CN1290860C

CN1290860C - 一种高羊茅干旱应答元件结合蛋白类转录因子及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN1290860C
Application number: CN 200510002788
Authority: CN
Inventors: 阳文龙; 刘强; 公衍道; 赵南明
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2005-01-28
Filing date: 2005-01-28
Publication date: 2006-12-20
Anticipated expiration: 2025-01-28
Also published as: CN1680436A

Abstract

本发明公开了一种高羊茅干旱应答元件结合蛋白(DREB)类转录因子及其编码基因与应用，属于生物基因工程技术领域。该转录因子为具有序列表SEQ ID №：1中氨基酸残基序列的蛋白质，是具有转录激活功能的调控高羊茅抗逆性的蛋白质。其编码基因为序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列；或编码序列表SEQ ID №：1中蛋白质序列的核苷酸序列；或与序列表中SEQ ID №：2限定的核苷酸序列具有95%以上同源性，且编码具有转录激活功能的调控高羊茅抗逆性的蛋白质的核苷酸序列；或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。该转录因子及其编码基因可用于培育抗逆性提高的植物。

Description

一种高羊茅干旱应答元件结合蛋白类转录因子及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，特别是涉及一种高羊茅干旱应答元件结合蛋白(DREB)类转录因子及其编码基因与其在培育抗逆性提高的植物中的应用。

技术背景

转录因子是生物体中与基因启动子区顺式作用元件相结合，调控该基因表达的蛋白质。它们在生物的生命活动中起着非常重要的作用，不仅参与了生物体的生长、发育，同时也调控着生物体对外界逆境如干旱、高盐、低温、病原物侵染等的应答反应。Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki在对逆境应答基因rd29A启动子区域的研究中，发现了一个逆境胁迫应答顺式作用元件，即干旱应答元件(DRE，drought-responsiveelement)。刘强等运用酵母单杂交方法(yeast one-hybrid method)克隆出与该DRE元件结合的反式作用因子编码基因，即干旱应答元件结合蛋白(DREB，drought-responsive element binding protein)基因。该DREB基因表达的产物与顺式作用元件DRE结合后，可激活一系列与植物抗性相关基因的表达。自从对DREB类转录因子的研究工作开展以来，对其结构和功能的研究及其在植物遗传改良上的应用研究已成为生物化学及分子生物学等领域研究的热点。目前已发现植物中许多逆境应答基因启动子区域含有DRE元件；DREB类转录因子在植物中普遍存在，是EREBP/AP2家族中EREBP亚家族中的一个成员，含有一段非常保守的由58个左右氨基酸组成的DNA结合区域(EREBP/AP2结构域)，DREB类转录因子是植物中特有的调控对外界干旱、高盐、低温等逆境的应答反应的转录因子，具有巨大的潜在应用价值。现已从拟南芥、油菜、水稻、小麦、玉米、棉花、番茄和大豆等植物中分离到类似于DREB的基因，但是在草坪草领域，还鲜有这方面的报道。

在世界各国日益重视环境质量的今天，草坪业发展非常迅速，各国均在进行大面积、大范围的引种。近年来，我国的草坪业发展也非常迅速，其中，西部大开发的计划之一就是改善西部恶劣的生态环境，因而更加迫切需要抗寒、抗旱、耐盐碱的优良草种。高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)耐热、抗旱、抗病优良，是近年来广泛种植的优良草坪草，但其抗寒性和耐盐碱性较低限制了其在环境较恶劣的西部的推广。

发明内容

本发明的目的是为解决高羊茅抗寒性和耐盐碱性较低的技术问题，提供一种高羊茅DREB类转录因子及其编码基因，该转录因子具有受低温、干旱和高盐特异诱导的特点，可与多个逆境应答基因启动子共有的DRE调控元件特异结合，调控这些基因的表达，从而激活植物体内的多种抗逆机制，提高抗逆能力。可利用基因工程技术对高羊茅品种进行遗传改良，使其能在环境较恶劣的区域推广使用。

