CN1290579C

CN1290579C - 重组***病毒vp1融合蛋白疫苗

Info

Publication number: CN1290579C
Application number: CNB2003101001751A
Authority: CN
Inventors: 于永利; 邵明玉; 王丽颖
Original assignee: DIWEIHUAYU BIO-TECHNOLOGY Co Ltd BEIJING
Current assignee: Jinyu Baoling Bio-pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2003-10-15
Filing date: 2003-10-15
Publication date: 2006-12-20
Anticipated expiration: 2023-10-15
Also published as: CN1607004A; WO2005034993A1

Abstract

本发明提供了重组***病毒VP1融合蛋白疫苗，它是将***病毒VP1肽段、2聚甘氨酸、6聚组氨酸编码基因融合，在大肠杆菌生产的重组融合蛋白。本发明提供了重组***病毒VP1融合蛋白的氨基酸序列及其核苷酸序列。本发明还提供了重组***病毒VP1融合蛋白预防***病毒感染的作用。

Description

重组***病毒VP1融合蛋白疫苗

发明领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及基因工程重组蛋白疫苗，特别是涉及一种预防动物***病毒感染的重组***病毒VP1融合蛋白疫苗(下文有时也称为重组***病毒VP1融合蛋白)。它是将***病毒VP1肽段、2聚甘氨酸、6聚组氨酸编码基因融合，在大肠杆菌生产的重组融合蛋白，在应用于动物机体后可以诱发机体产生针对***病毒的中和性抗体，具有预防动物***病毒感染的生物学活性。

发明背景

***(foot-and-mouthdisease，FMD)是由***病毒引起的烈性传染病。猪、牛、羊都可感染***病毒而发生***，轻者在口、舌、唇、蹄、***等部位出现水泡、破溃及烂斑等病变，重者发生死亡。***的发生和流行会造成巨大的直接和间接的经济损失[江鹏斐，1999]。国际兽疫局(OIE)将***列为A类家畜传染病。世界各国对预防和控制***都十分重视。除屠杀感染***的家畜外，接种疫苗是预防和控制***的主要措施[M.Woolhouse，2001]。传统的***疫苗由灭活的初步纯化的***病毒加油佐剂乳化制成的灭活苗，对易感家畜有相当的保护作用，但存在灭活不充分而引发***的可能。此外，在生产这种疫苗过程中动用的有活力的***病毒是一种不可忽视的潜在传染源。

二十世纪80年代初以来，许多国家投入了大量人力、物力和财力研制新型***疫苗，如重组蛋白疫苗，合成肽疫苗，活载体疫苗和DNA疫苗等[Broekhuigsen M P，1987；MorganD O，1990；Ward，G.，1997；Berinstein A，2000]。一些疫苗显示了较好的效果，但大部分仍在实验室的探索之中。

***病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)是***的病原体，是小RNA病毒科(Picornaviridae)***病毒属(Aphthovirus)的成员，现已发现了7个血清型，即0、A、C型(称欧洲型)，SAT1、SAT2、SAT3型(南非1、2、3型，也称非洲型)和AsiaI型(亚洲I型，称亚洲型)。O型***病毒是近年来世界范围内流行较广的血清型。研究表明，针对的体液免疫在肌体抗***病毒感染中起主要作用。在家畜体内，***病毒中和抗体的水平与其抵抗***病毒攻击的能力呈明显的正相关关系[Pay TW，1987]。基于这种观察，许多实验室做了大量实验，在***病毒上寻找能刺激机体产生病毒中和抗体的靶点，发现在***病毒的外壳蛋白(VP)存在五个侯选的结构[Crowther JR，1993；Kitson JD，1990]，其中的三个位于外壳蛋白1(Vp1)中。实验证明，从***病毒中分离出的Vp1蛋白具有良好的免疫原性[Bachrach HL，1975：Kleid DG，1981；Strohmaier K，1982；Rodriguez A，1994]。

用Vp1蛋白的肽段(141-160和200-213)免疫豚鼠和牛产生的中和性抗体能保护动物免于感染***病毒[Bittle JL，1982；Pfaff E，1982；DiMarchi R，1986]。VP1 140-160氨基酸构成的“环”状结构暴露在病毒表面，其中的R-G-D序列在***病毒高度保守，是***病毒结合细胞表面受体的关键结构，可能介导***病毒进入被感染的细胞[JacksonT，2002；Almeida MR，1998]。依据VP1环状结构合成的肽段能诱导产生高水平的中和抗体。也有研究表明，用从***病毒分离出来的或基因工程方法得到的Vp1蛋白免疫动物，可以产生部分保护作用。通过基因工程手段把Vp1蛋白与某些来源于其他微生物的蛋白融合在一起可以提高Vp1蛋白的免疫原性[Clarke BE，1987：Corchero JL，1996]。

参考文献：

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发明内容

本发明的一方面是提供一种重组***病毒VP1融合蛋白疫苗，它是将***病毒VP1肽段、2聚甘氨酸和6聚组氨酸编码基因融合，在大肠杆菌生产的重组融合蛋白。

本发明的另一方面提供了重组***病毒VP1融合蛋白的氨基酸序列及其核苷酸序列。

本发明的另一方面提供了***病毒VP1BT1融合肽的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。

本发明的另一方面提供了***病毒VP1BT2融合肽的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。

本发明的另一方面提供了***病毒VP1BT1融合肽的连接方式，包括2聚甘氨酸的存在、连接方式及位置。

本发明的另一方面提供了***病毒VP1BT2融合肽的连接方式，包括2聚甘氨酸的存在、连接方式及位置。

本发明的另一方面提供了两侧有6聚组氨酸的***病毒VP1肽段融合蛋白。

本发明的另一方面涉及重组***病毒VP1融合蛋白按照权利要求1所述的重组***病毒VP1融合蛋白，它在应用于动物机体后可以诱发机体产生针对***病毒的中和性抗体，具有预防动物***病毒的感染的生物学活性。

另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其它具有实质性特点的方面和其它具有创造性的有益效果对本领域的普通技术人员来说是显而易见的。

