CN1320957C - 从珍珠岩中筛选层析填料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从珍珠岩中筛选用于分离纯化无细胞百日咳蛋白质的层析填料的方法。该方法包括：1.选择符合食用检测指标的珍珠岩过筛，获得粒度在125-250μm的为初筛材料；2.称取步骤1的初筛材料，加入蒸馏水，其蒸馏水加入量以使珍珠岩充分悬浮起来为准，之后静置2-5分钟，弃去上部漂浮物；3.将步骤2获得的珍珠岩作填料进一步装柱筛选，用一次性注射器的筒为层析柱，底部用合成纤维均匀垫好，装入1ml珍珠岩为柱床，装柱后加入蒸馏水，当流速大于5秒/滴的珍珠岩再一次被弃去，余下的是可以做为分离纯化无细胞百日咳蛋白质的层析填料。该方法所用原料国产珍珠岩货源充足，价格便宜；该方法简便快速，省时，省力，节能。
Description
技术领域
本发明涉及筛选珍珠岩的方法，特别是涉及从国产珍珠岩中筛选适用于分离纯化无细胞百日咳蛋白质的层析填料的方法。
技术背景
珍珠岩是火山作用形成的天然珍珠岩，在1100℃高温下急速膨胀20倍以上形成膨胀珍珠岩的，经过独特的加工，工艺煅烧，粉碎研磨和风选等制造而成。它富含闭口和开口气孔(如图3)，具有容重轻、导热系数小、无毒、无味、无菌、无臭的膨胀珍珠岩，是一种新型助滤剂。它广泛用于啤酒、饮料、味精、医药、食用油、石油、化工、污水处理等工业生产中的液体过滤。如：Paracell是世界上最大的助滤剂制造商，格雷夫科公司(Grefco Inc)和日本三号金属矿业株式会社合作开发了珍珠岩的产品。我国许多厂家，例如：内蒙的包头、赤峰、河南省信阳等，某些生产厂家经过多年研究和革新，已使珍珠岩成为世界上一流的产品，是硅藻土理想的替代品。珍珠岩作为助滤剂，已在内蒙古啤酒厂和包头啤酒厂及华北药业集团等应用。
发明内容
本发明目的在于为了节约外汇，以国产珍珠岩为原料，从中筛选出用于分离纯化无细胞百日咳蛋白质的层析填料的方法；提供一种省时，省力，节能的从珍珠岩中筛选层析填料的方法。
本发明的目的是这样实现的：本发明提供的从珍珠岩中筛选用于分离纯化无细胞百日咳蛋白质的层析填料的方法，包括以下步骤进行筛选：
(1)首先选择符合食用检测指标的珍珠岩过筛，获得粒度在125-250μm的为初筛材料；
(2)称取步骤(1)获得的初筛材料，加入蒸馏水，蒸馏水加入量以使珍珠岩充分悬浮起来为准，之后静置2-5分钟，选择沉降的珍珠岩材料，弃去上部漂浮物；
(3)将步骤(2)获得的珍珠岩进一步装柱筛选，用一次性注射器的针筒为层析柱(1*5cm)，底部用合成纤维均匀垫好，把蒸馏水悬浮的珍珠岩装柱，柱床体积为1ml，然后蒸馏水流过珍珠岩的流速大于5秒/滴的珍珠岩再一次被弃去，余下的珍珠岩是可以做为分离纯化无细胞百日咳蛋白质的层析填料。
为了得到更好的用于分离纯化无细胞百日咳蛋白质的层析填料，可以对层析填料，进一步筛选还包括：
步骤(4)在步骤(3)的柱中用4种PH8.0 Tris-Hcl缓冲液(含NaCl)，按顺序阶段洗脱：将取无细胞百日咳蛋白质溶液1ml，加到步骤(3)处理好的国产珍珠岩为填料的层析柱中，自然流速，用10ml试管收集流出液，当样品流尽后，把收集的流出液用下述4种PH8.0的Tris-Hcl缓冲液(含NaCl)按顺序阶段洗脱，用编好号的试管收集洗脱液，每管收集1ml；
所述的4种PH8.0含NaCl的Tris-Hcl缓冲液如下：
1.25mM Tris-Hcl缓冲液5ml
2.50mM Tris-Hcl缓冲液含0.2M NaCl 5ml
3.50mM Tris-Hcl缓冲液含0.6M NaCl 5ml
4.50mM Tris-Hcl缓冲液含1.0M NaCl 5ml。
