CN1288247C - Arcelin－5启动子及其应用 - Google Patents

Arcelin－5启动子及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN1288247C
CN1288247C CNB018226620A CN01822662A CN1288247C CN 1288247 C CN1288247 C CN 1288247C CN B018226620 A CNB018226620 A CN B018226620A CN 01822662 A CN01822662 A CN 01822662A CN 1288247 C CN1288247 C CN 1288247C
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
promotor
sequence
seq
arcelin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB018226620A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1489631A (zh
Inventor
王�琦
帕特里克·杜波依斯
梁继红
蒂姆·乌尔马索夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Monsanto Co
Original Assignee
Monsanto Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Monsanto Co filed Critical Monsanto Co
Publication of CN1489631A publication Critical patent/CN1489631A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1288247C publication Critical patent/CN1288247C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C12N15/8234—Seed-specific, e.g. embryo, endosperm

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了能在植物中高水平转录异源核酸序列的Arcelin启动子。所述启动子特别适于在大豆植物和植物细胞中应用。本发明还公开了修饰、制备、和应用所述启动子的方法。本发明还公开了含有高表达的Arcelin启动子的组合物、转化的宿主细胞、转基因植物、和种子，以及它们的制备和应用方法。

Description

ARCELIN-5启动子及其应用
技术领域
本发明主要涉及植物遗传学领域。更具体地，本发明涉及植物中的基因表达。本发明提供了能在植物中高水平转录外源核酸序列的启动子，以及修饰、制备和应用所述启动子的方法。本发明还提供了含有高表达启动子的转化的宿主细胞，转基因植物，和种子，以及它们的制备和应用方法。
背景技术
植物和种子为人类和牲畜提供食用蛋白的重要来源。但植物和种子的蛋白营养通常不全面。例如，很多植物和种子蛋白缺少一或多种必需氨基酸。这种缺陷可通过遗传手段强化天然蛋白、使它们具有营养更全面的氨基酸组成(或其它一些所需特点)来克服。或者，可将具有所需特性的非天然(或异源)蛋白引入植物或种子。这些方法可用于制备具有重要的农业特性(如杀虫特性)、营养特性和药用特性的蛋白。
尽管目前已有多种分子工具，但由于基因工程蛋白的积累量不足，致使对植物和种子的遗传修饰仍常常受到限制。多种细胞内过程可能影响蛋白积累总量，所述过程包括转录、翻译、蛋白装配和折叠、甲基化、磷酸化、转运、以及蛋白裂解。对一或多种这样的过程进行干预可增加基因工程改造的植物和种子中所产生的蛋白的量。
例如，提高胞质中mRNA的稳态水平通常可增加翻译出的蛋白的积累量。很多因素可导致胞质中mRNA的稳态水平提高，包括由启动子强度所控制的转录速度和其它调节特性，mRNA加工的效力，和mRNA的总体稳定性。
在这些因素中，基因的启动子部分起关键作用。沿启动子区，可集合转录机制并启动转录。这一早期步骤与产生蛋白质的后续阶段相比常常为限速步骤。在启动子位置发生的转录起始可通过多种途径调节。例如，在有特定化合物存在的情况下诱导启动子，仅在特定组织中表达基因，或对编码序列进行组成型表达。因此，可将编码序列与具有不同调节特性的启动子可操作连接，以此修饰编码序列的转录。
来自种子贮藏蛋白的基因的启动子通常能进行高水平的表达。例如，菜豆(Phaseolus vulgaris)的种子通常包含大量的菜豆蛋白(36-46％，w/w)，球蛋白-2(5-12％)，清蛋白(12-16％)和谷醇溶蛋白(2-4％)。因此，来自这些基因的启动子可用于表达高水平的异源结构核酸序列。
但即使是这些强启动子的转录活性在不同植物之间也有差异。例如，多种启动子在烟草、矮牵牛和拟南芥中比7Sα’启动子具有更强的活性。但这些启动子没有一种被证实在转基因大豆植物中具有可比拟的活性。因此，在一种植物物种或品种中具有功能的启动子，在另一种植物物种或品种中可能不具有相似水平或形式的功能。
Romero等报道了一种新的种子蛋白，它来自产于Arcelia，Mexico的菜豆(P.vulgaris)(登录号PI 325690；CIAT 12882B)。因此将这种蛋白称为Arcelin(Andreas等，1986；Osborn等，1986)。后来又报道了数种Arcelin变体(例如，登录号为PI 417683的Arcelin-3(CIAT No.G12922)；登录号为PI417775的Arcelin-4(CIAT No.G12949))。其中一种变体，Arcelin-5由Lioi等报道(Lioi and Bollini，1989)。Arcelin-5的cDNA由Goossens等描述(Goossens等，1994)。
