CN1292033A - 用于遗传物质高通量表达的杆状病毒表达***和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于在宿主细胞中表达外源遗传物质的新型重组杆状病毒表达***。这种表达***可方便地应用于以高通量方式表达外源遗传物质的自动化方法。在其它方面,本发明阐述了用于通过采用本发明的重组杆状病毒表达***传染至宿主中而测定外源遗传物质功能的新型自动化方法。
Description
本发明的领域
广义上,本发明涉及分子生物学和遗传学领域。具体地,本发明涉及用于通过转染昆虫细胞表达外源遗传物质的新型杆状病毒表达***。
本发明的背景
已产生了描述许多较小生物遗传密码的大量序列信息。人们以一种比以前认为可能的快得多的方式在类似地描述高等生物如人类的遗传构成方面取得了巨大成功。毫无疑问,人们会加强努力完成这些生物,尤其是那些对人类重要的生物如植物和其它哺乳动物,的遗传密码的测序工作。现在特别需要开发确定这些序列数据已描述了序列的特定基因和内含子的功能的快速而准确的方法,以便利用这些序列数据。这种努力的第一步是表达已测序遗传物质的基因产物。有效完成这一目标所涉及的关键技术有可能利用能同时处理许多基因或基因产物样品的机器人技术。而且,可采用纯化表达基因产物的最佳方法进一步推动该技术。
杆状病毒感染昆虫细胞。原核细胞和真核细胞均已用于表达外源遗传物质。然而,只有当外源遗传物质的产物不需要翻译后修饰,例如糖基化、磷酸化或信号肽切除时,原核细胞如大肠杆菌细胞才适合表达其基因产物。原核细胞不含有这种翻译后修饰所需的机构。因此,在真核细胞中开发新型易操作的重组表达***尤为重要。杆状病毒感染的昆虫细胞可完成大多数真核细胞转录后修饰(包括磷酸化、N-和O-连接糖基化、乙酰化、二硫键交连、寡聚物组装和亚细胞定位),并且其已被用于从多种外源基因制备功能性重组蛋白。
遗传修饰的杆状病毒被广泛用于制备重组蛋白(Davies,Bio/technology 12:47-50(1994))。典型杆状病毒包括但不限于苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)、Rachiplusia ou、Galleria mellonella和家蚕(Bombyx mori)。其中,可能苜蓿银纹夜蛾表征最全面且应用最广泛。在天然的病毒生活周期中杆状病毒的多角体蛋白以非常高的水平表达,而在细胞培养中又不是必需的。这就允许将其替换为几乎任何感兴趣的异源核苷酸序列。任何***以替换多角体蛋白的异源核苷酸本身可由多角体蛋白启动子控制,并由此获得同样高水平的表达。
杆状病毒基因组包含大约130kb DNA,对于常规质粒克隆技术来说太大而不易操作,因此对其进行分子水平的操作是具有挑战性的。传统解决该问题的方法是通过同源重组导入同时含有外源基因、合适启动子和终止序列的盒子。这通过在质粒载体上以病毒DNA序列从两侧包围该盒子来完成,该病毒DNA序列是待***的病毒基因组位点的两侧序列。该方法的效率不到1%。
在过去采用噬菌斑纯化由此产生克隆载体。一些传统程序参见Smith等,美国专利4,745,051;Smith等,美国专利4,879,236;Summers等,美国专利5,169,784;Guarino等,美国专利5,077,214;Kang等,美国专利5,194,376;Matsuura等,美国专利5,229,293和Murphy等,美国专利5,516,657,这些专利的公开以参考文献并入本文。然而最近已发展了几种不同技术增加重组至杆状病毒基因组的效率。下面描述那些最成功的方法。
杆状病毒基因组已被重新构建成在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中增殖的复制子。这通过在杆状病毒基因组多角体蛋白位点***一个酵母自主复制序列(ARS),以及CEN(中心粒)序列(它作为有丝***着丝粒而确保病毒基因组以稳定的低拷贝数分离)和URA3筛选标记(以允许在无尿嘧啶培养基中生长)来实现。这样多角体蛋白启动子启动的外源基因的重组可被酵母接受,所产生的杆状病毒基因组可从酵母细胞中提取,并作为克隆载体直接转染至昆虫细胞中。该方法的优点包括接近100%的效率并能在外源宿主中操作那些其产物可能对昆虫细胞有毒的基因。然而,需要大量操作,使该方法繁重而复杂。
杆状病毒基因组还可被重新构建成可在大肠杆菌(Escherichiacoli)中增殖的复制子。Luckow等(病毒学杂志(J.Virology)67:4566-4579)在一个与酵母所用方法相同的方法中首次描述了可将杆状病毒基因组修饰成一个大质粒在大肠杆菌中复制,称为“杆粒”。这可通过重组一个小F复制子(其赋予杆状病毒基因组自主复制和稳定低拷贝数分离的能力)至多角体蛋白位点,和***一个kanr筛选标记来实现。还可导入Tn7细菌转座子的靶位点,作为pUC衍生质粒来源的lacZa序列中符合阅读框的***片段。因此该杆粒可与大肠杆菌宿主如DH 1 OB的缺损β-半乳糖苷酶lacZDM15进行等位基因内互补。但含有在Tn7位点***了外源基因的杆粒的大肠杆菌DH 1 OB将保持lacZaˉ,使含有重组杆粒的菌落能用视觉筛选。该程序的整个策略是在异源宿主(这里是大肠杆菌)中完成重组和筛选步骤,然后再将完成的产物转至昆虫细胞中。该策略具有酵母***类似的优点,但也涉及很多步骤。
