CN1314945A

CN1314945A - 用dna改组生产除草剂选择性作物

Info

Publication number: CN1314945A
Application number: CN99808019A
Authority: CN
Inventors: V·萨布拉马尼安; W·P·C·斯特默尔; L·A·卡斯尔; U·S·穆赫哈; D·L·西尔
Original assignee: Maxygen Inc
Current assignee: Maxygen Inc
Priority date: 1998-08-12
Filing date: 1999-08-12
Publication date: 2001-09-26
Also published as: BR9911681A; AU5482299A; WO2000009727A3; KR20010083077A; US20050060767A1; US20060253922A1; EP1105510A2; CA2333914A1; JP2002522089A; US20060253923A1; WO2000009727A2; IL140442A0; WO2000009727A8; US20020058249A1

Abstract

本发明提供了改组DNA以获得重组的除草剂耐受性核酸的方法,该核酸编码的蛋白质具有新的或改进的除草剂耐受性活性,本发明还提供了改组的除草剂耐受性核酸的文库,转基因植物和DNA改组混合物。

Description

用DNA改组生产除草剂选择性作物

发明领域

本发明涉及用核酸改组来获得或增强除草剂耐受性。

发明背景

除草剂被普遍用于现代农业来控制作物田地中的杂草生长。施加除草剂杀死杂草而不伤害种植物(作物植物)的策略取决于某些种植物对给定除草剂的选择耐受性。换句话说，种植物在施加除草剂后存活下来且没有明显生病，而杂草植物却不会这样。

“作物选择性”定义为，与除草剂对目标杂草的控制相比，作物经除草剂处理后存活下来且没有可见的伤害(或至少伤害最少)的能力。除草剂用于作物的事实提示它们对作物是安全的(有选择性)，但对经济上重要的杂草提供了整体的或至少可接受的控制。

作物选择性由不同作物的比除草剂所针对的杂草更迅速地代谢特定除草剂的先天能力而决定。参见，Owen(1989)“除草剂的代谢-作为选择性基础的解毒作用”，《除草剂和植物代谢》(Dodge AD编辑)171-198页，Cambridge UniversityPress,CambridgeUK(“Owen,1989”)，以及Owen和deBoer(1995)“植物代谢和新的选择性除草剂的设计”《第八次杀虫剂化学国际会议》(Ragsdale NN,Kearney PC and Plimmer JR，编辑)257-268页，American Chemical Society,Washington DC(＂Owen,1995″)。

由于农业上栽培了许多不同的种植物，因此一给定除草剂可被一些种植物耐受，但不被另一些耐受。当已知一种作物中的赋予耐受性的基因时，可将这些基因转移到第二种作物，使第二种作物也有抗性。总之，无论基因来源如何，均可将赋予耐受性的基因经工程改造到植物中。

例如，可将其它生物体(如微生物)中编码合适的除草剂代谢酶的基因工程改造到作物中，赋予作物对特异性除草剂的选择性。参见，Padgette等人(1996)″防治杂草的新机遇：发展具有Round UP ReadyTM基因的大豆″《除草剂抗性作物》(Duke编辑)，53-84页，CRC Lewis Publishers,Boca Raton(“Padgette,1996”)；和Vasil(1996)＂膦丝菌素抗性作物＂《除草剂抗性作物》(Duke编辑)，85-91页，CRC Lewis Publishers,BocaRaton(“Vasil,1996”)。

实际上，已经工程改造产生了一些转基因植物能表达各种各种生物体的除草剂耐受性/代谢基因。例如，已经将乙酰羟基酸合成酶(已发现表达该酶的植物对各种除草剂有抗性)克隆到各种植物中(例如参见，Hattori,J.等人(1995)Mol.Gen.Genet.246(4):419)。赋予对除草剂耐受性的其它基因包括：编码大鼠细胞色素P4507A1与酵母NADPH-细胞色素P450氧化还原酶嵌合蛋白的基因(Shiota等人(1994)Plant Physiol106(1)17)，谷胱甘肽还原酶和超氧化物歧化酶的基因(Aono，等人(1995)Plant CellPhysiol.36(8):1687)，以及各种磷酸转移酶的基因(Datta，等人.(1992)Plant Mol.Biol..20(4):619)。

类似地，可通过改变编码除草剂靶部位的基因来赋予作物选择性，从而使改变的蛋白不再受除草剂抑制(Padgette,1996)。已用特异性微生物酶对几种此类作物作了工程改造，赋予了对特定除草剂的选择性(Vasil,1996)。

已知许多基因具有有用的赋予除草剂耐受性的潜在性能。赋予天然作物对除草剂选择性的主要两类酶是(a)单加氧酶如细胞色素P450单加氧酶(P450)和(b)谷胱甘肽硫转移酶(GST)和同型谷胱甘肽硫-转移酶(HGST)(Owen1989,1995)。例如，已经克隆或特征分析了数百种细胞色素P450基因，这些基因编码的酶介导了细胞中的各种化学过程。关于细胞色素P450的介绍，见Ortiz de Montellano(编辑)(1995)CytochromeP450Structure Mechanism and Biochemistry,第二版，Plenum Press(New York andLondon)(“Ortiz de Montellano,1995”)及其中引用的参考文献。实际上，有许多可获得的基因可能编码除草剂耐受性的基因，从而为筛选除草剂耐受性基因提供了大量工作。

同样，已知有各种各样的化合物能杀死植物，使得它们成为潜在的除草剂，但是它们的耐受因子还未确定。即使对许多已知的除草剂耐受性基因进行筛选其代谢种类化合物的能力，但不能保证任何一个基因肯定能提供对除草剂的耐受性。据估计，通常要筛选30000种或更多种具有除草活性的化合物才能鉴定出一个作物选择性除草剂。例如参见，Subramanian等人(1997)＂工程改造作物中的麦草畏选择性：一种搜索合适的降解性酶的方法＂JInd.Microbiol.19:344-349(＂Subramanian,1997＂)及其引用的参考文献。

最后，潜在的除草剂耐受基因通常不会针对除草剂代谢作特异性进化。例如，异生素细胞色素P450基因存在于酵母、细菌、植物、脊椎动物和无脊椎动物等各种生物中，起着能进行各种各样反应的通用细胞酶作用，这些反应包括羟基化、环氧化、N-、S-和O-脱烷基化、N-氧化、磺化氧化、脱卤素和其它各种反应。在许多生物中，生物体细胞中显然存在P450的多种同种型，不同的同种型具有不同的底物特异性。因此，通常一些形式的P450在除草剂代谢方面比其它P450(即杂草中天然的P450)要好。尽管通常理论上有可能确定哪些特异的结构特征会使特定形式的P450(或潜在的除草剂耐受性基因编码的其它蛋白)能赋予除草剂耐受性，进而了解怎样来修饰该基因以提高耐受性，但是涉及该任务的工作量是相当大的。

令人惊奇的是，本发明提供了一种解决上述各问题的策略，并提供了其它各种特征，这些特征在阅读了下文后是显而易见的。

发明概述

在本发明中，用DNA改组技术来产生新的或改进的除草剂耐受基因。这些除草剂耐受基因可用来赋予诸如商品作物的植物除草剂耐受性。与天然存在的基因相比，这些新的或改进的基因具有令人惊奇的优越的性能。

在获得除草剂耐受基因的方法中，重组一个亲代核酸或多个亲代核酸衍生的多种变体形式。多个变体形式包括从亲代核酸衍生的片段。该亲代核酸编码了除草剂耐受性活性，或能经过改组而编码除草剂耐受性活性，因此亲代核酸是开发或进化除草剂耐受性活性的DNA改组的候选物。亲代核酸的多种变体形式相互之间至少在一个(通常为两个或多个)核苷酸处不同，在重组时，多种变体形式提供了重组核酸文库。该文库可以是体外的，或细胞、噬菌体等中的一组分子。筛选该文库，以鉴定出至少一种重组的除草剂耐受性核酸，该核酸编码了赋予细胞除草剂耐受性的活性。与一个或多个亲代核酸编码的活性相比，重组的除草剂耐受性核酸能编码独特的或改进的除草剂耐受性活性。

待改组的亲代核酸可以来自各种来源，包括合成的或克隆的DNA。亲代核酸能编码除草剂耐受性活性。或者，亲代核酸不编码除草剂耐受性活性，而是在亲代核酸的变体形式重组时产生了编码除草剂耐受性活性的核酸。或者，亲代核酸编码的多肽在功能上和/或结构上与天然的除草剂靶蛋白相关，并能产生一种核酸，在亲代核酸的变体形式重组时，该核酸编码的活性能取代天然除草剂靶蛋白的活性。

用于重组的亲代核酸例子包括编码以下各酶的基因：P450单加氧酶、谷胱甘肽硫转移酶、同型谷胱甘肽硫转移酶、草甘膦氧化酶、膦丝菌素乙酰转移酶、二氯苯氧基乙酸酯单加氧酶、乙酰乳酸合成酶、5-烯醇丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合成酶、以及UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮酸转移酶。例如，玉米和小麦的P450单加氧酶基因编码了赋予对除草剂麦草畏耐受性的活性，从而使这些基因适合作为改组的目标。同样，玉米的谷胱甘肽硫转移酶基因、大豆的同型谷胱甘肽硫转移酶基因、细菌的草甘膦氧化酶基因、细菌的膦丝菌素乙酰转移酶基因、细菌的二氯苯氧基乙酸酯单加氧酶基因、植物的乙酰乳酸合成酶基因、植物和藻类的原卟啉原氧化酶基因、植物和细菌的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因、以及细菌的UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮酸转移酶基因均是待改组DNA的较佳的来源。在这些改组技术中，可采用亲代核酸的等位基因变体和种间变体。多个核酸化学合成产生的与亲代核酸类似的变体形式，或亲代核酸易错转录产生的变体形式，或在增变细胞株中复制亲代核酸产生的变体形式也可用于这些改组技术。

各种筛选方法可用于筛选改组产生的重组核酸的文库，这取决于此文库针对哪种除草剂作选择。作为例子，待筛选的文库可以细胞群的形式存在。这样来筛选文库：使细胞在含有除草剂的培养基中或培养基上生长，选出除草剂和改进型除草剂之间在细胞中检测到的物理差别。典型的除草剂包括麦草畏、草甘膦、双膦酸酯(bisphosphonate)、sulfentrazone、咪唑啉酮、磺酰脲和***嘧啶。例如，可以监测除草剂的氧化(较佳的是用光谱分析方法)，从而提供文库编码的活性怎样有效地代谢除草剂的量度。类似地，还可根据偶联前后除草剂物理性质的差别来选择与除草剂或除草剂代谢物偶联的谷胱甘肽，或是与除草剂或除草剂代谢物偶联的同型谷胱甘肽。或者，这样来筛选文库：使细胞在含有除草剂的培养基中或培养基上生长，选出在除草剂存在下细胞生长增强的细胞。细胞生长增强可能需要存在重组除草剂耐受性核酸所编码的活性。在一个变化方案中，编码的活性是除草剂代谢活性，而且细胞生长需要除草剂的代谢产物。最后，可在文库中同时筛选或选择对一种以上除草剂的除草剂耐受性活性，即，筛选目标是鉴定出编码对一种以上除草剂有耐受活性的一种(或多种)重组的除草剂耐受性核酸。

反复筛选和选择除草剂耐受性也是本发明的一个特征。在这些方法中，经鉴定赋予细胞除草剂耐受性活性的核酸还可用亲代核酸或其他核酸(例如亲代核酸的变体形式)进一步改组，以产生第二个改组文库。然后筛选第二文库中的一种或多种除草剂耐受性活性，该活性可以是对第一轮筛选中同一除草剂的耐受活性，或是对不同的除草剂的耐受活性。该方法可以根据需要反复重复多次，直至获得性能优化的重组的除草剂耐受核酸。如果需要，可克隆并任选地表达用本文所述任一方法鉴定出的重组的除草剂耐受性核酸。例如，可将该核酸转导到植物中，以赋予植物除草剂耐受性活性。如果需要，可以通过例如植物除草剂耐受性的田间试验来测试赋予植物的除草剂耐受性活性。

本发明还提供了通过全基因组改组来提高植物细胞除草剂耐受性的方法。在这些方法中，多个基因组核酸被改组到植物细胞中。筛选具有一种或多种除草剂耐受性活性的重组的植物细胞，例如对以下除草剂有耐受性，例如包括，麦草畏、草甘膦、双膦酸酯、sulfentrazone、咪唑啉酮、磺酰脲、***嘧啶、二苯基醚、氯乙酰胺、hydantocidin等。基因组核酸可不同于希望有除草剂耐受性的植物细胞的种类或株系。同样，改组反应可用来自相同或不同种类或株系的基因组DNA在细胞中进行。在任何情况下，植物细胞或其细胞后代通常能再生成为具有所需除草剂耐受性活性的植物。

本发明的除草剂耐受性核酸编码的独特的或改善的除草剂耐受性活性包括以下各种活性中的一种或多种：代谢(即化学修饰或降解)除草剂的能力提高；该活性赋予耐受性所针对的除草剂范围增加(例如与亲代核酸编码的活性相比，对更广范围的除草剂有耐受活性)；表达水平比亲代核酸编码的多肽的表达水平有所提高；对除草剂抑制的敏感性比亲代核酸编码的活性低；对蛋白酶切割的敏感性比亲代核酸编码的多肽低；对高或低pH水平的敏感性比亲代核酸编码的多肽低；对高或低温度的敏感性比亲代核酸编码的多肽低；对宿主植物的毒性比所选核酸编码的多肽低。

本发明的一个特征是产生文库并改组上述方法中所用的混合物。例如，提供了包含核酸改组形式的噬菌体展示文库。同样，提供了包含至少三个同源DNA的改组混合物，其中每个DNA从编码多肽或其片段的亲代核酸衍生获得。这些亲代核酸能够编码的多肽例如包括，P450单加氧酶多肽、谷胱甘肽硫转移酶多肽、同型谷胱甘肽硫转移酶多肽、草甘膦氧化酶多肽、膦丝菌素乙酰转移酶多肽、二氯苯氧基乙酸酯单加氧酶多肽、乙酰乳酸合成酶多肽、原卟啉原氧化酶多肽、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶多肽、UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮酸转移酶多肽，或它们的变体形式。

通过筛选和选择上述方法制得的文库而鉴定出的重组的除草剂耐受性核酸也是本发明的一个特征。

本发明还提供了评价除草剂对植物进化变体的长期效果。这些方法需要将DNA片段文库输送到多个植物细胞中，其中至少有一些与细胞基因组中的片段发生重组，从而产生了修饰的植物细胞。在含有除草剂的培养基中繁殖修饰的植物细胞，并回收存活的细胞。将存活细胞的DNA再与另一DNA片段文库重组，文库中至少有一些片段与存活细胞DNA中的同源片段重组，从而产生了进一步修饰的植物细胞。使该进一步修饰的植物细胞在含有除草剂的培养基中繁殖，并收集进一步存活的植物细胞。根据需要重复这些重组和选择步骤，直至进一步存活的植物细胞获得了对除草剂预定程度的抗性。获得的抗性程度以及获得该程度所需的重复次数提供了除草剂杀死植物进化变体的效果的量度。该分析的信息在比较不同除草剂的相对优点，尤其是在评价这些除草剂在重复作用于杂草后的长期效果中是很有价值的。

附图简述

图1显示了对细菌EPSPS基因进行家族改组以产生能筛选和选择编码草甘膦耐受活性的重组的除草剂耐受性核酸的文库的策略。

定义

除非清楚地表示相反的意思，下列定义为本领域已知的术语的定义作了F列补充。

术语“重组”核酸是两个或多个核酸之间、或体外或人工方法制得的核酸之间重组产生的核酸。术语“重组”用于细胞时是指该细胞含有(或任选的复制)异源核酸，或表达由异源核酸编码的肽或蛋白。重组细胞可含有在细胞天然(非重组)形式中未见到的基因。重组细胞还可含有在天然形式的细胞中见到的基因，而这些基因经人工方式修饰并重新导入细胞内。该术语还包括含有内源核酸的细胞，该细胞经过人工修饰但没有从细胞中除去核酸；这些修饰包括基因置换、定点突变和有关技术获得的那些。

“重组的除草剂耐受性核酸”是一种重组的核酸，当该核酸在细胞内表达时，它所编码的蛋白具有赋予细胞除草剂耐受性的活性。

“编码(某一)活性的核酸”与“编码具有(某一)活性的蛋白的核酸”同义。同样，“核酸编码的活性”与核酸编码的蛋白质活性“同义。

蛋白质的“活性”(或核酸编码的“活性”)可包括催化(即酶促)活性，编码蛋白固有的物理性质(例如对蛋白酶切割的敏感性，对变性剂的敏感性，聚合或解聚的能力)，或这两者。

“除草剂耐受性”是细胞或植物在除草剂存在下存活、生长、和/或再生的能力。

“除草剂耐受性活性”或“赋予除草剂耐受性的活性”是这样一种活性，当其存在于细胞或植物内时，它能使细胞或植物在除草剂存在下存活、生长和/或再生。

“除草剂”是杀死一种或多种植物、通常是杂草植物的化学制剂或化合物。除草剂通常对一种或多种种植物有“选择性”，即它们不会明显损伤作物，同时能防止杂草生长。

“除草剂代谢”指通过一种或多种酶的作用，使除草剂被修饰(例如通过氧化、还原、乙酰化、偶联等)或降解，从而产生了对细胞或植物没有毒性的产物。

核酸的“多种变体形式”指核酸的多种同系物。同系物可以来自天然存在的同系物(例如两个或多个同源基因)，或是人工合成的具有相关序列的一种或多种核酸，或一种或多种核酸经修饰产生相关的核酸。当核酸通过天然或人工方法从共同的先祖序列衍生获得时，它们是同源的。在天然进化时，当两种或多种后代序列与亲代序列趋异时，即由于突变和天然选择，会出现这种现象。在人工条件下，趋异会以两种方式中的例如一种方式发生。首先，一给定序列能与另一序列人工重组(例如通常在克隆时发生)，从而产生一后代核酸。或者，可以合成序列上与给定亲代核酸序列不同的核酸来重头合成核酸。

