CN1312292A - 从转基因抗菌肽蝇蛆中制备人用基因抗菌肽药品的方法 - Google Patents

Abstract

从转基因抗菌肽蝇蛆中制备人用基因抗菌肽药品的方法,取转基因抗菌肽蝇蛆原料冷冻粉碎制成均浆,接比例加蒸馏水搅拌放入加层锅升温,使蛋白变性,降温抽滤除去蛋白,滤液用微孔滤膜除去残渣至透明液体,经两次超滤浓缩再除去大、小分子,最后过层析柱,使其药液抗菌肽活性蛋白纯度达98%,经各项指标检定符合基因生物药品要求。

Description

从转基因抗菌肽蝇蛆中制备人用基因抗菌肽药品的方法

本发明涉及利用转基因蝇蛆提取抗菌肽，特别是从转基因抗菌肽蝇蛆中制备人用基因抗菌肽药品的方法。

在自然界，苍蝇是传播疾病的重要媒介害虫，最多能给人、畜传染多种疾病，但自身并不染病。苍蝇对恶劣环境具有极强的适应能力和有效的防御机制；大量研究证实，任何病菌在苍蝇体内的存活时间最多不超过7天，而只要有万分这一浓度的苍蝇抗菌物质，就可以杀死多种病菌，其效力是目前人类已发现的任何一种抗菌素所无法比拟的。在目前不少病原菌对已有抗生素逐渐产生耐药性，而新的抗生素发现又极为困难，苍蝇抗菌肽不乏是未来抗菌素的最佳选择。

苍蝇的抗菌肽具有广谱抗菌活性，可以成为新一代不会在人体内形成抗药性的超级抗生素药物。美国的马盖宁制药公司于1987年开始致力于Magainin的商业性研制，现已人们赞誉“马盖宁”象青霉素那样，具有划时代的应用潜力。马盖宁(一种蛙皮肽)作为人用药。2000年批准上市后，当年销售额即达10亿美元。

现代研究证实，抗菌肽广泛存在于动物(昆虫)，植物和微生物中，采用纯化方法难以获得大量的抗菌肽。我们将人工合成的一种外源性抗菌肽，采用基因工程方法实现转基因蝇蛆抗菌肽为工厂化生产高含量抗菌肽奠定了坚实基础。

本发明的目的是利用现代技术手段，从转基因抗菌肽蝇蛆中制备人用基因抗菌肽药品的方法。

从转基因抗菌肽蝇蛆中制备人用基因抗菌肽药品的方法：_收集蝇蛆→蝇蛆灭菌技术处理→蝇蛆抗菌肽含量→低温深冻、贮存原料低温粉碎制成超微匀浆→抽提去除杂质→浓缩→分离纯化→鉴定各项指标→加稳定剂及赋形剂→调配不同规格制品→半成品鉴定→成品分装。

一、转基因抗菌肽家蝇的饲养

转基因抗菌肽蝇蛆接种于已配好的饲料中，饲料配方按麸皮、奶粉、白糖、米粉、豆饼粉等比例配成转基因抗菌肽蝇蛆的饲养。使配料松软透气，也可增加酵母粉及蛋白质的含量，以利幼蛆蛆的生长与发育。饲养盒(框)中饲料，厚度以不超过4-5公分为好，接种时用小铲将孵化盒中所孵化出的一龄幼蛆(种子)铲出并慢慢放入饲养盒中饲料上，接种量不可过密，也不能过稀。

幼虫(蛆)饲养盒中吃饲料时，一般是自上而下，若饲养盒中的培养物要注意温度、温度和PH值，以及室内光线和通气。要随时检查温度、湿度、PH值，饲料及蝇蛆的密度，随时调整。

幼蛆从卵孵化出，体长2毫米，24-36小时幼蛆进行第一次蜕皮，再经一次蜕皮民为老熟幼虫，此时体长可达12-14毫米，整个幼虫期为5-8天。

成熟的老熟幼虫(蛆)即停止取食，改变趋向，静止化蛹。饲养人员可及时给予这样的环境使之化蛹保种。同时，大量成蛆(老熟幼虫)分离出来，加入适量缓冲液利用渗透透压的压差，使蝇蛆中抗菌肽游离，同时还用物理学方法诱导或降低氧气浓度以进一步提高转基因蝇蛆体内抗菌肽的含量。经过这样处理后按一定规格分装，低温冷冻。作产品原料或商品贮存备用。