除了在认为适于筛选重组体的异源宿主中重新构建杆状病毒复制子外,还发展了一种体外重组反应将基因从转移载体转至病毒的多角体蛋白位点。利用噬菌体Pi的Cre重组酶及其底物lovp,该***的基因转移可通过单酶交换反应来实现。改造目标杆状病毒基因组(vaclox)和转移载体,使其均含有lox位点。该34个核苷酸序列指导Cre酶将两个底物DNA分子转换成拓扑结构上不相连的重组产物。在化学计量上该反应进行的效率约为70%,这种方法最大的优点是简便,但最大效率只有约70%。
1990年,Kitts等(核酸研究(Nucl.Acids Res.)18:5667-5672(1990))通过在多角体蛋白位点引入单一限制性位点(Bsu36I)从以共价闭合环状双链分子存在的野生性杆状病毒DNA衍生了新的杆状病毒DNA。用这个酶切位点将杆状病毒基因组线性化,减少了病毒DNA转染至昆虫细胞的效率,但与驱动多角体蛋白位点重组的转移载体共转染,产生了高出3倍比例的重组病毒。
在该策略中,含有Bsu36I位点的杆状病毒称为ACRP-SC(单酶切位点),该策略还发生转移待表达的外源基因及其自身拷贝的多角体启动子和终止子序列的两个双交换事件。这种共转染产生的子代病毒约15%-25%是重组子,但应注意,这是由于野生型病毒背景降低引起的,而不是重组子绝对数目增加引起的。
该***的随后发展将它与(基于lacZ的)病毒筛选和基于复制的筛选策略有效地联合起来。见Kitts等“生物技术”(Biotechniques)14:810-817(1993)。重组在传统转移载体和野生型基因组的衍生基因组(命名为BacPAK6)之间发生,该衍生基因组在多角体蛋白位点含有lacZ,在多角体蛋白侧翼序列还含有另外两个Bsu36I位点。用Bsu36I酶消化该杆状病毒DNA,不仅使该分子线性化,而且还除去了两个基因组片段,从而破坏了开放阅读框ORF-1629。该基因是杆状病毒所必需的,所以随着两个Bsu36I片段从基因组中去除,感受态病毒只能通过与转移载体重组来重建,由此基因组将恢复完整ORF-1629。而且在来自BacPAK6 DNA的蓝色噬菌斑背景上,重组病毒将形成白色噬菌斑。
该策略产生重组病毒的频率为85%-99%。大部分背景是由于污染了未消化的BacPAK6 DNA,它比该基因组的线性化形式具有更高的感染性。对将来的工作有用的病毒可能是产生的病毒总数中一小部分,它们可用传统技术(噬菌斑实验)来纯化。因此这种方法将简便和高效很好的统一起来,将是我们将阵列cDNA转移至表达载体的所选方法。
与杆状病毒表达***有关的一个具体问题是它们会引起被感染细胞凋亡或裂解。杆状病毒细胞凋亡抗性基因(p35基因)已证明该抗性增加了某些细胞系的病毒产量。带有该基因的重组杆状病毒能在合适的宿主中选择性地扩增(达到106倍)。
尽管杆状病毒表达***相关的处理将高产和可靠性有用的统一起来,但从杆状病毒感染的细胞中纯化目标产物不比任何其它真核***容易。已发展了许多表达载体能合成与便于纯化的多肽融合的目标抗原。例如,蛋白A融合蛋白可用IgG亲合纯化,聚精氨酸融合蛋白可用阳离子交换法纯化,聚组氨酸融合蛋白可利用其螯合锌离子的特性来纯化,β-半乳糖苷酶融合蛋白和其它与特定免疫原性成分融合的蛋白可用免疫亲合法纯化,β-半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白可通过底物亲合法纯化。也可使用其它附加表位如EE或Glu-Glu抗肽(antipeptide)抗体识别的附加表位。该抗体抗含有多形瘤中t抗原的主要酪氨酸磷酸化位点的多肽。这种附加表位已广泛用于多种重组应用中。一些研究者报道说,纯化附加EE的蛋白的尝试有90%以上成功,其中大部分不经过其它层析步骤可达到50%纯度(Jim Litts和Robin Clark未发表数据)。
该附加表位已通过NEmotope肽扫描分析进行了详细表征和优化(Mario Geysen,John Wang和Robin Clark未发表数据)。对EE标签(tag)具有中度亲合力(Kd-2X10-7)的抗体既允许有效结合粗裂解物中的蛋白质,又允许在非变性条件下以游离肽快速洗脱标记蛋白。EE标签尽管通常置于蛋白的N端,但置于C端或内部也可被识别。该标签的抗体还可用于免疫沉淀、免疫荧光和Western印迹。而且可通过EE杂交瘤产生高水平的该抗体。据报道,10L制品常规产生3-5g纯化抗体。该EE标签的另一个优点是含有一个蛋白激酶如src的强酪氨酸磷酸化底物。这种标签可直接以放射性磷酸标记或以抗磷酸酪氨酸抗体检测。
本发明概述
一方面,本发明描述了尤其适用于在宿主中表达异源遗传物质的新型杆状病毒表达***。一般地,该***包含一个或多个筛选标记基因、启动子例如多角体蛋白结构基因的多角体蛋白启动子或其片段、转录终止序列如多角体蛋白结构基因的转录终止序列或其片段、可操作接受外源遗传物质的克隆位点、可选择包含的标签和可选择包含的一个或多个限制性位点。筛选标记基因的例子包括凋亡抑制基因如AcNPV p35,在许多实施方案中,其位于多角体蛋白启动子上游。标签的例子包括EE标签序列。在优选实施方案中,该杆状病毒表达***中还含有ORF-1629基因,其可用作第二个筛选标记基因。本发明描述了一种制备重组杆状病毒的方法,其中含有外源遗传物质的DNA片段优选地与两个筛选标记基因组合成一个单一DNA片段,然后该片段与杆状病毒DNA共转染昆虫宿主细胞,从而产生可通过筛选标记基因筛选分离的重组杆状病毒。因此,本发明可用于制备重组杆状病毒而无需克隆步骤,因此对于自动化高通量(high throughput)表达***是有用的。