步骤(5)测洗脱液蛋白质的紫外吸收A280：从步骤(4)中得到的各管收集1ml洗脱液蛋白质，在紫外分光光度计上进行紫外吸光度测定，该蛋白质在280nm处有吸光度A280，记录读数。以A280的数值为纵坐标，收集洗脱液的管号数为横坐标作图，在图中可以看出分离的效果。对那些没有把蛋白质分离开的和洗脱时流速慢的珍珠岩又一次被淘汰。选用洗脱时流速快、分离效果好的珍珠岩为层析填料，分离结果如图1所示，从图1可以看出，国产珍珠岩分离的无细胞百日咳蛋白质有4个吸收峰。峰1、峰2、峰3、峰4。
还包括进行电泳鉴定分离蛋白质的纯度：步骤4中各蛋白吸收峰的洗脱液分别收集于一体，用标准纯百日咳蛋白质为对照，所获得峰1至峰4的样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶鉴定分离蛋白质的纯度。结果见图2，从图2中可以看出，峰1含69k和一些杂蛋白质，峰2、峰3分别是PT和FHA。其中峰2、峰3的蛋白质纯度达80％以上，基本不含杂蛋白。峰4是分离的杂蛋白质，弃去不要，根据分离纯化的效果和洗脱速度，确定哪种珍珠岩作为层析填料。用电泳鉴定分离蛋白质的纯度证明蛋白质69k，PT和FHA是百日咳蛋白质的主要成份，也证明了该方法的可行性和可靠性。
并可做如下分离纯化无细胞百日咳蛋白质实验进行检验：
1.测血凝活性检验国产珍珠岩分离纯化百日咳蛋白质的效果。
2.用SDS-聚丙烯酰胺凝胶鉴定分离蛋白质的纯度。
3.根据分离纯化的效果和洗脱速度，确定哪种珍珠岩作为层析填料。
本发明的优点：
本发明提供的从国产珍珠岩中筛选出用于分离纯化无细胞百日咳蛋白质做层析填料的方法，所用原料国产珍珠岩货源充足，价格便宜每公斤1.5-3.0元人民币，在国外每公斤珍珠岩6美元。该方法简便快速，省时，省力，节能。国产珍珠岩性能稳定，用于分离纯化无细胞百日咳蛋白质做层析填料易操作。
附图说明
图1是国产珍珠岩分离纯化百日咳蛋白质的图谱
图中峰1.含69k的杂蛋白质层析柱流出液；
峰2.PT； 峰3.FHA； 峰4.分离的杂蛋白质；
图2珍珠岩分离纯化百日咳蛋白质的SDS-PAGE图
图中：1.层析柱上样蛋白质2.图1中峰1样品
3.图1中峰2样品4.图1中峰3样品5.标准样品
6.图1中峰4样品
图3层析填料国产珍珠岩的电镜扫描照片(放大500倍的照片)
具体实施方式
实施例1：
取含SiO2 70-80％，Al2O3 10-20％的国产食用类珍珠岩，用孔径不同的筛子过筛，取粒度在125μm的珍珠岩材料分别为初筛材料；
将步骤1中获得的国产珍珠岩1g，分别放入25ml烧杯中，加入20ml蒸馏水，搅拌均匀后，静置2-5分钟，弃去上部漂浮物，选择沉降速度快的珍珠岩为材料，进一步装柱筛选；用一次性注射器的针筒为层析柱，底部用合成纤维均匀垫好，装入珍珠岩1ml，装柱时流速大于5-7秒/滴的珍珠岩再一次被弃去，余下的是可以做为分离纯化无细胞百日咳蛋白质的层析填料。
实施例2：
用实施例1得到的从国产珍珠岩中筛选出的用于分离纯化无细胞百日咳蛋白质的层析填料进行分离纯化无细胞百日咳蛋白质的实验：
将准备好的无细胞百日咳蛋白质溶液1ml，加到实施例1中处理好的国产珍珠岩为填料层析柱中，自然流速，用10ml试管收集流出液，当样品流尽后，流出液用PH8.0 Tris-Hcl缓冲液(含NaCl)所述的4种缓冲液为：按顺序阶段洗脱，用编好号的试管收集洗脱液，每管收集1ml，进行分离纯化无细胞百日咳蛋白质。所述的缓冲液为：
1.25mM Tris-Hcl缓冲液5ml；
2.50mM Tris-Hcl缓冲液含0.2M NaCl 5ml；