当不清楚知道两个核酸的祖先时，通常是通过两个序列的序列比较来推断同源性。当两个核酸序列显示有序列相似性时，推断这两个核酸具有共同的祖先。在本领域中，确定同源性所需的序列相似性的确切水平根据各种因素而异。出于本文公开的目的，当两个序列具有足够的序列相同性使两个核酸分子之间发生重组时，就认为这两个序列是同源的。通常，两核酸要求明确相似的区域间隔大致相同的距离，从而允许重组发生。通常，具有至少约60％或更高的序列相同性的区域最适合重组。

在两个或多个核酸或多肽序列的情况下，术语“相同”或“相同性”百分数是指，当比较和排列对比其最大一致性(用下列序列对比算法之一(或本领域技术人员可获得的其他算法)或目视观察来测定)时，两个或多个序列或亚序列相同，或具有指定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸。

在两个核酸或多肽情况下，术语“基本上相同”是指，当比较和排列对比其最大一致性(用下列序列对比算法之一或目视观察来测定)时，两个或多个序列或亚序列具有至少60％、较佳的80％、最佳的90-95％的核苷酸或氨基酸残基相同性。这样的“基本上相同的”序列通常被认为是同源的。较佳的，基本相同性存在于至少长约50个残基的序列区域内，更佳的在至少约100个残基的区域内，最佳的是序列在至少约150个残基内基本相同，或待比较的两个序列在整个长度内基本上相同。

为了比较序列和确定同源性，通常将一个序列作为参比序列与测试序列比较。当用序列对比算法时，将测试和参比序列输入计算机内，指定亚序列坐标，如果需要，指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列相对于参比序列的序列相同性百分数。

序列比较的最优序列排列对比可采用例如Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)中的局部同源性算法、Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)中的同源性排列算法、Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci(USA)85:2444(1988)中的相似性搜寻方法、这些算法的计算机化操作(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Wisconsin Genetics软件包，Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)、或目测(见Ausubel等人，下文)来进行。

一个适合测定序列相同性和序列相似性百分数的算法例子是Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中描述的BLAST算法。公众可通过National Center forBiotechnology Information获得进行BLAST分析的软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。该算法包括首先确定高的评分序列对(HSP)，方法是确定询问序列中长度为W的短词，该单词在与数据库序列中长度相同的单词对比时与一些阳性值临界评分T匹配或满足。T指相邻单词评分临界值(Altschul等人，同上)。这些初始的相邻单词命中物作为启动搜索以发现含有它们的较长HSP的启动源。然后沿每一序列两个方向延伸该单词命中物，只要累积对比评分能够增加。对于核苷酸序列，用参数M(一对匹配残基的奖励分；始终大于0)和N(不匹配残基的罚分；始终小于0)计算累积分。对于氨基酸序列，用评分矩阵来计算累积分。当累积对比分从其实现的最大值下降X量时；由于一个或多个负分残基对比的积累，累积分变为0或低于0；或到达序列的任一末端时，停止单词命中物在每个方向上的延伸。BLAST算法参数W、T和X确定了序列对比的敏感性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)采用的默认单词长度(W)为11，期望值(E)为10，截断值为100,M=5,N=-4，是两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序采用的默认值单词长度(W)为3，期望值(E)为10，并采用BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff & Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)。

除了计算序列相同性百分数外，BLSAT算法还统计分析两个序列之间的相似性(例如参见，Karlin & Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787)。BLAST算法提供的一种相似性测定方法是最小总和可能性(P(N))，它表示两个核苷酸或氨基酸序列之间匹配发生的可能性。例如，如果测试核酸和参比核酸比较中的最小总和可能性小于约0.1，更佳的小于约0.01，最佳的小于约0.001，则认为核酸与参比序列相似。

两个核酸序列基本上相同/同源的另一个指标是两个分子在严谨条件下相互杂交。术语“与…特异性杂交”指，当某序列存在于一个DNA或RNA复杂混合物中(例如总细胞)时，该分子在严谨条件下只与一特定的核苷酸序列结合、形成双链或杂交。“基本结合”指探针核酸与靶核酸之间的互补性杂交，并包括降低杂交介质的严谨度时可容纳的微量错配，而实现对该多核苷酸靶序列如所希望的检测。

在核酸杂交实验(如Southern和Northern杂交)中，“严谨的杂交条件”和“严谨的杂交洗涤条件”取决于序列，而且在不同的环境参数下不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。在Tijssen(1993)《生物化学和分子生物学的实验室技术一与核酸探针的杂交》第2章第1部分(杂交原理以及核酸探针试验方法的综述”，Elsevier,NewYork)中有关于核酸杂交的广泛的指导。通常，选择高度严谨的杂交和洗涤条件使得比在确定的离子强度和pH下特定序列的热解链温度(Tm)低大约5℃。通常，在“严谨条件”下，探针将与其靶亚序列杂交，但不与无关序列杂交。

Tm是在确定的离子强度和pH下，50％的靶序列与最佳匹配的探针杂交时的温度。选择非常严谨的条件，使其等于特定探针的Tm。在Southern或Northern印迹中滤膜上具有100个以上互补残基的互补性核酸杂交的严谨杂交条件实例是，42℃下50％甲酰胺和1毫克肝素，杂交过夜。高度严谨的洗涤条件实例是72℃0.15M NaCl洗涤约15分钟。严谨洗涤条件的实例是65℃0.2×SSC洗涤15分钟(参见Sambrook，下文，关于SSC缓冲液的描述)。通常，高严谨度的洗涤前有低严谨度的洗涤，以除去本底探针信号。例如，超过100个核苷酸的双链体的中等严谨洗涤是1×SSC45℃洗涤15分钟。超过100个核苷酸的双链体的低严谨度洗涤条件是4-6×SSC40℃洗涤15分钟。对于短探针(例如约10-50核苷酸)，严谨条件通常包括在pH 7.0-8.3下，盐浓度低于约1.0M钠离子，通常约0.01-1.0M的钠离子浓度(或其它盐)，温度通常至少约30℃。严谨条件还可通过加入去稳定剂如甲酰胺来实现。通常，在特定的杂交试验中，信噪比为不相关探针所测得信噪比的2倍(或更高)，就表明检测到有特异性杂交。如果核酸编码的多肽是基本相同的话，则在严谨条件下不相互杂交的核酸仍是基本相同的。例如，当用基因密码所允许的最大密码子简并性来生成一个核酸的拷贝时，会发生这种现象。

进一步表明两个核酸序列或多肽基本上相同/同源的是第一个核酸编码的多肽与第二个核酸编码的多肽发生免疫学交叉反应或特异性结合。因此，例如，当两种肽的区别仅在于保守性取代时，一个多肽通常与第二多肽基本上相同。

特定多核苷酸序列的“保守性修饰变化”指那些多核苷酸，它们编码相同或基本相同的氨基酸序列，或当多核苷酸不编码氨基酸序列时，具有基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，许多功能相同的核酸编码了一给定多肽。例如，密码子CGU、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG均编码氨基酸精氨酸。因此，在由密码子确定的每个精氨酸位置，密码子可以变成上述相应密码子的任一个而不改变编码的多肽。这种核酸变化是“沉默变化”，它是“保守性修饰变化”中的一种。本文描述的编码多肽的每个多核苷酸序列也描述了每种可能的沉默变化，除非另有所述。本领域技术人员会认识到，核酸中的每个密码子(除AUG外，它通常是甲硫氨酸的唯一密码子)均可用标准技术修饰产生功能相同的分子。因此，每一描述的序列意味着包括了编码某多肽的核酸的“沉默变化”。

另外，本领域技术人员也会认识到，当某改变导致一个氨基酸置换成化学相似的一个氨基酸时，个别置换、缺失或增加而使编码序列改变、增加或缺失单个氨基酸或少数氨基酸(通常低于5％，更通常地低于1％)是“保守性修饰变化”。提供功能相似氨基酸的保守性置换表是本领域所熟知的。下列5组各自含有能相互保守置换的氨基酸：脂族：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；芳族：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。另见Creighton(1984)Proteins,W.H.Freeman and Company。另外，在某编码序列中发生发生改变、增加或缺失单个氨基酸或少数氨基酸的个别置换、缺失或增加也是“保守性修饰变化”。因保守性变化而不同的序列通常是同源的。

“亚序列”指核酸或氨基酸的一种序列，该序列分别含有此核酸或氨基酸较长的序列(例如多肽)的一部分。某特定核酸或多肽的亚序列还可称为该核酸或多肽的“片段”或“节段”。

术语“基因”广泛地用来指与给定RNA或蛋白质表达有关的任何DNA片段。因此，基因包括编码所表达RNA的序列(通常包括多肽编码序列)，以及通常其表达所需的调控序列。基因可从各种来源获得，包括从感兴趣的来源克隆，或从已知的或预计的序列信息合成，并可包括设计的具有所需参数的序列。

术语“分离的”当应用于核酸或蛋白质时指，该核酸或蛋白质基本上不含天然状态下与其结合的其它细胞组分。

术语“核酸”指脱氧核糖核酸或核糖核酸及其单链或双链形式的聚合物。除非另有特别限定，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，该核酸具有与参比核酸相似的结合性能，并以类似于天然存在的核苷酸的方式进行代谢。除非另有指出，特定的核酸序列也意味着包括其保守性修饰的变体(如简并密码子取代物)和互补序列，以及明显表示的序列。具体地说，简并密码子取代可通过形成序列，使序列中一个或多个所选(或所有)密码子的第三个位置被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基取代来实现的。(Batzer等，(1991)Nucleic Acid Res.19:5081;Ohtsuka等，(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608;Cassol等(1992);Rossolini等，(1994)Mol.Cell.Probes 8:91-98)。术语核酸是“基因”、“DNA”、“cDNA”、“寡核苷酸”、“RNA”、“mRNA”等术语的通称。

“基因衍生的核酸”指这样一种核酸，其合成最终以基因或其亚序列作为模板。因此，mRNA、反转录自mRNA的cDNA、转录自cDNA的RNA、从cDNA扩增的DNA、转录自扩增DNA的RNA等均衍生自该基因，检测到这些衍生产物表明样品中存在和/或富含最初的基因和/或基因转录物。

当一核酸被置于与另一核酸序列有功能关系的位置时，核酸是“操作性相连的”。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。

“重组表达盒”(或简称“表达盒”)是用重组或合成方法产生的核酸构建物，其具有的核酸元件能使结构基因在与这些序列相容的宿主中表达。表达盒至少包括启动子，以及任选的转录终止信号。通常，重组表达盒包括待转录的核酸(例如编码所需多肽的核酸)以及启动子。实现表达所需的或有帮助的其它因子也可如本文所述那样使用。例如，表达盒还可包括编码信号肽或定位肽的核酸，这些肽能使表达的多肽转运到胞内细胞器或区室(例如叶绿体)或分泌通过膜。转录终止信号、增强子以及影响基因表达的其它核酸序列也可包括在表达盒内。

发明详述

介绍

作物选择性除草剂的发现是一个长期而艰苦的过程，见例如：Parry(1989)“除草剂使用与发明”于：除草剂和植物代谢(Dodge Ad编)，1-36页，Cambridge UniversityPress,Cambridge,UK。最初，筛选了数以千计的对选择的杂草有作用的化学物质。将那些显示出活性的化合物视为进一步后续合成和活性优化的前提。该过程中，通过在各种本的发毒团中加入各种代谢物质，希望一种或多种作物将快速代谢这些同类物中的几种，而实现作物选择性。因此，在基本发毒团中掺入作物选择性是一种尝试性，而且是错误的合成过程，虽然关于各种作物的天然代谢机制的知识是有用的(同前)。估计发现一种作物选择性除草剂将涉及筛选30000种以上的化合物(同前)。

在植物生物技术学中的最近进展，尤其是将异源基因稳定的整合入作物的能力，已打开了另一条实现对除草剂的作物选择性的途径。见例如Subramanian(1997)，见上。在最近10年中，已基因工程改造或在组织培养物中选择了数种对除草剂具有选择性的作物(同前)。例如，已通过掺入将编码5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合成酶)的较不敏感形式的基因，基因工程改造了对草苷膦具有选择性的大豆。草苷膦的除草活性是由于抑制了野生型EPSP合成酶(Padgette,1996)。类似的，通过掺入编码乙酰基转移酶的细菌基因，将对草丁膦的选择性用基因工程改造入玉米和其它作物(Vasil,1996)。这导致除草剂在转基因作物中的迅速被代谢，赋予了作物选择性。

一般，赋予作物对除草剂的选择性的生物技术方法包括：(a)改变编码靶位点的基因，从而使它对具体除草剂变得较不敏感(如某些草苷膦选择性作物的情况)，或(b)将编码能迅速代谢掉特定除草剂的酶通过基因工程改造入作物(如对草丁膦有选择性的作物，见Subriamanian,1997)。传统上，或通过广泛筛选微生物(Padgett,1996；Subramanian,1997；和Dyer(1996)“产生除草剂抗性作物的技术”于：除草剂抗性作物DukeSO，编)，pp85-91,CRC Lewis Publishers,Boca Raton(＂Dyer,1996＂))或通过诱变，然后严格选择(Padgette,1996;Dyer,1996)来发现这样的酶。尽管该流程是严格的，所选的酶可能不具有理想的性能来赋予作物选择性，或在转基因作物中有效的起作用(Pagette,1996)。

本发明克服了这些困难，通过DNA改组，获得重组的除草剂耐受性核酸(其编码的蛋白显示比亲本核酸编码的蛋白具有一种或多种明显或改进的除草剂耐受性)。用除草剂耐受性核酸来赋予高得多的作物选择性和对不同除草剂的安全性以更好的控制杂草。下文通过举例方式给出了许多应用。

在一常用方案中，对编码能将除草剂代谢(即，修饰或降解)成无活性(或活性较小)产物的蛋白的基因或基因家族进行了DNA改组。这些基因包括编码P450单加氧酶、谷胱甘肽硫转移酶、同型谷胱甘肽硫转移酶、草苷膦氧化酶、膦丝菌素乙酰转移酶、和二氯苯氧基乙酸酯单加氧酶的基因。通过DNA改组，优化了这些基因，从而增强了代谢特定的除草剂的速率，可任选的，不改变其它性能，如稳定性，或对天然底物、辅因子、效应物等的亲和性。在其它常用方案中，对编码靶向具体除草剂的蛋白(即“除草剂靶向蛋白”)，如乙酰乳酸合成酶、原卟啉原氧化酶、和5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶的基因或基因家族应用了DNA改组。用DNA改组优化了这些基因，使得特定除草剂对其靶蛋白的抑制作用降低，可任选的，不改变其它靶蛋白的性能，如稳定性，对天然底物、辅因子、效应物等的亲和性。在其它常用方案中，对获得新的活性(模仿天然植物除草剂靶蛋白的的活性)的基因或基因家族进行了DNA改组。要改组的候选亲代基因编码的蛋白具有和天然靶蛋白功能上和/或结构上的相似性，而和天然靶蛋白比较，对特定除草剂的抑制作用缺乏或减弱。用DNA改组优化了这些基因，可任选的，也对衍生自靶蛋白基因的核酸进行改组，来产生编码能在功能上取代天然除草剂敏感性靶蛋白的蛋白质的重组除草剂耐受性核酸。

提供方法来修饰核酸，使其获得或改进用于赋予植物对除草剂耐受性的活性，包括但不限于：修饰P450单加氧酶、谷胱甘肽硫转移酶、同型谷胱甘肽硫转移酶、草苷膦氧化酶、膦丝菌素乙酰转移酶。二氯苯氧基乙酸酯单加氧酶、乙酰乳酸合成酶、原卟啉原氧化酶、5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶和UDP-N-乙酰基葡糖胺烯醇丙酮酰基转移酶的方法。这些方法涉及使用DNA改组来获得重组除草剂耐受性基因，这些基因当存在于植物中或植物上时，对植物赋予除草剂耐受性。

本发明对优化除草剂耐受基因提供了超过现有方法的显著的优点。例如，DNA改组即使在对介导特定性能的机制缺乏详细了解时，可以优化所要的性能。另外，改组DNA后可获得全新的性能，即，改组的DNA可编码具有被改组的亲本DNA中完全不存在的性能的多肽或RNA。

可以许多不同形式和形式的置换来实现序列重组，如下文详述的那样。这些形式有一些共同原理。

修饰的底物，或“强制进化”在不同应用中，随着需要获得或改进的性能而不同。获得某种性能或性能的改进的候选底物的例子包括：编码具有酶或其它可用于赋予除草剂耐受性的蛋白质的基因。

该方法使用至少两种起始底物的变体。候选底物的变体形式可彼此具有基本的序列相似性或二级结构的相似性，但它们也应在至少一个或优选至少两个位置是不同的。在各形式之间的最初多样性可以是天然变异的结果，如可从不同个体或生物体的不同株(包括地理上的变体)，或来自同一生物体的组成型相关序列(如等位基因变体)，或来自不同生物体的组成型同源物(种间变体)获得不同的变体形式(同源物)。另外，可诱导最初的多样性，如，可通过起始底物第一形式的易错转录(例如易错PCR或用缺少校正活性的聚合酶；如Liao(1990)基因，88:107-111)，或通过在增变突变株中复制第一形式(下文讨论了突变体的宿主细胞，而且是一般熟知的)，或通过从第一形式合成序列改变的核酸，而产生变体形式。在为产生文库的重组的后续步骤中，底物之间的起始多样性大大增加了。

增变株可包括任何生物体中的突变体，其错配修复的功能受到了损害。这些包括mutS、mutT、mutH、mutL、ovrD、dcm、vsr、umuC、umuD、sbcB、recJ等的突变基因产物。通过基因突变、等位基因置换、受加入的小化合物或表达的反义RNA等试剂选择性抑制，或其它技术实现了这种损害。损害可以是对标出的基因，或在任何生物体中的同源基因。

