CN1295340C - 一种建立多形性腺瘤小鼠模型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种多形性腺瘤动物模型，在该动物的基因组中转入了外源性的FLAG1表达盒，所述表达盒含有(a)启动子，(b)与启动子操作性相连的PLAG1编码序列，(c)终止密码子。转基因小鼠发生了自发唾液腺肿瘤，病理检查表明肿瘤符合人多形性腺瘤的主要病理特征。本发明还提供了建立该多形性腺瘤小鼠模型的方法，以及该多形性腺瘤小鼠模型的用途。
Description
技术领域
本发明涉及转基因技术领域。更具体地，涉及一种多形性腺瘤小鼠模型、建立该多形性腺瘤小鼠模型的方法，以及该多形性腺瘤小鼠模型的用途。
背景技术
多形性腺瘤(pleomorphic adenoma)是口腔颌面外科最常见的唾液腺肿瘤，好发于腮腺及腭腺，界于良恶性肿瘤之间，是典型的临界瘤(border-linetumor)，约占全部唾液腺肿瘤的53.9％。多形性腺瘤又名混合瘤(mixed tumor)，在组织病理学形态方面具有多样性，可含有肿瘤上皮样组织、软骨样组织及粘液样组织等。
大量的细胞遗传学研究发现，多形性腺瘤中常出现异常核型。据统计，染色体核型正常的多形性腺瘤仅占总数的30％，其余70％均为异常核型，其中最常见的是8q12区发生重排。
1997年，Kas K等从t(3；8)(p21；q12)染色体异常的多形性腺瘤组织中克隆了一个新的约7.5Kb的转录物，命名为多形性腺瘤基因1(pleomorphicadenoma gene 1，PLAG1)。PLAG1位于人染色体8q12，cDNA(Gene Bank编号为U65002)全长为7313bp，包含5个外显子，编码框共1503bp，其表达产物为一锌指蛋白，含七个C2H2锌指结构。
多形性腺瘤中最常见的t(3；8)(p21；q12)染色体易位累及PLAG1和位于第3号染色体的β-连接素(β-catenin)基因。由于染色体易位导致两个基因的调控序列相互交换(promoter swapping)，使PLAG1基因激活；而t(5；8)染色体易位的多形性腺瘤中PLAG1基因的高表达则是与位于第5号染色体的白血病抑制因子受体(LIFR)基因发生启动子互换的结果。在一些核型正常的多形性腺瘤中，PLAG1和β-连接素、转录延长因子SII基因发生隐性重排，导致PLAG1表达升高。此外，在未检测到染色体核型异常和隐性重排的多形性腺瘤中，也普遍存在PLAG1的异常表达。这提示PLAG1基因的表达激活与多形性腺瘤发生密切相关。PLAG1在脂肪母细胞瘤的高表达也佐证了PLAG1在肿瘤发生中的作用。
虽然研究暗示PLAG1是一种潜在的癌基因，然而PLAG1的生物学功能及其高表达与多形性腺瘤发病的关系尚缺乏直接证据，亦无整体动物水平的研究报道。此外，由于多形性腺瘤发生的分子机制的研究相对滞后，目前还没有合适的多形性腺瘤动物模型，给多形性腺瘤的研究、治疗、药物筛选及防止术后复发等研究带来诸多不便。
因此，本领域迫切需要开发多形性腺瘤动物模型。
发明内容
本发明的目的就是提供一种多形性腺瘤小鼠模型以及建立该多形性腺瘤小鼠模型的方法。
本发明的另一目的是提供该多形性腺瘤小鼠模型的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种产生多形性腺瘤非人哺乳动物模型的方法，包括步骤：
(i)提供一线性化的转基因构建物，该构建物从5’至3’依次含有(a)启动子，(b)与启动子操作性相连的PLAG1编码序列，(c)终止密码子，并且在启动子的上游以及密码子下游还含有进行同源重组的同源区；
(ii)用显微注射技术将步骤(i)中的线性化的构建物基因引入非人哺乳动物受精卵；
(iii)将步骤(ii)的受精卵移植到假孕的非人哺乳动物的输卵管；
(iv)产生转基因的非人哺乳动物，所述的非人哺乳动物的基因组中整合有FLAG1表达盒，所述表达盒含有(a)启动子，(b)与启动子操作性相连的PLAG1编码序列，(c)终止密码子。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：(v)对步骤(iv)获得的转基因动物进行鉴定。
在另一优选例中，所述的鉴定是通过PCR和Southern杂交法。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：
(vii)将获得的转基因哺乳动物与正常的哺乳动物杂交，以获得子代。
在另一优选例中，所述的非人哺乳动物是小鼠、大鼠、兔、猴。
在另一优选例中，所述的鉴定是对转基因动物的组织用RT-PCR和Northern杂交进行表达谱分析。
在另一优选例中，所述的PLAG1是人的PLAG1。
在本发明的第二方面，通过了用上述方法获得的多形性腺瘤非人哺乳动物模型。
在本发明的第三方面，提供了一种用本发明上述方法获得的多形性腺瘤非人哺乳动物模型的用途，它被用于筛选治疗多形性腺瘤的药物。
附图说明
图1显示了对MMTV-PLAG1转基因阳性小鼠鉴定。