第二方面,本发明描述了一种制备重组杆状病毒表达***的方法,其包括步骤:(a)提供一种杆状病毒转移载体,其含有凋亡抑制基因、启动子例如多角体蛋白结构基因的多角体蛋白启动子或其片段、转录终止序列如多角体蛋白结构基因的转录终止序列或其片段、可操作接受外源遗传物质的克隆位点、可选择包含的标签和可选择包含的一个或多个限制性位点,和(b)将外源遗传物质连入该杆状病毒转移载体的克隆位点,使该外源遗传物质处于启动子控制之下。
第三方面,本发明描述了一种表达外源遗传物质的方法,其包括步骤:(a)提供一种杆状病毒转移载体,其含有一或多个筛选标记基因、启动子例如多角体蛋白结构基因的多角体蛋白启动子或其片段、转录终止序列如多角体蛋白结构基因的转录终止序列或其片段、可操作接受外源遗传物质的克隆位点、可选择包含的标签和可选择包含的一或多个限制性位点,(b)将外源遗传物质连入该杆状病毒转移载体的克隆位点,使该外源遗传物质处于启动子控制之下,和(c)将含有外源遗传物质的杆状病毒转移载体转染宿主细胞。在优选实施方案中,本发明适宜自动化,因此对于高通量表达是有用的。
第四方面,本发明描述了一种检测外源遗传物质功能的方法,其包括步骤:(a)提供一种杆状病毒转移载体,其含有一或多个筛选标记基因、启动子例如多角体蛋白结构基因的多角体蛋白启动子或其片段、转录终止序列如多角体蛋白结构基因的转录终止序列或其片段、可操作接受外源遗传物质的克隆位点、可选择包含的标签和可选择包含的一个或多个限制性位点,(b)将外源遗传物质连入该杆状病毒转移载体的克隆位点,使该外源遗传物质处于启动子控制之下,(c)将含有外源遗传物质的杆状病毒转移载体转染宿主细胞,和(d)观察由此产生的生物学结果。在优选实施方案中,本发明适宜自动化,因此对于高通量分析是有用的。
第五方面,本发明描述了通过本发明方法获得的基因和其片段、核苷酸序列和基因产物。本发明描述了所选核苷酸序列在宿主生物中的表达。本领域技术人员应十分明了这些核苷酸序列的基因产物可应用本领域已知的技术进行分离和纯化。这些分离和纯化可根据本文描述的一些方法进行优化。这些基因产物可表现出生物学活性如药物活性和其它类似功能。
附图简要说明
图1是可根据本发明方法进行的高通量蛋白功能分析的一般图解。所选cDNA克隆可进行扩增,选择性地附以标签,并以阵列模式转染至已线性化的重组杆状病毒转移载体中。该重组杆状病毒表达载体接着可被转染至合适的宿主细胞如昆虫细胞。外源遗传物质的产物可通过任意一种合适的纯化方法如亲合法进行纯化。然后,选择性地,可进一步分析纯化蛋白以测定其生物学活性和/或功能。
图2显示了本发明在表达遗传物质如EST cDNA克隆中的应用。含有p35凋亡抑制基因、多角体蛋白启动子、EE标签和处于多角体蛋白启动子控制下的克隆位点的杆状病毒可与外源遗传物质例如EST cDNA克隆相连,使该遗传物质能高水平表达。然后,用含有外源遗传物质的杆状病毒表达***感染宿主细胞例如昆虫细胞以实现该遗传物质的产物表达。EST cDNA克隆可根据本领域熟知的PCR方法进行扩增,并进行合适的操作克隆至感兴趣的克隆位点。该方法导致了外源遗传物质的高转录和高翻译率,从而允许进行高水平蛋白生产和基因功能的快速分析。
图3显示了采用表达β-葡糖醛酸酶(Gus)的重组杆状病毒在96孔板上进行的重组蛋白的酶学检测。Sf9细胞在昆虫无血清培养基上生长至对数中期,然后接种于96孔平底聚苯乙烯组织培养板上,密度为40,000细胞/100μl/孔。rGus病毒以10倍递增方式进行系列稀释。向培养板中加入病毒稀释液后孵育几天,然后向每孔加入X-葡糖苷酸原液。X-葡糖苷酸是β-葡糖醛酸酶的组织化学底物,水解后产生蓝色物质。加入底物后数分钟内许多孔中可见蓝色出现,伴随低MOI引起的感染中rGus产物的增加,显色反应在持续24小时后出现于高稀释液孔中。
图4显示了如下分析的结果:含有Imobilon-P滤膜的MilliporeMAIP N45高效蛋白结合板以附加了Glu或GST的蛋白处理后,用单克隆抗-Glu Glu抗体和结合了羊抗鼠IgG第二抗体的碱性磷酸酶进行的结合分析。碱性磷酸酶采用SigmaFast BCIP/NBT药片进行检测。这些数据说明,检测纯化的Rho-E、E2F-EE和Mut1-EE的浓度范围在0.1-2.0μg/孔。
图5显示了96孔板的扫描图象,该图象说明采用本发明方法无需任何克隆步骤可有效地产生重组杆状病毒。将可用显色反应检测表达的标记基因(Gus)克隆至一个IMAGE文库载体(Stratagenebluescript)中。该克隆的细菌培养物生长于96孔板上,并直接用于(从细菌中)PCR扩增。设计的PCR引物可与载体序列杂交,并含有用于连接独立克隆(Ligation Independent Cloning,LIC)的序列。所获产物用T4 DNA聚合酶消化,退火并连入(同样以T4 DNA聚合酶处理用于LIC的)重组臂。然后该连接产物和(以Bsu36I酶切割polyBSU2的)线性化杆状病毒共转染接种于96孔板中的Sf9细胞。所获病毒在Sf9细胞中传代3次以增加并正常化病毒滴度。最后一次传代的细胞用Magenta-gluc(GUS的比色分析底物)染色以检测重组病毒的存在(显示为洋红色)。该图象显示出88个实验中75个含有重组病毒。
本发明详细描述