附图简要说明

附图1：表达的重组***病毒VP1融合蛋白SDS-PAGE电泳图

附图2：纯化的重组***病毒VP1融合蛋白SDS-PAGE电泳图

附图3：重组***病毒VP1融合蛋白免疫豚鼠(1)血清对乳鼠的保护作用

附图4：重组***病毒VP1融合蛋白免疫豚鼠(2)血清对乳鼠的保护作用

附图5：重组***病毒VP1融合蛋白免疫豚鼠(3)血清对乳鼠的保护作用

具体实施方式

在本发明的上下文中，所使用的术语除非另外说明，一般具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。特别地，下列术语具有如下的含义：

重组蛋白疫苗：是利用分子克隆技术，将编码具有免疫原性的蛋白或多肽的基因克隆到原核或真核细胞的表达载体上，用此载体在细菌或真核细胞(酵母细胞或哺乳动物细胞)生产的具有免疫原性的蛋白质或多肽，这种蛋白质或多肽在应用于机体后可刺激机体(人或动物)发生特异性的体液免疫应答和/或细胞免疫应答。若将病毒如***病毒基因编码的具有免疫原性的蛋白或多肽的基因克隆到原核或真核细胞的表达载体上，用其在细菌或真核细胞(酵母细胞或哺乳动物细胞)生产的由病毒基因编码的蛋白质或多肽是具有抗病毒如***病毒作用的重组蛋白疫苗。这种疫苗在应用于动物后可诱导机体发生特异性的体液免疫应答和/或细胞免疫应答，防止病毒如***病毒引起的感染。

动物的***病毒(FMDV)感染：是由FMDV引起的偶蹄类动物共患的接触性传染病。FMDV是一种RNA病毒，其基因组约包含7500-8000个碱基。FMDV主要以唾液的方式传播，传播的速度很快，易引发大面积的流行。牛、猪、羊、鹿等均为***病毒的感染动物。

***病毒VP1抗原：是FMD病毒壳蛋白的一部分，它可诱导机体产生具有保护作用的***病毒中和抗体。

***病毒VP1肽段包括***病毒VP1BT1融合肽和***病毒VP1BT2融合肽

***病毒VP1BT1融合肽是指具有如SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的多肽。

GGVSNVRGDLQVLAQKAERALPGGEENYGGETQVQRRQHTDISFILDRFVKVTP(SEQ ID NO 2)。

***病毒VP1 BT2融合肽是指具有是指具有如SEQ ID NO 4所示氨基酸序列的多肽。

GGVSNVRGDLQVLAQKAKRALPGGPSDARHKQKIVAPAKQLLNFDL(SEQ ID NO4)氨基酸序列的肽段。

2聚甘氨酸是有2个相邻的甘氨酸组成的2肽。

***病毒VP1肽段融合蛋白编码基因是指具有如SEQ ID NO5所示的核苷酸序列的DNA，其编码的蛋白质为***病毒VP1肽段融合蛋白。

重组***病毒VP1融合蛋白疫苗编码基因具有如SEQ ID NO8所示的核苷酸序列，其编码的蛋白质为重组***病毒VP1融合蛋白疫苗或称重组***病毒VP1融合蛋白，它具有如SEQ ID NO 9所示的氨基酸序列。

本发明提供了一种重组***病毒VP1融合蛋白疫苗，它是将***病毒VP1肽段、2聚甘氨酸、6聚组氨酸编码基因融合，在大肠杆菌生产的重组融合蛋白。本发明的重组***病毒VP1融合蛋白疫苗具有SEQ ID NO8所示的核苷酸序列和SEQ ID NO9所示的氨基酸序列。

本发明提供的重组***病毒VP1融合蛋白中的***病毒VP1BT1融合肽具有SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。

本发明提供的重组***病毒VP1融合蛋白中的***病毒VP1BT2融合肽具有SEQ IDNO：3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列。

本发明提供的重组***病毒VP1融合蛋白中的***病毒VP1肽段融合蛋白编码基因具有如SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列，其编码的蛋白质为***病毒VP1肽段融合蛋白。

本发明提供的重组***病毒VP1融合蛋白中的***病毒VP1BT1融合肽具有SEQ IDNO：2所示的连接方式，包括2聚甘氨酸的存在、连接方式及位置。

本发明提供的重组***病毒VP1融合蛋白中的***病毒VP1BT2融合肽具有SEQ IDNO：4所示的连接方式，包括2聚甘氨酸的存在、连接方式及位置。

本发明提供的重组***病毒VP1融合蛋白中的***病毒VP1肽段融合蛋白具有如SEQID NO：5所示的连接方式。

本发明提供的重组***病毒VP1融合蛋白中的***病毒VP1肽段融合蛋白的两侧有6聚组氨酸的序列。

本发明提供的重组***病毒VP1融合蛋白采用大肠杆菌生产。

本发明提供的重组***病毒VP1融合蛋白在应用于动物后可以诱发机体产生针对***病毒的中和性抗体，具有预防动物***病毒的感染的生物学活性。

本发明还涉及该基因工程重组蛋白在制备用于预防动物***病毒的感染的疫苗制品中的用途以及含有该基因工程重组蛋白的疫苗制品。本领域技术人员可以理解的是，这些疫苗制品可用本领域周知的各种常规方法制备。

本发明的重组蛋白疫苗可通过皮下注射的方式给动物接种，接种的剂量为100-5000μg。为了加强效果，可在第一次免疫后14或21天进行1次加强免疫。

下面结合具体的制备实施例和生物学效果实施例，并参照附图进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例

在如下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，例如Molecular Cloning一书(J.Sambrook，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecularcloning，1989)所述的方法。

