CN1309738C - 抗il－8单克隆抗体、其可变区序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有中和白细胞介素-8(IL-8)生物活性的单克隆抗体以及该单克隆抗体的可变区序列。本发明以IL-8为免疫源，以小鼠为免疫对象，通过免疫注射小鼠，取免疫小鼠脾脏制备悬液，并使之与骨髓瘤细胞进行细胞融合获得可表达抗IL-8单克隆抗体的杂交瘤细胞株以制备抗IL-8单克隆抗体。本发明并同时克隆了抗IL-8单克隆抗体的可变区氨基酸序列。本发明的抗IL-8单克隆抗体可以与IL-8特异性结合，因此可以用于治疗与IL-8表达和分泌的异常或过量、失控有关的疾病。

Description

抗IL-8单克隆抗体、其可变区序列及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明是关于一种具有中和白细胞介素-8(IL-8)生物活性的抗IL-8单克隆抗体、其可变区序列及其应用。

背景技术

白细胞介素-8(IL-8)是细胞因子(Cytokine)中称之为趋化因子(Chemokine)的一种蛋白分子。在趋化因子大家族中，按照它们分子结构中N端的半胱氨酸(Cysteine)位置可分为C-X-C类趋化因子和C-C类趋化因子。IL-8属于C-X-C类趋化因子，分子量为8,000Da左右。IL-8是嗜中性粒细胞的强烈趋化和激活因子，能强力地汇集并激活嗜中性粒细胞，在许多生理或病理过程中具有广泛的生物活性，在炎症过程中起着关键性作用。IL-8可由多种参与炎症反应的细胞产生和分泌，如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、内皮细胞、角质化细胞等等，它继而作用于内皮细胞、嗜中性粒细胞和T淋巴细胞等多种炎症细胞，从而形成炎症反应。很多人类疾病与体内IL-8表达和分泌的异常或过量、失控有关。

抗体是由B淋巴细胞产生的一种蛋白分子，由两条相同的重链和两条相同的轻链组成。轻链和重链又各自由可变区和恒定区组成。抗体与相应抗原的特异性结合是由可变区的氨基酸序列决定的。单克隆抗体(McAb单抗)技术始创于1975年，用抗原免疫小鼠然后经杂交瘤技术筛选即可获得与相应抗原具有特异性结合活性的单克隆的抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗IL-8单克隆抗体。

本发明的第二个目的在于提供抗IL-8单克隆抗体的可变区氨基酸序列。

本发明的第三个目的在于提供抗IL-8单克隆抗体的应用。

本发明以IL-8为免疫源，以小鼠为免疫对象，通过免疫注射小鼠，取免疫小鼠脾脏制备悬液，并使之与骨髓瘤细胞进行细胞融合获得可表达抗IL-8单克隆抗体的杂交瘤细胞株以制备抗IL-8单克隆抗体。

本发明克隆的抗IL-8单克隆抗体的重链和轻链的可变区氨基酸序列分别如SEQ IDNo.1和2所示。

本发明的抗IL-8单克隆抗体可以与IL-8特异性结合，因此可以用于治疗与IL-8表达和分泌的异常或过量、失控有关的疾病。

实验证明，本发明的抗IL-8单克隆抗体对于上述IL-8表达和分泌的异常或过量、失控有关的疾病，如银屑病、湿疹、肿瘤、严重急性呼吸道症候群(SARS)等，均具有明显的疗效，且特异性高，因此具有很好的应用前景。

附图说明

图1为5’RACE产物电泳图，其中1号为轻链结果，2号为重链结果，M为DL2000Marker(分子量从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。

图2为抗IL-8嵌合抗体银染电泳图，其中1为蛋白Marker；2为杂交瘤抗体；3为嵌合型抗体。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。

实施例1抗IL-8单克隆抗体杂交瘤细胞的制备

1、免疫源

E.Coli表达的基因重组人体单核细胞来源的IL-8，由72个氨基酸组成，分子量为8.0KDa，它比由77个氨基酸组的内皮细胞来源的IL-8具有更强的生物活性。此基因重组IL-8由美国PeproTech公司生产(PeproTech Inc.)，经过N-terminal分析和SDS-PAGE银染色法测定，其纯度＞98％。在化学趋向活性试验(-Chemotaxis Assay)中显示，此基因重组IL-8对人体嗜中性白细胞有强烈的化学趋向作用。