一方面,本发明描述了尤其适用于在昆虫宿主中表达异源遗传物质的新型杆状病毒表达***。一般地,该***包含一个或多个筛选标记基因、启动子例如多角体蛋白结构基因的多角体蛋白启动子或其片段、转录终止序列如多角体蛋白结构基因的转录终止序列或其片段、可操作接受外源遗传物质的克隆位点、可选择包含的标签和可选择包含的一个或多个限制性位点。筛选标记基因的例子包括AcNPV p35,在许多实施方案中,其位于多角体蛋白启动子上游,在另一些实施方案中可位于转录终止序列下游。标签的例子包括EE标签序列,优选ORF-1629基因。
在一些实施方案中本发明描述了通过以连接片段转染昆虫细胞产生的重组杆状病毒,该连接片段包含转移载体元件、筛选标记和cDNA,这与现有技术所示的克隆转移载体质粒不同。因此,由于免除了质粒克隆步骤和允许表达不能在细菌中克隆的cDNA,本发明的杆状病毒表达***大大地简化了现有方法。在该实施方案中,位于不同片段上的筛选标记可和含有cDNA编码序列的片段连接在一起。这就可以筛选含有目标cDNA的重组杆状病毒。任何适于连接DNA片段的方法均可用于本目的。
在最优选的实施方案中,本发明重组杆状病毒表达***包含编码p35蛋白的凋亡抑制基因、多角体蛋白启动子、处于多角体蛋白启动子控制下的克隆至杆状病毒克隆位点的外源遗传物质、位于克隆位点上游或下游的标签序列如EE标签、以及被认为对杆状病毒复制和/或感染重要的ORF-1629基因。进一步讲,在所有这些元件的上下游均可含有方便的酶切位点,尽管这些位点并不需要临近任意一个具体元件。这些方便的酶切位点包括但不限于XhoI和PvuII位点。
第二方面,本发明描述了一种制备重组杆状病毒表达***的方法,其包括步骤:(a)提供一种杆状病毒转移载体,其含有一个或多个筛选标记、启动子例如多角体蛋白结构基因的多角体蛋白启动子或其片段、转录终止序列如多角体蛋白结构基因的转录终止序列或其片段、可操作接受外源遗传物质的克隆位点、可选择包含的标签和可选择包含的一个或多个限制性位点,和(b)将外源遗传物质连入该杆状病毒转移载体的克隆位点,使该外源遗传物质处于启动子控制之下。
在一些实施方案中,该重组杆状病毒表达***可通过自动化或高通量方式制备。特别提出,可用限制酶从杆状病毒基因组中除去杆状病毒的可操作部分,其包括凋亡抑制基因、启动子例如多角体蛋白结构基因的多角体蛋白启动子或其片段、转录终止序列如多角体蛋白结构基因的转录终止序列或其片段、可操作接受外源遗传物质的克隆位点和可选择包含的标签。
在重组杆状病毒表达***采用自动化方式制备的本发明实施方案中,在相对较短的时期内即可获得高产量。采用这种技术,遗传物质如cDNA可排成阵列***克隆位点,这样就可提供含有许多不同***片段的重组杆状病毒。
第三方面,本发明描述了一种表达外源遗传物质的方法,其包括步骤:(a)提供一种杆状病毒转移载体,其含有凋亡抑制基因、启动子例如多角体蛋白结构基因的多角体蛋白启动子或其片段、转录终止序列如多角体蛋白结构基因的转录终止序列或其片段、可操作接受外源遗传物质的克隆位点、可选择包含的标签和可选择包含的一个或多个限制性位点,(b)将外源遗传物质连入该杆状病毒转移载体的克隆位点,使该外源遗传物质处于启动子控制之下,和(c)将含有外源遗传物质的杆状病毒转移载体转染宿主细胞。
一般讲,在优选实施方案中,宿主细胞是昆虫细胞。杆状病毒对某些种类的昆虫细胞已表现出致病性。因此,在优选实施方案中,本发明重组杆状病毒表达***中提供了凋亡抑制基因。根据本发明的一些实施方案,Sf9已被特别证明为一种尤其可靠的用于生产重组蛋白的动物细胞。
具体讲,外源遗传物质的克隆和其表达产物的分离和纯化可自动化进行。允许平行处理样品的技术是各种组织模式的联合,尤其是96和384孔微滴定板的广泛应用和设计成按这种组织模式进行快速、***工作的样品操作机器人的日益增加的使用。例如,96孔圆形微滴定板最初专门为免疫领域而开发,但Lawrence Livermore国家实验室开发的384孔板则是用于基因组研究的。而且,早期的机器人设计成和384孔板一起使用以便于基因组研究。参见Copeland等,自然(Nature)369:421-422(1994)。
随着规范化和自动化的发展,基因组DNA和互补DNA(下面称为cDNA)的克隆样品正日益以这种规范化阵列形式提供。例如,作为能源部国家基因文库计划(Department of Energy’s National GeneLibrary Project)一部分的Lawrence Livermore国家实验室和LosAlamos国家实验室提供含有主要来自于流式分拣法分离的单个人类染色体的***片段的粘粒文库和噬菌体文库。最近,通过LawrenceLivermore国家实验室的I.M.A.G.E.协会(基因组及其表达的整合分子分析协会(Integrated Molecular Analysis of Genomes and theirExpression Consortium))可获得大量cDNA克隆。见Lennon等基因组学(Genomics)33:151-152(1996)。
I.M.A.G.E.协会促进了共享阵列cDNA文库的使用。通过与华盛顿大学的合作(Hillier等,基因组研究(Genome Rearch)6:829-845(1996),这些公众共享克隆的序列毫无限制和延迟地储存于公共序列数据库中,该数据库含有短序列标签或表达序列标签(dbEST)。在dbEST中,已排列了500,000个以上人类cDNA克隆,并含有500,000以上个序列。序列聚类分析显示80,000左右的人类基因中的大多数现已可由该数据库的克隆代表。见上述Hillier;Aaronson等,基因组研究6:829-845(1996)。