家蝇要在工厂化灭菌条件饲养。以满足抗菌肽药品产业化的需要。

二、从转基因抗菌肽蝇蛆制备药用抗菌肽的方法

从转基因抗菌肽蝇蛆中制备药用抗菌肽工艺可人分为转基因抗菌肽蝇蛆原料的贮藏、蝇蛆抗菌肽粗品提取、精品纯化、分装灯检与包装。

1、蝇蛆原料要求与贮藏：原料要从工厂化无菌饲养转基因家蝇的蝇蛆，于低温保存。要有转基因抗菌肽蝇蛆、重金属和相关卫生指标的检定报告。

2、粗品提取：冷冻的转基因抗菌肽蝇蛆用绞肉机绞碎，再用胶体磨研磨制成匀浆，倒入大罐内，按匀浆量1∶1加入蒸馏水置入加层升温锅，使温度加热至100度，持续20分钟，用输液泵把药液输入滤槽内进行过滤，再将药液放入水槽冷却，微孔滤膜过滤除去残渣，药液为抗菌肽粗品，置于2-8度保存。

3、精制纯品：取微孔滤膜除去残渣的抗菌肽药液再用5000分子量超滤膜超滤除5000以上大分子，然后用3000分子量超滤膜除3000以下小分子，浓缩最后过层析柱，分离得到的半成品原液其抗菌肽纯度达98％，也可将加热升温后的匀浆，用大容量低温离心收集上清液，将上清液加入硫酸铵沉淀，离心分离收集沉淀，然后在沉淀中加入缓冲液溶解，离心分离收集上清液，上清液经G-25脱盐、DEAE离子交换柱、phenyl疏水层析过柱、S-100凝胶层析柱分离得到合格的半成品原液，纯度也可达98％。

4、分装、灯检及包装

将检定合格的半成品原液加入赋型剂以及保护剂按生产所需规格稀释，稀释液经过筒式过滤器除菌，经过热源质、无菌试验合格后，经过分装机装入西立瓶，进行轧盖、灯检。抽样做成品检定，经过成品检定合格后可包装入库。

三、药用抗菌肽理化性质及质量检定

基因抗菌肽药品是利用转基因抗菌肽家蝇受精卵工程技术构建的工程家蝇繁育出的蝇蛆提取纯化而成。临床上主要用于治疗感染性疾病代替抗菌素，对肿瘤，真菌、病毒也有很好的治疗作用。

按照WHO《保证DNA重组技术药品质量的指导原则》和国家新药的要求，结合本品的生产工艺特点，参考国内外药典及国内外企业相关标准，对药用基因抗菌肽的性化和质量进行检定。

1、性质鉴别

DNA重组药物质量控制，可利用制品的分子量、电荷、等电点、氨基酸组成和疏水性等化学物理性质，采用现代分析手段，如聚丙烯酰胺凝胶电沪、等电聚焦、排阴色谱、反相色谱、离子交换色谱。肽图分析、氨基酸分析、紫外光谱、园二色散等其它光谱技术进行严格分析鉴定。本项目据国内现有条件参照国外标准，暂定三项鉴别试验：

1)还原型SDS-PAGE法测定迁移率，样品迁移率应与对照品一致，以证实基因药物与天然药物分子量大小一致。从一个侧面反映二者的同质性，用SDS-PAGE(还原法)。

2)RP-HPLC法测定保留时间，本标准采用BP的方法，以含有正丙醇的Tris缓冲液作为流动相，该法能鉴别带甲硫氨酸的与无甲硫氨酸的重组基因人抗菌肽。样品保留时间应与对照品一致(=2％)，以证实二者在疏水性方面具有同质性。用鉴别与相关蛋白测定方法。

3)肽图谱

本标准采用BP的方法，用胰蛋白酶裂解样品与照品，采用RP-HPLC法分离裂解的片段，在214nm波长处检测。从肽图谱上可以鉴别基因药物与天然药物在蛋白质一级结构上是否具有同质性。因为肽图说对第一咱蛋白质来说都是特征的、专一的。因制剂中非抗菌肽成份影响肽图分析，与对照图谱一致。用胰肽图谱方法之质量检定。