2、免疫动物

Balb/c小鼠由Charles River Laboratories，Inc.Canada供应。所有免疫用Balb/c小鼠均为标准化无病、健康的纯种小鼠，符合美国FDA和加拿大HPB要求的标准。

3、动物免疫程序

第1天：200μl抗原溶液(20μg IL-8/200μl PBS)加200μl福氏完全佐剂(Sigma公司，Catalogue number F5881)，配制成400μl抗原乳化液，注射于小鼠背部皮下多点以及足掌。

第27天：200μl抗原溶液(20μg IL-8/200μl PBS)加200μl不完全福氏佐剂(Sigma公司，Catalogue number F5506)，作腹腔、足掌注射。

第86天：注射剂量、方法同第27天。

第118天：注射剂量、方法同第27天。

第179天：20μg/450μl PBS抗原溶液作腹腔注射。

第183天：取出免疫小鼠脾脏，制备脾脏细胞悬液，作细胞融合用。

4、细胞融合：

(1)骨髓瘤细胞

SP2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞株来自美国ATCC(ATCC CRL-1581)，它不合成或分泌任何一种小鼠免疫球蛋白重链和轻链。此细胞对8-氮杂鸟嘌呤有抗性，在HAT(次黄嘌呤、氨基嘌呤和胸腺嘧啶核苷)培养液(GIBCO公司，Cat.No.21060-017)中无法持久生存，SP2/0-Ag14已广泛应用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤时作为融合细胞的partner。

(2)融合

A、取处于对数生长期的SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞，用无血清RPMI 1640培养液(GIBCO公司，Cat.No.11875)洗涤两次，计数备用。

B、取无菌条件下制备的免疫小鼠脾脏细胞悬液，用无血清RPMI1640培养液洗涤两次，计数备用。

C、将脾脏细胞和SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞以5∶1比例混合，离心(1500rpm)7分钟，弃尽上清液，然后，在1分钟内缓缓加入1ml PEG(PEG4000，M.W.3,000-4,000，GIBCO，BRL Cat.No.14030-019)，静置1.5分钟；再在2.5分钟内加入5ml无血清RPMI 1640培养液，静置5分钟，最后再加入5ml无血清培养液，离心(1000rpm)5分钟，弃去上清液，加入常规1640培养液(15％胎牛血清，FBS GIBCO，BRL Cat.No.16000-044)制备成细胞悬液。

D、将上述融合细胞悬液移入96孔培养板孔中，每孔2滴细胞悬液，置37℃、5％CO₂培养箱中；培养24小时后，每孔再加入2滴2x的HAT培养液，继续于37℃、5％CO₂培养箱培养。三天换一次HAT培养液，7-10天后换成HT培养液(GIBCO公司，Cat.No.11067-030)。培养12天后即开始用酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测克隆细胞孔的上清液，筛选出抗IL-8抗体阳性的克隆。

(3)杂交瘤的克隆化

采用有限稀释法，将细胞悬液稀释至3-10细胞/ml，然后将细胞悬液移入96孔板中，每孔加入2滴细胞悬液，置37℃5％CO₂培养箱培养，此后，每隔2～3天换1/3新鲜培液于每个孔中。大约10天后即进行第二次筛选和克隆。经连续三次亚克隆，每次克隆率必须小于66.7％，抗体阳性率为100％，方可确定所克隆的细胞为单克隆。

5、单克隆抗体的特征：

免疫球蛋白亚型鉴定：

采用美国BIORAD公司生产的Mouse Typer Sub-Isotyping Kit(Cat.No.172-2055BIORAD)对杂交瘤细胞株进行鉴定，其结果为：克隆6E6(又称I8-60)免疫球蛋白亚型：IgG1，Kappa。

该细胞株6E6(I8-60)已于2004年11月18日存放于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其编号为CGMCC No.1249。