可获得或改进的活性或其它特征广泛变化，而且当然，由底物的选择决定。例如，对于除草剂耐受性基因，人们可作的改进包括但不限于：增加具体耐受性基因有效的除草剂范围、提高对除草剂的代谢活性、提高耐受基因的表达、减弱除草剂抑制活性、降低对蛋白酶降解(或其它天然蛋白质或RNA降解过程)的敏感性，扩大对热、冷、低或高pH等条件的活性范围，和减弱对宿主植物的毒性。

重组至少两种能赋予除草剂耐受活性，或能潜在赋予除草剂耐受性活性的核酸变体形式，来产生重组核酸的文库。然后筛选该文库，来鉴定至少一种重组除草剂耐受基因，其对特定活性或感兴趣的一些活性进行优化。

通常，在一轮重组和筛选后实现了改进。然而，可使用递推序列重组，来实现对所需除草剂耐受活性的进一步改进，或从亲本核酸编码的活性造成新颖(即“不同的”)除草剂耐受活性。递推序列重组需要连续多轮重组，来产生分子多样性。即，人们能建立一组核酸分子，这些分子彼此显示某种序列相同性，但存在的突变可能不同。在任何给定的轮次中，重组可在体内或体外、细胞内或细胞外发生。另外，重组导致的多样性可在任一轮次中，通过使用诱变(如易错PCR或盒式诱变)底物或重组产物的现有方法得到增强。

一轮重组后，常常进行至少一轮筛选或选择编码所要的除草剂耐受活性核酸。如果在体外进行一轮重组，有时要将重组产物(即重组区段、重组文库、或“重组核酸的文库”)在筛选步骤之前引入细胞。还可将重组文库与合适的载体或其它调控序列在筛选前连接。另外，在筛选前，有时将体外产生的重组文库包装在病毒(如噬菌体)中。如果重组是在体内进行的，有时可在重组所发生的细胞中筛选重组文库。在其它应用中，从细胞中抽提出重组文库，并可任选的在筛选前作为病毒包装。

筛选或选择的性质由要获得何种除草剂耐受活性或寻求如何改进除草剂耐受活性而定，而且在下文讨论了许多例子。一般不必了解重组(重组文库)的具体产物与起始底物比较，获得新的、或改进的除草剂耐受活性的分子基础。例如，一个除草剂耐受基因可具有许多组成序列，它们各具有不同的作用(如编码序列，调控序列，靶向序列、赋予稳定性的序列和影响整合的序列)。这些组成序列各自同时是可变的和可重组的。然后可筛选/选择，例如，具有赋予植物除草剂耐受性能力提高的重组区段，而无需将这种改进归因于任一个别的组成序列。

根据用于所需性能的具体筛选方案，有时可用细菌细胞进行首轮筛选，因为细菌细胞转染效率高，培养方便。光合作用的细胞，如氰细菌和单细胞藻类Chlamydomonas(衣藻)，对筛选最终用于植物的活性是特别有用的。筛选的随后轮次，和其它筛选类型(不适于在细菌细胞中进行)，在植物细胞中进行，来优化在与要使用的环境相似的环境中使用的重组区段。筛选的最后轮次可在要用的确切细胞类型中进行(如，存在于植物中的细胞)，或甚至在整个植物中(如，野外进行的作物除草剂试验)进行。可在筛选植物细胞中利用瞬时基因表达***来表达除草剂耐受活性。在一些方法中，重组除草剂耐受基因的使用本身可用作一轮筛选。即，从靶细胞中回收被靶细胞成功摄入和/或表达的重组除草剂耐受基因，并用来赋予其它植物耐受性。从第一代靶细胞中回收的重组除草剂耐受基因是富含已进化的，即，已经递推序列重组修饰的基因，这种基因对于基因特异性摄入和整合、抗除草剂的有效性、稳定性等具有改进的或新颖的活性或特性。

筛选或选择步骤鉴定一种重组核酸亚群，其已进化成获得新的(“不同的”)，或改进的除草剂耐受活性，可用于赋予植物除草剂耐受性。根据筛选，可将重组核酸鉴定成细胞组分、病毒组分或游离形式。在各轮重组后，进行一轮以上筛选或选择。另外，可进行一轮以上重组，来提高在筛选或选择前重组核酸的多样性。

如果需要除草剂耐受活性的进一步改进，对第一轮筛选/选择后存活的重组除草剂耐受核酸的至少一种，和通常一个集合再进行一轮重组。这些重组除草剂耐受核酸可彼此重组，或和外源核酸(如衍生自原始亲本核酸或其进一步的变体)重组。另外，重组可在体外或体内进行。如果前一筛选步骤将所要的重组除草剂耐受核酸鉴定成细胞组分，那么可将该组分在体内进行进一步重组，或在体外进行进一步重组，或在分离后进行一轮体外重组。相反，如果前一筛选步骤将所要的重组除草剂耐受核酸鉴定成裸露形式，或病毒组分，可将这些核酸引入细胞，来进行一轮体内重组。第二轮重组，不论如何进行，都产生进一步重组的核酸，其包含了前一轮获得的重组核酸中存在的多样性以外的多样性。

在第二轮重组后，根据上文对第一轮讨论的原理，可再进行一轮筛选/选择。在轮与轮之间，可提高筛选/选择的严谨性。筛选的性质和被筛选的活性在各轮之间可以变化，如果需要改进一种以上的活性，或如果需要获得一种以上新的活性。然后可进行额外轮次的重组和筛选，直至重组区段已足够进化，获得所要的新颖或改进了除草剂耐受活性。

本发明的实施涉及在转染的宿主细胞中构建重组核酸和表达基因。实现这些目标的分子克隆技术是本领域已知的。对于本领域技术人员来说，适于构建重组核酸，如表达载体的各种克隆和体外扩增方法是熟知的。在本文中描述有用的分子生物学技术的一般方法，包括诱变、包括Berger和Kimmel，分子克隆技术指南，酶学方法(152卷)，Academic press,Inc.,San Diego,CA(＂Berger＂);Sambrook等，分子克隆-实验手册(第二版)，卷1-3,Cold Spring Harbor,New York,1989(＂Sambrook＂)和分子生物学现有技术，F.M.Ausubel等编，现有技术，Greene Publishing Associates,Inc.和John Wiley & Sons,Inc.的合作，(1998年补充)(“Ausubel”)。足够指导本领域技术人员通过体外扩增方法，包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、Q B-复制酶扩增技术和其它RNA聚合酶介导的技术的例子可在Berger,Sambrook，和Ausubel，以及Mullis等(1987)美国专利号4,683,202;PCR方案方法和应用指南(Innis等编)，Academic PressInc.San Diego,CA(1990)(Innis);Amheim & Levinson(1990年10月1日)C&EN,36-47；NIH研究杂志(1991)3,81-94;(Kwoh等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,1173；Guatelli等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,1874;Lomel等(1989)临床化学杂志35,1826;Landegren等(1988)科学241,1077-1080;Van Brunt(1990)生物技术，8,291-294;Wu和Wallace,(1989)基因4,560;Barringer等(1990)基因89,117和Sooknanan和Malek(1995)生物技术13:563-564。体外克隆扩增的核酸的改良方法在Wallace和美国专利号5426,039中有描述。用PCR扩增大型核酸的改良方法总结于Cheng等(1994)自然369:684-685和其中的参考文献，其中产生了大至40kb的PCR扩增物。本领域技术人员可理解，基本上任何RNA都可用反转录酶和聚合酶转化成为适合于限制性消化、PCR扩增和测序的双链DNA。见Ausubel,Sambrook和Berger，见上。

用作探针，如在体外扩增方法中用作基因探针，或作为改组靶(如合成基因或基因区段)的寡核苷酸通常是根据固相亚磷酰胺三酯方法(Beaucage和Caruthers(1981)，四面体通信，22(20):1859-1862描述)，如，使用自动合成仪(如Needham-VanDevanter等(1984)核酸研究，12:6159-6168所述)化学合成的。还可商品制备，或从本领域技术人员已知的各供应商购得寡核苷酸。

获得除草剂耐受性核酸的一般策略

可对编码与化学物质代谢(即修饰，降解)有关的酶的核酸进行DNA改组，从而产生文库，可筛选该文库，鉴定出一种或多种除草剂耐受性核酸，这些核酸编码与亲本核酸编码的活性比较，对某些除草剂代谢活性有所改进的，或编码与亲本核酸编码的活性不同的除草剂代谢活性。

可对编码某些除草剂的靶位点的蛋白质的核酸进行DNA改组，从而使改良的蛋白质对除草剂不敏感。但其与天然底物的亲和性相对不变。然后，可用编码改良蛋白质的除草剂耐受性核酸赋予作物对一种或多种抑制该蛋白质野生型的除草剂/除草剂家族的选择性。

可对编码与除草剂靶蛋白质具有结构和/或功能相似性的蛋白质(这些蛋白质对除草剂相对不敏感)的核酸进行DNA改组，来改进编码模仿除草剂靶蛋白质功能，但缺乏该靶蛋白质的除草剂敏感性的蛋白的对除草剂耐受性的核酸。

在下文的实施例中说明了这三种策略，其描述了对除草剂(如通过P450途径易代谢的那些(如麦草畏、磺脲、***基嘧啶等))耐受性的获得，通过缀合途径的除草剂代谢(如噻嗪、硫代氨基甲酸盐、氯化乙酰胺、磺脲)的增强，和除草剂靶蛋白的脱敏或功能性置换。

DNA改组来改进除草剂代谢活性

A．P450基因的改组

(ⅰ)麦草畏选择性

麦草畏(2-甲氧基-3,6-二氯苯甲酸)是一种苗后期使用的除草剂，其被用来控制玉米田和小麦田中的阔叶杂草。虽然玉米、小麦和其它禾木科作物能通过细胞色素P450单加氧酶来代谢麦草畏(Subramanian,1997;FrearDS(1976)于：除草剂，Kearney PC和Kaufman DD编，pp541-594,Marcell Dekker,New York(“Frear,1976”)，在这些作物中对除草剂的天然代谢并不迅速，而且不足以灵活的用于禾本科作物的商业化杂草控制。可进行DNA改组，来对小麦、玉米和其它禾本科作物中的P450基因的麦草畏的迅速代谢进行优化，来提供更高的对除草剂的作物选择性幅度。还可用优化的、代谢麦草畏的P450基因来赋予双子叶作物(如大豆)麦草畏选择性。

可从玉米、小麦或其它禾本科作物的cDNA文库中，用共有序列作为引物，分离出编码代谢麦草畏的细胞色素P450单加氧酶的基因(HotzeM等，FEBS通信374:345-350,Frey M等，(1995)，分子基因遗传学，246:100-109)。可在酵母中(BatardY(1998)植物杂志14:111-120)或在含P450还原酶的大肠杆菌中(Anderson JF(1994)生物化学33:2171-2177)功能性表达该分离的基因。通过例如，制备抽提物并检测麦草畏氧化活性，来确认表达P450基因的克隆对麦草畏的活性。可从亲本化合物中，通过例如HPLC分离出麦草畏氧化的预期产物，5-羟基麦草畏(Subramanian,1997)。还可通过在含有除草剂作为唯一碳源的极限培养基中生长，来鉴定含有编码麦草畏氧化活性的核酸的克隆。含有编码麦草畏氧化活性的P450的克隆由于形成5-羟基麦草畏，发荧光。

还可通过从各种来源筛选许多克隆的细胞色素P450单加氧酶的抗麦草畏活性，来分离编码麦草畏氧化活性的P450基因。可通过测量上述的麦草畏氧化活性，来进行筛选。克隆的P450可任选于微生物、植物、昆虫或哺乳动物。还可如下分离编码麦草畏代谢酶的基因，通过：(a)直接筛选能在麦草畏上生长的微生物，和/或(b)通过在麦草畏类似物，如氯或甲氧基苯甲酸酯上生长后来筛选麦草畏代谢活性(Subramanian,1997)。特别是方法(b)，能发现各种各样的能代谢麦草畏的酶。

可将用上述方法分离的，和编码麦草畏氧化活性的P450基因，通过各种不同途径改组，来改进活性。在一个方法中，可在一条亲本基因上进行DNA改组，如下文更详述的那样。在另一个方法中，可在改组反应中利用数条同源基因。可通过比较分离基因的序列来鉴定同源P450基因。还可从GenBank或其它序列保藏库找到同源P450基因，不论P450的功能。Ortiz de Montellano,1995，和其中的参考文献提供了对P450的结构和功能相当的细节。可在Ortiz de Montellano,1995的附录中找到P450酶的代表性排列。还在万维网http://dmelson.utmem.edu/cytochromep450.html上找到了电子格式的P450基因的最新列表。

通常如下更详细所述，合成并改组P450基因及其片段。基因改组和家族改组提供了两种能改进和“移植”(即，逐渐改变反应类型，底物特异性或对与亲本核酸编码的不同的活性)生物催化剂的功能的最有力的方法。在基因改组中，使亲本核酸突变，或改变为产生变体形式，然后重组变体形式。在家族改组中，重组同源序列(如来自不同物种或染色***置的序列)。

可将改组的基因克隆入，如含有细胞色素P450还原酶的大肠杆菌，并鉴定产生对麦草畏高度活性的大肠杆菌。首先，可检测表达P450的克隆的麦草畏氧化活性，如每库约10个，来快速筛选起始转化物。可将任何显示显著活性的库解卷积(如用有限稀释法克隆)，来鉴定单个具有高活性的所要的克隆。

可任选的，对一个或多个这些克隆的P450基因进行第二轮改组，从而进一步优化氧化麦草畏的速率。含有改组的P450基因的大肠杆菌转化物可直接在含有麦草畏的培养基上生长，而能氧化的菌株可通过产物的荧光得以鉴定。荧光强度在挑选具有高水平活性的克隆中有用。最后，可进一步在粗抽提物中试验直接从荧光筛选出来的克隆，来定量麦草畏代谢活性。另外，可对一个或多个克隆的P450基因进行反复改组，来进一步优化麦草畏氧化的速率。

虽然上文简单参照P450单加氧酶基因讨论，但将理解同样的用于基因优化的克隆、改组和筛选方法也可用于其它基因，来获得编码对麦草畏不同或改进的代谢活性的重组除草剂耐受核酸。事实上，如下文所讨论的，可用本文所述的筛选方法进行全基因组改组(不需要任何要筛选的起始基因的知识)。一般具有对麦草畏的潜在活性并因此适合改组的酶包括：已知的单加氧酶，如来自食油假单胞菌P.oleovorans的单加氧酶等能环氧化的酶(May等(1973)，生物化学杂志，248:725-1730;May等，美国化学协会杂志，98:7856-7858)。事实上，食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)的无亚铁血红素的硫酸铁单加氧酶***是催化单加氧酶反应的最广泛研究的***之一，而且已在数个菌属，包括红球菌、分枝杆菌、假单胞菌和芽胞杆菌中鉴定到了同源的酶。

使用能快速氧化麦草畏的优化的重组除草剂耐受核酸，在转基因玉米和小麦中提供更高的选择性幅度，并增加对这些作物施用麦草畏的窗口。另外，使用优化的核酸，在双子叶作物(如大豆)中提供了麦草畏选择性，其中现在不使用该除草剂。将基因转移到任何植物中的方法是可行的，而且在下文更详细的讨论。

(ⅱ)其它除草剂选择性

由于P450超家族的基因编码修饰各种化合物的活性，因此可对P450基因或P450基因家族进行DNA改组，使其产生一种或多种除草剂耐受核酸，其编码代谢其它除草剂的活性。可改组各种各样来源，包括微生物、昆虫、植物和动物的P450基因，从而产生能迅速代谢非选择性的除草剂的除草剂耐受核酸。可用这些核酸赋予作物对非选择性除草剂的选择性。数种能被P450代谢的除草剂是本领域已知的，如磺脲(Hinz等(1995)杂草科学45:474-480)和***基嘧啶(Owen,1995)。

例如，可进行DNA改组，来获得能迅速代谢非选择性除草剂，如二磷酸、sulfentrazone、磺脲、咪唑啉酮等的除草剂耐受核酸。可用本文描述的全部克隆、改组、筛选、选择和优化程序来使亲本基因或基因家族(如P450基因或基因家族)产生编码对给定的除草剂有代谢活性的重组核酸。因此，筛选可基于底物除草剂和其修饰产物之间物理性能的不同。编码优化的除草剂代谢活性的重组除草剂耐受核酸可用来向不同转基因作物提供对其给定除草剂的选择性。

还可用DNA改组来获得编码能迅速代谢一种以上除草剂的活性的，特异性广泛的除草剂耐受核酸。可用本文描述的全部克隆、筛选、改组、选择和优化程序来改组(如P450基因或基因家族)，以获得广泛特异性的除草剂耐受核酸。通常筛选可基于底物除草剂和其修饰产物之间物理性能的不同。编码快速代谢数种除草剂优化活性的重组除草剂耐受核酸，可用来向不同的转基因作物提供对许多除草剂的选择性，其可单独使用，或作为混合物使用。可理解的是，杂草植物对多种除草剂同时产生耐受性更困难；因此，能同时耐受施用的多种除草剂的种植物是尤其有价值的。

B．谷胱甘肽和同型谷胱甘肽转移酶基因的改组

可用DNA改组来优化编码代谢性偶联酶，如植物(如玉米和大豆等作物)，以及其它来源(如昆虫、细菌和动物)的谷胱甘肽硫转移酶(GST)或同型谷胱甘肽硫转移酶(HGST)，来迅速代谢除草剂(如三嗪、硫代氨基甲酸、氯乙酰胺、磺酰脲)或其它可被代谢或可被GST或HGST代谢的除草剂。用优化的基因来赋予作物对这些除草剂增强的选自性幅度，或赋予先前对上述除草剂之一敏感的作物选择性。

通过GST的作用与谷胱甘肽偶联，是玉米中除草剂解毒的主要机制之一。(Edwards R.Brighton Crop Protection Conference-Weeds-1995,823-832)。玉米有数种GST异构酶，它们对不同化合物(包括除草剂)有不同活性。类似的，大豆通过与同型谷胱甘肽(一种谷胱甘肽类似物)偶联去除一些除草剂的毒性(Owen,1995)。该反应由同型谷胱甘肽硫转移酶(HGST)催化。