I.M.A.G.E.cDNA数据库中可获得的大多数克隆来源于dT引导的mRNA,其平均长度在1-2kb之间。因此,该数据库更为全面的代表了许多mRNA 3’端1-2kb区域,而较少提供5’区和编码序列。人类非冗余mRNA集(NCBI)整理的4,200个人类mRNA中,约25%可完全由I.M.A.G.E.克隆代表,50%可部分代表,少于25%的没有任何代表克隆。基于这些克隆的重新测序,估计总的错误率目前约9%。因此,被认为位于微量滴定板特定位置的cDNA有91%的可能的确是从该板孔中生长起来的。
尤其希望采用这些cDNA克隆以提供本发明的外源遗传物质。而且,完全可以想到,其它生物来源和以不同方式排列的其它文库也可适于采用本发明方法而无需特别的实验要求。
尽管重组病毒表达***相关的操作具有高产量和可靠性,但从杆状病毒感染的细胞中纯化目标产物不比任何其它真核***容易。已发展了许多表达载体能合成与多肽融合以便纯化的目标抗原。例如,蛋白A融合蛋白可用IgG亲合纯化,聚精氨酸融合蛋白可用阳离子交换法纯化,聚组氨酸融合蛋白可利用其螯合锌离子的特性来纯化,β-半乳糖苷酶融合蛋白和其它与特定免疫原性成分融合的蛋白可用免疫亲合法纯化,β-半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白可通过底物亲合法纯化。也可使用其它附加表位如EE或Glu-Glu抗肽抗体识别的附加表位。该抗体抗含有多形瘤中t抗原的主要酪氨酸磷酸化位点的多肽。这种附加表位已广泛用于多种重组应用中。一些研究者报道说,纯化附加EE的蛋白的尝试有90%以上成功,其中大部分不经过其它层析步骤可达到50%纯度(Jim Litts和Robin Clark未发表数据)。
该附加表位已通过NEmotope肽扫描分析(Mario Geysen,John Wang和Robin Clark未发表数据)进行了详细表征和优化。对EE标签具有中度亲合力(Kd-2X107)的抗体既允许有效结合粗裂解物中的蛋白质,又允许在非变性条件下以游离肽快速洗脱标记蛋白。EE标签尽管通常置于蛋白的N端,但置于C端或内部也可被识别。该抗体还可用于免疫沉淀、免疫荧光和Western印迹。而且可通过EE杂交瘤产生高水平的该抗体。据报道,10L制品常规产生3-5g纯化抗体。该EE标签的另一个优点是含有一个蛋白激酶如src的强酪氨酸磷酸化底物。这种标签可作为高通量蛋白相互作用分析的有用分析检测标志。这种标签可直接以放射性磷酸标记或以抗磷酸酪氨酸抗体检测。
第四方面,本发明描述了一种检测外源遗传物质功能的方法,其包括步骤:(a)提供一种杆状病毒转移载体,其含有一个或多个筛选标记基因、启动子例如多角体蛋白结构基因的多角体蛋白启动子或其片段、转录终止序列如多角体蛋白结构基因的转录终止序列或其片段、可操作接受外源遗传物质的克隆位点、可选择包含的标签和可选择包含的一个或多个限制性位点,(b)将外源遗传物质连入该杆状病毒转移载体的克隆位点,使该外源遗传物质处于启动子控制之下,(c)将含有外源遗传物质的杆状病毒转移载体转染宿主细胞,和(d)观察由此产生的生物学结果。在优选实施方案中,本发明适于自动化,因此对于高通量分析是有用的。
本领域技术人员易于理解,有多种方法可用于测定宿主如昆虫细胞中表达的外源遗传物质的功能。在一个实施方案中,核酸功能的测定可通过互补分析进行。也就是说,目标核酸的功能可通过观察因目标核酸导入引起的一个或多个内源基因功能的替代或提高来测定。在第二个实施方案中,可根据本领域技术人员已知的任意一种方法分析酶反应的底物或产物积累的生化改变来检测核酸功能。在第三个实施方案中,核酸功能可通过包括形态学的、宏观或微观的分析在内的方法观察宿主的表型改变来测定。在第四个实施方案中,核酸功能可通过观察由于外源遗传物质的局部和/或***表达引起的宿主生化途径的改变来测定。在第五个实施方案中,核酸功能可通过利用本领域已知技术观察外源遗传物质的表达所导致的宿主细胞细胞质中基因表达的抑制来测定。
检测基因功能的一个尤其有用的方法是,观察表达特定外源遗传物质的生物的表型。可通过微观、宏观或其它方法观察的有用的生物表型性状包括但不限于杀虫剂耐受性提高,对极端冷、热、干旱、盐或渗透压的耐受性提高,(对真菌、细菌或病毒)疾病抗性提高,酶或次生代谢物的产生等等。其它例子包括产生重要蛋白或其它产物如抗体、激素、药物和抗生素等。该表型性状也可是期望产生的次生代谢物。
已提出用于促进这种工作的一个策略是创建可用于鉴定表达基因的表达序列标签(ESTs)数据库。表达序列标签(ESTs)的积累和分析已成为基因组研究的一个重要成分。EST数据可用于鉴定基因产物并由此加快基因克隆。为了储存一直进行的测序工作产生的庞大数量的序列信息,并将它们联系起来,已构建多个序列数据库。特别期望,本发明方法可用于加快分离功能性基因和测定其生物学功能的工作。
第五方面,本发明描述了通过本发明方法获得的基因及其片段、核苷酸序列和基因产物。本发明描述了在宿主细胞中所选外源遗传物质包括核酸序列的表达。本领域技术人员应十分明了这些外源遗传物质的基因产物可应用本领域已知的技术进行分离。这些基因产物可表现出生物学活性如药物活性和其它类似功能。