Arcelin-5的一种基因组克隆包括未限定的5’和3’区，据报道它在转基因植物中表达。该未限定区包括Arcelin-5编码区5’侧的约1.8kb碱基对。在拟南芥和Phaseolus acutifolius中都报道了表达(Goossens等，1999)。但这种表达比最初鉴定出Arcelin-5的野生型菜豆中的表达水平低。可见，遗传背景对于调节Arcelin-5的表达很重要。而且，由于Goosens使用的是Arcelin-5的完整基因组克隆，因此Arcelin-5启动子的相对强度并不清楚。尽管报道了各种Arcelin的表达，但目前对这类Arcelin启动子在诸如玉米和大豆等作物中的效力仍一无所知。所以该领域仍需要能在重要的作物物种(如玉米和大豆)中进行相对高水平转录的启动子。
发明简述
本发明提供了能在植物中高水平转录异源结构核酸序列的启动子，以及修饰、制备、和应用所述启动子的方法。本发明还提供了含有高表达的所述启动子的组合物、转化的宿主细胞、转基因植物、和种子，以及它们的制备和应用方法。
本发明包括并提供了一种转化的大豆植物细胞，它含有一种核酸分子，所述分子沿5’-3’方向依次包含：具有与SEQ ID NO：1至少94％相同的核酸序列的启动子；可操作连接至结构核酸序列；其中所述启动子与所述结构核酸序列来源不同。
本发明包括并提供了一种转基因大豆植物细胞，它含有一种核酸分子，所述分子沿5’-3’方向依次包含：具有与SEQ ID NO：1至少94％相同的核酸序列的启动子；可操作连接至结构核酸序列；其中所述启动子与所述结构核酸序列来源不同。
本发明包括并提供了一种转化的大豆植物细胞，它含有一种核酸分子，所述分子沿5’-3’方向依次包含：启动子以及与其可操作连接的异源结构核酸序列。所述启动子优选在严格条件下与SEQ ID NO：1或其互补序列杂交；或者与SEQ ID NO：1至少94％相同。
本发明包括并提供了一种转基因大豆植物细胞，它含有一种核酸分子，所述分子沿5’-3’方向依次包含：启动子以及与其可操作连接的异源结构核酸序列。所述启动子优选在严格条件下与SEQ ID NO：1或其互补序列杂交；或者与SEQ ID NO：1至少94％相同。
本发明包括并提供了一种转化的植物细胞，它含有一种核酸分子，所述分子沿5’-3’方向依次包含：启动子以及与其可操作连接的异源结构核酸序列。所述启动子优选在严格条件下与SEQ ID NO：1或其互补序列杂交；或者与SEQ ID NO：1至少94％相同。
本发明包括并提供了一种转基因植物细胞，它含有一种核酸分子，所述分子沿5’-3’方向依次包含：启动子以及与其可操作连接的异源结构核酸序列。所述启动子优选在严格条件下与SEQ ID NO：1或其互补序列杂交；或者与SEQ ID NO：1至少94％相同。
本发明包括并提供了一种转化植物细胞的方法。所述方法主要包括提供一种核酸分子并用所述核酸分子来转化植物细胞，其中所述核酸分子沿5’-3’方向包含启动子以及与其可操作连接的异源结构核酸序列。所述启动子优选在严格条件下与SEQ ID NO：1或其互补序列杂交；或者与SEQ IDNO：1至少94％相同。
本发明包括并提供了一种制备转基因植物的方法。所述方法主要包括提供一种核酸分子、用所述核酸分子来转化植物细胞、并在能产生植物的条件下培养已被转化的植物细胞，其中所述核酸分子沿5’-3’方向包含启动子以及与其可操作连接的异源结构核酸序列。所述启动子优选在严格条件下与SEQ ID NO：1或其互补序列杂交；或者与SEQ ID NO：1至少94％相同。
序列简述
SEQ ID NO：1是菜豆引进种基因型(exotic genotype)G02771 Arcelin-5启动子序列的截短型。
SEQ ID NO：2是菜豆引进种基因型G02771 Arcelin-5启动子序列的截短型。
SEQ ID NO：3是GmHSP17.95’UTR序列。
SEQ ID NO：4是PetHSP70 5’UTR序列。
SEQ ID NO：5是GmdSSU 5’UTR序列。
SEQ ID NO：6是ADR12 3’终止子序列。
SEQ ID NO：7是E9 3’终止子序列。
SEQ ID NO：8是Arc5 3’终止子序列。
SEQ ID NO：9是Arcelin-3启动子序列，如图1所示。
SEQ ID NO：10是Arcelin-4启动子序列，如图1所示。
SEQ ID NO：11是Arcelin-5启动子序列，如图1所示。
SEQ ID NO：12是Arcelin-3启动子序列，如图4a-e所示。
SEQ ID NO：13是Arcelin-4启动子序列，如图4a-e所示。
SEQ ID NO：14是Arcelin-5启动子序列，如图4a-e所示。
附图说明
图1是Arcelin-3，Arcelin-4，和Arcelin-5启动子的部分核酸序列的序列比对。序列之间的差异已经标明。
图2比较了Arcelin-3，Arcelin-4，和Arcelin-5启动子在瞬时转化的大豆组织中的启动子活性。
图3比较了Arcelin启动子与7Sα’启动子在转基因大豆种子中的启动子活性。
图4a，4b，4c，4d，和4e显示Arcelin-3，Arcelin-4，和Arcelin-5启动子全长核酸序列的序列比对。
图5显示各种具有Arcelin-5启动子序列的构建体。
图6显示pMON55540的质粒图谱。
图7为柱形图，显示具有Arcelin-5启动子序列的各种构建体的活性。
定义
以下定义有助于理解发明详述。
术语“Arcelin-5启动子”是指由Arcelin-5编码序列的转录起始位点的5’侧区域衍生或构建的启动子区。Arcelin-5启动子进一步被限定为不同于Arcelin-1(Osborn等Science，240：207-210，1988)，-2(John等，Gene 86：171-176，1990)，-3，或-4(Mirkov等，Plant Mol.Biol.，26：1103-1113，1994)启动子。
术语“编码序列”，“结构序列”以及“结构核酸序列”是指一种包含有序排列的核酸的物理结构。所述核酸以一组核酸三联体的形式排列，其中每一个三联体形成一个密码子。每一密码子编码一种具体的氨基酸。因此，编码序列、结构序列、和结构核酸序列编码一系列氨基酸，这些氨基酸形成蛋白、多肽、或肽序列。编码序列，结构序列，和结构核酸序列可以包含在较大的核酸分子、载体等结构中。此外，这些序列中核酸的有序排列可以用序列表、附图、附表、电子媒介等形式进行描述。
术语“DNA序列”和“核酸序列”是指一种包含有序排列的核酸的物理结构。所述DNA序列或核酸序列可以包含在较大的核酸分子、载体等结构中。此外，这些序列中核酸的有序排列可以用序列表、附图、附表、电子媒介等形式进行描述。