实施例2抗IL-8杂交瘤单克隆抗体的特异性

取实施例1得到的抗IL-8单克隆抗体，分别与相同浓度(μl/ml)的其他细胞因子、化学趋向因子GM-CSF、TGF-β、MCAF、TNF-α、IL-7、IL-1β、b-FGF、IL-16、MCP-3、M-CSF、EGF以及与IL-8结构上同源的细胞因子GRO α、PF-4、ENA78、NAP-2、GCP2进行交叉反应，其ELISA检测的结果分别如表1和表2所示。可见，本发明的单克隆抗体与其他细胞因子、化学趋向因子以及与IL-8结构上同源的细胞因此均无交叉反应，而对IL-8有高度的特异性反应。

表1 ELISA方法检测本抗体对各种细胞因子/化学趋向因子的交叉反应

细胞因子	IL-8	GM-CSF	TGF-β	MCAF	TNF-α	IL-7	IL-1β
								O.D.值	＞2.0	0.037	0.021	0.023	0.039	0.06	0.029
细胞因子	b-FGF	IL-16	MCP-3	M-CSF	EGF	BSA	HSA
								O.D.值	0.027	0.044	0.024	0.044	0.044	0.147	0.129

表2 ELISA方法检测本抗体对其他与IL-8结构上同源的细胞因子的交叉反应

细胞因子	IL-8	GRO α	PF-4	ENA78	NAP-2	GCP2
							O.D.值	＞2.0	0.097±0.008	0.113±0.04	0.073±0.009	0.031±0.004	0.088±0.007

实施例3 抗IL-8单克隆抗体中和IL-8化学趋化活性的能力

应用小室趋向性试验(Chemotaxis Assay)(Ben-Baruch A，et al.Cytokine.1997Jan；9(1)：37-45.)，以人嗜中性粒细胞(分离自正常人外周血，Liu WC，et al.Xibao YuFenzi Mianyixue Zazhi 1996；12：64-66)或稳定表达IL-8受体的293细胞株(Ben-BaruchA，et al.Cytokine.1997 Jan；9(1)：37-45.)为指示细胞，测定本抗体对IL-8的化学趋向性的抑制能力。

本抗体稀释成50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml、0.05μg/ml四种浓度，分别与10ng/ml的IL-8反应，置37℃30分钟后，各组样品分别注入化学趋向测定小室的下层孔中。50μl人嗜中性粒细胞或稳定表达IL-8受体的293细胞(1×10⁶/ml)放于小室的上层孔中。小室上下层之间用10μm孔径的聚碳酸酯滤膜隔开。将小室置于37℃，5％CO₂中温育5小时后，取出滤膜，用Dieff-QuicK染色，计算膜上嗜中性粒细胞或293细胞数目，结果用三个平行孔值的平均值表示。

实验证明，在单克隆抗体与IL-8的浓度比例在50∶1时能有效地中和IL-8对嗜中性粒细胞或稳定表达IL-8受体的293细胞的化学趋向作用。

表3

抗IL-8单克隆抗体浓度	IL-8浓度	Ab∶Ag	化学趋向抑制率
				50μg/mL	10ng/ml	5000∶1	118.25％
5μg/mL	500∶1	99.81％
			0.5μg/mL	50∶1		83.90％
0.05μg/mL	5∶1	17.09％

实施例4嵌合型抗体真核表达质粒的构建

1、杂交瘤细胞株I8-60中抗IL-8单克隆抗体的可变区序列的克隆

采用5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends，快速扩增cDNA末端)技术，从分泌抗人IL-8鼠单抗的杂交瘤细胞株I8-60中克隆功能性抗体的可变区序列。其步骤可简述为：由一个反义的基因特异性引物(GSP1)来合成cDNA第一链，cDNA第一链纯化后，利用末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal deoxynucleotidy transferase，TdT)在cDNA的3′末端加上一个合成的同聚核苷酸锚定序列。利用第二个巢式基因特异性引物(GSP2)和一个与同聚核苷酸尾巴可以退火的锚定引物来扩增cDNA。具体实验过程如下：

材料：

-杂交瘤细胞株6E6(I8-60)分泌抗人IL-8单克隆抗体

-大肠杆菌菌株Top10(Invitrogen公司，Cat.No.C4040-03)

-克隆载体pGEM-T-easy(Promega公司，Cat.No.A1360)