实施例1、合成VP1BT1融合肽编码基因

采用PCR方法合成VP1 BT1融合肽编码基因。设计并合成了具有下述序列的PCR引物：

引物1：′CTGCAAGTACTGGCTCAAAAAGCAGAACGTGCTCTGCCGGGTGGCGAAGAAAACTACGGTGGT3′

引物2：5′TGAAGGAGATGTCAGTGTGCTGACGACGCTGAACCTGAGTTTCACCACCGTAGTTTTCTTCGCC3′

引物3：5′GAATTCAGATCTGGCGGTGTATCTAACGTACGTGGTGACCTGCAAGTACTGGCTCAA3′

引物4：5′AAGCTTCCCGGAGTAACTTTAACGAAACGGTCCAGGATGAAGGAGATGTCAGTGTG3′

采用引物1，2合成具有下述序列的DNA片段(片段1，2)：

CTGCAAGTAC TGGCTCAAAA AGCAGAACGT GCTCTGCCGG GTGGCGAAGA AAACTACGGT GGTGAAACTC

AGGTTCAGCG TCGTCAGCAC ACTGACATCT CCTTCA

以片段1，2为摸板，采用引物3，4合成两侧带限制性内切酶切点的VP1 BT1融合肽编码基因，其序列(SEQ ID NO：1)如下：

GAATTCAGAT CTGGCGGTGT ATCTAACGTA CGTGGTGACC TGCAAGTACT GGCTCAAAAA GCAGAACGTG

CTCTGCCGGG TGGCGAAGAA AACTACGGTG GTGAAACTCA GGTTCAGCGT CGTCAGCACA CTGACATCTC

CTTCATCCTG GACCGTTTCG TTAAAGTTAC TCCGGGATCC

AAGCTT

采用的PCR操作程序是：

在一500μl微量离心管中加入下列试剂：

10×PCR缓冲液 5μl

(500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-Cl，

15mmol/L MgCl₂)

dNTPs(10mmol/L) 1μl

5’端和3’端引物(0.01mmol/L)各 0.5μl

Taq DNA聚合酶(5u/μl) 0.25μl

加去离子水至终体积 50μl

混合后加入矿物油 3滴

反应条件：94℃，30″；55℃，1’；72℃，2’，30个循环周期后，72℃延伸10分钟。

将PCR产物做2％琼脂糖凝胶电泳(1xTAE，150-200mA，0.5小时)。采用北京鼎国公司的DNA回收试剂盒回收用PCR合成的VP1 BT1融合肽编码基因DNA片段。从琼脂糖凝胶上切下含DNA片段的凝胶，放入一离心管中。加入3倍体积的溶胶液(北京鼎国公司)，45-55℃水浴5-10min使胶完全融化。加入10ul玻璃奶(北京鼎国公司)，轻弹管底混匀，然后在45-55℃水浴5-10min，期间每2-3min混匀一次。5000g离心60秒，弃上清。加400ul漂洗液，轻弹管底混匀玻璃奶，然后同上离心，弃上清。再加入400ul漂洗液，轻弹管底混匀玻璃奶，然后同上离心弃上清，并用加样器尽量除净漂洗液。然后室温晾干玻璃奶。加10-30μl无菌双蒸水将玻璃奶悬浮起来，45-55℃水浴5-10分钟。10000g离心2min，回收上清(含VP1 BT1融合肽编码基因DNA片段)备用。

将VP1 BT1融合肽编码基因DNA片段克隆入pMD18-T Vect质粒(TakaRa公司)。

连接反应体系：

VP1 BT1融合肽编码基因DNA片段(序列参见SEQ ID NO：1)0.05-0.3pmol

pMD18-T Vect(TakaRa公司) 0.5-1μl

Solution I(TakaRa公司) 5μl

双蒸水加齐到10μl

16℃反应1小时

将克隆有VP1 BT1融合肽编码基因DNA片段的pMD18-T Vect质粒转化入大肠杆菌JM109(Novagen公司)。

感受态大肠杆菌JM109细胞的制备方法是：取一大肠杆菌JM109单菌落于2ml LB培养基中，37℃，225rpm速度震荡培养12-16小时；取1ml上述培养物接种于100ml LB培养基中，37℃C，225rpm的速度震荡培养直至OD值为0.5左右(大约3小时)；将菌液冰浴2小时，然后2,500×g，4℃离心20分钟收集菌体；加入100ml冰冷的Trituration缓冲液(100mmol/LCaCl2，70mmol/L MgCl2，40mmol/L醋酸钠，pH5.5)，混匀，置冰上45分钟；1,800×g，4℃离心10分钟，弃上清，加入10ml冰冷的Trituration缓冲液悬浮细胞；按每份200μl分装，4℃可保存1-2周。若需长期保存，可加甘油至终浓度为15％，置-70℃备用。

转化的方法是：将200μl感受态细胞置冰上融化，然后加入3μl DMSO或β-巯基乙醇，混合后，加入2μl连接反应液(含重组质粒)，混匀，置冰上30分钟；42℃45秒，然后迅速放回冰中1-2分钟；加入2ml LB培养液，37℃，225rpm的速度摇荡培养1小时；4,000×g离心10秒钟，弃上清，用200μl LB培养液重悬菌体；将菌液铺于含有抗生素的LB琼脂培养板上，涂匀，室温放置20-30分钟，倒置于37℃孵箱中培养12-16小时。

挑选阳性克隆，提取质粒(J.Sambrook，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)。

实施例2、合成VP1BT2融合肽编码基因

引物7：5′GTGACCTGCAAGTACTGGCTCAAAAAGCTAAACGTGCTCTGCCGGGTGGTCCGTCT3′

引物8：5′CGGAGCAACGATTTTCTGTTTGTGACGAGCGTCAGACGGACCACCCGGCA3′

引物9：5′CCATGGAATTCAGATCTGGTGGTGTTTCTAACGTTCGTGGTGACCTGCAAGTACTGGC3′

引物10：5′AAGCTTGGATCCCAGGTCGAAGTTCAGCAGCTGTTTAGCCGGAGCAACGATTTTCTG3′

采用引物7，8合成具有下述序列的DNA片段(片段7，8)：

GTGACCTGCA AGTACTGGCT CAAAAAGCTA AACGTGCTCT GCCGGGTGGT CCGTCTGACG CTCGTCACAA

ACAGAAAATC GTTGCTCCG

以片段7，8为摸板，采用引物9，10合成两侧带限制性内切酶切点的VP1 BT2融合肽编码基因，具有如SEQ ID NO：3所示的如下序列：

CCATGGAATT CAGATCTGGT GGTGTTTCTA ACGTTCGTGG TGACCTGCAA GTACTGGCTC AAAAAGCTAA

ACGTGCTCTG CCGGGTGGTC CGTCTGACGC TCGTCACAAA CAGAAAATCG TTGCTCCGGC TAAACAGCTG

CTGAACTTCG ACCTGGGATC CAAGCTT

采用的PCR操作程序和实施例1类同。回收、克隆VP1BT2融合肽编码基因的方法和实施例1类同。将含VP1BT2融合肽编码基因的pMD18-T Vect质粒转化入感受态大肠杆菌JM109细胞(方法类同于实施例1)。挑选阳性克隆，提取质粒(J.Sambrook，Cold Spring HarborLaboratory Press，Molecular cloning，1989)。