术语“表达”是指基因转录，产生相应的mRNA，并翻译该mRNA以产生相应的基因产物(即，肽，多肽，或蛋白)。
术语“反义RNA的表达”是指对DNA进行转录，从而产生第一种RNA分子，后者能与第二种RNA分子杂交。RNA-RNA杂合体的形成可抑制第二种RNA分子翻译出基因产物。
术语“基因”是指编码肽、多肽、蛋白、或RNA分子的染色体DNA、质粒DNA、cDNA、合成的DNA、或其它DNA。
“同源性”是指两个或多个核酸序列或氨基酸序列之间以位置同一性百分比表示的相似性(即，序列相似性或同一性)。同源性还指不同的核酸或蛋白之间相似的功能特性的概念。
术语“异源”是指两个或更多个不同来源的核酸序列或蛋白序列之间的关系。例如，启动子如果在自然界通常的情况中不与编码序列组合在一起，那么该启动子相对于该编码序列是异源的。此外，一个具体序列可以相对于它***至其中的细胞或生物为“异源”的(即，并非该具体细胞或生物所天然具有的)。
“杂交”是指一条核酸链与一条互补链通过碱基配对来相连的能力。当两条核酸链中的互补核酸序列在适当条件下彼此相遇，就可发生杂交。
术语“可操作相连”是指两个或更多个核酸区域或核酸序列的功能性空间排列。例如，启动子区相对于核酸序列的位置可以使该核酸序列在该启动子区的指导下进行转录。此时，该启动子区与该核酸序列“可操作相连”。
术语“启动子”或“启动子区”是指通常发现于编码序列上游(5’)的、能指导该核酸序列转录为mRNA的一种核酸序列。启动子或启动子区通常提供RNA聚合酶的识别位点以及转录的正确起始所需的其它因子。本文中，启动子或启动子区包括通过***或缺失调节区，对启动子进行随机或定点诱变等方式而进行改变的启动子。启动子的活性或强度如下测量：将其在细胞或组织中产生的RNA的量，或积累的蛋白的量，与已经评估过转录活性的启动子进行比较。
术语“重组载体”是指诸如质粒、粘粒、病毒、自我复制序列、噬菌体、线性或环状单链或双链DNA或RNA核苷酸序列等任何物质。重组载体可以来自任何来源，它能进行基因组整合或自我复制，它包含与一或多个核酸序列可操作相连的启动子核酸序列。重组载体通常用于将所述可操作相连的序列引入适当的宿主。
“调节序列”是指位于编码序列上游(5’)、内部或下游(3’)的核苷酸序列。编码序列的转录和表达通常受到调节序列存在与否的影响。
术语“充分同源”是指，根据本文所述BestFit程序(版本10；GeneticsComputer Group，Inc.，University of Wisconsin Biotechnology Center，Madison，wI)以默认参数测定，序列同一性至少90％的两个序列。
术语“转化”是指核酸引入受体宿主的过程。术语“宿主”是指细菌细胞，真菌，动物和动物细胞，植物和植物细胞，或任何植物部分或组织包括原生质体，愈伤组织，根，块茎，种子，茎，叶，幼苗，胚和花粉。
优选实施方案详述
本发明提供能在植物中高水平转录异源结构核酸序列的启动子，以及修饰、制备和应用该启动子的方法。本发明还提供含有该高表达启动子的组合物，转化的宿主细胞，转基因植物，和种子，以及它们的制备和应用方法。
启动子
本发明提供一种启动子，它具有与SEQ ID NO：1杂交的核酸序列，其互补链，或其任何片段。本发明还提供一种启动子，它具有SEQ ID NO：1的核酸序列，其互补链，或其任何片段。
本发明提供一种启动子，它具有与SEQ ID NO：2杂交的核酸序列，其互补链，或其任何片段。本发明还提供一种启动子，它具有SEQ ID NO：2的核酸序列，其互补链，或其任何片段。
本发明提供一种启动子，它具有与SEQ ID NO：14杂交的核酸序列，其互补链，或其任何片段。本发明还提供一种启动子，它具有SEQ ID NO：14的核酸序列，其互补链，或其任何片段。
核酸杂交是DNA操作领域技术人员已知的技术。一对具体核酸的杂交特性可指示它们的相似性或同一性。
可用低严格度条件选出与靶核酸序列同一性较低的核酸序列。所述条件可以是，约0.15M-约0.9M氯化钠，约20℃-约55℃。
可用高严格度条件选出与已公开的核酸序列(Sambrook等，1989)同一性较高的核酸序列。
高严格度条件通常包括：在约2X-约10X SSC(由含有3M氯化钠和0.3M柠檬酸钠的20X SSC原液，pH 7.0用蒸馏水稀释而成)，约2.5X-约5X Denhardt溶液(由含有1％(w/v)牛血清白蛋白，1％(w/v)ficoll，和1％(w/v)聚乙烯吡硌烷酮的50X原液用蒸馏水稀释而成)，约10mg/mL-约100mg/mL鱼精DNA，以及约0.02％(w/v)-约0.1％(w/v)SDS中进行核酸杂交，于大约50℃-大约70℃保温数小时-过夜。优选高严格度条件为6X SSC，5X Denhardt溶液，100mg/mL鱼精DNA，和0.1％(w/v)SDS，55℃保温数小时。
杂交之后通常进行数个洗涤步骤。洗涤组合物通常包含约0.5X-约10X SSC，以及0.01％(w/v)-约0.5％(w/v)SDS，约20℃-约70℃保温15分钟。优选地，当在0.1X SSC中65℃洗涤至少一次以后，核酸片段仍保持杂交。
启动子的核酸序列优选在低或高严格度条件下与SEQ ID NO：1，其互补链，或其任何片段杂交。最优选，启动子在高严格度条件下与SEQ ID NO：1，其互补链，或其任何片段杂交。
在另一实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO：1至少有85％相同的核酸序列，更优选至少86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，或99％相同。最优选启动子包含或就是SEQ ID NO：1。
启动子的核酸序列优选在低或高严格度条件下与SEQ ID NO：2，其互补链，或其任何片段杂交。最优选，启动子在高严格度条件下与SEQ ID NO：2，其互补链，或其任何片段杂交。
在另一实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO：2至少有85％相同的核酸序列，更优选至少86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，或99％相同。最优选启动子包含或就是SEQ ID NO：2。
启动子的核酸序列优选在低或高严格度条件下与SEQ ID NO：14，其互补链，或其任何片段杂交。最优选，启动子在高严格度条件下与SEQ ID NO：14，其互补链，或其任何片段杂交。