引物设计：

根据免疫球蛋白基因的特点，设计两套分别对应Ig和Kappa恒定区的基因特异性引物GSP1、GSP2，引物序列如下：

pRace-H-GSP1：GTCCACCKYGGTSYTGCTGGCYGGGTG

pRace-H-GSP2：GCACACYRCTGGACAGGGATCCAGAGTTCC

pRace-K-GSP1：ACTTGACATTGATGTCTTTG

pRace-K-GSP2：CACGACTGAGGCACCTCCAGATG

克隆过程：

1)第一链的合成

以总RNA为模板，以GSP1为引物，在反转录酶的作用下合成cDNA第一链。具体步骤为：

①在一个0.5ml的微量离心管中加入以下组分：

GSP1             2.5pmol

总RNA            1-5μg

补充经DEPC处理的水至总体积为15.5μl，混匀。

②70℃变性10min，冰浴1min，短暂离心后依次加入以下组分：

10x PCRbuffer            2.5μl

25mMgCl₂                 2.5μl

10mM dNTP mix            1μl

0.1M DTT                 2.5μl

③混匀，短暂离心后置42℃1min。

④在反应体系中加入1μl SuperScriptTMII RT(Invitrogen公司)，轻轻混匀后置42℃反应50min。

⑤反转录结束后置70℃15min以终止反应。

⑥离心10-20秒后置于37℃。

⑦加入1μl RNase mix，轻轻混匀后置于37℃反应30min。

⑧将反应管取出置冰上备用。

2)cDNA的纯化

使用QIAGEN公司QIAquick PCR纯化试剂盒。

①加5倍体积于反转录体系的PB缓冲液于反转录反应管中，混匀。

②将QIAquick离心柱置于2ml收集管中，把样品加入离心柱，13,000rpm离心60秒。

③弃去液体，将离心柱放回原来的收集管中，加0.75ml PE缓冲液于QIAquick离心柱，13,000rpm离心60秒。

④弃去液体，将QIAquick离心柱放回原来的收集管，13,000rpm离心60秒。

⑤将QIAquick离心柱置于一干净的1.5ml离心管，在QIAquick膜中央加入30μl EE缓冲液，静置1分钟后，13,000rpm离心1分钟。

3)cDNA加尾

①在一个0.5ml的微量离心管中依次加入以下组分：

DEPC处理的水                  6.5μl

5×tailing buffer             5.0μl

2mM dCTP                      2.5μl

纯化的cDNA                    10.0μl

混匀

②将反应管置94℃维持3min后，冰浴1min，短暂离心后置冰上。

③加入1μl TdT，混匀后置37℃反应10min。

④将反应管置于65℃中作用30min终止反应，离心后置于冰上备用。

4)PCR

在一个0.2ml的PCR薄壁管中加入以下组分

灭菌水                  31.5μl

10×PCR Buffer          5.0μl

25mM MgCl₂              3.0μl

10mM dNTP mix           1.0μl

GSP2(10pmol/ul)         2.0μl

AAP(10pmol/ul)          2.0μl

dC-tailed cDNA          5.0μl

Taq酶                   0.5μl

合计                    50.0μl

混匀后置PCR仪中进行反应。

5)PCR产物电泳纯化

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示：其中1号为轻链结果，在约500bp处有一特异性条带；2号为重链结果，在约500bp处有一特异性条带；

6)使用Promega公司的pGEM-T easy试剂盒，将PCR产物克隆到pGEM-T easy载体，转化大肠杆菌Top10(Invitrogen公司，Cat.No.C4040-03)，具体过程为：

a)PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，回收500bp的条带，最终定容于20μl体积的灭菌水中；

b)在一个0.5ml的微量离心管中，加入以下组分：

2×连接缓冲液                   5μl

PGEM-T-easy                     50ng(1μl)

PCR产物                         25ng(about 3μl)

T4连接酶                        1μl

混匀后室温连接2小时或者4℃连接16小时以上。

c)转化大肠杆菌感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素和IPTG、X-GAL的LB平板上，37℃培养12小时左右。

7)测定所克隆的PCR产物的碱基序列：各选取至少5个质粒测定其所含的PCR产物的碱基序列。

8)根据碱基序列与氨基酸编码序列的相应关系，分析PCR产物的阅读框架，确定相应可变区的氨基酸序列，其重链和轻链的序列分别如SEQ ID No.1和2所示。根据免疫球蛋白基因的特点验证其为抗体序列。