实施例3、构建VP1肽段融合蛋白编码基因

用BamHI消化pMD18-T Vect质粒上的VP1BT1融合肽编码基因，用Bg1II消化pMD18-TVect质粒上的BT2融合肽编码基因，用T4连接酶将两个消化片段连接得到BT1融合肽编码基因-BT2融合肽编码基因融合基因(SEQ ID NO：5)，其序列如下：

GAATTCAGAT CTGGCGGTGT ATCTAACGTA CGTGGTGACC TGCAAGTACT GGCTCAAAAA GCAGAACGTG

CTCTGCCGGG TGGCGAAGAA AACTACGGTG GTGAAACTCA GGTTCAGCGT CGTCAGCACA CTGACATCTC

CTTCATCCTG GACCGTTTCG TTAAAGTTAC TCCGGGATCT GGTGGTGTTT CTAACGTTCG TGGTGACCTG

CAAGTACTGG CTCAAAAAGC TAAACGTGCT CTGCCGGGTG GTCCGTCTGA CGCTCGTCAC AAACAGAAAA

TCGTTGCTCC GGCTAAACAG CTGCTGAACT TCGACCTGGG ATCCAAGCTT

用BamHI和Bg1II分别消化VP1 BT1融合肽编码基因-VP1 BT2融合肽编码基因融合基因，得到BamHI消化的VP1 BT1融合肽编码基因-VP1 BT2融合肽编码基因融合基因片段和Bg1II消化的VP1 BT1融合肽编码基因-VP1 BT2融合肽编码基因融合基因片段，用T4连接酶将两个消化片段连接得到VP1 BT1融合肽编码基因-BT2融合肽编码基因融合基因的2聚体基因(SEQ ID NO：6)，其序列如下：

GAATTCAGAT CTGGCGGTGT ATCTAACGTA CGTGGTGACC TGCAAGTACT GGCTCAAAAA GCAGAACGTG

CTCTGCCGGG TGGCGAAGAA AACTACGGTG GTGAAACTCA GGTTCAGCGT CGTCAGCACA CTGACATCTC

CTTCATCCTG GACCGTTTCG TTAAAGTTAC TCCGGGATCT GGTGGTGTTT CTAACGTTCG TGGTGACCTG

CAAGTACTGG CTCAAAAAGC TAAACGTGCT CTGCCGGGTG GTCCGTCTGA CGCTCGTCAC AAACAGAAAA

TCGTTGCTCC GGCTAAACAG CTGCTGAACT TCGACCTGGG ATCTGGCGGT GTATCTAACG TACGTGGTGA

CCTGCAAGTA CTGGCTCAAA AAGCAGAACG TGCTCTGCCG GGTGGCGAAG AAAACTACGG TGGTGAAACT

CAGGTTCAGC GTCGTCAGCA CACTGACATC TCCTTCATCC TGGACCGTTT CGTTAAAGTT ACTCCGGGAT

CTGGTGGTGT TTCTAACGTT CGTGGTGACC TGCAAGTACT GGCTCAAAAA GCTAAACGTG CTCTGCCGGG

TGGTCCGTCT GACGCTCGTC ACAAACAGAA AATCGTTGCT CCGGCTAAAC AGCTGCTGAA CTTCGACCTG

GGATCCAAGC TT(SEQ ID NO：6)

用BamHI消化VP1 BT1融合肽编码基因-VP1 BT2融合肽编码基因融合基因的2聚体基因，用Bg1II消化VP1 BT1融合肽编码基因-VP1 BT2融合肽编码基因融合基因，用T4连接酶将两个消化片段连接得到VP1 BT1融合肽编码基因-VP1 BT2融合肽编码基因融合基因的3聚体基因(SEQ ID NO：7)，其序列如下：

GAATTCAGAT CTGGCGGTGT ATCTAACGTA CGTGGTGACC TGCAAGTACT GGCTCAAAAA GCAGAACGTG

CTCTGCCGGG TGGCGAAGAA AACTACGGTG GTGAAACTCA GGTTCAGCGT CGTCAGCACA CTGACATCTC

CTTCATCCTG GACCGTTTCG TTAAAGTTAC TCCGGGATCT GGTGGTGTTT CTAACGTTCG TGGTGACCTG

CAAGTACTGG CTCAAAAAGC TAAACGTGCT CTGCCGGGTG GTCCGTCTGA CGCTCGTCAC AAACAGAAAA

TCGTTGCTCC GGCTAAACAG CTGCTGAACT TCGACCTGGG ATCTGGCGGT GTATCTAACG TACGTGGTGA

CCTGCAAGTA CTGGCTCAAA AAGCAGAACG TGCTCTGCCG GGTGGCGAAG AAAACTACGG TGGTGAAACT

CAGGTTCAGC GTCGTCAGCA CACTGACATC TCCTTCATCC TGGACCGTTT CGTTAAAGTT ACTCCGGGAT

CTGGTGGTGT TTCTAACGTT CGTGGTGACC TGCAAGTACT GGCTCAAAAA GCTAAACGTG CTCTGCCGGG

TGGTCCGTCT GACGCTCGTC ACAAACAGAA AATCGTTGCT CCGGCTAAAC AGCTGCTGAA CTTCGACCTG

GGATCTGGCG GTGTATCTAA CGTACGTGGT GACCTGCAAG TACTGGCTCA AAAAGCAGAA CGTGCTCTGC

CGGGTGGCGA AGAAAACTAC GGTGGTGAAA CTCAGGTTCA GCGTCGTCAG CACACTGACA TCTCCTTCAT

CCTGGACCGT TTCGTTAAAG TTACTCCGGG ATCTGGTGGT GTTTCTAACG TTCGTGGTGA CCTGCAAGTA

CTGGCTCAAA AAGCTAAACG TGCTCTGCCG GGTGGTCCGT CTGACGCTCG TCACAAACAG AAAATCGTTG

CTCCGGCTAA ACAGCTGCTG AACTTCGACC TGGGATCCAA GCTT(SEQ ID NO：7)。

VP1 BT1融合肽编码基因-VP1BT2融合肽编码基因融合基因的3聚体基因既为VP1肽段融合蛋白编码基因。

将VP1肽段融合蛋白编码基因克隆入pMD18-T Vect质粒，采用的方法和实施例1所用的类同。将含VP1肽段融合蛋白编码基因的pMD18-T Vect质粒转化入感受态大肠杆菌JM109细胞(方法类同于实施例1)。挑选阳性克隆，提取质粒(J.Sambrook，Cold Spring HarborLaboratory Press，Molecular cloning，1989)。

