大肠杆菌
<400>4
cagacctccc tggaaccgct gcaggaatcc ccgcgttccga ccggtgtttg gaaatcccgt 60
gaagttgcta c 71
<210>5
<211>87
<212>DNA
<213>E.coli
<214>大肠杆菌
<400>5
cccaagctta acgcggagca cgcagggtgt acagaaccat tttacggtga ccccggatac 60
cttcggtagc aacttcacgg gatttcc 87
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>E.coli
<214>大肠杆菌
<400>6
cccaagctta acgcggagc 19
Claims (2)
1.鉴定样品中的天然N-末端前BNP的方法,其利用识别N-末端前BNP的不同表位并能同时与N-末端前BNP结合的至少两种抗体,通过三明治方式进行,其中至少两种抗体结合N-末端前BNP的氨基酸10-50的氨基酸区域。
2.重组N-末端前BNP作为标准物在权利要求1的鉴定N-末端前BNP的方法中的应用。
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