2、克隆人源抗体的IgG1和kappa链的恒定区

引物设计：

以NCBI数据库中人源抗体的IgG1和kappa链的恒定区序列为模板，设计两对引物，分别克隆人源轻链及重链的恒定区序列，引物序列如下：

p-CH-F：CCAAGGGCCCATCGGTCTTC

p-CH-R：GCGCTTAAGTCATTTACCCGGAGACAGG

p-CK-F：GCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC

p-CK-R：GCCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAG

经PCR分别扩增人源轻链及重链的恒定区序列后，分别用ApaI & PstI，BsiWI & NotI酶切，连接入经相同酶酶切的真核表达质粒pcDNA3.1(Invitrogen公司，Cat.No.V795-20)中。

3、表达质粒的构建

以5’RACE测序结果所得的序列为模板，设计两对引物分别经PCR将鼠源功能性抗体基因的可变区序列及信号肽序列扩增，分别由NheI & ApaI，EcoRV & BsiWI酶切后连接到用相同酶酶切的含上述人源抗体IgG1和kappa链恒定区的pcDNA3.1中，获得嵌合型抗体真核表达质粒。

引物序列如下：

p-VH-F：CGGCTAGCCACCATGGACATGAGGGTGCC

p-VH-R：GCGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACCG

p-VK-F：GCGATATCCACCATGGATTTTCAGGTGCAG

p-VK-R：GCGGCGTACGTTTTATTTCCAGCTTGGT

实施例5嵌合型抗体表达

以脂质体法转染CHO细胞(购自中国科学院细胞库)，获得稳定转染细胞株。具体方法为：

1)转染前一天种3×10⁶细胞于10cm平板，转染前3小时换10ml新鲜培养液(DMEM+10％FBS)；

2)转染：将10ug重链质粒和10ug轻链质粒加入到装有1.5ml DMEM的A管中，温和混匀，室温放置5min；同时，将60ul Lipofectamine2000加入到装有1.5ml DMEM的B管中，温和混匀，室温放置5min。将A、B两管液体合并，轻轻混匀，室温放置20min。将DNA-Lipofectamin2000混合物逐滴加入到CHO细胞培液中。37℃，CO₂培养箱中培养6hr后，更换培液，继续培养48hr后，将细胞1∶10稀释，继续培养10-14天后，挑选单克隆。

实施例6嵌合型抗体的纯化

采用protein A亲和层析法纯化嵌合抗体。具体步骤为：(1)用3-5倍柱体积的水清洗protein A亲和层析柱。(2)20mM磷酸缓冲液，pH7.0平衡protein A亲和层析柱。(3)将所需纯化的单抗样品泵入protein A亲和层析柱。(4)用20mM磷酸缓冲液，pH7.0洗柱，至OD280＜0.01。(5)用0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH3.0洗脱，收集洗脱峰，并加1M pH9.0的Tris-HCl缓冲液中和收集的抗体溶液。(6)用10mM PBS，pH7.2透析脱盐。电泳图见图3。纯化后嵌合抗体经HPLC测定，其纯度为95.89％。

实施例7嵌合型抗体的免疫活性测定

采用Elisa方法对嵌合型抗体的免疫活性进行测定，并与鼠源性杂交瘤抗体进行比较。表4的结果显示嵌合型抗体的免疫活性与鼠源性杂交瘤抗体无明显差别。

表4嵌合型抗体与鼠源性杂交瘤抗体Elisa结果比较

	Mouse anti-IL8Ab			Chimeric anti-IL8Ab
							浓度(ng/ml)	30	15	3	30	15	3
OD450	1.091	0.626	0.352	1.898	1.092	0.406
							OD450	1.269	0.708	0.377	2.001	1.14	0.398
平均值	1.18	0.667	0.3654	1.9495	1.116	0.402

Elisa plate coated with 1ug/ml IL-8.

second antibody：goat anti-mouse protein L-HRP conjugated

实施例8嵌合型抗体的生物学功能测定

采用微孔小室趋化实验检测嵌合型抗体对IL-8趋化活性的抑制效果。表5的结果显示1ug/ml嵌合型抗体能明显抑制IL-8的趋化活性，其抑制率与鼠源性杂交瘤抗体无明显差别。