实施例4、构建重组***病毒VP1融合蛋白编码基因

用EcoRI和HindIII消化含VP1肽段融合蛋白编码基因(SEQ ID NO：5)的pMD18-T Vect质粒和pET28质粒。

含VP1肽段融合蛋白编码基因(SEQ ID NO：5)的pMD18-T Vect质粒DNA的消化反应：

质粒DNA 1μg

10×缓冲液(10×M buffer Lot：A1032，TaKaRa) 1μl

限制性内切酶HindIII(10单位/μl) 1μl

限制性内切酶EcoRI(10单位/μl) 1μl

用双蒸水补齐至 10μl

混合后于37℃温育30-120分钟。

pET-28a(+)质粒的消化反应：

质粒DNA 1μg

10×缓冲液(10×K buffer Lot：A1018，TaKaRa) 1μl

限制性内切酶EcoRI(10单位/μl) 1μl

限制性内切酶HindIII(10单位/μl) 1μl

用双蒸水补齐至 10μl

混合后，于37℃温育30-120分钟。

将用EcoRI和HindIII消化的VP1肽段融合蛋白编码基因DNA片段和经限制性内切酶EcoRI和HindIII消化的原核细胞表达载体pET-28a(+)质粒(美国Novagen公司)相连接。

连接反应：

pET-28a(+)质粒(0.5μg/μl) 2μl

VP1肽段融合蛋白编码基因DNA片段DNA(300ng/μl) 5μl

10×连接缓冲液

(T4 Ligation Solution Lot：CA2901，TaKaRa) 1μl

T4DNA连接酶(T4 Ligation Code No：D2011A，TaKaRa) 1μl

用双蒸水补齐至 10μl

混合后置14-16℃水浴6-12小时。

将含***病毒VP1肽段融合蛋白编码基因的重组pET-28a(+)质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21(BL21(DE3)。

对pET-28a(+)质粒中的***片段进行DNA测序。利用pET-28a(+)质粒EcoRI和HindIII切点两侧的序列融合出重组***病毒VP1融合蛋白编码基因，其序列(SEQ ID NO：8)如下：

ATGGGCAGCA GCCATCATCA TCATCATCAC AGCAGCGGCC TGGTGCCGCG CGGCAGCCAT ATGGCTAGCA

TGACTGGTGG ACAGCAAATG GGTCGCGGAT CCGAATTCAG ATCTGGCGGT GTATCTAACG TACGTGGTGA

CCTGCAAGTA CTGGCTCAAA AAGCAGAACG TGCTCTGCCG GGTGGCGAAG AAAACTACGG TGGTGAAACT

CAGGTTCAGC GTCGTCAGCA CACTGACATC TCCTTCATCC TGGACCGTTT CGTTAAAGTT ACTCCGGGAT

CTGGTGGTGT TTCTAACGTT CGTGGTGACC TGCAAGTACT GGCTCAAAAA GCTAAACGTG CTCTGCCGGG

TGGTCCGTCT GACGCTCGTC ACAAACAGAA AATCGTTGCT CCGGCTAAAC AGCTGCTGAA CTTCGACCTG

GGATCTGGCG GTGTATCTAA CGTACGTGGT GACCTGCAAG TACTGGCTCA AAAAGCAGAA CGTGCTCTGC

CGGGTGGCGA AGAAAACTAC GGTGGTGAAA CTCAGGTTCA GCGTCGTCAG CACACTGACA TCTCCTTCAT

CCTGGACCGT TTCGTTAAAG TTACTCCGGG ATCTGGTGGT GTTTCTAACG TTCGTGGTGA CCTGCAAGTA

CTGGCTCAAA AAGCTAAACG TGCTCTGCCG GGTGGTCCGT CTGACGCTCG TCACAAACAG AAAATCGTTG

CTCCGGCTAA ACAGCTGCTG AACTTCGACC TGGGATCTGG CGGTGTATCT AACGTACGTG GTGACCTGCA

AGTACTGGCT CAAAAAGCAG AACGTGCTCT GCCGGGTGGC GAAGAAAACT ACGGTGGTGA AACTCAGGTT

CAGCGTCGTC AGCACACTGA CATCTCCTTC ATCCTGGACC GTTTCGTTAA AGTTACTCCG GGATCTGGTG

GTGTTTCTAA CGTTCGTGGT GACCTGCAAG TACTGGCTCA AAAAGCTAAA CGTGCTCTGC CGGGTGGTCC

GTCTGACGCT CGTCACAAAC AGAAAATCGT TGCTCCGGCT AAACAGCTGC TGAACTTCGA CCTGGGATCC

AAGCTTGCGG CCGCACTCGA GCACCACCAC CACCACCACT GA(SEQ ID NO：9)。此基因(1092个碱基)编码由363个氨基酸残基组成的重组***病毒VP1融合蛋白，此重组蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)如下所示：

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSEFRSGGVSNVRGDLQVLAQKAERALPGGEENYGGETQVQRRQHTDI

SFILDRFVKVTPGSGGVSNVRGDLQVLAQKAKRALPGGPSDARHKQKIVAPAKQLLNFDLGSGGVSNVRGDLQVLAQKAE

RALPGGEENYGGETQVQRRQHTDISFILDRFVKVTPGSGGVSNVRGDLQVLAQKAKRALPGGPSDARHKQKIVAPAKQLL

NFDLGSGGVSNVRGDLQVLAQKAERALPGGEENYGGETQVQRRQHTDISFILDRFVKVTPGSGGVSNVRGDLQVLAQKAK

RALPGGPSDARHKQKIVAPAKQLLNFDLGSKLAAALEHHHHHH

实施例5、重组***病毒VP1融合蛋白疫苗的表达及裂菌

将单菌落的细菌接种于100ml LB培养基，于500ml三角烧瓶中，37℃水浴震荡培养至OD600为0.6。加入IPTG使其终浓度为1mM，37℃水浴震荡培养3小时。将三角烧瓶子冰上5分钟，4℃离心5分钟(5000×g)。弃上清，收集细菌，立即使用或冻存。取样做SDS-PAGE分析重组***病毒VP1融合蛋白的表达(附图1)。