3.50mM Tris-Hcl缓冲液含0.6M NaCl 5ml；
4.50mM Tris-Hcl缓冲液含1.0M NaCl 5ml；
实施例3：
测洗脱液蛋白质的紫外吸收A280：从实施例2中得到的各管洗脱液，在紫外分光光度计280nm处测定蛋白质的吸光度A280，记录读数。以A280的数值为纵坐标，收集洗脱液的管号数为横坐标作图，在图中可以看出分离的效果。对那些没有把蛋白质分离开的和洗脱时流速慢的珍珠岩又一次被淘汰。选用洗脱时流速快、分离效果好的珍珠岩为层析填料，如图1所示的分离结果，从图1可以看出，国产珍珠岩分离的无细胞百日咳蛋白质有4个吸收峰。峰1、峰2、峰3、峰4。
实施例4：
取含SiO2 70-80％，Al2O3 10-20％的国产食用类珍珠岩，用孔径不同的筛子过筛，取粒度在250μm的珍珠岩材料做初筛材料；
将步骤1中获得的国产珍珠岩1g，分别放入25ml烧杯中，加入20ml蒸馏水，搅拌均匀后，静置2-5分钟，弃去上部漂浮物，选择沉降速度快的珍珠岩为材料，进一步装柱筛选；用一次性注射器的针筒为层析柱，底部用合成纤维均匀垫好，装入珍珠岩1ml，装柱时流速大于5-7秒/滴的珍珠岩再一次被弃去，余下的是可以做为分离纯化无细胞百日咳蛋白质的层析填料进一步筛选。
将准备好的无细胞百日咳蛋白质溶液1ml，加到实施例1中处理好的国产珍珠岩为填料层析柱中，自然流速，用10ml试管收集流出液，当样品流尽后，流出液用PH8.0 Tris-Hcl缓冲液(含NaCl)所述的4种缓冲液为：按顺序阶段洗脱，用编好号的试管收集洗脱液，每管收集1ml，进行分离纯化无细胞百日咳蛋白质。所述的缓冲液为：
1.25mM Tris-Hcl缓冲液10ml；
2.50mM Tris-Hcl缓冲液含0.2M NaCl 5ml；
3.50mM Tris-Hcl缓冲液含0.6M NaCl 5ml；
4.50mM Tris-Hcl缓冲液含1.0M NaCl 5ml；
实施例5：
电泳鉴定分离蛋白质的纯度：实施例3和4中各蛋白吸收峰的洗脱液分别收集于一体，用标准纯百日咳蛋白质为对照，峰1至峰4的样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，结果见图4。从图2中可以看出，峰1含69k和一些杂蛋白质，峰2、峰3分别是PT和FHA。其中峰2、峰3的蛋白质纯度达80％以上，基本不含杂蛋白。峰4是分离的杂蛋白质，弃去不要.蛋白质69k，PT和FHA是百日咳蛋白质的主要成份。用电泳鉴定分离蛋白质的纯度证明了该方法的可行性和可靠性，也说明珍珠岩层析填料的颗粒度在125-250μm适用于分离纯化无细胞百日咳蛋白质。
实施例6：电镜扫描
分离纯化无细胞百日咳蛋白质，洗脱时流速快、分离效果好的珍珠岩层析填料，固定在电镜样品耙上，离子溅射金，日立S-570
扫描电镜观察，并照相，结果见图3。从图3可以看出，筛选的国产珍珠岩表面不规则，多孔。
Claims (1)
1.一种从珍珠岩中筛选层析填料的方法，其特征是：按以下步骤进行：
(1)首先选择符合食用检测指标的珍珠岩过筛，获得粒度在125-250μm的为初筛材料；
(2)称取步骤(1)获得的珍珠岩初筛材料，加入蒸馏水，蒸馏水加入量以使珍珠岩充分悬浮起来为准，之后静置2-5分钟，选择沉降的珍珠岩材料；
(3)将步骤(2)获得的珍珠岩进一步装柱筛选，用一次性注射器的针筒为层析柱，底部用合成纤维均匀垫好，装入1ml珍珠岩为柱床，装柱后加入蒸馏水，通过珍珠岩水的流速大于5秒/滴的珍珠岩再一次被弃去，余下的是做为分离纯化无细胞百日咳蛋白质的层析填料。
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