在另一实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO：14至少有85％相同的核酸序列，更优选至少86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，或99％相同。最优选启动子包含或就是SEQ ID NO：14。
序列同一性百分比优选用序列分析软件包(版本10；Genetics ComputerGroup，Inc.，University of Wisconsin Biotechnology Center，Madison，WI)的“Best Fit”或“Gap”程序来确定。“Gap”是利用Needleman和Wunsch的算法(Needleman and Wunsch，1970)来找出两个序列的对比排列，它使匹配数最大并使空隙数最小。“BestFit”是对两个序列之间的最相似片段进行最佳对比排列，它还***空隙以便使匹配数最大，它利用Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith and Waterman，1981；Smith等，1983)。同一性百分比最优选用“Best Fit”程序来确定。
本发明还提供了SEQ ID NO：1的核酸分子片段，与具有SEQ ID NO：1的核酸分子杂交的核酸分子片段，与SEQ ID NO：1有序列同一性的核酸分子片段，以及上述任一种分子的互补体。
本发明还提供了SEQ ID NO：2的核酸分子片段，与具有SEQ ID NO：2的核酸分子杂交的核酸分子片段，与SEQ ID NO：2有序列同一性的核酸分子片段，以及上述任一种分子的互补体。
本发明还提供了SEQ ID NO：14的核酸分子片段，与具有SEQ ID NO：14的核酸分子杂交的核酸分子片段，与SEQ ID NO：14有序列同一性的核酸分子片段，以及上述任一种分子的互补体。
在另一实施方案中，所述片段的长度为250-15个核苷酸，更优选150-15个核苷酸，更优选100-15个核苷酸，50-15个核苷酸或25-15个核苷酸。在另一优选实施方案中，所述片段的长度为250-50个核苷酸，更优选150-15个核苷酸，更优选100-50个核苷酸，50-25个核苷酸或25-20个核苷酸。在另一实施方案中，所述片段的长度为250-100个核苷酸，更优选150-100个核苷酸，更优选100-75个核苷酸。
启动子活性
启动子的活性或强度可用RNA的量或该RNA所特别产生的蛋白积累量相对于细胞性RNA或蛋白的总量来定量。所述启动子优选表达可操作连接的核酸序列，其水平占细胞性RNA或蛋白总量的2.5％以上；更优选占5，6，7，8，或9％以上；还更优选占10，11，12，13，14，15，16，17，18，或19％以上；最优选占20％以上。
或者，启动子的活性或强度可表示为已知启动子(其转录活性已经过评估)的相对量。例如，可将一种了解不多的启动子与报告序列(例如，GUS)可操作相连，并将其引入特定类型的细胞。用类似方法制备已知启动子(例如7Sα’启动子)，将其引入相同的细胞内环境中。通过比较相对于已知启动子而言的报告分子表达量，可确定未知启动子的转录活性。在此公开的启动子的活性优选在相同的细胞内环境中与7Sα’启动子的活性强度相同。细胞内环境优选canola，大豆，或玉米；最优选大豆。
结构核酸序列
本发明的启动子可与异源结构核酸序列可操作相连。该结构核酸序列通常是希望提高转录水平的任何核酸序列。优选结构核酸序列编码一种适于掺入人或动物膳食之中的多肽。适当的结构核酸序列包括编码下列蛋白的那些：种子贮藏蛋白，抗除草剂蛋白，抗病蛋白，脂肪酸生物合成酶，维生素E生物合成酶，氨基酸生物合成酶，或杀虫蛋白。优选的结构核酸序列包括，但不限于，γ甲基转移酶、叶绿基异戊烯转移酶、β-酮脂酰-CoA合酶、脂酰CoA还原酶、脂酰CoA：脂醇转酰酶、邻氨基苯甲酸合酶、苏氨酸脱氨酶、乙酰羟酸合成酶、天冬氨酸激酶、二羟酸合成酶、天冬氨酸激酶、二氢吡啶甲酸合成酶、硫酯酶、7Sα’种子贮藏蛋白、11S种子贮藏蛋白、大豆球蛋白、β-conglycinin、菜豆蛋白、玉米球蛋白-1、玉米醇溶蛋白、种子清蛋白、或种子凝集素。
或者，可通过设计启动子和结构核酸序列来下调特定的核酸序列。这通常通过将启动子与反义取向的结构核酸序列相连来实现。本领域技术人员很熟悉这类反义技术。简短说，转录出反义核酸序列后，它与互补核酸序列杂交并使后者被封闭(sequester)在细胞内侧。这种双链RNA分子不能通过细胞的翻译机制翻译出蛋白。如此一来，由于后续翻译步骤中断，细胞中的互补序列被有效下调。
任何核酸序列都可以通过这种方式进行负调节。这种调节作用的目标包括含有较少量的必需氨基酸、但在特定组织中以相对较高的水平表达的多肽。例如，β-conglycinin和大豆球蛋白都能在种子中大量表达，但在营养方面欠缺必需氨基酸。这种反义方法也可以用于有效除去植物性食品中的其它不想要的蛋白，如拒食剂(例如，凝集素)，清蛋白，和变应原。
修饰的结构核酸序列
本发明的启动子还可与异源的修饰型结构核酸序列相连。可以对结构核酸序列进行修饰，以便提供各种所需特性。例如，可以对结构核酸序列进行修饰以增加必需氨基酸的含量，促进对氨基酸序列的翻译，改变翻译后修饰(例如，磷酸化位点)，将翻译出的产物转运至细胞的内侧或外侧的空间中，增加蛋白的稳定性，***或删除细胞信号传递基序，等等。
在一优选实施方案中，结构核酸序列被强化，使得能编码如下的多肽，该多肽中至少1种，更优选2，3，或4中选自下组的必需氨基酸的含量增加：组氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸和苯丙氨酸。必要时，也可以添加非必需氨基酸以强化多肽的结构和营养性。特别适于这类强化作用的结构核酸序列包括，编码表达水平相对较高和/或必需氨基酸的含量特别低的天然多肽的那些。实例如种子贮藏蛋白，如大豆球蛋白和β-conglycinin。其它合适的目标包括菜豆蛋白，凝集素，玉米醇溶蛋白和清蛋白。
在另一实施方案中，结构核酸序列经过修饰后，相对于改造前的结构核酸序列，能编码瘤胃抗性增强和/或对蛋白裂解性降解作用的抗性增强的多肽。修饰的结构核酸序列通常编码适于掺入动物膳食中的任何多肽。修饰的结构核酸序列优选编码在给定的植物组织中以相对较高的浓度表达的多肽，如种子贮藏蛋白。