将细菌重悬于细胞裂解液(20mM Tris，0.5M NaCl，5mM咪唑，调pH至7.9)中，1克湿菌/3ml细胞裂解液，加DNA酶致终浓度2毫克/毫升，加1mM Mg₂SO₄(10μl/ml)，加50MmPMSF(0.5μl/ml)，冰上孵育30分，5,000rpm，离心15min，弃上清。

对沉淀加结合液，1克湿菌产生的沉淀加6ml结合液(20mM Tris，0.5M NaCl，5mM咪唑，6M尿素，调pH至7.9)。冰浴震摇2小时。5,000rpm，离心30min，收上清，用上清上柱。

施例6、重组***病毒VP1融合蛋白疫苗的纯化

(1)、亲合层析

装柱：

用磷酸盐缓冲液装柱(20mM phosphate，pH 7.2 1M NaCl)，层析介质为Sepharose4B-Ni²⁺(Pharmacia)并平衡。

用5个柱床体积的双蒸水洗柱。

将3-5个柱床体积的20mM金属离子溶液(100mM镍离子溶液的配制：NiSO₄·6H₂O 13.1g，双馏水加到1000ml)加到柱中。

用5个柱床体积的洗脱缓冲液(20mM Tris，pH 7.9，5M NaCl，0.5M咪唑，4M尿素)洗柱。

用5个柱床体积的吸附缓冲液(20mM Tris，pH7.9，0.5M NaCl，5mM咪唑)洗柱。

结合：

将样品加到金属螯合的柱中。

用洗涤1缓冲液(20mM Tris，pH 7.9，0.5M NaCl，20mM咪唑，4M尿素洗柱。

洗脱：

用洗脱2缓冲液(20mM Tris，pH 7.9，0.5M NaCl，1M咪唑，4M尿素)洗脱，收集洗脱的蛋白。直到吸收值不在下降为止，用容器接取不同时段的流出液，并进行SDS电泳，判定纯化效果，纯度可达50％以上。

(2)、除盐

用Sephadex G25(Pharmacia)装柱。

用2个柱床体积的双蒸水洗柱。

用2个柱床体积的10mM PBS，pH 7.2洗柱。

上样。

用10mM PBS，pH 7.2洗脱，

收集洗脱的蛋白，此蛋白为重组***病毒VP1融合蛋白。

冻干保存重组***病毒VP1融合蛋白。

用SDS-PAGE对纯化的重组***病毒VP1融合蛋白进行鉴定，其纯度达95％(见附图2)。

实施例7、重组***病毒VP1融合蛋白的免疫

免疫程序：

三次免疫，间隔14天，初次免疫铝加佐剂，两次加强免疫不加铝佐剂。每次免疫的剂量均为50微克/只/次。设重组***病毒VP1融合蛋白免疫组、***病毒灭活苗(内蒙生物制药厂组)组和PBS对照组，每组3只豚鼠。

配制铝佐剂：

10％12水硫酸铝钾溶液10毫升移入50毫升锥形瓶中。逐滴加入0.25N氢氧化钠22.8毫升，边加入边震荡混匀。

室温孵育10分钟。1000g离心10分钟。弃上清。加入50毫升蒸馏水重悬沉淀的氢氧化铝。

分装上述氢氧化铝悬液至20个离心管中，每管1毫升。1000g离心10分钟.弃上清。

将200微克重组***病毒VP1融合蛋白溶于400微升制备的铝佐剂，吹打混匀，室温孵育20分钟。腹腔注射免疫，100微升/每只豚鼠。

在腹腔注射免疫后第21天，做加强免疫。用PBS溶解重组***病毒VP1融合蛋白，浓度为50微克/0.2毫升。静脉(***静脉)注射，每只豚鼠0.2毫升。对照组豚鼠注射0.2毫升PBS。

在腹腔注射免疫后第42天，做第二次加强免疫。用PBS溶解重组***病毒VP1融合蛋白，浓度为50微克/0.2毫升。静脉(***静脉)注射，每只豚鼠0.2毫升。对照组豚鼠注射0.2毫升PBS。

在腹腔注射免疫后第46天。无菌取豚鼠心脏血。放置于试管中。37℃1小时。4℃倾斜放置过夜，待血清充分析出后，收集血清，无菌分装，-20℃保存。

实施例8、***病毒特异性抗体的检测(ELISA法)

***病毒的纯化在内蒙生物制药厂进行。取经BHK单层细胞培养扩增的新鲜O1型***病毒液(内蒙生物制药厂)，4000转/分离心20分钟，去除细胞碎片。在上清中逐滴加入饱和的聚乙二醇6000至终浓度为7％，边滴加边搅拌，4℃静止过夜。5000转/分离心30分钟，收集沉淀。用pH7.6的PB液将沉淀重悬，在15％-45％的蔗糖密度梯度上进一步纯化(离心力为35000克力，时间为3小时，温度为4℃)。分段取样，用紫外监测仪测各段样品260nm吸收值，146s的病毒颗粒出现在30％-35％的蔗糖中。将其用PB液稀释5倍，在含20％蔗糖的PB液上离心2小时，离心力为35000克力，温度为4℃，收集沉淀。将沉淀用PB液重悬，用BCA法测定纯化的***病毒浓度。

用纯化的***病毒抗原包板。包被液为0.05M，PH值9.6的碳酸盐缓冲液，每孔100μl，含***病毒抗原1μg，4℃包被过夜。用含0.05％吐温20的PBS(PBS-T)洗液洗板3次后，加入封闭液(含2％BSA的PBS-T)200μl于37℃孵箱放置1小时。洗板3次后将稀释(1∶2048)好的待检血清100μl加入各孔，于37℃孵箱放置1小时。设3个复孔。洗板3次，加入酶标抗体(辣根过氧化物酶标记的羊抗豚鼠IgG)工作液，37℃孵育1小时，加入TMB底物溶液及H₂O₂ 37℃放置10-30分钟，用酶标仪测OD值(A492)，用各组OD值的均值和标准差表示结果。