虽然GST和HGST使用密切相关的类似物作为偶联底物而催化非常相似的反应，但它们一般不代谢同样的除草剂。另外，已知能被GST去除毒性的玉米-选择性除草剂在大豆中不显示相似的选择性幅度。因此，在另一个实施例中，可对GST和HGST核酸进行DNA改组，或对GST和HGST核酸的组合进行DNA改组，来产生一种转移酶，该酶接受谷胱甘肽和同型谷胱甘肽二者作为底物。使用优化的GST/HGST转移酶核酸，例如，产生转基因玉米和大豆，它们对同样的除草剂具有抗性。

可通过使用这些基因中可得的共有序列，来分离和克隆玉米的编码GST同工酶的基因(Shah DM等(1986)，植物分子生物学6:203-211)。例如，用衍生自核酸序列或从蛋白质序列反翻译的引物，来分离大豆的HGST基因。还可从GenBank或其他序列库，通过序列比较分析(例如，通过选择具有给定百分数的相同性(如上详述)的序列)，鉴定出GST和HGST的同类物。可合成(或PCR扩增，或从合适来源的材料克隆)，改组，一般通过家族改组，克隆并引入大肠杆菌等细胞。可通过直接酶试验，如在约10个转化物的集合体中，筛选表达活性GST和HGST的转化物。可在粗抽提物或在迅速纯化酶(如通过谷胱甘肽亲和柱)进行试验。可通过HPLC分离并定量底物除草剂和偶联的产物。另外，可用质谱分析来跟踪偶联的产物。将显示显著活性的集合体解卷积(deconvolute)，来鉴定具有高活性的唯一所要的克隆。可对来自一个或多个这种克隆的GST/HGST基因进行第二轮改组，来进一步优化反应速率。如果底物除草剂抑制细胞生长，可直接在除草剂上选择改组的基因，因为除草剂偶联物一般是无毒的。在这种情况下，转化物菌落的大小可表明改组基因产物的活性。还可通过直接定量试验，使用从阳性克隆制备的抽提物来确认活性。另外，可对一个或多个这样的克隆的GST/HGST基因进行反复改组来优化。

C．其他用于除草剂耐受性的代谢基因的改组

可对植物或非植物来源的其他基因或基因家族进行DNA改组，来产生文库，可筛选这些文库，来鉴定一种或多种编码不同或改进的活性(其将一种特定的除草剂，或各种除草剂代谢(即，降解或修饰)成对植物无毒的产物)的重组除草剂耐受性核酸。

在热嗜乙酸梭菌(Clostridium thermoaceticum)的紫丁香酸降解的第一种酶对麦草畏具有活性，将其转化成3,6-二氯水杨酸(DCSA;el KasmiA．等(1994)生物化学33:11217-11224)。编码该酶的核酸，以及通过与GenBank数据库序列比较而鉴定的核酸，可通过本文所述的方法或其他本领域技术人员已知的方法来分离或合成。可将基因单独改组，或与其他同源序列一起改组。可将改组的基因克隆并引入细胞，如大肠杆菌，而可用上述方法，或通过基于荧光的对DCSA的形成，筛选对麦草畏产生高活性的基因。可进一步在粗抽提物中试验在恶草畏筛选中具有高活性率的选择出的克隆，定量测定活性。可对选出的基因进行反复改组，来进一步优化恶草畏代谢的速率。可分离已知的，或怀疑能编码代谢恶草畏(如Subramanian,1997中所述的)，或代谢其他除草剂的活性的植物或非植物基因，并通过DNA改组来优化，以提供本发明的除草剂耐受性核酸。

Bar基因编码膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)，其将除草剂膦丝菌素乙酰化成无毒产物。在GenBank中，以登录号X17220出版了吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的编码PAT的基因。可将衍生自该出版的序列、或其区段的变体显示改组成单基因形式。另外，可通过对GenBank数据库该公布序列的同源性搜索，找到同源序列；可用这些同源序列来制备其他用于家族改组形式的核酸底物。根据乙酰膦丝菌素形成速率的提高筛选克隆。

还可进行DNA改组，来增强与将草甘瞵代谢成无活性产物有关的酶的活性。一种这样的酶是微生物酶：草甘瞵氧化酶(GOX;Padgette,1996)。通过用草甘瞵作为唯一磷源，在Mpu+大肠杆菌菌株中筛选无色杆菌(Achromobacter)的基因组DNA制备物，分离编码该酶的基因。筛选是基于事实：该大肠杆菌菌株的生长被草甘瞵抑制。引入该草甘瞵氧化酶基因，恢复了生长，因为草甘瞵被转化成氨基甲基磷酸酯，其易于被Mpu+菌株用作碳和磷源。在草甘瞵的存在下，在Mpu⁺菌株中改组和筛选GOX，其中较大的菌落尺寸表示了增强的氧化酶活性。通过直接测量粗抽提物中的草甘瞵代谢，确定了该结果。使用了编码改良的草甘瞵氧化酶活性的改组和优选的基因，来将对草甘瞵的选择性赋予许多作物。

苯氧基乙酸除草剂，如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)，显示对双子叶植物的除草剂活性。已从接触2,4-D的土壤中分离到了许多降解2,4-D的细菌菌株(见例如，Ka J.O.等(1994)，应用环境微生物60(4):1106-15;Fulthorpe R.R．等，(1995)应用环境微生物学61(9):3274-81)。这些细菌产生各种酶，这些酶与2,4-D代谢和解毒有关。一种这样的酶，由来自真养产碱菌(Alealigenes eutrophus)的tfdA基因编码2,-二氯苯氧基乙酸酯单加氧酶，将2,4-D代谢成对植物无毒的2,-二氯苯酚。可单独或与同源序列一起，根据本文所述的方法，改组tfdA基因，或其他编码苯氧基乙酸除草剂代谢活性的基因，来优化编码改良的苯氧基乙酸除草剂代谢活性的核酸，并被用来赋予大豆等双子叶作物苯氧基乙酸除草剂(2,4-D)选择性。

Fulthorpe等(见上)建议，2,4-D-降解细菌的进化中与各种同源降解性基因的广泛物种间转移有关。可通过使用如下所述的全基因组改组形式，利用天然多样性来产生与未确定特征的2-4-D代谢酶和/或多酶途径有关的除草剂耐受性核酸。

赋予，或能赋予作物对除草剂选择性的细菌降解性基因的其他例子可在例如，Subramanian(1997)和Quinn J.P.(1990；生物技术进展，8:321-333)中。

DNA改组来修饰除草剂靶蛋白质

A．EPSPS基因改组

通过抑制5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合成酶，或EPSPS)(一种催化植物芳族氨基酸生物合成途径的基本步骤的酶)来制备草甘瞵除草剂活性。将EPSPS称为植物中草甘瞵的靶位点。可改组编码EPSPS的基因，来产生重组核酸文库。可筛选文库，获得重组除草剂耐受性核酸，其编码一种修饰的蛋白质，该蛋白质受草甘瞵抑制程度比天然植物EPSPS低，但是与天然植物EPSPS的其他性能，例如底物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和莽草酸3-磷酸(S3P)的动力学性能相当。用重组除草剂耐受性核酸赋予作物草甘瞵选择性。

从各种植物，细菌、酵母、或其他生物直接从cDNA文库(如商业上可购得)，或从分离自植物的mRNA(Padgette(1987)农业生物化学生物物理学258:564-573;Gasser CS等(1988)生物化学杂志263:4280-4289)，从细菌DNA或RNA，从酵母DNA或RNA，或从任何其他需要的生物体(见Ausubel,Sambrook或Berger，见上，对产生细菌和酵母文库的标准方法的描述)分离EPSPS的编码基因。也可从例如GenBank数据库等来源获得的序列化学合成各种来源的编码EPSP合成酶的基因，或那些基因的片段。例如，可从来自各种植物，如矮牵牛花和番茄得到的EPSPS基因序列，设计基因分离用的引物。可单独、或作为一个家族改组、克隆来自各种植物或非植物来源的EPSPS基因，并将其转化入细胞，如大肠杆菌AroA^-菌株(Padgette,1987)。

类似的，可使用细菌EPSPS基因，它是本文各种改组程序的起始材料(或用来设计起始材料)的优选来源。已知各种细菌EPSPS，其中许多在GenBank中可找到。这些包括登录号X00557(EPSPS的大肠杆菌AroA基因)，登录号U82268(EPSPS的痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)的AroA基因)，登录号M10947(EPSPS的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhinurium)的AroA基因)，登录号X82415(EPSPS的肺炎克雷伯菌(Klebsiela pneumoniae)的AroA基因)，登录号L46372(EPSPS的鼠疫耶尔森氏菌(Yersinapestis)的AroA基因)，和Z14100(EPSPS的假单胞菌(Pseudomonas multocida)AroA基因)。另外，可用标准技术，如与DNA文库杂交，或通过用降解(或保守)引物PCR扩增分离(特别从非病原体菌株)同源序列。

可通过将转化物影印铺在含有增量草甘瞵(其对野生型细菌(或对AroA^-细菌)具有抑制性和致死性)的极限培养基平板上鉴定功能性克隆。可用Q-bot仪器，如下所述，使该过程自动化。使用出版的试验方法(Padgette,1987)，定量测定草甘瞵对EPSPS的抑制，和天然底物(PEP和S3P)动力学性能的缺少或降低，并与野生型酶(优选与需要除草剂选择性的作物植物的野生型酶)的性能比较。可用从所选的克隆分离的基因进行反复改组，来优化所要的性能。使用与优选的作物ESPS酶比较，对草甘瞵较不敏感，或不敏感，但与天然底物的动力学性能差别很小，或无差别的EPSP酶的那些编码基因，来赋予优选作物，或许多作物对除草剂的选择性。

图1显示了用于改组细菌EPSPS基因，来获得草甘瞵耐受性的示范性家族改组过程。如所述，将细菌的EPSPS基因(具有合适的1.3kb的平均长度)片段化、合并、再装配/扩增。克隆得到的重组核酸文库，将其转化入大肠杆菌AroA^-菌株，筛选EPSPS活性，并选择对增量草甘瞵的耐受性。可从选择的克隆纯化得到酶，并分析草甘瞵-耐受EPSPS活性的动力学参数(如对于草甘瞵的K_i和对于底物的k_cat,K_m分析)。可重新改组所选的克隆，重复该过程，来进一步优化动力学参数。在下文实施例1和2提供了其他例子。

B．其他除草剂靶基因的改组

乳酸乙酯合成酶(ALS；也被称为乙酰羟基酸合成酶或AHAS)与植物分枝链氨基酸生物合成途径有关。除草剂，如磺脲、咪唑啉酮和***嘧啶等的靶位点是ALS，或抑制ALS。拟南芥(arabidopsis)(GenBank登录号T20822)，棉花(GenBank登录号Z46960)，大麦(GenBank登录号AF059600)和其他植物，以及非植物来源的ALS序列是可得到的，而且可用来合成核酸，用作改组底物，或作为探针来分离其他来源的ALS基因。在单基因或家族改组形式(如本文所述)中，使用DNA改组来产生文库，可筛选该文库中ALS对一种或多种除草剂或除草剂类(例如磺脲、咪唑啉酮、或***嘧啶类的除草剂)的活性，而保留与天然植物ALS对天然底物和辅因子的活性相当的动力学参数。

在植物和绿藻细胞中，原卟啉原氧化酶(protox)的抑制，引起大量原卟啉IX积聚，导致光照下膜变质和细胞死亡。Protox是除草剂(包括二苯基醚型除草剂)的分子靶。在GenBank中可得的Protox序列包括拟南芥(Arabidopsis)(GenBank登录号D83139)，光合成藻类衣原体(Chlamydomonas reinhardtii)(GenBank登录号AF068635)，和烟草(GenBank登录号Y3465)，其可被用作亲本改组底物和/或用来寻找同类protox序列(通过数据库搜索，或通过探测cDNA文库)。使用DNA改组，来产生文库，能筛选该文库，获得重组除草剂耐受性核酸，其编码protox对二苯基醚除草剂的耐受活性。例如，可将改组的protox核酸文库引入衣原体(Rochaix JD(1995)遗传学年度综述29:209-230)，并筛选对二苯基醚除草剂的耐受活性(Randolph-AndersonBL等(1998)植物分子生物学38:839-59)。

DNA改组，来产生新的除草剂耐受活性

在另一种通用策略中，对基因或基因家族进行DNA改组，获得新颖活性，其模仿天然植物除草剂靶蛋白质的活性。要改组的候选亲本基因编码的蛋白与天然靶蛋白质功能和/或结构相似，但与天然靶蛋白质比较，缺乏对除草剂抑制的易感性或降低。DNA改组优化了这些基因，可任选的和衍生自靶蛋白质基因的核酸一起改组，来编码新的蛋白质，其可功能性取代植物中的天然除草剂敏感性靶蛋白质。

细菌MurA基因编码UDP-N-乙酰基葡糖胺的烯醇丙酮酰基转移酶(EPT)，其催化磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的烯醇丙酮酰基部分转移到UDP-N-乙酰基葡糖胺的3-羟基上。EPT是除了EPSPS以外，唯一已知的能催化PEP的烯醇丙酮酸部分的转移(Wanke C等(1992),FEBS通信，310:271-276)；然而，不象EPSPS，草甘瞵不抑制EPT，即耐受。EPT具有和EPSPS非常类似的三级结构，尽管整体的氨基酸序列仅有25％的相同性(SchonbrunE等，(1996)结构4(9):1065-1075)。

可利用DNA改组来产生MurA核酸，来编码新的EPT衍生物(称为EPTD)，其催化烯醇丙酮酰基转移到S3P上，并保留对草甘瞵的耐受性。新的EPTD基因编码的活性能在植物芳族氨基酸生物合成途径中功能性取代EPSPS活性，而且因此赋予含有EPTD基因的植物草甘瞵耐受性。

从细菌，或从其他直接可商品购得的cDNA分离获得，或用标准方法从细菌(或其他所要的生物体)DNA或RNA产生cDNA文库，或可化学合成编码EPT的序列或其片段。已知各种细菌的EPT基因，包括从GenBank找到的一些。这些基因包括登录号M76452(对于EPT，大肠杆菌MurA基因)，登录号Z11835(来自阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)基因)，登录号AF142781(来自沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的MurA基因)，和登录号X96711(来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的MurA基因)。可从序列库鉴定，或用标准技术，如与DNA文库杂交，PCR，或RT-PCR，用降解或保守引物分离了其他同源序列。

根据本文所述的技术，制备了改组EPT核酸的文库。包括在改组反应中的衍生自EPSPS的序列，具体是衍生自S3P结合区的序列，可促使EPT进化成对莽草酸-3-磷酸受体的EPSP类特异性。可筛选改组文库的草甘瞵耐受性，和如前节所述的烯醇丙酮酸莽草酸磷酸合成活性的出现，从其选择候选的EPTD基因。可在候选EPTD基因上进行反复改组，可任选的包括EPSPS序列，来优化对天然植物EPSPS酶的底物动力学性能。可将优化的、编码新的EPTD酶的除草剂耐受核酸引入植物，来赋予植物草甘瞵耐受性。

筛选的自动化

在筛选中，有利的是，可可靠的使用一种试验，来从数千种能精确增加除草剂耐受活性的突变中鉴定出几个突变物。在许多试验形式中，限制因素是文库细胞(或病毒)的生长一致性。该变异是后续试验中的基线可变性的来源。接种体的尺寸和培养环境(温度/湿度)上细胞生长变动的来源。建立最初培养物的所有方面的自动化，和现代的控温和控湿培养箱在减少变化上是有用的。

一方面，在固体培养基上分离细胞、病毒噬斑、孢子等中的文库成员，来产生单独的克隆(或噬斑)。用自动菌落采集器(如Q-bot,Genetix,U.K.)，鉴定并采集菌落，将10,000个不同的突变物在96孔微量滴定板培养皿(含有两个3毫米球/孔)中培育。Q-bot不采集整个菌落，而将一根针***菌落中心，并与细胞(菌丝)和孢子(或在噬斑应用中的病毒)的小量样品一起存在。针在菌落中的时间，接种培养基的点数，和针在该培养基中的时间都影响接种体尺寸，都能被控制并被优化。Q-bot的均匀过程降低了人工操作的误差，并增加建立培养物(粗略的是10,000/4小时)的速率。然后在温度和湿度控制的培养箱中振摇这些培养物。在微量滴定板中的球(可以是用玻璃、钢、或其他合适的惰性物质制造)起到了促进细胞的均匀通气，和细胞材料的分散，与发酵罐的叶片作用相似。优选钢球，因为它们可用磁铁操纵。

可用该试验筛选的单个突变物的数目增加了找到编码改良的除草剂耐受活性的文库组分的机会。为了增加鉴定足够大的集合体的机会，可使用预筛选，其约10倍增加了处理的突变物的数目。显示显著除草剂耐受活性的集合体能被解卷积(如用有限稀释法克隆)，来鉴定具有所需活性的单个克隆。

序列重组的模式

本发明方法可用于重组(“改组”)和筛选，从而推进单个基因、整个质粒或病毒、多基因簇、甚至整个基因组的“进化”(Stemmer(1995)生物技术(Bio/Technology13:549-553)。可重复进行重组和筛选，进一步推进感兴趣的核酸的进化。这些技术不象传统多肽工程那样需要繁复的分析和计算机化。与自然的对对重组(例如有性复制过程中的重组)相反，改组允许以最少的选择轮次完成大量突变的重组。因此，本发明序列重组技术的特有优点在于，它能够进行部分或所有突变之间的重组，从而提供一种快速检索不同的突变组合以哪种方式获得所需结果的方法。然而，有时，可以获得的结构和/或功能信息虽然不是序列重组所必需的，但却提供了改进技术的可能性。