结构核酸序列中的密码子应用特点
由于遗传密码的简并性，可以用不同的核苷酸密码子编码给定的氨基酸。宿主细胞常常表现出优选的密码子应用模式。优选结构核酸序列经过构建能利用给定宿主细胞的密码子应用模式。这通常能增强该结构核酸序列在转化的宿主细胞中的表达。可对上述任一种核酸或氨基酸序列进行修饰，以反映容纳它们的宿主细胞或生物优选的密码子应用特性。在植物中修饰结构核酸序列，使密码子应用最优化的方法可参见美国专利5,689,052。
对结构核酸序列的其它修饰
上述结构核酸序列中的其它变化可编码出与改造前的蛋白相比等效或更优秀的蛋白。突变包括对基序序列进行缺失，***，截短，取代，融合，改组等。
对结构核酸序列的突变可通过特定方式或随机方式引入，这两种方式都是分子生物学领域技术人员已知的。定点诱变技术有很多种，它们通常利用寡核苷酸将突变引入结构核酸序列中的特定位置。实例包括单链挽救(Kunkel等，1985)，唯一位点的消除(Deng和Nickloff，1992)，缺口保护(Vandeyar等，1988)，及PCR(Costa等，1996)。随机或非特异性突变，可通过化学试剂产生(综述参见，Singer和Kusmierek，1982)，如亚硝基胍(Cerda-Olmedo等，1968；Guerola等，1971)和2-氨基嘌呤(Rogan和Bessman，1970)；或通过生物学方法产生，如由突变株传代(Greener等，1997)。
修饰可以在氨基酸序列中导致保守或非保守的改变。保守改变源自对结构核酸序列进行不改变蛋白的最终氨基酸序列的添加、缺失、取代等。在一个优选实施方案中，蛋白包含0-500个保守改变，更优选0-300个保守改变，还更优选0-150个保守改变，最优选0-75个保守改变。
非保守改变包括能导致氨基酸序列发生改变的那些添加、缺失和取代。在一优选实施方案中，蛋白包含0-250个非保守氨基酸改变，更优选0-100个非保守氨基酸改变，还更优选0-50个非保守氨基酸改变，最优选0-30非保守氨基酸改变。
产生上述改变的其它方法可参见Ausubel等(1995)；Bauer等(1985)；Craik(1985)；Frits Eckstein等(1982)；Sambrook等(1989)；Smith等(1981)；以及Osuna等(1994)。
可以对本发明的蛋白序列以及编码它们的核酸节段进行修饰但保留所述分子的所需特性。以下是关于对蛋白的氨基酸序列进行改变来产生等效，或者可能更优良的第二代分子的讨论。氨基酸改变可以通过改变结构核酸序列的密码子来实现，密码子参见表1。
表1：氨基酸的密码子简并性
  氨基酸   单字母   三字母   密码子
  丙氨酸   A   Ala   GCA GCC GCG GCT
  半胱氨酸   C   Cys   TGC TGT
  天冬氨酸   D   Asp   GAC GAT
  谷氨酸   E   Glu   GAA GAG
  苯丙氨酸   F   Phe   TTC TTT
  甘氨酸   G   Gly   GGA GGC GGG GGT
  组氨酸   H   His   CAC CAT
  异亮氨酸   I   Ile   ATA ATC ATT
  赖氨酸   K   Lys   AAA AAG
  亮氨酸   L   Leu   TTA TTG CTA CTC CTG CTT
  甲硫氨酸   M   Met   ATG
  天冬酰胺   N   Asn   AAC AAT
  脯氨酸   P   Pro   CCA CCC CCG CCT
  谷氨酰胺   Q   Gln   CAA CAG
  精氨酸   R   Arg   AGA AGG CGA CGC CGG CGT
  丝氨酸   S   Ser   AGC AGT TCA TCC TCG TCT
  苏氨酸   T   Thr   ACA ACC ACG ACT
  缬氨酸   V   Val   GTA GTC GTG GTT
  色氨酸   W   Trp   TGG
  酪氨酸   Y   Tyr   TAC TAT
可以在不明显损失所需活性的前题下，将蛋白序列中特定的氨基酸取代为其它氨基酸。从这一点上来看，可以在所公开的蛋白序列的肽序列，或它们的相应核酸序列中进行多种改变而不明显损失生物活性。
在制造这类改变时，可考虑氨基酸的疏水/亲水倾向性指数。氨基酸的疏水/亲水倾向性指数在赋于蛋白质以交互式生物功能方面的重要性已为领域内广泛理解(Kyte和Doolittle，1982)。可以接受的是，氨基酸的相对疏水/亲水倾向性决定所得蛋白的二级结构，而后者又限定了该蛋白与其它分子，如酶，底物，受体，DNA，抗体，抗原等的相互作用。
每种氨基酸基于其疏水性和荷电特性而分配了一个疏水/亲水倾向性指数。具体是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸/谷氨酰胺/天冬氨酸/天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；精氨酸(-4.5)。
本领域已知，特定氨基酸可以被具有相似疏水/亲水倾向性指数或评分的其它氨基酸取代，所得蛋白质仍具有相似的生物活性，即，仍能获得生物功能性蛋白。在制造这类改变时，疏水/亲水倾向性指数在±2以内的氨基酸的取代为优选，在±1以内的为更优选，在±0.5以内的为最优选。
本领域也能理解，可以在亲水性的基础上有效地进行相似氨基酸的取代。美国专利4,554,101(Hopp，T.P.，1985年11月19日授权)称，一种蛋白质上受其邻接氨基酸的亲水性控制的最大局部平均亲水性与该蛋白的生物学特性相关。氨基酸的亲水值如下：精氨酸/赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸/谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺/谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸/组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸/异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