结果：

空白对照：OD值：0.005±0.0005

重组***病毒VP1融合蛋白免疫豚鼠1：1.55±0.013

重组***病毒VP1融合蛋白免疫豚鼠2：1.231±0.021

重组***病毒VP1融合蛋白免疫豚鼠3：1.001±0.013

3只PBS对照组小鼠：0.403±0.014

实验结果表明，重组***病毒VP1融合蛋白免疫豚鼠血清中存在高水平的抗***病毒的抗体。

实施例9、重组***病毒VP1融合蛋白免疫血清的乳鼠中和实验

将2倍倍比稀释待检测血清和***病毒液(100 TCID50/0.1ml)等体积混合，37℃孵育1小时。经乳鼠项背部皮下注射0.2ml上述混合液，连续观察3天，记录各组发病、死亡情况。

乳鼠中和实验在内蒙生物制药厂进行，采用“O”型***病毒毒株。病毒的浓度为1毫升1000 LD50。倍比稀释豚鼠血清。将100μl不同稀释度豚鼠血清和100μl病毒稀释液混合，37℃孵育1小时。在乳鼠背部注射上述混合物。观察48小时。记录存活的乳鼠数目。

结果(如附图3，4，5所示)：重组***病毒VP1融合蛋白免疫豚鼠的血清在稀释至1∶2048时仍能完全保护乳鼠。

结论：重组***病毒VP1融合蛋白刺激动物产生中和抗体，此中和抗体可预防动物感染***病毒。

序列表

<110>北京迪威华宇生物技术有限公司

<120>重组***病毒VP1融合蛋白疫苗

<160>9

<210>1

<211>186

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>两侧带限制性内切酶切点的VP1 BT1融合肽编码基因

<400>1

gaattcagat ctggcggtgt atctaacgta cgtggtgacc tgcaagtact ggctcaaaaa 60

gcagaacgtg ctctgccggg tggcgaagaa aactacggtg gtgaaactca ggttcagcgt 120

cgtcagcaca ctgacatctc cttcatcctg gaccgtttcg ttaaagttac tccgggatcc 180

aagctt 186

<210>2

<211>54

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>***病毒VP1BT1融合肽的氨基酸序列

<400>2

Gly Gly Val Ser Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln

1 5 10 15

Lys Ala Glu Arg Ala Leu Pro Gly Gly Glu Glu Asn Tyr Gly Gly

20 25 30

Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Ile Ser Phe Ile

35 40 45

Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro

50 54

<210>3

<211>167

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>两侧带限制性内切酶切点的VP1 BT2融合肽编码基因

<400>3

ccatggaatt cagatctggt ggtgtttcta acgttcgtgg tgacctgcaa gtactggctc 60

aaaaagctaa acgtgctctg ccgggtggtc cgtctgacgc tcgtcacaaa cagaaaatcg 120

ttgctccggc taaacagctg ctgaacttcg acctgggatc caagctt 167

<210>4

<211>46

<212>

<213>artificial

<220>

<223>***病毒VP1BT2融合肽的氨基酸序列

<400>4

Gly Gly Val Ser Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln

1 5 10 15

Lys Ala Lys Arg Ala Leu Pro Gly Gly Pro Ser Asp Ala Arg His

20 25 30

Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Ala Lys Gln Leu Leu Asn Phe Asp

35 40 45

Leu

46

<210>5

<211>330

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>BT1融合肽编码基因-BT2融合肽编码基因融合基因序列

<400>5

gaattcagat ctggcggtgt atctaacgta cgtggtgacc tgcaagtact ggctcaaaaa 60

gcagaacgtg ctctgccggg tggcgaagaa aactacggtg gtgaaactca ggttcagcgt 120

cgtcagcaca ctgacatctc cttcatcctg gaccgtttcg ttaaagttac tccgggatct 180

ggtggtgttt ctaacgttcg tggtgacctg caagtactgg ctcaaaaagc taaacgtgct 240

ctgccgggtg gtccgtctga cgctcgtcac aaacagaaaa tcgttgctcc ggctaaacag 300

ctgctgaact tcgacctggg atccaagctt 330

<210>6

<211>642

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>VP1 BT1融合肽编码基因-BT2融合肽编码基因融合基因的2聚体基因序列<400>6

gaattcagat ctggcggtgt atctaacgta cgtggtgacc tgcaagtact ggctcaaaaa 60

gcagaacgtg ctctgccggg tggcgaagaa aactacggtg gtgaaactca ggttcagcgt 120

cgtcagcaca ctgacatctc cttcatcctg gaccgtttcg ttaaagttac tccgggatct 180

ggtggtgttt ctaacgttcg tggtgacctg caagtactgg ctcaaaaagc taaacgtgct 210

ctgccgggtg gtccgtctga cgctcgtcac aaacagaaaa tcgttgctcc ggctaaacag 300

ctgctgaact tcgacctggg atctggcggt gtatctaacg tacgtggtga cctgcaagta 360

ctggctcaaa aagcagaacg tgctctgccg ggtggcgaag aaaactacgg tggtgaaact 420

caggttcagc gtcgtcagca cactgacatc tccttcatcc tggaccgttt cgttaaagtt 480

actccgggat ctggtggtgt ttctaacgtt cgtggtgacc tgcaagtact ggctcaaaaa 540

gctaaacgtg ctctgccggg tggtccgtct gacgctcgtc acaaacagaa aatcgttgct 600

ccggctaaac agctgctgaa cttcgacctg ggatccaagc tt 642

<210>7

<211>954

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>VP1 BT1融合肽编码基因-VP1 BT2融合肽编码基因融合基因的3聚体的基因序列