2、质量检定

(1)宿主蛋白

由于转基因药物临床时间短，宿主蛋白是否具有危害性还难以在短期内观察到，因此还需要控制其含量。本标准采用斑点免疫分析法，其检测灵敏度达2ng。检查国内各批原料中含宿主蛋白不得过30ng/mgpro，制剂可不做此检查。用宿主蛋白测定方法。

(2)残余DNA

作为外源DNA，被认为是具有潜在致癌性杂质。WHO要求每剂量药品中残余DNA含量应＜100pg。本标准采用非放射性地高辛标记DNA作控针，并与待测样品中的同源DNA序列进行分子杂交，用免疫学法显色，通过比较样品与标准DNA的显色程度，米检查样品中残余DNA的量。该法灵敏度可达1pg。BP标准中未规定其限量，故本标准规定同WHO的要求，制剂不做此项检查，用残余DNA含量测方法。

(3)相关蛋白

主要指氧化抗菌肽及其它相关抗菌肽，这些成份多不具有抗菌肽的生物活性，其过量存在将大大影响抗菌肽的疗效。BP标准规定，总相关蛋白，原料中应＜10％，故暂订为不得过10％，用鉴别与相关蛋白测定方法。

(4)高分子蛋白

主要指二聚和多聚抗菌肽，它们不具有生物活性，产品中其含量高时将极大影响药品的疗效。本标准采和BP的方法(HPSEC法)，检测国内产品，其高分子蛋白量均＜4％，故本标准暂订为原料与制剂中含量高分子蛋白应＜4％。用高分子蛋白与含量测定方法。

(5)脱氨组份

抗菌肽分子含有的Asn和Gln，在一事实上条件下会脱去氨基，表现为等电点降低。本标准采用等电聚焦电泳检查原料与制剂中的脱氨组份。目前所测国内试验正式产品均未检出脱氨组份。BP中采用此方法，仅作鉴别，Kabi企业标准用此法，并规定脱氨组分应＜10％，因此本标准暂订＜10％！用等电聚焦法。

6、活性测定

用的平四琼脂糖孔穴扩散法进行了改进，命名检测敏感性提高2.2-3.8倍，抗菌肽含量为0.1ug时即可观察到有明显的抑菌圈。薄层平板法可保证琼脂糖厚度一致，从而提高检查结果的稳定性，同时由原来的半定量发展为定量测定。用薄层平板琼脂糖孔穴扩散法。

(7)纯度

本标准采和银染法非还原SDS-PAGE法，BP标准不用此法，USP标准草案及国外企业均采用此法，故本标准用薄层扫描电泳胶片，按归一化法计算主成份相对百分含量，规定纯度为98％。用SDS-PAGE(非还原型)方法。

(8)基因药物半成品无菌、内毒素等均应符合注射剂要求。

4、含量测定

(1)基因抗菌肽含量目前BP、EP和USSP标准草案及国外企业标准均采用HPSEC法测定抗菌肽含量，已无生物效价测定项目。所用色谱条件基本一致。制剂以ug/瓶标示。本标准依据BP的方法，并以“马盖宇”(蛙抗菌肽)样为对照，测定原料与制剂中抗菌肽单体含量。参照USP草案，本标准暂订制剂中抗菌肽的含量应为标示量的90-11％。

(2)总蛋白含量的测定：总蛋白测定采用了USP标准草案和“马盖宁”样品标定所用方法，即紫外吸收系数法，该法具有简便、快速、准确的特点。取本品，用水配成1mg/ml的深液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IVA)，在适度nm的波长和适度nm的波长处检测吸收度，按吸收系数(EL％C)为0.8，以下式计算即得。

四、基因抗菌肽药物指标控制要点

下述项目与指标必须符合基因生物药品质量规定要求。Lowos检测蛋白含量             1.65        外观检查                微色液体SDS-PAGE电泳纯度测定          ＞97        PH值                    6.55HPLC纯度测定                  100         无菌试验                合格SDS-PAGE电脉分子量测定        3300        热原质检定(家免法)      合格等电聚焦电泳等电点测定        5.5         内毒素试验(鱼试剂法)    ＜kc/n特异性及纯度检测(免疫印迹法)  阳性        安全试验                合格残余DNA检测                   ＜10pg/mg   稳定性试验              合格宿主蛋白含量测定              ＜510pg/mg全自动紫外全波段扫描          276.9效价测定                      4.72肽图谱测定                    合格N端氨基酸序列                 与理酸一致(N端不含氨基酸)生物活性测定                  50ug/ml