提供以下定义以进一步阐明本发明。具体定义不应是限制性的,而是为了阐明本文所用术语的含义。
表达序列标签(ESTs):从cDNA克隆和其衍生RNA的一个或多个末端获得的相对较短的单向DNA序列。它们可以5’或3’方向存在。ESTs已显示出对特定基因的鉴定有用。
表达:本文所用该术语是指包括转录、逆转录和翻译中的一种或多种。
基因:负责生产一个或多个细胞产物和/或行使一个或多个细胞间或细胞内功能的一段独立的核酸序列。
宿主:能够复制外源遗传物质例如核酸并能通过杆状病毒或其转移载体片段被外源遗传物质转染的细胞、组织或生物。该术语旨在包括合适的原核和真核细胞、器官、组织或生物。
转移载体:可操作转移外源遗传物质进入宿主细胞以实现外源遗传物质随后的转录和/或翻译的核酸序列。杆状病毒和其片段包括线性化片段尤其属于该术语的范围。
优选实施方案的实例
以下实施例进一步阐述了本发明。这些实施例仅旨在描述本发明,而不应解释为限制性的。这些实施例尤其旨在说明以自动化方式通过重组杆状病毒表达***在昆虫宿主细胞中表达外源遗传物质,以快速实现蛋白和多肽的产生和随后评价其功能。
实施例1选择和在96孔格式中重排cDNA
我们选择已有cDNA克隆的一组基因。在96孔板格式中重排这些克隆。Lawrence Livermore国家实验室使用的重排机器人可用于该目的。根据需要测序证实克隆的一致性。一些克隆接种于多个孔中以初步估计孔间的可重复性。同时启动数据跟踪过程以便获得每一个重排板有关克隆标识符、序列访问号、传代数等的信息。所选克隆还代表已知和未知克隆的混合。对于已知克隆,既包括一些完整的代表,也包括一些部分的代表。
实施例2阵列cDNA的扩增
我们直接转染已连接至含有必要的重组和表达元件的线性杆状病毒表达***(转移载体)的扩增cDNA。这样,使该程序自动化所需要的步骤减至最少,并提供了操作多种cDNA克隆所需的最大灵活性。
设计和合成适于每一个cDNA文库载体的PCR引物。该引物应包括用于直接连接转移载体片段的限制性位点。cDNA***片段采用这些引物进行扩增,以合适的限制性酶切割,连接转移载体片段,如果需要进行纯化,并转染昆虫细胞。将这些转染细胞的上清液传代以产生高滴度重组病毒原液。我们还研究了采用未消化PCR产物进行直接单碱基突出端连接的可能性。重要的是使用可获得的最高保真度的耐热聚合酶以及最小的扩增循环数以减少序列的非忠实性。
为了保证每一个cDNA***片段对于载体的开始密码子而言具有正确的阅读框,必须为每一个cDNA克隆选择合适的载体。这可通过根据cDNA已知的5’(EST)序列的分析为机械移液器编程以挑选正确的载体来完成。实施例3接受并适合扩增cDNA的杆状病毒转移载体的构建
构建一系列新的表达载体系列以便克隆已有cDNA文库来源的cDNA片段。这些表达载体利用了昆虫细胞表达方面的最新进展。重组杆状病毒可通过用含有转移载体成分和cDNA***片段的连接片段而非克隆的转移载体质粒转染昆虫细胞来产生。由于免除了质粒克隆步骤,这大大地简化了获得重组杆状病毒的方法。这些载体应包括用于扩增cDNA***片段的引物所特异的单一限制性酶切位点如SfiI和NotI。因此,这些载体表达的蛋白质产物将在N端含有EE标签,其后是接头序列来源的2-4个氨基酸。
杆状病毒细胞凋亡抗性基因(p35基因)已被证实可增加某些细胞系的病毒产量。Clem等,科学(Science)254:1388-1390(1991)。带有该基因的重组杆状病毒能在合适的宿主中选择性地扩增(达到106倍)。见Lerch等,核酸研究21:1753-1760(1993)。我们在载体的设计中包含了该基因,但清除了宿主病毒株的该基因,以保证在我们的病毒原液中的重组杆状病毒百分数维持在接近100%。更具体地,将p35凋亡抑制基因***多角体蛋白启动子上游。这可在该载体与缺失p35基因的杆状病毒株联合使用时提供另一种筛选重组病毒的方法。除此之外这些载体与其来源的pAcoG和pAcOGS载体一致。
这些载体与polyBsu2(Cetus公司开发的杆状病毒株)(MarthaStampfer和Robin Clark,未发表)的DNA共转染。polyBsu2含有3个Bsu36I位点,其酶切将从杆状病毒基因组中除去必需的ORF-1629基因。因此,该株系与已报道株系极为类似。Kitts等,生物技术(Biotechniques)14:810-817(1993)。Bsu36I消化的polyBsu2 DNA的活性仅可通过与含有ORF-1629基因的载体DNA重组来恢复。该株系可采用标准重组方法进行修饰以失活p35凋亡抑制基因。
实施例4通过连接DNA的直接转染制备重组杆状病毒
为了开发特别是机器人方式,可对昆虫细胞培养的许多方面进行优化。例如,Sf9宿主细胞的接种可根据96孔板上细胞的接种密度进行优化。
在一些设计用于模仿高通量和/或自动化程序的实验中,我们采用了源于大量培养物的Sf9接种物,将其生长在无血清昆虫培养基上,并以各种密度在96孔组织培养板上培养细胞。我们获得了在24小时内产生可重复指数生长的接种密度。因此,这种培养可允许在最适条件下产生用于重组杆状病毒感染和供体转移载体与受体杆状病毒DNA共转染的培养物。
实施例5
我们将优化从重组杆状病毒表达***产生蛋白质的方法。然而,现在认为可接受现有的和文献描述的方法。根据已知程序而无需特殊实验即可优化必要操作的微型化和自动化,所述操作包括细胞培养、感染、收获感染细胞、制备溶胞物、亲合层析和纯化蛋白的储存。