<400>7

gaattcagat ctggcggtgt atctaacgta cgtggtgacc tgcaagtact ggctcaaaaa 60

gcagaacgtg ctctgccggg tggcgaagaa aactacggtg gtgaaactca ggttcagcgt 120

cgtcagcaca ctgacatctc cttcatcctg gaccgtttcg ttaaagttac tccgggatct 180

ggtggtgttt ctaacgttcg tggtgacctg caagtactgg ctcaaaaagc taaacgtgct 240

ctgccgggtg gtccgtctga cgctcgtcac aaacagaaaa tcgttgctcc ggctaaacag 300

ctgctgaact tcgacctggg atctggcggt gtatctaacg tacgtggtga cctgcaagta 360

ctggctcaaa aagcagaacg tgctctgccg ggtggcgaag aaaactacgg tggtgaaact 420

caggttcagc gtcgtcagca cactgacatc tccttcatcc tggaccgttt cgttaaagtt 480

actccgggat ctggtggtgt ttctaacgtt cgtggtgacc tgcaagtact ggctcaaaaa 540

gctaaacgtg ctctgccggg tggtccgtct gacgctcgtc acaaacagaa aatcgttgct 600

ccggctaaac agctgctgaa cttcgacctg ggatctggcg gtgtatctaa cgtacgtggt 660

gacctgcaag tactggctca aaaagcagaa cgtgctctgc cgggtggcga agaaaactac 720

ggtggtgaaa ctcaggttca gcgtcgtcag cacactgaca tctccttcat cctggaccgt 780

ttcgttaaag ttactccggg atctggtggt gtttctaacg ttcgtggtga cctgcaagta 840

ctggctcaaa aagctaaacg tgctctgccg ggtggtccgt ctgacgctcg tcacaaacag 900

aaaatcgttg ctccggctaa acagctgctg aacttcgacc tgggatccaa gctt 954

<210>8

<211>1092

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>重组***病毒VP1融合蛋白编码基因序列

<400>8

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccgaattcag atctggcggt 120

gtatctaacg tacgtggtga cctgcaagta ctggctcaaa aagcagaacg tgctctgccg 180

ggtggcgaag aaaactacgg tggtgaaact caggttcagc gtcgtcagca cactgacatc 240

tccttcatcc tggaccgttt cgttaaagtt actccgggat ctggtggtgt ttctaacgtt 300

cgtggtgacc tgcaagtact ggctcaaaaa gctaaacgtg ctctgccggg tggtccgtct 360

gacgctcgtc acaaacagaa aatcgttgct ccggctaaac agctgctgaa cttcgacctg 420

ggatctggcg gtgtatctaa cgtacgtggt gacctgcaag tactggctca aaaagcagaa 480

cgtgctctgc cgggtggcga agaaaactac ggtggtgaaa ctcaggttca gcgtcgtcag 540

cacactgaca tctccttcat cctggaccgt ttcgttaaag ttactccggg atctggtggt 600

gtttctaacg ttcgtggtga cctgcaagta ctggctcaaa aagctaaacg tgctctgccg 600

ggtggtccgt ctgacgctcg tcacaaacag aaaatcgttg ctccggctaa acagctgctg 720

aacttcgacc tgggatctgg cggtgtatct aacgtacgtg gtgacctgca agtactggct 780

caaaaagcag aacgtgctct gccgggtggc gaagaaaact acggtggtga aactcaggtt 840

cagcgtcgtc agcacactga catctccttc atcctggacc gtttcgttaa agttactccg 900

ggatctggtg gtgtttctaa cgttcgtggt gacctgcaag tactggctca aaaagctaaa 960

cgtgctctgc cgggtggtcc gtctgacgct cgtcacaaac agaaaatcgt tgctccggct 1020

aaacagctgc tgaacttcga cctgggatcc aagcttgcgg ccgcactcga gcaccaccac 1080

caccaccact ga 1092

<210>9

<211>363

<212>

<213>artificial

<220>

<223>重组***病毒VP1融合蛋白的氨基酸序列

<400>9

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val

1 5 10 15

Pro Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met

20 25 30

Gly Arg Gly Ser Glu Phe Arg Ser Gly Gly Val Ser Asn Val Arg

35 40 45

Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Glu Arg Ala Leu Pro

50 55 60

Gly Gly Glu Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg

65 70 75

Gln His Thr Asp Ile Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val

80 85 90

Thr Pro Gly Ser Gly Gly Val Ser Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln

95 100 105

Val Leu Ala Gln Lys Ala Lys Arg Ala Leu Pro Gly Gly Pro Ser

110 115 120

Asp Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Ala Lys Gln Leu

125 130 135

Leu Asn Phe Asp Leu Gly Ser Gly Gly Val Ser Asn Val Arg Gly

140 145 150

Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Glu Arg Ala Leu Pro Gly

155 160 165

Gly Glu Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln

170 175 180

His Thr Asp Ile Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr

185 190 195

Pro Gly Ser Gly Gly Val Ser Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val

200 205 210

Leu Ala Gln Lys Ala Lys Arg Ala Leu Pro Gly Gly Pro Ser Asp

215 220 225

Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Ala Lys Gln Leu Leu

230 235 240

Asn Phe Asp Leu Gly Ser Gly Gly Val Ser Asn Val Arg Gly Asp

245 250 255

Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Glu Arg Ala Leu Pro Gly Gly

260 265 270

Glu Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His

275 280 285

Thr Asp Ile Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro

290 295 300

Gly Ser Gly Gly Val Ser Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu

305 310 315

Ala Gln Lys Ala Lys Arg Ala Leu Pro Gly Gly Pro Ser Asp Ala

320 325 330

Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Ala Lys Gln Leu Leu Asn

335 340 345

Phe Asp Leu Gly Ser Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His

350 355 360

His His His

363

Claims

1、一种重组***病毒VP1融合蛋白，它是将***病毒VP1肽段的融合蛋白编码基因和6聚组氨酸编码基因融合，在大肠杆菌生产的重组融合蛋白，其中的VP1肽段融合蛋白编码基因是具有SEQ ID NO5所示的核苷酸序列的VP1BT1融合肽编码基因-VP1BT2融合肽编码基因融合基因的3聚体基因。

2、按照权利要求1所述的重组***病毒VP1融合蛋白，它是由SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列所编码或具有SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。

3、按照权利要求1所述的重组***病毒VP1融合蛋白，其中的***病毒VP1肽段融合蛋白两侧有6聚组氨酸序列。

4、按照权利要求1所述的重组***病毒VP1融合蛋白在制备预防动物***病毒感染的疫苗中的用途。