可理解，一种氨基酸可以被具有相似的亲水评分值的另一种氨基酸取代，所得蛋白质仍具有相似的生物活性，即，仍能获得生物功能性蛋白。在制造这类改变时，疏水/亲水倾向性指数在±2以内的氨基酸的取代为优选，在±1以内的为更优选，在±0.5以内的为最优选。
综上所述，氨基酸取代因此是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性，亲水性，电荷，大小，等等。涉及上述多种特性的取代实例为本领域众所周知，它们包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；缬氨酸，亮氨酸，和异亮氨酸。对于不能预计有利的那些改变，如果能使所得的蛋白质与原始未经改造的多肽相比，瘤胃抗性增强和/或对蛋白裂解性降解作用的抗性增强，则也可以使用。
重组载体
上述任何启动子和结构核酸序列都可提供在重组载体中。重组载体通常按5’至3’方向依次包含：能指导结构核酸序列转录的启动子，以及结构核酸序列。重组载体还可根据需要而包含：3’转录终止子，3’聚腺苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转位及靶向核酸序列，选择标记，增强子，和操纵子。
制备重组载体的方式为本领域已知。制备特别适于植物转化的重组载体的方法可参见美国专利4,971,908,4,940,835,4,769,061和4,757,011。对这些类型的载体已有综述(Rodriguez等，1988；Glick等，1993)。
用于在高等植物中进行核酸表达的典型载体为本领域已知，包括来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体(Rogers等，1987)。其它可用于植物转化的重组载体，包括pCaMVCN转移控制载体，也已有记载(Fromm等，1985)。
重组载体中的启动子
重组载体中所用的启动子优选能在植物中高水平转录异源结构核酸序列。更优选，所述启动子与SEQ ID NO：1，其互补链，或其任何片段杂交。适当的杂交条件如上所述。优选启动子的核酸序列在低度或高度严格条件下与SEQ ID NO：1，其互补链，或其任何片段杂交。最优选启动子在高度严格条件下与SEQ ID NO：1，其互补链，或其任何片段杂交。
在另一实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO：1有至少85％相同的序列，更优选至少86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98或99％相同。最优选启动子包含或者本身就是SEQ ID NO：1。计算两个或更多个核酸序列的同一性百分比的优选方法如上所述。在另一实施方案中，启动子是如上所述的片段。
在另一实施方案中，所述启动子与SEQ ID NO：2，其互补链，或其任何片段杂交。适当的杂交条件如上所述。优选启动子的核酸序列在低度或高度严格条件下与SEQ ID NO：2，其互补链，或其任何片段杂交。最优选启动子在高度严格条件下与SEQ ID NO：2，其互补链，或其任何片段杂交。
在另一实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO：2有至少85％相同的序列，更优选至少86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98或99％相同。最优选启动子包含或者本身就是SEQ ID NO：2。计算两个或更多个核酸序列的同一性百分比的优选方法如上所述。在另一实施方案中，启动子是如上所述的片段。
在另一实施方案中，所述启动子与SEQ ID NO：14，其互补链，或其任何片段杂交。适当的杂交条件如上所述。优选启动子的核酸序列在低度或高度严格条件下与SEQ ID NO：14，其互补链，或其任何片段杂交。最优选启动子在高度严格条件下与SEQ ID NO：14，其互补链，或其任何片段杂交。
在另一实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO：14有至少85％相同的序列，更优选至少86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98或99％相同。最优选启动子包含或者本身就是SEQ ID NO：14。计算两个或更多个核酸序列的同一性百分比的优选方法如上所述。在另一实施方案中，启动子是如上所述的片段。
重组载体中的附加启动子
重组载体中还可提供一个或更多个附加启动子。这些启动子可与上述任何结构核酸序列可操作相连。或者，所述启动子可与其它核酸序列，如编码转位肽、可选择的标记蛋白的那些序列、或反义序列，可操作相连。
这些附加启动子可根据载体所要***的细胞类型来选择。在细菌、酵母和植物中具有功能的启动子为本领域已知。附加的启动子还可以根据它们的调节特性来选择。这些特性的实例包括对转录活性、诱导能力、组织特异性、以及发育阶段特异性的强化作用。已有文献描述了植物中的诱导型启动子，病毒来源的或合成的启动子，组成型启动子，时间调节型启动子，以及空间调节型启动子(Poszkowski等，1989；Odell等，1985；Chau等，1989)。
常用的组成型启动子包括CaMV 35S启动子(Odell，J.T.等，1985)，增强型CaMV 35S启动子，玄参花叶病毒(FMV)启动子(Richins等，1987)，甘露氨酸合成酶(mas)启动子，胭脂氨酸合成酶(nos)启动子，以及章鱼氨酸合成酶(ocs)启动子。
有用的诱导型启动子包括由水杨酸或聚丙烯酸诱导的启动子(PR-1；Williams，S.W.等，1992)，由于应用安全剂而诱导的启动子(安全剂如取代的苯磺酰胺除草剂；Hershey，H.P.and Stoner，T.D.，1991)，热休克启动子(Ou-Lee等，1986；Ainley等，1990)，来源于菠菜亚硝酸根还原酶结构核酸序列的硝酸根诱导型启动子(Back等，1991)，激素诱导型启动子(Yamaguchi-Shinozaki等，1990；Kares等，1990)，与RuBP羧化酶和LHCP家族的小亚单位结合的光诱导型启动子(Kuhlemeier等，1989；Feinbaum，R.L.等，1991；Weisshaar，B.等，1991；Lam，E.and Chua，N.H.，1990；Castresana，C.等，1988；Schulze-Lefert等，1989)。