a：PCR鉴定1：转基因阳性出现1.1K和610bp带或只出现610bp带，野生型或阴性小鼠可扩增出1.1K带。
b：PCR鉴定2：转基因阳性出现660bp带，野生型或阴性小鼠无特异带扩增。
c：转基因小鼠southern blot鉴定(基因组DNA用BamHI酶切)，阳性小鼠出现1.9K预期条带。以质粒DNA为阳性对照。
泳道M为分子量标记物，泳道9、41等为各转基因小鼠的编号，Wt为野生型小鼠。
图2显示了对转基因小鼠唾液腺PLAG1基因表达分析(Northern blot)。
图3显示了发生多形性腺瘤的转基因小鼠。
具体实施方式
本发明人经过深入而广泛的研究，将人PLAG1基因克隆在MMTV表达载体中，经显微注射获得了转基因小鼠，从而首次建立了表型稳定的多形性腺瘤动物模型。转基因小鼠发生了自发唾液腺肿瘤，病理检查表明肿瘤符合人多形性腺瘤的主要病理特征。在此基础上完成了本发明。
可用于本发明的PLAG1没有特别限制，可以是人、小鼠、大鼠、猪或其他哺乳动物的PLAG1。可以是野生型PLAG1，也可以是突变型PLAG1。一种特别优选的PLAG1序列是GenBank编号为U65002的序列，其全长为7313bp(SEQID NO：1)，包含5个外显子，编码框共1503bp，其表达产物为一锌指蛋白，含七个C2H2锌指结构。
可用于本发明的启动子没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：MMTV LTR启动子、CMV启动子、唾液淀粉酶基因启动子等。
在本发明的产生转基因动物的方法中，首先构建一构建物，该构建物从5’至3’依次含有(a)启动子，(b)与启动子操作性相连的PLAG1编码序列，(c)终止密码子。此外，在启动子的上游以及密码子下游还含有进行同源重组的同源区。
在获得了构建物之后，可用常规方法将线性化的构建物转入受精卵中。待小鼠出生后用PCR检测、Southern印迹法等方法鉴定PLAG1是否发生整合入其基因组，从而获得转基因小鼠。
本发明多形性腺瘤非人哺乳动物模型的主要用途包括：多形性腺瘤的预防研究，多形性腺瘤的手术和药物治疗研究，多形性腺瘤术后复发的预防研究，多形性腺瘤发病机制的研究等。一种特定的用途是筛选治疗多形性腺瘤的药物，即将候选药物施用于本发明的模型动物，并观察多形性腺瘤的大小变化，从而确定有效的治疗药物。
本发明的主要优点在于：
(a)是国际上第一个符合人多形性腺瘤病理特征及其分子机制的唾液腺瘤动物模型。
(b)转基因可以孟德尔规律稳定遗传。有多个不同发病率、不同发病时间的转基因小鼠系，可根据研究目的选用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
MMTV-PLAG1质粒的构建
用以下引物，引物PLAG381：5’-TTACGACCACATGAAACTTGAG-3’(SEQ ID NO：2)，引物PLAG2003：5’-TGAATCCATGTCCCAGAATCCT-3’(SEQ ID NO：3)，以人唾液腺瘤或胎盘标本中总RNA经逆转录获得的cDNA为模板，通过常规的RT-PCR法获得人的PLAG1基因。然后直接克隆入pGEM-Teasy载体(Promega)，得到质粒pGEMT-PLAG1。
MMTV-EGFR-stop(Xie W，Paterson AJ，Chin E，et al.Targetedexpression of a dominant negative epidermal growth factor receptor inthe mammary gland of transgenic mice inhibits pubertal mammary ductdevelopment.Mol Endocrinol.1997；11(12)：1766-81)含有MMTV LTR启动子。将MMTV-EGFR-stop用EcoRI酶切，切除其中EGFR基因，回收载体片段后用CIAP(牛胰碱性磷酸酶)去磷酸化；用EcoRI酶切pGEMT-PLAG1，回收PLAG1基因片段；用连接酶连接两个片段，形成质粒MMTV-PLAG1，其中，PLAG1基因位于MMTV LTR下游。
实施例2：
PLAG1经显微注射引入小鼠受精卵以及转基因阳性鼠的产生
转基因质粒MMTV-PLAG1用XhoI线性化后，回收含有MMTV LTR和PLAG1基因的片段(4.3kb)。将线性化的DNA(约500拷贝)注射至小鼠受精卵的雄原核中，注射后的受精卵移植给假孕小鼠。约20天后，小鼠出生。
小鼠出生3周后，剪尾提取DNA，分析是否有转基因整合：用两套PCR反应检测后，引物如表1所示。以MMTV-PLAG1质粒含有的β-球蛋白基因为探针做Southern印迹法确认。
表1
| 编号 | 序列(5’-3’) | SEQ ID NO： |
| 1 | GenBank编号：U65002 | 1 |
| 2 | TTACGACCACATGAAACTTGAG | 2 |