实施例6采用Glu-Glu标签亲合纯化重组蛋白
可根据许多方法中的任意一种,从杆状病毒感染细胞中纯化目标产物。已发展了许多表达载体,能合成与便于纯化的多肽融合的目标抗原。例如,蛋白A融合蛋白可用IgG亲合纯化,聚精氨酸融合蛋白可用阳离子交换法纯化,聚组氨酸融合蛋白可利用其螯合锌离子的特性来纯化,β-半乳糖苷酶融合蛋白和其它与特定免疫原性成分融合的蛋白可用免疫亲合法纯化,β-半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白可通过底物亲合法纯化。
也可使用EE或Glu-Glu抗肽抗体识别的附加表位。见Grussenmeyer等,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)82:7952-7954(1985)。该抗体抗含有多形瘤中t抗原的主要酪氨酸磷酸化位点的多肽。见Talmage等,细胞(Cell)59:55-65(1989)。Cetus公司开发了该标签用于蛋白纯化的应用(Rubinfeld等,细胞65:1033-1042(1991)),也是Chiron公司用于此目的的主要标签。该表位标签已通过Mimotope肽扫描分析(Mario Geysen,John Wang和Robin Clark未发表数据)进行了详细描述和优化。对EE标签具有中度亲合力(Kd-2X10-7)的抗体既允许有效结合粗裂解物中的蛋白质,又允许在非变性条件下以游离肽快速洗脱标记蛋白。EE标签尽管通常置于蛋白的N端,但置于C端或内部也可被识别。该抗体还可用于免疫沉淀、免疫荧光和Western印迹。见Garcia等,分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)13:6615-6620(1993)。由于可通过EE杂交瘤产生高水平的该抗体,所以该抗体的供应不成问题。10L制品常规产生3-5g纯化抗体。该EE标签的另一个优点是含有一个蛋白激酶如src的强酪氨酸磷酸化底物。见Garcia等,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)268:25146-25151(1993)。这种标签可作为高通量蛋白相互作用分析的分析检测标志。这种标签可直接以放射性磷酸标记或以抗磷酸酪氨酸抗体检测。
一系列称为pAcOG1、2和3的杆状病毒表达载体促进了该EE标签的使用,其中在所有三个阅读框中pAcC13的原始多聚接头已被编码起始甲硫氨酸、Glu-Glu表位标签和多个单一限制性酶切位点的合成多聚接头替代。见Munemitsu等,分子细胞生物学10:597-5982(1990)。这些载体允许一步构建杆状病毒表达载体,该载体的(具有天然终止密码子的)***编码序列与N-端的EE标签在阅读框中融合。另一组载体,pAcO G1S、2S和3S,也在所有三个阅读框中含有一系列串联终止子,用于本身不带有终止密码子的不完整构建体。这些位点的顺序受用于构建cDNA文库的最常见限制性酶的影响。通过在起始甲硫氨酸上下游包含已实验证实可在Sf9细胞中增强表达的独特序列,优化载体本身的表达。这些载体已被用于制备许多已附加EE的蛋白质。
为了说明已附加Glu的蛋白质可用适于高通量自动化生产的96孔模式方便地进行免疫分析,我们进行了如下实验。用已附加Glu或GST的蛋白质处理含有Immobilon-P滤膜的Millipore MAIP N45高效蛋白结合板,然后用单克隆抗-Glu-Glu抗体和结合了羊抗鼠IgG二抗的碱性磷酸酶分析结合程度。碱性磷酸酶用SigmaFast BCIP/NBT药片检测。如图4所示,检测纯化的Rho-E、E2F-EE和Mytl-EE的浓度范围在0.1-2.0μg/孔。这些结果说明Glu标签对于在96孔模式中定量重组蛋白是方便而特异的免疫检测靶标。而且该技术很容易适用于筛选重组杆状病毒的有限稀释实验,还可适于原位检测96孔组织培养物中的重组蛋白。
实施例7
这些数据说明,在接种Sf9细胞并感染病毒的相同96孔格式中对杆状病毒表达的重组蛋白进行酶学分析是可行的。我们采用的病毒表达一种可用比色实验方便检测的酶(如Gus)。但是,同样的原理可扩展至具有其它功能的蛋白质。
采用表达β-葡糖醛酸酶(Gus)的重组杆状病毒在96孔格式上进行重组蛋白的酶学检测。Sf9细胞在无血清昆虫培养基上生长至对数中期,然后接种于96孔平底聚苯乙烯组织培养板上,密度为40,000细胞/100μl/孔。rGus病毒以10倍递增方式进行系列稀释。向培养板中加入病毒稀释液后孵育几天,然后每孔加入X-葡糖苷酸原液。X-葡糖苷酸是β-葡糖醛酸酶的组织化学底物,水解后产生蓝色物质。
加入底物后数分钟内许多孔中可见蓝色出现,伴随低MOI引起的感染中rGus产物的增加,显色反应在持续24小时后出现于高稀释液孔中。在感染细胞的上清液和显微镜检测的单个细胞中均可见显色反应。如图3所示,这些结果说明,在低细胞数以低MOI感染的杆状病毒感染培养物中可很容易地检测到酶学活性。因此,杆状病毒感染后进行这种和相关的原位酶学分析,可适于高通量自动化。
实施例8
本实施例说明本发明的一些原则,其中本发明不经过克隆步骤用微型化(96孔)形式从cDNA克隆产生重组杆状病毒。本发明的基本要素图示于图2,讨论如上。
步骤1:在96孔板中排列含有cDNA克隆质粒的细菌培养物。该质粒是含有通常用作表达标记的Gus基因的Bluescript cDNA文库载体。