以下专利和专利申请中已经描述了一些序列重组的模式和例子，例如“DNA改组”，“快速强制进化”或“分子选育”：美国专利5,605,793;PCT申请WO95/22625(PCT/US95/02126),1995年2月17日申请；美国专利08/425,684,1995年4月18日申请；美国专利08/621,430,1996年3月25日申请；PCT申请WO97/20078(PCT/US96/05480),1996年4月18日申请；PCT申请WO97/35966,1997年3月20日申请；美国专利08/675,502,1996年7月3日申请；美国专利08/721,824,1996年9月27日申请；PCT申请WO98/13487,1997年9月26日申请；PCT申请WO98/42832,1998年3月25日申请；PCT申请WO98/31837,1998年1月16日申请；美国专利09/166,188,1998年7月15日申请；美国专利09/354,922,1999年7月15日申请；美国专利60/118,813,1999年2月5日申请；美国专利60/141,049,1999年6月24日申请；Stemmer，科学(Science)270:1510(1995);Stemmer等，基因(Gene)164:49-53(1995);Stemmer，生物技术(Bio/Technology)13:549-553(1995);Stemmer，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91:10747-10751(1994);Stemmer，自然(Nature)370:389-391(1994);Crameri等，自然医学(Nature Medicine)2(1):1-3(1996)；和Crameri等，自然生物技术(Nature Biotechnology)14:315-319(1996)。本发明参考了以上诸文献。

选育从至少这样两种物质开始，它们显示彼此序列基本一致(即，至少30％,50％,70％,80％或90％序列一致性)，但在某些位置不同。所述的不同可以是各种突变，例如取代、***和缺失。通常，不同的节段之间在约5-20个位置上有差异。为了通过重组得到比起始材料更高的多样性，起始材料必须至少在两个核苷酸位置上互不相同。即，如果只有两种材料，那必须有至少两个位置不相同。如果有三种材料，第一种材料可以在一个位置上不同于第二种，第二种则可以在另一位置上不同于第三种。起始DNA节段可以互为天然变异体，例如等位变异体或物种变异体。这些节段也可以来自非等位基因但表现出一定程度结构和(通常)功能相关性(例如，同属一超家族的不同基因，例如同属细胞色素P450超家族)。起始DNA节段还包括彼此的变体。例如，一DNA节段可以是另一节段易错PCR复制或诱变盒取代的结果。也可以通过在诱变株中扩增一节段(或两节段)进行诱变。这种情况下，严格地说，第二DNA节段并不是一个节段，而是一大族相关节段。形成起始材料的不同节段通常长度相等或基本相等。然而，并非必须如此；例如，节段之一可以是另一节段的亚序列。这些节段可以作为大分子的一部分存在，也可以是分离的形式。

起始DNA节段可用本发明各种序列重组模式进行重组，从而得到一个重组DNA节段多样性文库。这样的文库可以小到10个成员以下，大到10⁵、10⁹、10¹²个成员以上或更多。一些实施例中，起始节段和得到的重组文库包括全长编码序列和表达所必需的调控序列，例如启动子和聚腺苷酸化序列。另一些实施例中，可将文库中的重组DNA节段***带有表达所必需序列的常用载体，然后进行筛选/选择。

用限制酶位点重组突变

某些情况下，适合用核酸内的限制酶位点在感兴趣的核酸内指导突变的重组。此类技术特别适合某些片段的进化，这些片段因存在重复DNA或其他难处理的一级基序而不易改组。此类情况还包括需要保留某些序列不突变的重组模式。限制酶位点还适用于改组大片段(一般大于10kb)，例如因为其大小而不易改组和“PCR扩增”的基因簇。虽然，曾报道PCR扩增了50kb的片段(Barnes，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)91:2216-2220(1994)，但要扩增10kb以上片段就可能很难，因此，最好有用其他方法进行10-50kb或以上的改组。较好的是，使用Ⅱ类限制性核酸内切酶(Sambrook,Ausubel和Berger,同上)，特别是其中可产生非回文粘端的那些，例如AlwnI,SfiⅠ或BstⅪ。这些酶产生非回文粘端，可用DNA连接酶有效地有序重接。通常，限制酶(或核酸内切酶)位点可用常规限制酶图谱技术(Sambrook,Ausubel和Berger,同上)，分析该基因的序列信息，或通过合成将所需的限制性位点引入一段核酸序列(即，引入沉默突变)来鉴定。

被消化DNA底物分子可以来自体内复制的DNA例如质粒制剂，或来自PCR扩增的核酸片段，它们带有感兴趣的限制酶识别位点，所述位点最好靠近片段末端。通常，用已知在感兴趣的核酸序列内切断的至少一种限制酶消化感兴趣的基因的至少两个各有一处或多处突变的变异体。然后，用DNA连接酶将这些限制片段连接成具有改组区域的全长基因。改组区的数量取决于感兴趣的核酸内的切点数量。可将这些改组分子引入前述细胞，如本发明所述筛选或挑选所需的特性。然后，可从具有所需特性的混合物(文库)或克隆中分离核酸，重复以上过程，直至获得所需程度的进步。

有些实施例中，至少分离出一个DNA底物分子或其片段，并对其进行了诱变。有些实施例中，重新连接的限制片段混合物或文库先诱变，然后重复消化-连接过程。“诱变”在此包括本领域已知的这些技术，例如PCR诱变，寡核苷酸定向的诱变，定点诱变等，和用任一本发明所述技术进行的递进序列重组。

重装配PCR

在核酸序列内重组突变的另一技术使用了“重装配PCR”。该方法可用来装配已分别进化成全长核酸模板例如基因的多个节段。根据过去的研究已知或通过筛选突变体已被鉴定了一组有利突变的时候，使用该技术，所述突变体可以是用本领域各种已知诱变技术产生的，例如PCR诱变、盒式诱变、预测寡核苷酸诱变、化学诱变或DNA模板在诱变株内体内增殖。确定感兴趣核酸序列节段的边界最好在基因间区域、内含子或基因内不太可能发生感兴趣的突变的区域内。较好的是，合成寡核苷酸引物用于PCR扩增感兴趣的核酸序列的节段，使得寡核苷酸的序列与两节段的结合部重叠。重叠区一般长10-100核苷酸。用一组这样的引物扩增各节段。然后按照重装配方案“重装配”PCR产物，例如本发明中用于装配随机片段基因的方案。简而言之，在装配方案之一中，先从引物中纯化PCR产物，用例如凝胶电泳或大小排阻层析。将纯化产物混合在一起，在存在聚合酶和脱氧三磷酸核苷(dNTPs)和合适的缓冲盐但没有附加引物的情况下，进行约1-10轮变性、退火和延伸(“自身引发”)。然后用该基因两侧的引物进行的PCR扩大完全重装配和改组基因的得率。

有些实施例中，先对所得的重装配基因进行诱变，然后重复以上过程。

在另一实施例中，如下文所述，扩增感兴趣的核酸节段所用的PCR引物被用来在感兴趣的基因内引入变异。通过筛选或选择，测定核酸序列同源性等来鉴定核酸序列内感兴趣位点的突变。然后合成PCR引物，它们编码感兴趣位点的野生型或突变型信息。然后将这些引物用于PCR诱变，产生全长基因文库，这些基因编码特定位置上野生型和突变型信息的多种排列。这一技术一般适合于筛选或选择过程昂贵、麻烦或因感兴趣的突变体的基因测序和诱变寡核苷酸合成的费用而言不可行的情况。

用编码同源突变的寡核苷酸进行定点诱变(SDM)，随后进行改组

本发明的有些实施例中，将一段或多段底物序列的序列信息加给一段给定的“亲本”序列，然后在每轮筛选或选择间重组。通常，这是用本领域熟知的技术，以一个作为模板的底物和编码其他底物序列(例如同源基因)中一个或多个突变的核苷酸进行定点诱变进行的(例如Sambrook,Ausubel和Berger，同上)。在对一个感兴趣的改良表型进行筛选或选择后，选出的重组体可用本发明所述的RSRS进一步进化。在筛选或选择后，可用另一组编码同源突变的寡核苷酸再次进行定点诱变，并重复上述过程，直至获得所需的特性。

当两同源基因间的差异是一个密码子内的一个或多个点突变时，可使用编码两同源基因序列的简并寡核苷酸。一段寡核苷酸可包含多个这样的简并密码子而仍然能够彻底检索该序列块的所有排列。

但同源序列空间很大时，宜将检索限制在某些变体内。这样，例如，可用计算机工具(Lathrop等(1996)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),255:641-665)制作靶蛋白上各种同源突变模型，并剔除可能严重扰乱结构及功能的突变。

体外DNA改组模式

在一个体外改组DNA序列的模式中，用于重组的最初底物是相关序列的混合物，例如不同的变体形式，生物不同个体、株系或种类的同源序列，或同一生物体的相关序列，如等位基因变异。这些序列可以是DNA或RNA，可以是不同长度的，这取决于有待重组或重装配的基因或DNA片段的大小。较好的是，这些序列长50bp至50kb。

将相关底物的混合物转化成重叠片段，例如5bp至50kb或更长的片段。通常，例如，片段长约10-1000bp，有时，DNA片段长约100-500bp。上述转化可用多种不同的方法进行，例如DnaseⅠ或Rnase消化，随机剪切或限制酶部分消化。有关核酸的分离、操作、酶消化等的论述参见例如Sambrook,Ausubel和Berger，同上。特定长度或序列的核酸片段的浓度一般低于总核酸重量的0.1％或1％。混合物中不同特异性核酸片段的数量一般至少约100,500或1000。

用包括例如加热、化学变性、使用DNA结合蛋白等多种技术将核酸片段混合物转化为至少部分单链的形式。这种转化可如下进行：加热至80-100℃,90-96℃更好，形成单链核酸片段，然后退火。也可以用单链DNA结合蛋白(参见，Wold，生物化学年报(Annu.Rev.Biochem.)66:61-92)或recA蛋白(参见，Kiianitsa(1997)美国科学院院报94:7837-7840)处理进行转化。与另一单链核酸片段具有相同序列区域的的单链核酸片段然后通过冷却至20-75℃，更好的是40-65℃来退火。可加入聚乙二醇(PEG)，其他占空间试剂或盐来加速复性。盐浓度以0-200mM为宜，10-100mM更好。所述盐可以是KCl或NaCl。PEG的浓度以0-20％为宜，5-10％更好。重新退火的片段可以是不同的底物。将退火后的片段在例如Taq或Klenow等核酸聚合酶和dNTPs(即，dATP、dCTP、dGTP和dTTP)存在下保温。如果相同序列区域大，可使用Taq聚合酶和45-65℃之间的退火温度。如果相同序列区域小，可用Klenow聚合酶和20-30℃之间的退火温度。聚合酶加入随机核酸片段可以在退火前，退火的同时，或退火后。

变性，复性，在重叠片段的聚合酶存在下孵育，产生包含片段的不同排列的一组聚核苷酸，该过程有时又称核酸的体外改组。以上循环重复所需的次数。较好的是，以上循环重复2-100次，更好的是重复10-40次。所得的核酸是一族50bp-100kb的双链聚核苷酸，长500bp-50kb的更好。这些片段代表起始底物的变异体，它们的序列基本一致，但在数个位置上不相同。这些片段的数量多于起始底物。用改组得到的这些片段转化宿主细胞，可以先克隆到载体内后再转化。

采用体外改组的一实施例中，在一定条件下扩增全长序列可产生重组底物的亚序列，所述的条件产生一重要组分，通常至少20％或更多的不完全延伸的扩增产物。另一实施例用随机引物来引发整个DNA模板，产生非全长的扩增产物。将这些扩增产物，包括不完全延伸的扩增产物，变性，并至少再多进行一轮退火和扩增。这至少一轮的退火和扩增产生一份重要的不完全延伸产物，这一改变又称“打滑(stuttering)”。在以后的扩增中，这些部分延伸的产物(非全长的)与不同的序列相关性模板重新退火，并引发延伸。在另一实施例中，可通过底物的部分PCR扩增将底物转化为片段。

另一实施例中，在片段混合物中掺加一种或多种寡核苷酸。可将这些寡核苷酸设计成包括一种野生型序列的预知突变，或个体或物种之间的天然变异位点。这些寡核苷酸内上述突变或变异两侧具有充分的序列或结构同源性，使它们可与野生型片段结合。退火温度可根据同源长度来调节。

另一实施例中，至少一轮循环中的重组是通过模板切换发生的，例如一模板引物在相关但不同的另一模板上的同源位置衍生出一段DNA片段。可通过在扩增混合物中添加recA(参见，Kiianitsa(1997)同上)，rad51(参见，Namsaraev(1997)，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)17:5359-5368),rad55(参见，Clever(1997)欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)16:2535-2544),rad57(参见，Sung(1997)，基因发展(Gene Dev.)11:1111-1121)或其他聚合酶(例如病毒聚合酶，逆转录酶)诱导模板切换。也可以通过提高DNA模板浓度来增强模板切换。

另一实施例使用至少一轮扩增循环，这可以用序列相关但长度不同的一组重叠单链DNA片段进行。这些片段可用单链DNA噬菌体，例如M13来制备(参见，Wang(1997)，生物化学(Biochemistry)36:9486-9492)。各片段都能与该组内的另一片段杂交并引发聚核苷酸链的延伸，从而形成序列重组的聚核苷酸。另一种改变中，可由第一DNA模板，用Pfu、Taq、Vent、Deep Vent、UITma或其他DNA聚合酶产生长度不定的ssDNA片段(参见，Cline(1996)，核酸研究(Nucleic Acids Res.)24:3546-3551)。将这些单链DNA片段用作第二Kunkel型模板即含尿嘧啶环状ssDNA的引物。结果得到第一模板在第二模板内的多处取代。参见，Levichkin(1995)，分子生物学(Mol.Biology)29:572-577;Jung(1992)，基因(Gene)121:17-24。

本发明的有些实施例中，将用本发明递进重组法得到的改组核酸被放入一种细胞和/或生物体内进行筛选。例如，可将改组除草剂耐性基因引入细菌、酵母或植物细胞进行初筛。芽孢杆菌(例如枯草杆菌)和大肠杆菌是两例合适的细菌细胞，适合改组除草剂耐性基因的***和表达。改组基因可通过整合到染色体DNA中或作为质粒引入细菌或酵母细胞。改组基因也可引入植物细胞进行筛选。这样，可用本发明的递进序列重组法体外修饰一个感兴趣的转基因，然后重新***细胞，体内/原位选择新的或改良的特性。

寡核苷酸和硅内(In Silico)改组模式

除以上改组模式之外，本发明还实施了至少另两种相关模式。第一种称“硅内”改组，即用计算机算法在计算机内用基因运算符进行“虚拟”改组。以用于本发明为例，用计算机***重组除草剂耐性核酸序列串，然后通过例如合成寡核苷酸的重装配PCR制造所需的产物。1999年2月5日提交的美国专利申请60/118,854即“字符串、聚核苷酸和具有理想特性的多肽的制造方法”中详细描述了硅内改组。简而言之，用基因运算符(代表例如点突变、两同源核酸链重组等给定基因活动的算法)模拟一种或多种核酸内可能发生的重组或突变，例如通过核酸序列串排列(用标准排列软件或人工检视和排列)和预计重组结果。通过寡核苷酸合成和重装配PCR用预计的重组结果产生相应的分子。

第二种模式称“寡核苷酸介导的改组”，其中，对应于一族相关同源核酸(例如对本发明来说，即一段除草剂耐性核酸或潜在除草剂耐性核酸的种间或等位变异体)被重组，产生可选择的核酸。1999年2月5日提交的美国专利申请60/118,813和1999年6月24日提交的美国专利申请60/141,049即“聚核苷酸介导的核酸重组”中详细描述了这种模式。该技术可用于重组同源，甚至非同源的核酸序列。

寡核苷酸介导的改组模式的优点之一是能够重组序列相似度低的同源核酸，甚至非同源核酸。在这些低同源性寡核苷酸改组法中，一组或多组核酸片段被重组，例如与一组交换家族的多样性寡核苷酸重组。这些交换寡核苷酸有许多序列多样性结构域，对应于许多低序列相似度同源或非同源核酸的序列多样性结构域。与一种或多种同源或非同源核酸比照而得到的这些寡核苷酸片段可与交换寡核苷酸的一个或多个区域杂交，从而促进重组。

当重组同源核酸时，多组重叠家族基因改组寡核苷酸(通过同源核酸比较和寡核苷酸片段合成得到)杂交，并延长(例如通过重装配PCR)，产生一组重组核酸，可在它们中选择所需的特性。通常，所述的重叠家族改组基因寡核苷酸组包括许多寡核苷酸成员类型，这些类型具有来自许多同源靶核酸的共有区域亚序列。

通常，家族基因改组寡核苷酸是通过排列同源核酸序列，选出序列相同的保守性区域和序列不同的区域对齐排列而得到的。(连续或平行地)合成对应于至少一个序列不同区域的多个家族基因改组寡核苷酸。

用于寡核苷酸改组的片段组或片段亚组的获得可以是：剪切一种或多种同源核酸(例如用DNA酶)，或着，更多时，是通过合成对应于至少一段核酸内多个区域的一组寡核苷酸(通常，对应于一全长核酸的寡核苷酸作为核酸片段组的成员)。在本发明改组过程中，可在一个或多个重组反应中用这些剪切片段(例如一个潜在除草剂耐性基因的片段)与家族基因改组寡核苷酸一起产生重组的耐除草剂核酸。

密码子修饰改组

1998年9月29日申请的美国专利60/102362和1999年1月29日申请的美国专利60/117729即“密码子改变的基因的改组”中详细描述了密码子修饰改组的过程。简而言之，合成其中编码多肽的密码子被改变的核酸，在该核酸发生突变后就可能访问一完全不同的突变云。这提高了用于改组方案的起始核酸的序列多样性，改变了强制进化过程的速度和结果。密码子修饰过程可用于，例如，在进行DNA改组之前修饰各种本发明所述的耐除草剂(或潜在耐除草剂)核酸，或者，如前所述，密码子修饰方法可与寡核苷酸改组过程联合。