本发明所提供的高羊茅DREB类转录因子，名称为FaDREB1，是具有序列表SEQ ID №：1中氨基酸残基序列的蛋白质。

该蛋白质由238个氨基酸残基组成，自氨基端第58-115位为EREBP/AP2保守结构域的氨基酸残基序列，该蛋白质是具有转录激活功能的调控高羊茅抗逆性的蛋白质。

上述高羊茅DREB类转录因子(FaDREB1)的编码基因(FaDREB1，该基因的克隆菌株已经保存在中国微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC 1303，保存时间为2005年1月24日)可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的核苷酸序列；

3)与序列表中SEQ ID №：2限定的核苷酸序列具有95％以上同源性，且编码具有转录激活功能的调控高羊茅抗逆性的蛋白质的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

其中，序列表中的SEQ ID №：2由864个碱基组成，其编码序列为自5’端第5到第721位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质；自5’端第176到第349位碱基为EREBP/AP2保守结构域的编码序列，编码58个氨基酸。

本发明的特点及技术效果：

本发明的转录因子FaDREB1序列具有DREB类转录因子家族共有的特征：具有一个含有58个氨基酸的EREBP/AP2保守区。酵母单杂交实验证明该DREB类转录因子具有转录激活功能。此外，用Real time RT-PCR方法，分析了FaDREB1基因在低温、干旱、高盐处理下的表达模式。结果表明FaDREB1基因明显受低温、干旱和高盐的诱导表达。

本发明的高羊茅DREB类转录因子FaDREB1是一个受低温、干旱和高盐特异诱导的转录因子，可与多个逆境应答基因启动子共有的DRE调控元件特异结合，调控这些基因的表达，从而激活植物体内的多种抗逆机制，提高抗逆能力。在实际应用中，可将本发明的含有高羊茅DREB类转录因子基因的表达载体导入植物(如高羊茅)中，调控植物(如高羊茅)的抗逆性(如抗寒耐盐碱特性)。

本发明的DREB类转录因子FaDREB1可同时激活一系列抗性相关基因的表达，克服了传统植物抗逆基因工程中用单个功能基因提高抗逆性的局限性，使植物抗逆特性的大幅度提高成为可能。因此FaDREB1为基因工程改良植物耐逆性提供了一条全新的技术途径，尤其在草坪草抗逆性的综合改良过程中具有广泛的应用前景和巨大的经济价值。

附图说明

图1A为冷处理下高羊茅总RNA的琼脂糖凝胶检测结果。

图1B为盐处理下高羊茅总RNA的琼脂糖凝胶检测结果。

图1C为干旱处理下高羊茅总RNA的琼脂糖凝胶检测结果。

图2A为冷处理下高羊茅FaDREB1 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶检测结果。

图2B为盐处理下高羊茅FaDREB1 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶检测结果。

图2C为干旱处理下高羊茅FaDREB1 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶检测结果。

图3A为冷处理下高羊茅actin RT-PCR产物的琼脂糖凝胶检测结果。

图3B为盐处理下高羊茅actin RT-PCR产物的琼脂糖凝胶检测结果。

图3C为干旱处理下高羊茅actin RT-PCR产物的琼脂糖凝胶检测结果。

图4为0mM 3-AT条件下，高羊茅FaDEREB1酵母单杂交功能鉴定结果。

图5为20mM 3-AT条件下，高羊茅FaDEREB1酵母单杂交功能鉴定结果。

图6为40mM 3-AT条件下，高羊茅FaDEREB1酵母单杂交功能鉴定结果。

具体实施方式

本发明所提出的一种高羊茅DREB类转录因子及其编码基因结合实施例及附图详细说明如下(下述实施例中所用方法如无特别说明均采用《分子克隆实验指南》第三版中公开的常规方法)：

本发明的FaDREB1编码基因的制备方法实施例包括FaDREB1基因的分离和冷、盐和干旱诱导处理下FaDREB1基因的表达模式两部分；其中，所述FaDREB1基因的分离部分，具体包括如下步骤：

1、构建高羊茅冷诱导cDNA文库

1)将禾本科植物高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)的种子浸泡于1％次氯酸钠溶液中消毒20分钟后，用无菌水洗三遍，播于1/2MS固体培养基(pH5.8)中。在25℃，16小时/8小时(光/暗)的条件下培养14天后，取幼苗洗净，将其根部置于蒸馏水中4℃下处理5小时，然后将经过处理的幼苗立即用液氮速冻，-80℃保存用于总RNA的提取。