| 3 | TGAATCCATGTCCCAGAATCCT | 3 |
图1显示了对MMTV-PLAG1转基因阳性小鼠鉴定。a：PCR鉴定1：转基因阳性出现1.1K和610bp带或只出现610bp带，野生型或阴性小鼠可扩增出1.1K带。b：PCR鉴定2：转基因阳性出现660bp带，野生型或阴性小鼠无特异带扩增。c：转基因小鼠southern blot鉴定(基因组DNA用BamHI酶切)，阳性小鼠出现1.9K预期条带。以质粒DNA为阳性对照。
结果，共获得转基因阳性小鼠9只，这些小鼠经交配繁育建系，共建立了6个转基因小鼠系。
实施例3
转基因在小鼠唾液腺中的表达
为了检测MMTV LTR/PLAG1融合基因在小鼠体内是否表达，用Trizol试剂按常规方法提取小鼠唾液腺总RNA。取20mg RNA电泳后转移至硝酸纤维素膜，用PLAG1基因片段为探针进行Northern blot杂交。
结果发现在其中5个转基因小鼠系中存在PLAG1转基因高水平表达(图2)。
实施例4
转基因小鼠自发多形性腺瘤
6个转基因小鼠系中有3个转基因小鼠系自发性地出现唾液腺肿瘤，经病理检查，肿瘤组织内含有腺上皮样组织、假软骨样组织、粘液样组织及肌上皮细胞等；各种组织常出现与人多形性腺瘤中类似的排列方式。肿瘤具有人多形性腺瘤的主要病理特征(图3)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海南方模式生物科技发展有限公司
中科院上海生命科学研究院上海第二医科大学健康科学中心
上海第二医科大学
上海第二医科大学附属第九人民医院
<120>一种建立多形性腺瘤小鼠模型的方法
<130>033705
<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>7313
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
ggcagcgcat acactacaat ggctgctgga aagaggcgta aggaaacaat ttccaggccc 60
gccgcgtcca gcccgaaata tgagaaaaaa attattagaa attccgcggg cggtgtagag 120
gcggcggacg ggccggaggg aggatgttaa agccccgcgg ttgcctcttg gtgctgcctt 180
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ctagagtttg gagcagggcc tcagattggc caaaatggga aggattggat tccactctct 300
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acacacatgc acacataccg cacttcatag aatcaaagtt gctctctgaa ggagctttgg 3960
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Claims (7)
1.一种产生多形性腺瘤非人哺乳动物模型的受精卵的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)提供一线性化的转基因构建物，该构建物从5’至3’依次含有(a)启动子，(b)与启动子操作性相连的PLAG1编码序列，(c)终止密码子，并且在启动子的上游以及密码子下游还含有进行同源重组的同源区；
(ii)用显微注射技术将步骤(i)中的线性化的构建物基因引入非人哺乳动物受精卵，从而获得用于产生多形性腺瘤非人哺乳动物模型的受精卵，
其中所述的非人哺乳动物是小鼠或大鼠。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非人哺乳动物是小鼠。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PLAG1是人的PLAG1。
4.一种用权利要求1-3中任一项所述方法所制备的受精卵的用途，其特征在于，用于制备多形性腺瘤非人哺乳动物模型，并且所述的非人哺乳动物是小鼠或大鼠，其中所述的动物模型的基因组中整合有FLAG1表达盒，所述表达盒含有(a)启动子，(b)与启动子操作性相连的PLAG1编码序列，(c)终止密码子。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的非人哺乳动物是小鼠。
6.一种线性化的转基因构建物，其特征在于，该构建物从5’至3’依次含有(a)启动子，(b)与启动子操作性相连的PLAG1编码序列，(c)终止密码子，并且在启动子的上游以及密码子下游还含有进行同源重组的同源区。
7.如权利要求6所述的构建物，其特征在于，所述的PLAG1是人的PLAG1。
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