有用的组织特异性、发育调节型启动子的实例包括β-conglycinin 7Sα’启动子(Doyle，J.J.等，1986；Slighton and Beachy，1987)，和种子-特异性启动子(Knutzon，D.S.等，1992；Bustos，M.M.等，1991；Lam and Chua，1991；Stayton等，1991)。可用于在种子质体中优先表达的植物功能性启动子，包括来自植物贮藏蛋白的启动子，以及来自与含油种子中脂肪酸生物合成有关的蛋白的启动子。这类启动子的实例包括下列结构核酸序列的5’调节区：napin(Kridl等，1991)，菜豆蛋白，玉米醇溶蛋白，大豆胰蛋白酶抑制剂，ACP，硬脂酰-ACP去饱和酶，和油质蛋白。对种子-特异性调节作用的描述可参见EP0 255 378。
另一例组织特异性启动子是凝集素启动子，它特异于种子组织。大豆种子中的凝集素蛋白由单个结构核酸序列(Lel)编码，该序列仅在种子成熟期表达，它占种子中总mRNA的大约2-5％。凝集素结构核酸序列和种子特异性启动子目前已被全面鉴定，并用于指导转基因烟草植物中的种子特异性表达(Vodkin等，1983；Lindstrom等，1990)。
重组载体中特别优选的附加启动子包括携带在根癌土壤杆菌肿瘤诱导质粒上的胭脂氨酸合成酶(nos)启动子，甘露氨酸合成酶(mas)启动子，以及章鱼氨酸合成酶(ocs)启动子；花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子；增强型CaMV 35S启动子；玄参花叶病毒(FMV)35S启动子；核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)小亚单位的光诱导型启动子；烟草EIF4A启动子(Mandel等，1995)；谷物蔗糖合成酶1(Yang和Russell，1990)；谷醇脱氢酶1(Vogel等，1989)；谷物光收获复合物(Simpson，1986)；谷物热休克蛋白(Odell等，1985)；拟南芥壳多糖酶启动子(Samac等，1991)；花椰菜LTP(脂转移蛋白)启动子(Pyee等，1995)；矮牵牛查耳酮异构酶(Van Tunen等，1988)；菜豆甘氨酸富集蛋白1(Keller等，1989)；土豆patatin(Wenzler等，1989)；玉米遍在蛋白启动子(Christensen等，1992)；以及水稻肌动蛋白启动子(McElroy等，1990)。
附加启动子优选具有种子选择性，组织选择性，为组成型或诱导型。最优选的启动子为胭脂氨酸合成酶(nos)，章鱼氨酸合成酶(ocs)，甘露氨酸合成酶(mas)，花椰菜花叶病毒19S和35S(CaMV19S，CaMV35S)，增强型CaMV(eCaMV)，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)，玄参花叶病毒(FMV)，CaMV衍生的AS4，烟草RB7，小麦POX1，烟草EIF-4，凝集素蛋白(Lel)，或水稻RC2的启动子。
重组核酸载体中的结构核酸序列
重组载体中的启动子优选与结构核酸序列可操作相连。结构核酸序列及其修饰形式的实例见上文详述。本发明的启动子可与相对于该启动子为异源的结构核酸序列可操作相连。一方面，结构核酸序列一般可以是需要提高转录水平的任何核酸序列。结构核酸序列优选编码适于掺入人或动物膳食中的多肽。适当的结构核酸序列包括编码种子贮藏蛋白，除草剂抗性蛋白，疾病抗性蛋白，脂肪酸生物合成酶，维生素E生物合成酶，氨基酸生物合成酶，或杀虫蛋白的那些。优选的结构核酸序列包括，但不限于，γ甲基转移酶、叶绿基异戊烯转移酶、β-酮脂酰-CoA合酶、脂酰CoA还原酶、脂酰CoA：脂醇转酰酶、邻氨基苯甲酸合酶、苏氨酸脱氨酶、乙酰羟酸合成酶、天冬氨酸激酶、二羟酸合成酶、天冬氨酸激酶、二氢吡啶甲酸合成酶、硫酯酶、7Sα’种子贮藏蛋白、11S种子贮藏蛋白、大豆球蛋白、β-conglycinin、菜豆蛋白、玉米球蛋白-1、玉米醇溶蛋白、种子清蛋白、或种子凝集素。
或者，可设计启动子和结构核酸序列以便下调特定核酸序列。这通常通过将启动子与反义方向的结构核酸序列相连来实现。本领域技术人员很熟悉这类反义技术。简短说，转录出反义核酸序列后，它与互补核酸序列杂交并使后者被封闭在细胞内侧。这种双链RNA分子不能通过细胞的翻译机制翻译为蛋白。这就使细胞内的互补核酸序列由于后续翻译步骤的中断而被有效下调。
任何核酸序列都可能以这种方式进行负调节。这类调节作用的目标可包括必需氨基酸含量低、但在特定组织中以相对较高水平表达的多肽。例如，β-conglycinin和大豆球蛋白都在种子中大量表达，但在营养方面缺少必需氨基酸。这种反义方法也可用于有效除去植物来源的食物中其它不想要的蛋白，如拒食剂(例如，凝集素)，清蛋白，和变应原。
带有附加的结构核酸序列的重组载体
重组载体还可包含一或多个附加的结构核酸序列。这些附加结构核酸序列通常为适于在重组载体中使用的任何序列。这样的结构核酸序列包括上述任一种结构核酸序列及其修饰形式。附加结构核酸序列还可与上述任一种启动子可操作相连。所述一或多个结构核酸序列可分别与不同(separate)启动子可操作相连。或者，多个结构核酸序列可与单个启动子可操作相连(即，单个操纵子)。
附加结构核酸序列优选编码种子贮藏蛋白，除草剂抗性蛋白，疾病抗性蛋白，脂肪酸生物合成酶，维生素E生物合成酶，氨基酸生物合成酶，或杀虫蛋白。优选的结构核酸序列包括，但不限于，γ甲基转移酶、叶绿基异戊烯转移酶、β-酮脂酰-CoA合酶、脂酰CoA还原酶、脂酰CoA：脂醇转酰酶、邻氨基苯甲酸合酶、苏氨酸脱氨酶、乙酰羟酸合成酶、天冬氨酸激酶、二羟酸合成酶、天冬氨酸激酶、二氢吡啶甲酸合成酶、硫酯酶、7Sα’种子贮藏蛋白、11S种子贮藏蛋白、大豆球蛋白、β-conglycinin、菜豆蛋白、玉米球蛋白-1、玉米醇溶蛋白、种子清蛋白、或种子凝集素。
或者，可将第二种结构核酸序列设计成能下调特定的核酸序列。这通常通过将第二种结构氨基酸按照反义方向与启动子可操作相连来实现。本领域技术人员很熟悉这类反义技术。该方法也已在上文中简述。任何核酸序列都可能以这种方式进行负调节。优选的目标核酸序列包含低含量的必需氨基酸、但在特定组织中以相对较高水平表达。例如，β-conglycinin和大豆球蛋白都在种子中大量表达，但在营养方面缺少必需氨基酸。这种反义方法也可用于有效除去植物来源的食物中其它不想要的蛋白，如拒食剂(例如，凝集素)，清蛋白，和变应原。