本发明的特点：

1、规模大，适用于产业化生产。

2、工艺流程短、简便，可连续操作；

3、收率高，抗菌肽回收率可达70％；

4、纯度好，活性抗菌肽蛋白纯度可达98％；

5、各环节质控指标严，产品合格率可达到95％。

实施例1：

从冷冻库中提取转基因抗菌肽蝇蛆的合格原料10公斤，将冻块分割绞碎，制成匀浆，加10公斤蒸馏水搅拌，升温100度持续20分钟，降温除去变性蛋白及残渣，两次超滤浓缩，过层析柱，收集药液，置于2-8度低温保存，供制剂抗菌肽药品用。

实施例2：

从转基因抗菌肽家蝇工厂化无菌饲养场冷冻库取回转基因抗菌肽蝇蛆，新鲜原料100公斤，用绞肉机绞碎，放入大型胶体磨研磨成匀浆，再加入100公斤蒸馏水搅拌置入加层升温锅，升温至100度持续20分钟，降温用输液泵过滤除去变性蛋白，再用微孔滤膜除去残渣，再次超滤浓缩最后过层析柱，使其药液中抗菌肽纯度达98％。在整个制备中严格控制各项质控指标。使药液完全符合国家规定的基因生物药品各项质量指标的要求。

Claims (5)

1、从转基因抗菌肽蝇蛆中制备人用基因抗菌肽药品的方法，收集蝇蛆→蝇蛆灭菌技术处理→蝇蛆抗菌肽含量→低温深冻、贮存原料低温粉碎制成超微匀浆→抽提去除杂质→浓缩→分离纯化→鉴定各项指标→加稳定剂及赋形剂→调配不同规格制品→半成品鉴定→成品分装。

2、根据权利要求1所述的制备人用基因抗菌肽药品的方法，冷冻的转基因抗菌肽蝇蛆用绞肉机绞碎，再用胶体磨研磨制成匀浆，倒入大罐内，按匀浆量1∶1加入蒸馏水置入加层升温锅，使温度加热至100度，持续20分钟，用输液泵把药液输入滤槽内进行过滤，再将药液放入水槽冷却，微孔滤膜过滤除去残渣，药液为抗菌肽粗品，置于2-8度保存。

3、根据权利要求1或2所述的制备人用基因抗菌肽药品的方法，从冷冻库中提取转基因抗菌肽蝇蛆的合格原料10公斤，将冻块分割绞碎，制成匀浆，加10公斤蒸馏水搅拌，升温100度持续20分钟，降温除去变性蛋白及残渣，两次超滤浓缩，过层析柱，收集药液，置于2-8度低温保存，供制剂抗菌肽药品用。

4、根据权利要求1所述的制备人用基因抗菌肽药品的方法，取微孔滤膜除去残渣的抗菌肽药液再用5000分子量超滤膜超滤除5000以上大分子，然后用3000分子量超滤膜除3000以下小分子，浓缩最后过层析柱，分离得到的半成品原液其抗菌肽纯度达98％，也可将加热升温后的匀浆，用大容量低温离心收集上清液，将上清液加入硫酸铵沉淀，离心分离收集沉淀，然后在沉淀中加入缓冲液溶解，离心分离收集上清液，上清液经G-25脱盐、DEAE离子交换柱、phenyl疏水层析过柱、S-100凝胶层析柱分离得到合格的半成品原液，纯度也可达98％。

5、根据权利要求1或4所述制备人用基因抗菌肽药品的方法，从转基因抗菌肽家蝇工厂化无菌饲养场冷冻库取回转基因抗菌肽蝇蛆，新鲜原料100公斤，用绞肉机绞碎，放入大型胶体磨研磨成匀浆，再加入100公斤蒸馏水搅拌置入加层升温锅，升温至100度持续20分钟，降温用输液泵过滤除去变性蛋白，再用微孔滤膜除去残渣，再次超滤浓缩最后过层析柱，使其药液中抗菌肽纯度达98％。