2)用Trizol法(Trizol购于GIBCO公司)提取步骤1)保存的受冷诱导5小时的高羊茅植株的总RNA，用PolyATtract mRNA Isolation Systems(Promega公司)从上述高羊茅植株的总RNA中分离出mRNA；再以此mRNA为模板，用ZAP Express cDNA SynthesisKit(Stratagene公司)合成其cDNA；最后，将获得的cDNA两端分别加上EcoR I和XhoI接头后，将其***到λ-ZAP载体(Stratagene)的EcoR I和Xho I酶切位点之间，再用ZAP Express cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit(Stratagene公司，参见试剂盒说明书中的Gigapack III Gold封装混合法)构建出受冷诱导的高羊茅cDNA文库。

2、从高羊茅冷诱导cDNA文库中分离FaDREB1基因

1)根据已报道的DREB基因序列设计一对特异性兼并引物，引物序列为：引物1(正向引物)：5’-GAGACGC(A)GG(C)CACCCGG(C)TGTT(A)-3’；引物2(反向引物)：5’-GGCGGAGTCGGCGAAGTTA(G)AG-3’；以步骤1中受冷诱导5小时的2μg高羊茅幼苗总RNA为模板，在引物1和引物2的引导下，用RT-PCR的方法(RT-PCR Kit，TaKaRa)扩增得到高羊茅DREB基因AP2保守区的cDNA片段；其中，

2)以步骤1)获得的AP2保守区的cDNA片段为探针，用常规方法从步骤1构建的冷诱导cDNA文库中筛选出多个阳性克隆，用377 DNA Sequencer(ABI PRISM)对获得的多个阳性克隆进行序列测定，与已报道的DREB基因序列进行序列比对，从中得到高羊茅DREB的cDNA序列，该cDNA序列全长为864bp，具有序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列，5’端的非翻译区长度为4bp，3’端的非翻译区长度为143bp，其编码序列(开放阅读框架)长度为717bp，是自SEQ ID №：2的5’端的第5-721位碱基，其编码序列编码具有序列表中SEQ ID №：1(238个氨基酸残基)的氨基酸残基序列的蛋白质。将高羊茅的DREB基因命名为FaDREB1，编码蛋白命名为FaDREB1。对FaDREB1进行生物信息学分析，结果表明：FaDREB1具有DREB蛋白家族的特征，其中自N端第58-115位为EREBP/AP2保守结构域。

所述冷、盐和干旱诱导处理下FaDREB1基因的表达模式部分，具体包括如下步骤：

1、分别对第一部分中培养的高羊茅幼苗进行冷诱导、盐诱导和干旱诱导处理，处理方法如下：1)冷诱导处理：高羊茅幼苗置于4℃光照培养箱处理，其根部置于蒸馏水中；2)盐诱导处理：高羊茅幼苗的根部置于250mM NaCl溶液中进行处理；3)干旱诱导处理：高羊茅幼苗置于超净工作台上风干处理，湿度为50％；分别于处理后0、1、2、4、8、12和24小时对经上述不同方法诱导处理的高羊茅幼苗间隔取样，然后将样品立即用液氮速冻，-80℃保存用于提取总RNA。用Trizol法(Trizol购于GIBCO公司)提取上述不同样品的总RNA，并用1.0％琼脂糖凝胶电泳对不同样品的总RNA进行检测，检测结果如图1A，B，C所示(泳道0、1、2、4、8、12和24分别表示第0、1、2、4、8、12和24小时采集的样品的总RNA)。