步骤2:采用与cDNA***位点两侧质粒载体序列杂交的引物,通过PCR程序扩增Gus基因***片段。这些引物在5’端还含有限制性位点(5’引物是NotI,3’引物是SfiI)。含有限制性位点的引物部分不与质粒载体序列杂交,但被引入至PCR产物中。
步骤3:用NotI和SfiI限制性内切核酸酶消化步骤2的PCR产物,在该产物上产生适当粘性末端。
步骤4:用层析法在Arrayit 96孔DNA纯化装置中纯化步骤3产生的限制性片段。
步骤5:用NotI、SfiI、PvuII和XhoI限制性酶消化pAcOP2,产生杆状病毒转移载体臂。质粒pAcOP2含有EE表位标签和其后的包含NotI和SfiI限制性位点的克隆位点。EE标签包括起始密码子,其位置使其可被多角体蛋白启动子转录。pAcOP2还包含orf-1629和p35筛选标记,因此是图2所示的杆状病毒转移载体的一个例子,描述见上。该酶切消化产物的DNA用层析法在Qiagen柱上纯化。
步骤6:混合步骤4和5的酶切片段,并用DNA连接酶连接。
步骤7:用Bsu36I消化在orf-1629区域含有Bsu36I限制性内切核酸酶位点的杆状病毒DNA,产生缺失完整orf-1629基因的线性化片段。
步骤8:采用标准昆虫细胞感染步骤如Invitrogen脂转染法将步骤6的连接产物和步骤7的杆状病毒DNA共转染至(接种于96孔板的)昆虫(Sf9)细胞中。
步骤9:将步骤8的转染Sf9培养物孵育5天。所获杆状病毒原液在Sf9细胞上传代2次。
步骤10:用含有150ug/ml X-gluc的培养基10倍稀释步骤9的传代病毒原液,并将其用于感染96孔板中的Sf9细胞。取96孔中的8个用作实验对照。
步骤10:感染两天后,记数步骤10的培养板出现蓝色的孔,这指示GUS基因的表达。蓝色孔相对总孔数的百分比指示这种方法的效率和成功程度。
Claims (22)
1.含有至少一个筛选标记基因、启动子、转录终止序列和可操作接受外源遗传物质的克隆位点的杆状病毒表达***。
2.权利要求1的杆状病毒表达***,其中启动子含有多角体蛋白结构基因的多角体蛋白启动子或其片段。
3.权利要求1的杆状病毒表达***,其中转录终止序列含有多角体蛋白结构基因的转录终止序列或其片段。
4.权利要求1的杆状病毒表达***,其还含有一个标签和一个或多个限制性位点。
5.权利要求1的杆状病毒表达***,其中筛选标记基因是细胞凋亡抑制基因p35基因。
6.权利要求5的杆状病毒表达***,其中所述凋亡抑制基因位于多角体蛋白启动子的上游。
7.一种产生重组杆状病毒表达***的方法,其包括步骤:
(a)提供一种杆状病毒转移载体,其包含至少一个筛选标记基因、一个启动子如多角体蛋白结构基因的多角体蛋白启动子或其片段、一个转录终止序列如多角体蛋白结构基因的转录终止序列或其片段、一个可操作接受外源遗传物质的克隆位点,并选择性地含有一个标签和选择性的一个或多个限制性位点;和
(b)在克隆位点将外源遗传物质连接至杆状病毒转移载体中,使外源遗传物质处于启动子的控制之下。
8.权利要求7的方法,其中所述杆状病毒转移载体是线性化的。
9.权利要求7的方法,其中所述外源遗传物质是cDNA。
10.权利要求7的方法,其中所述连接在多孔阵列中自动化进行。
11.表达外源遗传物质的方法,其包括步骤:
(a)提供一种杆状病毒转移载体,其包含一个细胞凋亡抑制基因、一个启动子如多角体蛋白结构基因的多角体蛋白启动子或其片段、一个转录终止序列如多角体蛋白结构基因的转录终止序列或其片段、一个可操作接受外源遗传物质的克隆位点,并选择性地含有一个标签和选择性的一个或多个限制性位点;
(b)在克隆位点将外源遗传物质连接至杆状病毒转移载体中,使外源遗传物质处于启动子的控制之下;和
(c)将含有外源遗传物质的杆状病毒转移载体转染至宿主细胞中。
12.权利要求11的方法,其还包括纯化产生的基因产物。
13.权利要求12的方法,其中所述纯化通过标签表位的免疫实验来进行。
14.权利要求11的方法,其中所述杆状病毒转移载体是线性化的。
15.权利要求11的方法,其中所述外源遗传物质是cDNA。
16.权利要求11的方法,其中所述连接在多孔阵列中自动化进行。
17.权利要求11的方法,其中宿主细胞含有杆状病毒基因组。
18.权利要求11的方法,其中宿主细胞含有杆状病毒基因组,条件是该杆状病毒基因组不含细胞凋亡抑制基因。
19.测定外源遗传物质功能的方法,其包括步骤:
(a)提供一种杆状病毒转移载体,其包含一个细胞凋亡抑制基因、一个启动子如多角体蛋白结构基因的多角体蛋白启动子或其片段、一个转录终止序列如多角体蛋白结构基因的转录终止序列或其片段、一个可操作接受外源遗传物质的克隆位点,并选择性地含有一个标签和选择性的一个或多个限制性位点;
(b)在克隆位点将外源遗传物质连接至杆状病毒转移载体中,使外源遗传物质处于启动子的控制之下;
(c)将含有外源遗传物质的杆状病毒转移载体转染至宿主细胞中;和
(d)观察由此产生的生物学结果。
20.权利要求19的方法,其中所述观察包括分析酶反应底物或产物积累的生化变化。
21.权利要求19的方法,其中所述观察包括比较含有外源遗传物质的第一种细胞中的RNA表达情况和不含目标外源遗传物质的第二种细胞中的RNA表达情况。
22.选自根据权利要求11的方法产生的基因或其片段、核苷酸序列和基因产物的产品。
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