表5嵌合型抗体与鼠源性杂交瘤抗体趋化实验结果比较

IL-8抗原浓度(ng/ml)	抗体	抗体浓度(ug/ml)	趋化指数	抑制率(％)
					20	mouse anti-IL8	10	1.22	91.10
20	mouse anti-IL8	1	1.46	81.06
					20	mouse anti-IL8	0.1	2.24	48.88
20	chimeric anti-IL8	10	1.60	75.13
					20	chimeric anti-IL8	1	1.48	80.15
20	chimeric anti-IL8	0.1	2.25	48.20

实施例9抗IL-8单克隆抗体的应用

1)含有0.004％抗人白细胞介素-8单克隆抗体药物的冷霜的制备

所用的基质为：

二甲基硅油          20g

液体石蜡            10g

硬脂酸              10g

鲸蜡醇                1g

硬脂醇                3g

甘油                  20g

尼泊金乙酯            0.1g

平平加A-20            0.36g

柔软剂SG              0.84g

蒸馏水加至            100g

首先将基质混合均匀，加热至80℃，继续搅拌0.5小时，然后降温至35℃，用滴管吸取药液向不断搅拌的基质中滴加，继续搅拌30分钟至均匀制成冷霜，用于以下银屑病和湿疹的研究。

2)治疗银屑病的临床研究结果

根据I、II、III期临床试验的结果，和国家药监局药品评价中心批文的精神，于2001.8～2002.8由中国医学科学院皮肤病研究所为组长单位，与全国17家中心医院一起，对该抗IL-8单克隆抗体制备的冷霜治疗寻常型银屑病和掌跖脓疱型银屑病患者进行IV期临床试验。以大样本、多中心、长疗程、开放性临床试验，深入观察该冷霜外用治疗银屑病的疗效与安全性。为临床广泛应用提供可靠的科学资料。

IV期临床共入选1431例寻常型银屑病，使用该冷霜，每日外擦皮损2次，连续用8周。1365例完成8周疗程；入选99例掌跖脓疱型银屑病，87例完成8周疗程。此次临床试验总计共入选病例1530例，完成8周疗程1452例。

经18家临床皮肤科医疗单位的一年临床研究观察，结果表明该冷霜治疗寻常型银屑病8周后，各项观察的症状、体征，即靶皮损直径、红斑、皮厚浸润、鳞屑、搔痒程度积分，显著降低(P值均小于0.001)。该冷霜具有较强的治疗作用。治疗8周后，基本痊愈率17.85％，有效率61.91％。经分析临床资料表明，该冷霜对点滴状、钱币状、小斑块状和混合状银屑病皮损表现者，均有很好的疗效，以点滴状为最佳。对进行期或静止期银屑病均有疗效，以进行期为佳。

该冷霜治疗寻常型银屑病8周内痊愈者226例，再继续随访8周，复发率仅为5.8％。表明该冷霜治疗后，病情仍稳定，不易反跳复发。

该冷霜治疗掌跖脓疱型银屑病8周疗程后，各项临床观察症状、体征，即靶皮损直径、脓疱数量、红斑、水疱、鳞屑、搔痒和疼痛的程度积分，大幅度下降(P值均小于0.001)，对疾病的主要症状和体征具有显著的疗效。经8周治疗后，掌趾脓疱型银屑病基本痊愈率14.8％，有效率60.5％。因此，IV期临床试验显示该冷霜治疗掌趾脓疱型银屑病疗效好。

总之，经过该抗IL-8单克隆抗体制备的冷霜治疗银屑病IV期临床试验，结合I、II、III期临床试验结果，证明该冷霜可外用治疗各种类型的进行期或静止期寻常型银屑病，以及外用治疗掌跖脓疱型银屑病。长期治疗既安全又有效，患者依从性高，不易复发。可推广于临床广泛应用。