2、用RT-PCR法分析冷、盐、干旱诱导条件下FaDREB1基因的表达模式

分别以步骤1提取的不同样品的总RNA为模板，在引物3(正向引物)：5’-ATGTGCGGGATCAAGCGA-3’和引物4(反向引物)：5’-GGCGCCAACTAGCTAGCTCT-3’的引导下，用One-step realtime RT-PCR kit(TaKaRa)进行RT-PCR反应检测在冷、盐和干旱诱导条件下FaDREB1的表达模式，并在引物5(正向引物)：5’-CAACTGGGATGAC(t)ATGGAGA-3’和引物6(反向引物)：5’-CCA(g)ATCCAGACACTGTACTTCC-3’引导下，用同样的参数条件及反应条件下PCR扩增高羊茅的看家基因肌动蛋白actin基因(内参)，RT-PCR反应体系为：RNase Free H₂O 10.5μl，10×One step RNA PCR缓冲液2.5μl，dNTP混合物(各10mM)2.5μl，MgCl₂(25mM)5μl，RNase Inhibitor(40U/μl)0.5μl，M-MLV RTase(25U/μl)0.5μl，TaKaRa Ex Taq HS(5U/μl)0.5μl，引物3和引物4(各10μM)各1μl，总RNA 1μg；反应条件：先50℃ 30分钟，94℃ 2分钟；再94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 60秒，进行22个循环；最后72℃ 5分钟。将PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2A，B，C和图3A，B，C所示(泳道0、1、2、4、8、12和24分别表示第0、1、2、4、8、12和24小时采集的样品的RT-PCR产物，图2A，B，C示目的条带，图3A，B，C示actin基因，表明FaDREB1受低温、干旱和高盐诱导表达。

FaDREB1转录激活载体的构建和FaDREB1转录激活功能的检测，包括如下步骤：

1)以上述步骤1提取的高羊茅总RNA为模板，经反转录成cDNA后，在引物7(正向引物)：5’-AATGTGCGGGATCAAGCGA-3’和引物8(反向引物)：5’-AGGCGCCAACTAGCTAGCTCT-3’的引导下，用高保真Pfu DNA聚合酶(Promega公司)通过PCR法获得FaDREB1的编码区；其中，

2)将步骤1)获得的FaDREB1的编码区片段克隆到载体pGEM-T easy(Promega公司)上，获得重组载体，经测序检测无误后，用限制性内切酶SpeII和NotI从重组载体上切下FaDREB1的编码区片段，并将其与用相同酶酶切的YEpGAP112(ATCC公司)连接获得重组载体，命名为FaDREB1/YEpGAP112，经检测无误后，将重组载体FaDREB1/YEpGAP112分别转化到含双报道子(HIS3和LacZ)的含野生型DRE元件酵母菌株4271和含突变型DRE元件酵母菌株4271(Clontech公司，Liu等构建，Plant Cell，1998，10(8)：1391-1406)中，再将转化有重组载体FaDREB1/YEpGAP112的重组酵母菌株涂于含有3-AT(浓度分别为0mM，20mM，40mM)的SD-Agar三缺固体培养基(His^-，Trp^-，Ura^-，Clontech公司)上检测其生长情况。

同时以含拟南芥DREB1A的重组载体DREB1A/YEpGAP112(Liu等构建，Plant Cell，1998，10(8)：1391-1406)为对照，将其分别转化到含双报道子(HIS3和LacZ)的含野生型DRE元件酵母菌株4271和含突变型DRE元件酵母菌株4271(Clontech公司，Liu等构建，Plant Cell，1998，10(8)：1391-1406)中，再将转化有重组载体DREB1A/YEpGAP112的重组酵母菌株分别涂于含有3-AT(浓度分别为0mM，20mM，40mM)的SD-Agar三缺固体培养基(His^-，Trp^-，Ura^-，Clontech公司)上检测其生长情况。

结果如图4-6所示。1为拟南芥DREB1A在含野生型DRE元件酵母中；2为FaDRBEB1基因在含野生型DRE元件酵母中；3为野生型酵母对照；4为拟南芥DREB1A基因在含突变型DRE元件酵母中；5为FaDRBEB1基因在含突变型DRE元件酵母中；6为突变型酵母对照。结果表明含FaDREB1和野生型DRE元件的酵母菌株在3-AT-SD-Agar三缺培养基上生长良好，而含FaDREB1和突变型DRE元件的酵母菌株在3-AT-SD-Agar三缺培养基上不能生长。说明FaDREB1可特异结合DRE元件，从而激活下游目的基因的表达，具有调控草坪草高羊茅抗逆性应答的功能。

序列表

SEQ ID №：1

<110>1

<111>238

<112>Protein

<113>高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)