在此类方法中，选择编码第一多肽序列的第一核酸序列。然后选择多个改变了密码子的核酸序列，它们各自编码第一多肽或一修饰多肽或相关多肽(例如，可在识别文库组成或活性的生物试验中选择一个密码子改变的核酸文库)，然后将这多个密码子改变了的核酸序列重组，产生密码子改变了的编码第二蛋白的靶核酸。然后在该密码子改变的核酸中筛选可测的功能或结构特性，可以与第一多肽和/或相关多肽的特性进行比较。如此筛选的目的是鉴定某结构或功能特性相同或优于第一多肽或相关多肽的多肽。编码这样的多肽的核酸基本上可用于任何所需过程，包括将密码子改变的靶核酸引入细胞、载体、病毒、减毒病毒(例如作为疫苗的组分或免疫组合物)、转基因生物体，等。

体内DNA改组模式

在本发明部分实施例中，DNA底物分子被引入细胞，细胞机能引导它们重组。例如，构建一突变体文库，用任一本文所述的技术筛选或选择具有改良表型的突变体。用任一本文所述的技术回收编码最佳候选突变的DNA底物分子，然后将其剪切成片段，用于转染植物宿主，并筛选或选择改良的功能。如果需要进一步改良，则用例如PCR从植物宿主细胞中回收DNA底物分子，重复上述过程，直至获得所需水平的改良。部分实施例中，片段在转染前变性和重新退火，包被以例如recA等促重组蛋白，或与例如Neo^R等可选择标记共转染，从而可对接受了重组的感兴趣基因的细胞进行阳性选择。例如，PCT申请WO98/13487和WO97/07205描述了体内改组的方法。

体内改组的效率可通过增加感兴趣基因在宿主细胞内的拷贝数来提高。例如，大多数培养于充分培养基中的稳定期细菌细胞培养物含2、4或8个基因组。在基本培养基中，细胞含1到2个基因组。因此，每个细菌细胞的基因组数量取决于细胞进入稳定期时的生长速度。这是因为，生长迅速的细胞具有多个复制叉，于是在结束后在细胞内得到多个基因组。基因组的数量具有菌株依赖性，但所有被测菌株在稳定期都含有一个以上染色体。稳定期细胞内基因组的数量会随时间而减少。这可能是因为完整染色体的断裂和降解，类似于哺乳动物细胞的凋亡。含多份基因组拷贝的细胞内的这种基因组断裂造成了广泛的重组和诱变。此类细胞内多基因组拷贝的存在使得这些细胞内的同源重组频率更高，既发生在细胞内不同基因组内同一基因的拷贝之间，也发生在细胞内基因组与转染片段之间。重组频率的提高可加快基因的进化，从而获得最佳特性。

在自然界，某种细胞内有多份基因组拷贝并不是优点，因为这需要更多的营养来维持这一拷贝数。然而，可对人工条件进行设计，以便挑选高拷贝数。将具有重组基因组的修饰细胞培养在充分培养基中(此时，多拷贝数不再成为劣势)，接触一种或多种混合的诱变剂(例如紫外线或γ射线)或化学诱变剂(例如丝裂霉素、亚硝酸、光激活的补骨脂素)，这些诱变剂诱导易于重组修复的DNA断裂。这种条件可挑选出多拷贝的细胞，因为它们可进行的突变效率更高。经接触诱变剂而存活下来的修饰细胞是富含多基因组拷贝的细胞。如果需要，可分析每个挑选出的细胞的基因组拷贝数(例如，通过与合适的对照的定量杂交)。例如，可用细胞分选仪挑选(例如用DNA特异性荧光化合物，或利用光散射挑选体积增大的细胞)含较多DNA的细胞。测试部分或所有挑选出的细胞，看是否存在针对所需特性经过了优化的基因。

实施例之一中，建立噬菌体文库，并在突变株(例如含mutS、mutT、mutH、mutL、ovrD、dcm、vsr、umuC、umuD、sbcB、recJ等的突变或不全基因产物的细胞)中重组。所述不全是通过基因突变，等位置换，加入试剂(例如小化合物或反义RNA表达产物)进行选择性抑制或其他技术造成的。用高感染复数(MOI)文库来感染细胞，以提高重组频率。

美国专利5,521,077描述了构建噬菌体文库和/或将供体DNA与受主细胞重组的其他策略。PCT申请WO97/07205描述了酵母内质粒重组的其他重组策略。

全基因组改组

实施例之一中，本发明方法被用于“全基因组改组”模式。有关全基因组改组的全面指南可参见1998年7月15日提交的US09/166,188和1999年7月15日提交的US09/354,922即“利用递进序列重组的全细胞及生物体进化”。

简而言之，全基因组改组对于什么核酸可能提供所需的特性事先不做任何假设。相反，在细胞内进行整个基因组(例如，来自基因组文库，或从生物体中分离)的改组，并对细胞进行选择。

通过全基因组改组使细胞进化以获取所需功能的方法需要(例如)将一个DNA片段文库引入多个细胞，于是，至少片段之一与细胞基因组或游离基因内的一个节段发生重组，从而产生修饰细胞。可以繁殖这些细胞，以提高所得重组细胞群的多样性。然后，在这些修饰细胞或重组细胞群中筛选向获得所需功能方向进化的修饰或重组细胞。然后，可以将向获得所需功能方向进化的修饰细胞的DNA与另一DNA文库重组，至少其中之一与修饰细胞内基因组或游离基因内的一个节段发生重组，得到进一步修饰的细胞。然后在这些进一步修饰的细胞中筛选进一步向获得所需功能方向进化的细胞。根据需要重复重组然后筛选/选择的步骤，直至进一步修饰的细胞获得了所需的功能。在该方法的一种变化形式中，在对任何产物细胞进行选择之前，先对修饰细胞进行递进重组以提高细胞的多样性。

全基因组递进改组的一种应用是推进植物细胞或由其获得的转基因植物的进化以获得除草剂耐性。重组材料可以是(例如)全基因组文库，其组分或聚焦文库，其中包含已知或推测提供对一种上述除草剂耐受性的基因的变异体。文库片段常来自与待进化植物不同的物种。不论究竟使用的是何改组方法，可以如本文所述地进行前文所述的筛选和选择方法，包括选择对麦草畏、双膦酸酯(bisphosphonate)、sulfentrazone、咪唑啉酮、磺酰脲、***嘧啶等的耐受性。

用标准方法，包括电穿孔(From等(1985)，美国科学院院报82:5824)，用诸如烟草花叶病毒等病毒进行感染(CaMV;Hohn等，植物肿瘤的分子生物学(MolecularBiology of Plant Tumors)(Academic Press,New York,1982)pp.549-560;Howell，美国专利4,407,956)，用基质内包含或表面上带有核酸的微珠或微粒进行高速轰击穿透(Klein等(1987)，自然，327:70-73)，用花粉为载体(WO85/01856)，或用携带着克隆了DNA片段的T-DNA质粒的根瘤土壤杆菌或毛根土壤杆菌，将DNA片段导入植物组织，培养的植物细胞或植物原生质体。当植物细胞被根瘤土壤杆菌感染时，T-DNA质粒就转移到其中，而且，其中一部分稳定地整合到植物基因组内(Horsehc等(1984)，科学(Science)233:496-498;Fraley等(1983)，美国科学院院报80:4803)。

还可以通过植物原生质体间的基因交换来产生多样性。植物原生质体的形成和融合方法参见美国专利4,677,066;Akagi等的美国专利5,360,725;Shimamoto等的美国专利5,250,433;Cheney等的美国专利5,426,040。

在培养适当时间以便发生重组并表达重组基因后，让植物细胞接触需要获得对其耐性的除草剂，然后收集存活的植物细胞。可对这些细胞中的部分或全部再进行一次重组和筛选。最后获得具有所需程度耐性的植物细胞。

然后可由这些细胞培养成转基因植物。由培养的原生质体再生植物参见Evans等的“原生质体分离和培养”，植物细胞培养手册(Handbook of Plant Cell Cultures)1,124-176(MacMillan Publishing Co.,New York,1983);Davey，“植物原生质体培养和再生的最新发展”原生质体(Protoplasts)(1983)pp.12029,(Birkhauser,Basal 1983);Dale,“谷类和其他难处理作物的原生质体培养和植株再生”，原生质体(1983)pp.31-41(BirKhauser,Basal(1983)Binding“植物的再生”，植物原生质体(PlantProtoplasts)pp.21-73,(CRC Press,Boca Raton,1985)，以及本领域熟练技术人员所知的其他参考文献。有关从细胞再生成植株的其他细节也可参见下文。

在上述方法的一种改变形式中，可按照对植物细胞一样的策略在细菌细胞内进行一轮或多轮预备重组和筛选。在细菌细胞内可获得更快的进化，因为它们的繁殖速度更快，DNA导入这样的细胞的效率更高。经一轮或多轮重组/筛选后，从细菌中回收DNA片段文库，转化到植物中。所述文库可以是完全文库，也可以是聚焦文库。可用植物序列，特别是已知或推测参与耐受性传递的植物序列特异性的引物进行扩增来构建聚焦文库。

植物基因组改组允许递进循环用于向所需植物种类提供改良特性的基因或途径的导入和重组。任何表现出所需特征(例如除草剂耐性)的植物种类(包括种子和野生栽培品种)都可用作导入农作物或园艺植物宿主的DNA的来源。

断裂从源植物制备的基因组DNA(例如，用DnaseⅠ，限制酶或机械法)，然后克隆到适合构建植物基因组文库的载体中，例如pGA482(An.G.(1985)，分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)44:47-58)。该载体具有将基因转移到植物细胞内所需的根瘤土壤杆菌左右边界，和在大肠杆菌、土壤杆菌和植物细胞内进行选择的抗生素标记。提供一个多克隆位点，用于基因组片段的***。其中有一段cos序列，用于有效地将DNA包装入λ噬菌体的头部，以便将原代文库转染到大肠杆菌内。该载体可接受25-40kb的DNA片段。

原代文库也可通过电穿孔直接导入用于感染和转化植物宿主细胞的根瘤土壤杆菌或毛根土壤杆菌(Main,GD等(1995)，分子生物学方法，44:405-412)。或者，DNA可通过电穿孔或PEG介导的摄取，或通过对细胞或组织的粒子轰击(Christou，同上，A2-1-15)导入受主植物的原生质体(Bilang等(1994)，植物分子生物学手册(Plant Mol.Biol.Manual),Kluwer Academic PublishersA1:1-6)。如有必要，只要能够进行特征的选择，可去除T-DNA区域内的抗生素标记，使得最终的植物产物不含抗生素基因。

在含有除草剂的固体或液体培养基上选择稳定转化的获得特征的全细胞，所述除草剂正是导入DNA提供的耐受性所针对的。如果不能直接选择到所需的情况，可用抗生素选择转化细胞，使之形成愈伤组织或再生成为完整的植株，然后筛选所需的特性。

第二轮及以后的轮次包括从各转基因系中分离基因组DNA，将其导入一种或多种其他转基因系。每一轮，挑选出转化细胞，这通常以一种递进的方式进行(例如提高剂量)。为了加速使用多轮转化的过程，可以直到最后一次才进行植物再生。由原生质体或转化组织得到的愈伤组织可作为基因组DNA的来源和新的宿主细胞。最后一轮之后，再生成能育植株，挑选***了DNA的纯合后代。或者，分离出小孢子，即由自然二倍体生成的纯合子。最后，创造了一种新的植物，它带有多个***基因，它们叠加性或协同性地提供高水平的所需特性。

此外，可对提供所需特性的导入DNA进行示踪，因为其两侧是载体内的已知序列。用PCR或质粒拯救来分离所述序列，并更详细地描述它们的特征。以T-DNA边界序列为引物，用合适的试剂和方法进行全长25-40kb***片段的长PCR(Foord,OS和Rose,EA,1995,PCR引物：实验室手册，CSHL Press,pp.63-77)。如果将载体修饰成在T-DNA边界序列之间具有大肠杆菌的复制起始点和抗生素标记，就用只在***DNA末端切断的稀有剪切限制酶例如NotⅠ和SfiⅠ来产生含有源植物DNA的片段，这些片段于是自身连接，并转化到大肠杆菌中，以质粒形式进行复制。可对与被转移特性的相关的总DNA或其亚片段通过DNA改组进行体外进化。然后将改组后的文库导入植物宿主细胞，筛选特征的改良。用这种方式，可将单基因或多基因特征从一个品种转移到另一品种，并进行优化以获得更高的表达或活性，从而获得生物体的整体改良。

或者，可用小孢子转化细胞，然后直接在再生而成的单倍体植株中筛选改良特征。小孢子是单倍体雄性孢子发育成的花粉颗粒。花粉囊在早单核体至第一次有丝***期间含有大量小孢子。已成功地将大多数植物种类的小孢子都诱导发育成为植株，例如稻米(Chen,CC(1977)，体外(In Vitro)13:484-489)，烟草(Atanassov,I.等(1998)，植物分子生物学38:1169-1178)，紫露草(Savage JRK和Papworth DG(1998)，突变研究(Mutat.Res.)422:313-322)，阿布(Park SK等(1998)，发育(Development)125:3789-3799)，甜菜(Majewska-Sawka A和Rodrigues-Garcia MI(1996)，细胞科学杂志(J.CellSci.)109:859-866)，大麦(Olsen FL(1991)，遗传(Hereditas)115:255-266)和葡萄柚(Boutillier KA等(1994)，植物分子生物学，26:1711-1723)。

小孢子长成的植株大多数是单倍体或二倍体(很少多倍体和非整倍体)。双倍体植株是纯合子而且能育，可在较短时间内长成。来自F1杂交植物的小孢子具有很大的多样性，因此是研究重组的很好模型。而且，可用土壤杆菌导入的T-DNA，或用其他已知方法转化小孢子，然后再生成单个植株。可用小孢子制备原生质体，并用本领域已知方法进行融合。

将小孢子(特别是单倍体)产生的原生质体混合并融合。将来自原生质体融合产生的植物的小孢子再次混合并融合，以提高所得小孢子的遗传多样性。可用各种方式对小孢子进行诱变，例如化学诱变，辐射诱导诱变和(例如)t-DNA转化，然后融合或再生。可通过前文所述的递进过程使产生的新突变发生重组。

全细胞内除草剂耐性的快速进化

可用例如前文所述的全基因组改组方法来使比亲本植物细胞具有独特或改良耐除草剂活性的植物细胞进化。当提供对特定除草剂耐性的基因或提供对特定除草剂耐性的机制不清楚时，或当已知和/或推测了多种耐性机制时，这一方法特别有用。选来接受外源DNA片段的植物细胞最好是农作物细胞。可从不同的植物品种，最好是具有除草剂耐性的植物品种，或从其他生物体，特别是具有确知或推测除草剂耐性的生物体分离用于转化的外源DNA。用标准方法分离DNA(Sambrook,1989)，用(例如)剪切进行断裂。将DNA导入一群悬浮培养的原生质体或细胞。然后，给予该样群一定剂量即可杀死大多数(例如95％)细胞的除草剂。对于存活者，进一步用供体的DNA或存活组的DNA转化。以上过程不断递进，直至获得所需水平的耐性。然后由进化细胞或原生质体再生成植株，选育出具有耐性特征的品系。如果转化所用的DNA片段含有特殊序列，使得导入的DNA能通过PCR从被转化植物中回收，则可进一步改良该方法。以这种方式，可将编码除草剂耐性的重组核酸转移给任意品种，而不仅仅限于进行转化和选择所在的品种。

如果能获得适当的作物选择性，则目前某些市售的重要除草剂可拓展出新的用途。例如，这样的除草剂包括氯乙酰胺类，如异丙甲草胺、乙草胺和dimethenamid。目前尚不知道氯乙酰胺类的作用机制，也未曾发现过对此类除草剂的耐性。以上方法可用来进化谷类作物的植物细胞，从而获得对氯乙酰胺类除草剂的耐性。然后将这些细胞再生成具有氯乙酰胺类选择性的农作物，于是，可对它们使用氯乙酰胺类除草剂，例如用于出芽前除草。

例如，进行光合作用的绿色衣藻属(Chlamydomonas reinharditii)对除草剂具有耐性，可将从中分离的DNA片段导入植物细胞，从而进化获得对抑光合作用除草剂，例如氨基甲酸苯酯、哒嗪酮、三嗪、三嗪酮(triazinone)、脲嘧啶等抑制光***Ⅱ的除草剂的耐性(参见，例如，Erickson JM等(1989)，植物细胞(PlantCell)1(3):361-71)。

另一例中，可促进植物细胞进化以获得对除草剂hydantocidin的耐性，该除草剂可杀死所有种类的植物。hydantocidin在植物内被一种未知机制磷酸化。该磷酸化产物抑制嘌呤生物合成路径中的腺嘌呤琥珀酸合成酶。没有磷酸基的hydantocidin不抑制该酶。虽然来自大肠杆菌和大鼠肝的腺嘌呤琥珀酸合成酶和植物的该酶一样受到磷酸化hydantocidin的抑制，但hydantocidin本身对这两种生物体的毒性极小。使得hydantocidin在这些生物体内的毒性低于在植物细胞内的机制可能包括，hydantocidin的吸收降低，hydantocidin磷酸化降低，或毒性磷酸hydantocidin的脱磷酸作用增强，等等。通过前述全基因组改组方法，用分离自hydantocidin对其毒性极小或无毒的生物体基因组的DNA片段，可使得细胞进化获得对hydantocidin的耐性。

生成转基因植物

本发明内容之一中，通过上述方法为获得除草剂耐性而进行的核酸改组被用来生成转基因植物细胞。另一项内容中，所述核酸被用来生成转基因植物。

本发明所述的植物细胞或原生质体转化可按植物分子生物学领域所熟知的方法中任一一种进行，这些方法包括但不限于本文所述的那些。主要参见，酶学方法(Methods in Enzymology),Vol.153(“重组DNA,D部”)1987,Wu和Grossman编辑，Academic Press。“转化”在此表示，通过导入一段核酸序列即“外源”核酸序列来改变宿主植物的基因型。外源核酸序列不一定要来自不同的来源，但在某些位点已不同于它将进入的细胞。