3)湿疹的治疗和研究

抗IL-8单克隆抗体制备的冷霜对湿疹的初步治疗结果

病例	疗效
			显效	无效
	8	5			3

4)***的研究结果

实体瘤生长的一个明显特征就是严格依赖新血管生成。Folkman首先推断肿瘤生长是血管生成依赖性的，肿瘤的生长要求伴随着血液供应的增加。很多文献已经报道了在新鲜分离的人非小细胞肺癌(NSCLC)组织中IL-8是作为一种促血管生成因子存在的。IL-8作为CXC化学趋化因子家族的一员，是一种有效的促血管生成因子。在用IL-8进行动物试验，对移植的肿瘤进行免疫组化分析表明IL-8定位于人的肿瘤细胞。因小鼠无法产生IL-8，而抗人IL-8抗体与小鼠同源CXC化学趋化因子无交叉反应性，这样我们的结果就可以证明SCID小鼠肿瘤的减小是由抗人IL-8抗体引起的。对NSCLC细胞系来说，IL-8不是一种自分泌生长因子，这进一步证实了抗人IL-8抗体在肿瘤抑制中的作用是由阻断血管生成而不是阻断细胞生长。

(一)材料：

1、细胞株A549维持在含10％小牛血清的DMEM中。

2、SCID小鼠：8周龄雌性小鼠

3、抗人IL-8抗体

(二)、方法：

i)SCID小鼠移植瘤实验取活跃增殖期A549细胞，调整细胞浓度至4×10⁷/ml，按1∶1比例与Matrigel(美国BD公司)混合，每小鼠皮下注射0.1ml此A549细胞混合液。接种第二天将小鼠随机分为对照组和125μg抗IL-8抗体治疗组，每组4只小鼠。治疗方案：腹腔注射200μl生理盐水或者抗人IL-8抗体，每周一、三、五打药。三周后停止实验。

ii)小鼠肿瘤组织的分离，断颈法处死小鼠，小心从小鼠皮下取出肿瘤组织，称重，快速冻于负70℃冰箱。

iii)RNA抽提及cDNA的合成取5mm直径组织块，采用Trizol试剂(上海申能***公司)抽提总RNA。获得的RNA(2μg)按Revertaid首链cDNA合成试剂盒(立陶宛MBI Ferments)合成cDNA(反应体积20μl)。

iv)实时定量PCR检测定量PCR检测在LightCycler型PCR仪上进行，反应体积为25μl，内含cDNA 2μl，5×Buffer 5μl，250mM MgCl₂ 0.5μl，10mM dNTP 0.75μl，Taq HS0.25μl，100μM引物各0.1μl，50μM探针0.1μl。反应条件为：50℃180s，95℃300s，然后95℃15s，60℃60s，40个循环。IL-8，VEGF，CD31及GAPDH mRNA检测结果根据标准曲线由计算机软件自动计算后给出，以拷贝数/反应表示。每一份cDNA样本均在相同反应条件下检测，IL-8，VEGF及CD31表达值以(拷贝数×10³)/GAPDH拷贝数表示。

(三)结果：

1、给药三周后抗人IL-8抗体对不同肿瘤细胞接种的SCID小鼠肿瘤大小的影响  从表6可以看出，在给药三周后，A549接种的肿瘤明显减少，抗人IL-8抗体对肿瘤抑制率为75.62％。

表6三周后抗人IL-8抗体对肿瘤细胞接种的SCID小鼠肿瘤大小的影响

	A549
		对照组	100.9±11.6
给药组	24.6±12.2

注：单位：毫克

2、不同肿瘤组织中CD31，IL-8及VEGF基因表达的实时定量PCR分析应用定量PCR方法分析了不同肿瘤组织中IL-8，VEGF及CD31基因的表达值，并进行比较。从表7可以看出，A549所形成的实体瘤中，IL-8基因表达的量很高，当用抗人IL-8抗体治疗后，A549肿瘤中IL-8表达明显减少。

表7不同细胞接种的肿瘤中基因表达的情况

		IL-8mRNA	VEGF mRNA	CD31mRNA
					A549	对照组	14942.52±17642.09	171.71±180.77	2122.76±400.22
给药组	7911.75±5145.22	586.80±469.68	23774.01±27160.58

注：单位：(拷贝数×10³)/GAPDH拷贝数

4)治疗SARS的研究结果：

1、为了探讨是否SARS患者由于病毒感染引起趋化因子(炎症因子)在体内感染部位的过量表达和分泌是造成肺组织中严重炎症反应的原因。我们通过北京协和医院和中日友好医院对SARS患者血清中IL-8、MCAF等趋化因子进行定量检测结果如下：