<200>1

1 MetCysGlyIleLysArgGluMetSerGlyGluSerGlyLeuSerCysSerGlyGluTyr

21 HisSerProSerThrSerProGluGlnGlnGlnGlyHisSerGlnLysGlnThrAlaTrp

41 MetLysArgProAlaGlyArgThrLysPheArgGluThrArgHisProValPheArgGly

61 ValArgArgArgGlyAsnAlaGlyArgTrpValCysGluValArgValProGlyArgArg

81 GlySerArgLeuTrpValGlyThrPheAspThrAlaGluIleAlaAlaArgAlaHisAsp

101 AlaAlaMetLeuAlaLeuAlaAlaGlyAspAlaCysLeuAsnPheAlaAspSerAlaGlu

121 LeuLeuAlaValProAlaSerTyrArgAsnLeuAlaGluValArgHisAlaValThrGlu

141 AlaValGluAspPheGluArgArgGlnGluLeuGlyGluLysAspSerLeuSerGlyThr

161 SerSerSerThrProSerSerSerSerLeuThrAspAspGluGluAlaSerSerGlnAla

181 AspAsnSerProPheGluLeuGluValLeuSerAspMetGlyTrpAspLeuTyrTyrSer

201 SerLeuAlaGlnGlyMetMetLeuMetAlaProProPheLeuAlaAlaSerAlaAlaPhe

221 GlyAspTyrGlyGluValAsnLeuAlaAspValProLeuTrpSerTyrGlnSer***

SEQ ID №：2

<310>1

<311>864

<312>mRNA

<313>高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)

<400>1

1 GAAGATGTGC GGGATCAAGC GAGAGATGAG CGGGGAGTCA GGCTTGTCGT GCAGCGGGGA

61 GTATCACTCG CCCTCGACCT CGCCGGAGCA GCAGCAGGGG CACAGTCAGA AGCAGACGGC

121 GTGGATGAAG CGGCCGGCGG GGCGGACAAA GTTCAGGGAG ACGCGGCACC CGGTGTTCCG

181 CGGCGTGCGG CGCAGGGGCA ATGCCGGGCG TTGGGTGTGC GAGGTGCGGG TGCCAGGGCG

241 GCGTGGAAGC AGGCTCTGGG TCGGCACCTT CGACACCGCT GAGATCGCCG CACGCGCGCA

301 CGACGCCGCC ATGCTCGCCC TGGCCGCGGG CGATGCCTGC CTCAACTTCG CCGACTCCGC

361 CGAGCTGCTC GCCGTGCCGG CATCCTACCG CAACCTCGCG GAGGTCCGCC ACGCCGTCAC

421 CGAGGCCGTC GAGGACTTCG AGCGGCGCCA GGAGCTCGGC GAGAAGGACT CTCTTTCCGG

481 CACGTCTTCT TCGACGCCCT CCTCCTCCTC CCTCACCGAC GACGAGGAGG CGTCTTCGCA

541 GGCCGACAAT TCGCCGTTCG AGCTGGAAGT CCTCAGTGAT ATGGGATGGG ACCTGTACTA

601 CTCCAGCTTA GCGCAGGGAA TGATGCTCAT GGCGCCGCCT TTCTTGGCTG CGTCTGCGGC

661 GTTCGGCGAT TACGGCGAGG TCAACCTCGC CGATGTGCCG CTCTGGAGCT ACCAGAGCTA

721 GCTAGTTGGC GCCACTTCAA AAATCCTCCT TTTTTTTTCA TGTCTTGGCT TCCGATGCCA

781 AATTTTGGTG CTGTACGGTC ACTGCTTGCA GTTTCTGGGT AATGTGATTG TGCAAATTCA

841 GGAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA

Claims

1、一种高羊茅干旱应答元件结合蛋白类转录因子，其特征在于，该转录因子的氨基酸序列如序列表SEQ ID №：1所示。

2、根据权利要求1所述的转录因子，其特征在于：序列表中SEQ ID №：1的自氨基端第58-115位为EREBP/AP2结构域。

3、编码权利要求1所述的转录因子的基因，其核苷酸序列选自下组之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的核苷酸序列；

4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述编码序列为自序列表中SEQ ID №：2的5’端第5-721位核苷酸。

5、根据权利要求3所述的基因在培育抗逆性提高的植物中的应用。