除了Berger、Ausubel和Sambrook等植物细胞克隆、培养和再生的常用参考文献外，还有Payne等(1992)，液态***内植物细胞和组织的培养(Plant Cell and TissueCulture in Liquid Systems),John Wiley & Sons,Inc.New York,NY(Payne)；和Gamborg和Philips(编辑)(1995)，植物细胞、组织和器官的培养；基本方法(Plant Cell,Tissue andOrgan Culture;Fundamental Methods,Springer Lab Mannal,Springer-Verlag(BerlinHeidelberg New York)(Gamborg)。细胞培养基参见Atlas and Parks(编辑)，微生物培养基手册(The Handbook of Microbiological Media)(1993),CRC Press,Boca Raton,FL(Atlas)。其他信息可自下列文献获取：例如，Sigma-Aldrich,Inc(St Louis,MO)(Sigma-LSRCCC)的生命科学研究细胞培养物目录和Sigma-Aldrich,Inc(St Louis,MO)(Sigma-PCCS)的植物培养物目录及增补(1997)。

本发明实施例之一中，为了使植物获得***性的除草剂耐性，制备包含分离序列且适合转化植物细胞的重组DNA载体。通常采用编码所需核酸的DNA序列，例如编码全长蛋白的cDNA或基因组序列，构建可导入所需植物的重组表达盒。一个表达盒一般包括所选的改组核酸序列，它与启动子序列及其他转录、翻译启动调控序列操作性连接，这些序列在被转化植物的目标组织(例如整株植物，叶，根)内指导基因的转录。

例如，可使用一个强或弱的组成型启动子，它可在所有植物组织内指导改组的P450或前述其他酶的表达。此类启动子在大多数环境条件下和细胞发育分化各阶段都具有活性。组成型启动子的例子包括根瘤土壤杆菌T-DNA的1′或2′启动子，以及众所周知的各种植物基因的转录起始区。如果耐除草剂因子的过表达对植物有害，则技术人员根据本发明所述，会意识到，可用弱组成型启动子进行低水平表达。当高表达对植物无害时，可用强启动子，例如t-RNA或其他polⅢ启动子，或烟草花叶病毒启动子等强polⅡ启动子。

或者，可对植物启动子进行环境控制。此类启动子称“诱导型”启动子。会引发转录的环境条件的例子包括：病原攻击，厌氧条件或有光存在。

本发明实施例之一中，本发明构建物所用启动子是“组织特异性的”并受发育控制(developmental control)，这样，所需基因只在某些组织，例如叶和根中表达。

P450加单氧酶、谷胱甘肽硫转移酶、同型谷胱甘肽硫转移酶、草甘膦氧化酶和5-烯醇式丙酮酰(pyruvyl)莽草酸-3-磷酸酯合成酶的内源性启动子特别适用于在被转染植物中指导这些基因的表达。

还可用组织特异性启动子指导异源结构基因，包括本发明所述的改组核酸的表达。因此，可将启动子用在重组表达盒中，用于驱动各种在施用除草剂后需要其表达的基因的表达。这样的例子包括：正常情况下提供植物除草剂耐性的蛋白的编码基因，编码有用表型特征，例如影响异配优势的基因。

一般说来，植物表达盒内所用的具体启动子取决于特定的用途。许多在植物细胞内指导转录的启动子中的任意一种都可能适合。启动子可以是组成型的，也可以是诱导型的。除上述启动子外，可在植物中起作用的细菌启动子包括章鱼碱合成酶启动子，胭脂氨酸合成酶启动子和天然Ti质粒的其他启动子。参见，Herrara-Estrella等(1983)，自然303:209-214。病毒启动子包括烟草花叶病毒的35S和19S RNA启动子。参见，Odell等(1985)，自然313:810-812。其他植物启动子包括1,3-二磷酸羧化酶小亚基启动子和菜豆碱启动子。还可使用E8基因和其他基因的启动子序列。E8基因启动子的分离和序列的详细描述参见Deikman和Fischer,1988)，欧洲分子生物学杂志，7:3315-3327。

为了鉴定候选启动子，分析基因组克隆5′部分的特征性启动子序列。例如，启动子元件包括通常位于转录起始位点上游20-30碱基对处的TATA盒共有序列(TATAAT)。在植物中，在TATA盒上游即-80至-100处，一般还有一个启动子元件，是带有围绕三核苷酸G(或T)NG的一系列腺嘌呤。Messing等，植物基因工程(GeneticEngineering in Plants),Kosage等(编辑)，pp.221-227(1983)。

制备本发明表达载体时，最好还使用除启动子和改组基因以外的序列。如果需要正确表达多肽，应包括位于改组编码区3′末端的聚腺苷酸化区域。该聚腺苷酸化区域可来自天然基因，来自许多其他植物基因，或来自T-DNA。还可以使用信号/定位肽，它们帮助所表达的多肽转移到内部细胞器(例如叶绿体)，或分泌到胞外。

含改组序列的载体一般带有标记基因，为植物细胞提供可选表型。例如，所述标记基因编码抗微生物剂耐性，特别是抗生素耐性，例如对卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素的耐性，除草剂耐性，例如对chlorosluforon或phosphinothricin(除草剂bialaphos和Basta的有效成分，这两种除草剂除作为选择剂之外，还可能是前述DNA改组的目标)的耐性。可以使用报道基因(例如)监测植物细胞内瞬时基因的表达，报道基因被用于通过可显示反应产物(例如β-glucoronidase,β-半乳糖苷酶和氯霉素乙酰转移酶)或直接显示基因产物本身(例如绿荧光蛋白(GFP)；Sheen等(1995)，植物杂志8:777-784)监测基因的表达和蛋白的位置。在筛选植物细胞培养物的除草剂耐性时，可在植物细胞中使用瞬时表达***。

植物的转化

原生质体

本发明参考了许多本领域已知的制备各种植物的可转化原生质体，然后转化培养的原生质体的方法。例如，参见，Hashmoto等(1990)，植物生理学(Plant Physiol.93:857；植物原生质体(Plant Protoplasts),Fowke LC和Constabel F编辑，CRC Press(1994)；Saunders等(1993)，植物在体外技术中的应用讨论会，UPM,16-18,1993年11月；和Lyznik等(1991)，生物技术(Bio Techniques)10:295，本发明参考了以上诸文献。

叶绿体

叶绿体可能是某些除草剂耐性的作用场所，而且，有时，除草剂耐性基因的产物优先与叶绿体转运序列肽融合，从而促进基因产物进入叶绿体。此时，最好将改组的除草剂耐性核酸转化到植物宿主细胞的叶绿体内。本领域内的许多方法可进行叶绿体转化与表达(Daneill等(1998)，自然生物技术(Nature Biotechnology)16:346;O′Neill等(1993)，植物杂志(The Plant Journal)3:729;Maliga P(1993)TIBTECH11:01)。表达构建物包含在植物内有效的转录调节序列，它与编码除草剂耐性基因产物的聚核苷酸操作性连接。至于设计成在叶绿体内有效的表达盒(例如所含除草剂耐性核酸编码本发明耐草甘膦EPSP合成酶或其他新EPTD的表达盒)，它含有确保在叶绿体内表达所需的序列。通常，编码序列的两侧是与叶绿体基因组同源的区域，这样可与基因组发生同源重组；两侧的质体DNA序列内通常还具有一个可选标记基因，用于在所得的转质体(transplastonic)植物细胞中挑选出遗传上稳定转化的叶绿体(参见，MaligaP(1993)和Daniell等(1998))。

一般转化方法

可通过多种常规技术将本发明的DNA构建物导入所需植物宿主细胞的基因组。转化大量高等植物种类的技术是众所周知的，并记载在技术与科技文献中。参见，Payne,Gamborg,Atlas,Sigrna-LSRCCC和Sigma-PCCS(同上)和Weising等(1988)，遗传学年度回顾(Ann.Rev.Genenet)22:421-477。

例如，可通过电穿孔或显微注射植物细胞原生质体等技术，将DNA构建物直接导入所需植物宿主的基因组，或者，可用轰击法，例如DNA粒子轰击，将DNA构建物直接导入植物组织。或者，可将DNA构建物与合适的T-DNA两侧序列组合，然后导入常规的根瘤土壤杆菌宿主载体。当植物细胞宿主被根瘤土壤杆菌感染时，根瘤土壤杆菌的毒性将把构建物和邻近的标记***植物细胞DNA。

显微注射是本领域的公知技术，并记载在科技和专利文献中。用聚乙二醇沉淀导入DNA构建物的方法参见Paszkowski等，欧洲分子生物学杂志3:2717-2722(1984)。电穿孔技术参见Fromm等，美国科学院院报82:5824(1985)。轰击转化法参见Klein等，自然327:70-73(1987)和Weeks等，植物生理学102:1077-1084(1993)。

在一特别优选的实施例中，用根瘤土壤杆菌介导转化的方法将改组的编码序列导入转基因植物。土壤杆菌介导的转化主要用于双子叶植物，但有些单子叶植物也可用土壤杆菌来转化。例如，稻的土壤杆菌转化，参见Hiei等(1994)，植物杂志6:271-282；美国专利5,187,073；美国专利5,591,616;Li等(1991)，中国科学(Science inChina)34:54；和Raineri等(1990)，生物/技术(Bio/Technology)8:33(1990)。土壤杆菌转化的玉米，大麦，黑麦和芦笋，参见Xu等(1990)，中国植物学杂志(Chinese J.Bot.)2:81。

在此项技术中，利用根瘤土壤杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒整合到植物细胞基因组内的能力，将感兴趣的核酸共转移到本发明的重组植物细胞内。通常，制备一个表达载体，其中，感兴趣的核酸连接在一个自主复制质粒内，该质粒还含有T-DNA序列。T-DNA序列一般在感兴趣的表达盒核酸两侧，并包含该质粒的整合序列。除表达盒之外，T-DNA通常还包含标记序列，例如抗生素耐性基因。然后，将含有T-DNA和表达盒的该质粒转染到根瘤土壤杆菌内。为了转化植物细胞，根瘤土壤杆菌在天然Ti质粒上也含有必需的vir区。

在其他转化技术中，T-DNA序列和vir序列在同一质粒上。有关根瘤土壤杆菌基因转化，参见，Firoozabady & Kuehnle，植物细胞、组织和器官培养：基本方法，Gamborg & Philips(编辑)，Springer Lab Mannual(1995)。

关于本发明的植物转化，一方面，外植体用所需植物组织如叶子制成。然后将该外植体培育在约0.8×10⁹至1.0×10⁹细胞/毫升的根癌农杆菌溶液中合适的时间(通常是数秒)。然后使外植体在合适的培养基上生长大约2-3天。

转基因植物的再生

通过植物转化技术衍生获得的转化的植物细胞，包括上述那些，可培育再生成具有转化基因型的全植物，从而具有所需的表型，例如对除草剂的***性获得的耐受性。这些再生技术依靠的是在组织生长培养基中进行某些植物激素的操作，通常依靠的是和所需的核苷酸序列一起导入的杀生物剂和/或除草剂标记。从培养的原生质体再生植物的方法在Evans，等人，《原生质体分离和培养，植物细胞培养手册》124-176页，Macmillan Publishing Company,New York,1983；和Binding，《植物再生，植物原生质体》21-73页CRC Press,Boca Raton,1985中有所描述。还可从植物胼胝体、外植体、器官或其部分再生植物。这些再生技术在Klee等人，Ann.Rev.of Plant Phys.38:467-487(1987)中有所描述。另见，Payne,Gamborg,Atlas,Sigma-LSRCCC和Sigrna-PCCS(同前)。

在用农杆菌转化后，将外植体转移到选择培养基中。本领域技术人员将认识到，选择培养基取决于何种可选择标记被共转染到外植体内。在适当长的时间后，转化体开始形成芽。在芽苗长约1-2厘米后，应将芽苗转移到合适的根芽培养基中。在根芽培养基中，应维持选择压力。

转化体在1-2周内会长出根并形成小植株。小植株高度约为3-5厘米后，应将它们放入纤维盆中无菌土壤内。本领域技术人员会理解，应当使用不同的习服适应程序来获得不同种类的转化植物。在一个较佳的实施方案中，将长出根和苗后的转化植物的插枝以及体细胞胚转移到培养基中用来建立小植株。关于转化植物的选择和再生的描述，参见Dodds & Roberts，《植物组织培养实验》第3版，Cambridge UniversityPress(1995)。

本发明的转基因植物可从基因型或表型来鉴定，以确定改组基因的存在。基因型分析是测定特定遗传物质的存在与否。表型分析是测定表型性状的存在与否。表型性状是由植物遗传物质与环境因素共同决定的植物的物理特征。改组DNA序列的存在可以如上文“优化的改组核酸的鉴定”部分中所述的那样检测，例如PCR扩增转基因植物的基因组DNA并使基因组DNA与特异标记的探针杂交。植物在所选除草剂上存活也可用来监测除草剂耐受性因子是否掺入植物内。

如本文所述的那样，用改组的核酸转导植物，以获得除草剂耐受性。利用本文的技术，基本上所有植物均能获得除草剂耐受性。可获得除草剂耐受性的一些合适的植物例如包括下列各属的植物种类：草莓属、莲属、苜蓿属、驴豆属、车轴草属、胡卢巴属、豇豆属、柑橘属、亚麻属、天竺葵属、木薯属、胡萝卜属、拟南芥属、芸苔属、萝卜属、欧白芥属、颠茄属、辣椒属、曼陀罗属、天仙子属、番茄属、烟草属、茄属、碧冬茄属、毛地黄属、Majorana、菊苣属、向日葵属、莴苣属、雀麦属、天门冬属、金鱼草属、Hererocallis、Nemesia、天竺葵属、黍属、狼尾草属、毛莨属、千里光属、Salpiglossis、香瓜属、Browaalia属、大豆属、黑麦草属、玉蜀黍蜀、小麦属、高粱属、苹果属、芹属和曼陀罗属，包括甘蔗、甜菜、棉花、果树和豆荚。特别适合的是草科植物，如玉米、小麦、大麦、燕麦、苜蓿、水稻、小米、黑麦等。工业上重要的豆类作物如大豆也是特别适合的。

作为预测工具的迅速进化

递推序列重组可用来模拟植物细胞(如杂草植物细胞)在对接触受测试除草剂的反应中而发生的天然进化。一个目的是鉴定出在杂草(或杂草亚组)中进化获得耐受性只能缓慢获得(如果完全获得的话)的除草剂。利用全基因组改组方式(如上所述)，植物细胞的进化比天然进化的速度更快。进化速度的一个量度是细胞获得既定水平的除草剂耐受性所需的重组和筛选的轮数。该分析得到的信息在比较不同除草剂的相对优点，尤其是在评价这些除草剂在重复施用于杂草后的长期效果中是很有价值的。

用于该分析的植物细胞和DNA可以从例如通常的和/或商业上重要的杂草衍生获得，这些杂草例如是苘麻(Abutilon threophrasi)、藜属(Chenopodium spp.)、苋属(Amaranthus spp.)、番薯属(Ipomoea spp.)、狗尾草属(Setaria spp.)、稗属(Echinochloaspp.)、茄属(Solanum spp.)、假高粱(Sorghum halopense)、马唐属(Digitaria spp.)、黍属(Panicum spp.)、旱雀麦(Bromus tectorum)和地肤(Kochia scoparia)等。进化这样来实现，用DNA片段文库转化对测试除草剂敏感的植物(例如上述杂草之一)的转化细胞或原生质体，其中文库的至少一个成员与天然植物基因组同源。片段例如可以是待进化植物的基因组的突变型。如果除草剂的靶标是已知蛋白质或核酸，则可使用含有对应基因的变体的聚焦文库(focused library)。或者，文库可包含来自其它植物种类(尤其是杂草植物)的DNA，从而模拟了来源物质的体内重组。文库还可包含杂草或已知对除草剂有耐受性的其它植物的DNA。在转化和繁殖细胞适当时间以使重组发生且重组基因表达后，使细胞接触受测试的除草剂(在初始浓度下，例如使90-95％的细胞死亡的浓度下)，然后收集存活者来筛选细胞。对存活的细胞进行数轮重组。随后的回合可以通过分开和合并方法来进行，将存活细胞的一个亚组的DNA导入细胞第二个亚组中。或者，可在存活细胞内导入新的DNA片段文库。随后的选择回合可在浓度增加的除草剂下进行，以提高选择的严谨度，直至获得对预定水平的除草剂的抗性。预定水平的除草剂抗性可能反映了实践中给予作物的除草剂最大水平。该分析方法在调查杂草对各种除草剂耐受性的长期获得方面很有价值，这些除草剂例如是氟哒酮、氟乐灵、胺硝草、那捕净、dichlofop-methyl、imazethapyr、麦草畏、草丁膦、虎威、封草醚等。该方法特别适合用来评价杂草长期获得对较新除草剂(包括具有新的作用方式的那些除草剂，如sulcotrione和isoxaflutole)的耐受性的可能性。该分析方法在评价对除草剂组合的耐受性的长期获得方面特别有价值。

先将该方法应用于植物获得耐受性的手段已知的那些除草剂，可进一步提高该分析的价值。可用作分析标准品的除草剂例子包括，已知植物能相对迅速获得耐受性的那些除草剂，如嗪磺隆和莠去津，以及已知植物较慢获得耐受性的那些除草剂，如草甘膦和异丙甲草胺。

在不背离权利要求所要求的本发明精神或范围内，可对上述方法和材料作改进，且本发明可用于许多不同的用途，它们包括：

用集成***测试改组DNA中的除草剂耐受性，包括在一个重复的过程内。

用集成***预测除草剂在改组DNA中的长期效果，包括在一个重复的过程内。

利用上述任一筛选或选择策略、材料、组分、方法或底物任一项的试验、试剂盒或***。试剂盒可任选地包含实施所述方法或试验的说明书，包装材料，含有试验、装置或***组件等的一个或多个容器。