                 表8北京协和医院的检测结果(单位：pg/ml)

组别	病例	病期	IL-6	IL-8	MCAF	TNF-α
							正常人	15	-	0	0	436.19±84.5	0
SARS患者	50	急性期	54.44±138.99	98.19±289.29	1329.97±642.51	48.69±144.41
							恢复期	0.158±0.96	0.118±0.834	565.12±179.44	59.34±91.82

急性期SARS患者的IL-8、MCAF、IL-6、TNF-α浓度明显高于正常人(P＜0.01)，在恢复期IL-8水平下降至正常人的水平(P＞0.05)，然而，MCAF水平持续高于正常人水平(P＜0.01)，说明IL-8和MCAF的变化较IL-6和TNF-α明显。

表9中日友好医院的检测结果(单位：pg/ml)

组别	IL-8	MCAF
			SARS患者	201.3±184.5(9例)	1152.08±448.15(160例)

1、SARS患者的血清学检测表明，急性期患者体内IL-8和MCAF的水平有明显升高，恢复期IL-8的水平下降至正常人水平。这表明SARS病毒感染后引起的严重炎症反应很可能与趋化因子过量表达和分泌有关，感染肺组织的病变程度和可能的后遗症也可能与IL-8和MCAF的存在有关。

2、为了从组织病理上进一步研究SARS患者的发病、病变机理，用免疫组织化学方法分析尸检肺组织标本仍是十分必要的。初步检测证明，在SARS患者和ARDS(急性呼吸衰竭综合症)患者中，肺部炎症反映确实与IL-8，MCAF的过量表达和分泌相关，所以，应用高效价的中和性抗IL-8和抗MCAF单克隆抗体，去除过量表达的趋化因子，解除由它们引起的强烈炎症反应，可能对治疗SARS患者、减轻SARS患者肺组织的破坏、降低SARS患者的死亡率是十分有效、可行的治疗办法。

虽然以上只是列举了含有SEQ ID NO：1和2所示的重链和轻链可变区的抗IL-8单克隆抗体的例子，但是本领域的普通技术人员通过本发明的公开将所述重链和轻链可变区用于其它分子，如免疫球蛋白全分子、抗体的片段Fab或(Fab’)2或单链抗体、与其它成分的融合体等是显而易见的，不需要花费创造性的劳动，因此此处不再赘述。

                      序列表

<110>叶庆炜

<120>抗IL-8单克隆抗体、其可变区序列及其应用

<130>041301C

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>119

<212>PRT

<213>antibody

<220>

<221>VH

<222>(1)..(119)

<223>

<400>1

Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Lys Phe Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr

            20                  25                  30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Thr Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu

    50                  55                  60

Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Leu Asp Gly Tyr Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>2

<211>112

<212>PRT

<213>antibody

<220>

<221>VK

<222>(1)..(112)

<223>

<400>2

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Asp Tyr

            20                  25                  30

Gly Leu Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Arg Pro Pro

        35                  40                  45

Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala

    50                  55                  60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His

65                  70                  75                  80

Pro Leu Glu Glu Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys

                85                  90                  95

Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

            100                 105                 110

Claims (7)

1、一种抗IL-8单克隆抗体的可变区序列，其特征在于，所述可变区序列具有SEQ IDNo.1所示的重链和SEQ ID No.2所示的轻链的氨基酸序列。

2、一种抗IL-8单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的结构中具有SEQ ID No.1的重链和SEQ ID No.2所示的轻链的可变区氨基酸序列。

3、权利要求1的抗IL-8单克隆抗体用于制备治疗与IL-8表达和分泌的异常或过量、失控有关的疾病的药物的用途。

4、权利要求3的抗IL-8单克隆抗体的用途，其特征在于，所述疾病为银屑病。

5、权利要求3的抗IL-8单克隆抗体的用途，其特征在于，所述疾病为湿疹。

6、权利要求3的抗IL-8单克隆抗体的用途，其特征在于，所述疾病为肿瘤。

7、权利要求3的抗IL-8单克隆抗体的用途，其特征在于，所述疾病为SARS。

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