另一方面，本发明提供了实施本文方法和装置的试剂盒。本发明的试剂盒任选地含有一种或多种以下物质：(1)本文所述的改组文库；(2)实施本文所述方法和/或进行本文的筛选或选择程序的说明书；(3)一种或多种除草剂试验组分；(4)盛放除草剂、核酸、植物、细胞等的容器；和(5)包装材料。

另一方面，本发明提供了本文的任一组分或试剂盒用于实施本文任一方法或试验的用途，和/或任一装置或试剂盒用于实施本文任一试验的用途。

实施例

提供下列实施例的目的是为了说明，而不是限制本发明。在所述确切程序上作出的基本等价的变化是本领域技术人员在看了本文的揭示后能明白的。

实施例1：改组植物EPSPS基因以获得草甘膦耐受性

用引物5′GCAGT CCATG GAGAA AAGCG TCGGA GATTG TACTT CAACC C-3′和5′-TAGAC TAAGA TCTGT GCTTT GTGAT TCTTT CAAGT ACTTG G-3′从反转录RNA PCR扩增拟南芥EPSPS cDNA。用NcoⅠ和BglⅡ消化该片段，然后定向克隆到原核表达载体pQE60(QIAGEN)中，并导入大肠杆菌AroA AB2829株(Pittard,1966)中。同样，用引物5′-ACGTC CATGG CAAAA CCCCA TGAGA TTGTG CTAG-3′和5′-CAGTA GATCT GTGCT TAGAG TACTT CTGGA G-3′从cDNA文库(Stratagene)的纯化噬菌体DNA扩增番茄cDNA，克隆到pQE60中，并导入AB2829细胞内。转化细胞在缺乏芳族氨基酸的极限培养基上生长证明AroA突变的功能被克隆的EPSPS基因表达所补充。

用通用的M13正向和反向引物来PCR扩增pQE60克隆的拟南芥和番茄EPSPS基因。混合这两个DNA，用DNA酶处理，然后改组。将用于拟南芥和番茄的NcoI和BglⅡ引物混合，用来从最终重装配的混合物扩增改组产物。将改组基因克隆到pQE60中，电穿孔转移到AB2829细胞内。将转化的细胞接种到极限培养基上，将复制品接种到含有2、5、10和20毫摩尔草甘膦的极限培养基平板中。所有平板均含有75毫克/升氨苄青霉素。

使有功能的耐受草甘膦的克隆在LB培养基中生长，用IPTG诱导，并用His-Tag纯化***(QIAGEN)纯化EPSPS蛋白。如实施例2所述，用纯化的酶测试对草甘膦和PEP的活性以及结合动力学。

实施例2：EPSP合成酶的重组形式对草甘膦的耐受性

通过用孔雀绿比色试验(Lanzetta PA等人，Anal.Biochem.100:95-97,1979)监测磷酸盐的产生，测定EPSP合成酶的正向活性。反应在含有酶、0.1mM磷酸烯醇丙酮酸、0.1mM莽草酸-3-磷酸以及各种浓度的草甘膦的试验缓冲液(50mM HEPES,pH7.0和0.1mM钼酸铵)中进行，最终体积为0.2毫升。20分钟后，加入0.7毫升孔雀绿试剂(3份0.045％孔雀绿与1份4.2％钼酸铵)终止反应。10分钟后，用Beckman DU600分光光度计测定660nm下的吸光度。从活性百分数对草甘膦浓度的曲线得到每种酶对草甘膦的抑制常数(150)。从形成产物的速度对PEP浓度的曲线获得PEP的K_m。

尽管出于清楚和明了的目的已经描述前述发明的一些细节，但本领域技术人员在阅读了本文公开的内容后显然能作出不脱离本发明真实范围的形式上和细节上的各种变动。例如，上述所有技术和材料可以各种组合方式使用。本申请中引用的所有出版物和专利文献均出于所有目的全部纳入本文作参考，正如每份出版物或专利文献单独表示出的那样。

序列表<110>Subramanian,Venkiteswatan

Stemmer,Willem P.C.

Castle,Linda A.

Muchhal,Umesh S.

Siehl,Daniel L.<120>用DNA改组生产除草剂选择性作物<130>0113.100<140>PCTUS99/18394<141>1999-08-12<150>60/096,288<151>1998-08-12<150>60/111,146<151>1998-12-07<150>60/112,746<151>1998-12-17<160>4<170>FastSEQ for Windows DEMONSTRATION Version 4.0<210>1<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的引物<400>1gcagtccatg gagaaaagcg tcggagattg tacttcaacc c 41<210>2<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的引物<400>2tagactaaga tctgtgcttt gtgattcttt caagtacttg g 41<210>3<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的引物<400>3acgtccatgg caaaacccca tgagattgtg ctag 34<210>4<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的引物<400>4cagtagatct gtgcttagag tacttctgga g 31

Claims

1．一种获得重组的除草剂耐受性核酸的方法，当植物中存在该重组的除草剂耐受性核酸时，该核酸能赋予植物对除草剂的耐受性，该方法包括：

(ⅰ)重组一种或多种亲代核酸的多个变体形式，其中多个变体形式包括从亲代核酸衍生的片段，其中亲代核酸编码除草剂耐受性活性，或可经改组而编码除草剂耐受性活性，其中多个变体形式相互之间至少有一个核苷酸不同，从而产生重组核酸文库；

(ⅱ)筛选该文库，鉴定出至少一种重组的除草剂耐受性核酸，其中重组的除草剂耐受性核酸编码了赋予细胞除草剂耐受性的活性。

2．根据权利要求1所述的方法，其中重组的除草剂耐受性核酸编码了与亲代核酸相比有独特性或改进的除草剂耐受性活性。

3．根据权利要求1所述的方法，其中一个或多个亲代核酸编码了除草剂耐受性活性。

4．根据权利要求1所述的方法，其中亲代核酸不编码除草剂耐受性活性，其中多个变体形式的重组提供了编码除草剂耐受性活性的核酸。

5．根据权利要求1所述的方法，其中亲代核酸编码的多肽在功能上或结构上与除草剂靶蛋白相似。

6．根据权利要求1所述的方法，其中亲代核酸的多个变体形式包括亲代核酸的等位基因变体或种间变体。

7．根据权利要求1所述的方法，其中亲代核酸的多个变体形式是通过合成多个与亲代核酸同源的核酸而制得的。

8．根据权利要求1所述的方法，其中亲代核酸的多个变体形式是通过亲代核酸的易错转录或亲代核酸在增变细胞株中复制而制得的。

9．根据权利要求1所述的方法，其中亲代核酸编码的多肽或多肽片段选自下列：P450单加氧酶多肽、谷胱甘肽硫转移酶多肽、同型谷胱甘肽硫转移酶多肽、草甘膦氧化酶多肽、膦丝菌素乙酰转移酶多肽、二氯苯氧基乙酸酯单加氧酶多肽、乙酰乳酸合成酶多肽、原卟啉原氧化酶多肽、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶多肽、以及UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮酸转移酶多肽。

10．根据权利要求9所述的方法，其中亲代核酸选自下列：玉米和小麦的P450单加氧酶基因、玉米的谷胱甘肽硫转移酶基因、大豆的同型谷胱甘肽硫转移酶基因、细菌的草甘膦氧化酶基因、细菌的膦丝菌素乙酰转移酶基因、细菌的二氯苯氧基乙酸酯单加氧酶基因、植物的乙酰乳酸合成酶基因、植物的原卟啉原氧化酶基因、藻类的原卟啉原氧化酶基因、细菌的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因、植物的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因、以及细菌的UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮酸转移酶基因。

11．根据权利要求5所述的方法，其中亲代核酸编码UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮酸转移酶，其中除草剂是草甘膦。

12．根据权利要求1所述的方法，其中文库包含通过重组亲代核酸的多个变体形式制得的重组核酸，亲代核酸选自下列：

P450单加氧酶核酸、同型谷胱甘肽硫转移酶核酸、谷胱甘肽硫转移酶核酸、草甘膦氧化酶核酸、膦丝菌素乙酰转移酶核酸、二氯苯氧基乙酸酯单加氧酶核酸、乙酰乳酸合成酶核酸、烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶核酸、以及UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮酸转移酶核酸。

13．根据权利要求1所述的方法，其中筛选包括选自下列的步骤：

(a)筛选除草剂的氧化；

(b)筛选除草剂或除草剂代谢物与谷胱甘肽的偶联；

(c)筛选除草剂或除草剂代谢物与同型谷胱甘肽的偶联。

14．根据权利要求1所述的方法，其中重组核酸的文库存在于细胞群中。

15．根据权利要求14所述的方法，其中筛选包括使细胞群在含有除草剂的培养基中或培养基上生长，并检测细胞产生的除草剂和除草剂修饰形式之间的物理差异。

16．根据权利要求15所述的方法，其中除草剂与除草剂修饰形式之间的物理差别是通过除草剂和除草剂修饰形式之间的荧光或吸光度差别来检测的。

17．根据权利要求16所述的方法，其中除草剂是麦草畏，重组的除草剂耐受性核酸编码麦草畏氧化活性，通过麦草畏氧化形式的荧光来筛选麦草畏被氧化的细胞。

18．根据权利要求14所述的方法，其中筛选包括使细胞群在含有除草剂的培养基中或培养基上生长，选出在除草剂存在下细胞生长增强的细胞。

19．根据权利要求18所述的方法，其中细胞生长增强需要重组除草剂耐受性核酸编码的活性。

20．根据权利要求19所述的方法，其中细胞生长增强需要重组的除草剂耐受性核酸所编码的活性与除草剂反应的产物。

21．根据权利要求20所述的方法，其中细胞是细菌Mpu⁺株，除草剂是草甘膦，重组的除草剂耐受性核酸编码的活性是催化草甘膦转变成磷酸氨基甲酯。

22．根据权利要求19所述的方法，其中细胞是细菌的AroA^-株，除草剂是草甘膦，重组的除草剂耐受性核酸编码的活性是将磷酸烯醇丙酮酸和莽草酸3-磷酸催化转变成5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸。

23．根据权利要求1所述的方法，该方法还包括在文库中筛选赋予对一种或多种其它除草剂耐受性的一种或多种额外的活性。

24．根据权利要求1所述的方法，其中重组步骤在多个细胞中进行。

25．根据权利要求24所述的方法，该方法还包括：

(a)使编码除草剂耐受性活性的多个细胞的DNA与第二个DNA片段文库重组，DNA片段中至少有一个与细胞中的核酸片段重组产生重组细胞，或使编码除草剂耐受性活性的多个细胞的DNA相互重组产生修饰的细胞。

26．根据权利要求25所述的方法，它还包括：

(b)重组和筛选重组的或修饰的细胞，产生更加进化的有独特性的或改进的除草剂耐受性活性的进一步重组的细胞。

27．根据权利要求26所述的方法，它还包括：

重复(a)或(b)，直至进一步重组的细胞获得额外的独特的或改进的除草剂耐受性活性。

28．根据权利要求1所述的方法，其中该方法还包括：

(ⅲ)使至少一个重组的除草剂耐受性核酸与另一核酸重组，该另一核酸与(ⅰ)的多个变体形式中的一个或多个相同或不同，以产生进一步的重组核酸文库；

(ⅳ)筛选该进一步文库，鉴定出与非重组除草剂耐受性基因相比所编码的除草剂耐受性活性进一步改善的至少一个进一步的重组除草剂耐受性核酸；和，任选的，

重复(ⅲ)和(ⅳ)。

29．根据权利要求28所述的方法，其中进一步的重组除草剂耐受性核酸编码两个或多个独特的或改进的除草剂耐受性活性。

30．根据权利要求1所述的方法，其中文库存在于细菌细胞中，该方法包括：

合并多个分开的文库成员；

在所得合并文库成员中筛选出与非重组除草剂耐受性核酸相比所编码的除草剂耐受性活性是独特的或有所改进的重组除草剂耐受性核酸；和，

克隆该独特的或改进的重组除草剂耐受性核酸。

31．根据权利要求2所述的方法，其中独特的或改进的除草剂耐受性活性选自下列：代谢除草剂的能力提高；该活性赋予的耐受性所针对的除草剂的范围增加；表达水平比亲代核酸编码的多肽有所提高；对除草剂抑制的敏感性比亲代核酸编码的活性低；对蛋白酶切割的敏感性比亲代核酸编码的多肽低；对高或低pH水平的敏感性比亲代核酸编码的多肽低；对高温或低温的敏感性比亲代核酸编码的多肽低；对宿主植物的毒性比所选核酸编码的多肽低；以及以上两种或多种的任何组合。

32．根据权利要求1所述的方法，该方法还包括将重组的除草剂耐受性核酸转导到植物内。

33．根据权利要求1所述的方法，该方法还包括将重组的除草剂耐受性核酸转导到植物内，并测试所得转导植物对除草剂的耐受性。

34．根据权利要求1所述的方法，该方法还包括将重组的除草剂耐受性核酸转导到植物内，用相同种类的不同植物株繁殖该植物，然后在所得后代中选出对除草剂有耐受性的后代。

35．一种用权利要求1所述的方法制得的重组核酸文库。

36．根据权利要求35所述的文库，其中文库是噬菌体展示文库。

37．一种用权利要求1所述的方法制得的重组除草剂耐受性核酸。

38．一种DNA改组混合物，它包含至少三个同源DNA，其中至少三个同源DNA的每一个从编码多肽或其片段的亲代核酸衍生获得，这些多肽或多肽片段选自P450单加氧酶、谷胱甘肽硫转移酶、同型谷胱甘肽硫转移酶、草甘膦氧化酶、膦丝菌素乙酰转移酶、二氯苯氧基乙酸酯单加氧酶、乙酰乳酸合成酶、原卟啉原氧化酶、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶、以及UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮酸转移酶。

39．根据权利要求38所述的DNA改组混合物，其中至少三个同源的DNA存在于细胞培养物内、体外或植物中。

40．根据权利要求38所述的DNA改组混合物，其中同源DNA从编码玉米或小麦的P450单加氧酶的亲代核酸衍生获得。

41．根据权利要求38所述的DNA改组混合物，其中同源DNA中的至少一个从编码玉米的谷胱甘肽硫转移酶的亲代核酸衍生获得。

42．根据权利要求38所述的DNA改组混合物，其中同源DNA中的至少一个从编码大豆的同型谷胱甘肽硫转移酶的亲代核酸衍生获得。

43．根据权利要求38所述的DNA改组混合物，其中同源DNA中的至少一个从编码细菌的草甘膦氧化酶的亲代核酸衍生获得。

44．根据权利要求38所述的DNA改组混合物，其中同源DNA中的至少一个从编码细菌的膦丝菌素乙酰转移酶的亲代核酸衍生获得。

45．根据权利要求38所述的DNA改组混合物，其中同源DNA中的至少一个从编码细菌的二氯苯氧基乙酸酯单加氧酶的亲代核酸衍生获得。

46．根据权利要求38所述的DNA改组混合物，其中同源DNA中的至少一个从编码植物的乙酰乳酸合成酶的亲代核酸衍生获得。

47．根据权利要求38所述的DNA改组混合物，其中同源DNA中的至少一个从编码细菌的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶的亲代核酸衍生获得。

48．根据权利要求38所述的DNA改组混合物，其中同源DNA中的至少一个从编码植物的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶的亲代核酸衍生获得。

49．根据权利要求38所述的DNA改组混合物，其中同源DNA中的至少一个从编码细菌的UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮酸转移酶的亲代核酸衍生获得。

50．根据权利要求38所述的DNA改组混合物，其中同源DNA中的至少一个从编码植物或藻类的原卟啉原氧化酶的亲代核酸衍生获得。

51．一种获得或改进亲代植物细胞中除草剂耐受性活性的方法，该方法包括对植物细胞中的多个基因组核酸进行全基因组改组，形成修饰的植物细胞，然后在修饰的植物细胞中筛选与亲代植物细胞相比具有独特的或改进的对一种或多种除草剂的耐受性活性。

52．根据权利要求51所述的方法，其中除草剂选自麦草畏、草甘膦、双膦酸酯、sulfentrazone、咪唑啉酮、磺酰脲、***嘧啶、苯氧基乙酸、二苯基醚、氯乙酰胺和hydantocidin。

53．根据权利要求51所述的方法，其中基因组核酸来自不同于亲代植物细胞的种类或株系。

54．根据权利要求51所述的方法，该方法还包括：将修饰的植物细胞或其细胞后代再生成植物。

55．一种预测除草剂杀死植物的长期效果的方法，该方法包括：

(ⅰ)用DNA片段文库转化多个植物细胞，至少一些DNA片段与细胞基因组中的片段发生重组，产生了修饰的植物细胞；

(ⅱ)使修饰的植物细胞在含有除草剂的培养基中繁殖，并回收存活的植物细胞；

(ⅲ)将存活植物细胞的DNA与另一DNA片段文库重组，文库中至少有一些片段与存活植物细胞DNA中的同源片段重组，产生进一步修饰的植物细胞；

(ⅳ)使该进一步修饰的植物细胞在含有除草剂的培养基中繁殖，并收集进一步存活的植物细胞；

(ⅴ)根据需要重复(ⅲ)和(ⅳ)，直至进一步存活的植物细胞获得了对除草剂所需程度的抗性，获得的抗性程度以及获得该程度所需的(ⅲ)和(ⅳ)的重复次数提供了除草剂杀死植物的长期效果的量度。

56．根据权利要求55所述的方法，其中植物是杂草植物。

57．根据权利要求56所述的方法，其中植物选自苘麻、藜属、苋属、番薯属、狗尾草属、稗属、茄属、假高粱、马唐属、黍属、旱雀麦和地肤属。

58．根据权利要求55所述的方法，该方法还包括重复地重组来自修饰植物细胞的DNA，其中重复重组在修饰的植物细胞在含除草剂的培养基中繁殖之前进行。

59．根据权利要求55所述的方法，该方法还包括将存活的植物细胞分为第一和第二集合体，从第一集合体中分离出进一步的DNA文库，用该进一步的文库转化第二集合体。

60．根据权利要求55所述的方法，其中进一步的DNA文库从不同于植物细胞的种类或株系获得。