选择标记
重组载体还可包含选择标记。能用作选择标记的核酸序列产生细胞表型，使这些细胞比不含该标记的细胞更容易被鉴定。
选择标记的实例包括，但不限于：neo基因(Potrykus等，1985)，它编码卡那霉素抗性基因，可用卡那霉素，G418等进行筛选；bar基因，它编码bialaphos抗性；突变的EPSP合成酶基因(Hinchee等，1988)，它编码草甘膦抗性；腈水解酶基因，它赋予对溴苯腈的抗性(Stalker等，1988)；突变的乙酰乳酸合成酶基因(ALS)，它赋予对咪唑啉酮或磺脲的抗性(欧洲专利申请0154204)；绿色荧光蛋白(GFP)；以及氨甲喋呤抗性DHFR基因(Thillet等，1988)。
选择标记的其它实例包括：β-葡萄糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，它编码一种酶，该酶的多种显色底物是已知的(Jefferson(I)，1987；Jefferson(II)等，1987)；一种R-座基因，它编码一种产物，该产物调节植物组织中花色素苷(红色)的产生(Dellaporta等，1988)；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe等，1978)，它编码一种酶，该酶的多种显色底物是已知的(例如，PADAC，一种显色的头孢菌素)；萤光素酶基因(Ow等，1986)；xylE基因(Zukowsky等，1983)，它编码一种儿茶酚双加氧酶，此酶可转化显色型儿茶酚；α-淀粉酶基因(Ikatu等，1990)；酪氨酸酶基因(Katz等，1983)，它编码一种能将酪氨酸氧化为DOPA和多巴醌(dopaquinone，进一步浓缩为黑色素)的酶；α-半乳糖苷酶，可使显色的α-半乳糖底物发生转变。
术语“选择标记”还包括编码选择标记的基因，所述选择标记是指其检测可作为鉴定或筛选转化细胞的手段的那些。实例包括编码可通过抗体相互作用予以鉴定的分泌型抗原的标记物，或甚至可通过催化检测的分泌型酶。分泌型选择标记蛋白可分为数类，包括可通过(例如，ELISA)检测的小分子可扩散型蛋白，可在胞外溶液中检测到的小分子活性酶(例如，α-淀粉酶，β-内酰胺酶，膦丝菌素转移酶)，或者***或陷落在细胞壁中的蛋白(如包含前导序列的蛋白，如发现于延伸的表达单元中的蛋白，或烟草PR-S)。其它可能的选择标记基因对本领域技术人员而言是显而易见的。
选择标记优选为GUS，绿色荧光蛋白(GFP)，新霉素磷酸转移酶II(nptII)，萤光素酶(LUX)，抗生素抗性编码序列，或除草剂(例如，草甘膦)抗性编码序列。选择标记最优选卡那霉素，潮霉素，或除草剂抗性标记。
重组载体中的其它元件
各种具有顺式作用的非翻译5’和3’调节序列也可以包括在重组核酸载体中。任何这类调节序列可在重组载体中伴有其它调节序列。可通过设计或改变这类组合来产生所需的调节特征。调节序列的组合的实例包括，但不限于表2所列的那些。
3’非翻译区通常提供转录终止信号，聚腺苷酸化信号，后者在植物中能导致腺苷酸添加在mRNA的3’末端。这可通过下述序列的3’区实现：胭脂氨酸合成酶(nos)编码序列，大豆7Sα’贮藏蛋白编码序列，Arcelin-5编码序列，清蛋白编码序列，以及豌豆ssRUBISCO E9编码序列。特别优选的3’核酸序列包括Arcelin-5 3’，nos 3’，E9 3’，adr12 3’，7Sα’3’，11 S 3’，USP 3’，以及清蛋白3’。
位于距聚腺苷酸化位点数百个碱基对的下游处的核酸序列通常可终止转录。这些区是转录的mRNA进行有效腺苷酸化所必需的。
重组载体中还可掺入翻译增强子。因此，重组载体优选包含一或多个5’非翻译前导序列，以便增强核酸序列的表达。这类增强子序列预计能增强或改变所得mRNA的翻译效力。优选的5’核酸序列包括dSSU 5’，PetHSP705’，和GmHSP17.95’。
重组载体还可包含编码转位肽的核酸序列。这种肽可用于将蛋白引到胞外空间，叶绿体，或细胞内侧或外侧的其它空间中(参见，例如欧洲专利申请公开号0218571)。
重组载体中的结构核酸序列可包含内含子。这些内含子可以与结构核酸序列有不同来源。优选的内含子包括水稻肌动蛋白内含子和谷物HSP70内含子。
转基因植物和经过转化的宿主细胞
本发明还涉及转基因植物和转化植物细胞，它们按照5’至3’方向包含启动子以及与其可操作相连的异源结构核酸序列。其它核酸序列也可与上述启动子和结构核酸序列一起引入植物或宿主细胞中。所述其它序列可包括3’转录终止子，3’聚腺苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转位或靶向序列，选择标记，增强子，和操纵子。
本发明优选的核酸序列包括重组载体，结构核酸序列，启动子，及其它调节元件，都已在上文中描述。启动子优选具有在严格条件下与SEQ IDNO：1或其互补序列杂交的核酸序列；或者至少与SEQ ID NO：1有94％相同。在另一实施方案中，所述启动子具有在严格条件下与SEQ ID NO：2或其互补序列杂交的核酸序列；或者至少与SEQ ID NO：2有94％相同。在另一实施方案中，所述启动子具有在严格条件下与SEQ ID NO：14或其互补序列杂交的核酸序列；或者至少与SEQ ID NO：14有94％相同。
制备这样的重组载体的方法是本领域已知的。例如，制备特别适于植物转化的重组载体的方法可参见美国专利4,971,908,4,940,835,4,769,061和4,757,011。这些载体已有相关综述(Rodriguez等，1988；Glick等，1993)并且已在上文中描述。
可用细胞和高等植物中的表达的典型载体是本领域已知的，如衍生自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)肿瘤诱导(Ti)质粒的载体(Rogers等，1987)。其它可用于植物转化的重组载体也已有描述(Fromm等，1985)。这类重组载体的元件如上文所述。
被转化的宿主细胞通常可以是任何能容于本发明的细胞，优选原核细胞，更优选细菌细胞，还更优选土壤杆菌(Agrobacterium)，芽孢杆菌(Bacillus)，埃希氏菌(Escherichia)，假单胞菌(Pseudomonas)的细胞，最优选大肠埃希氏菌的细胞。
或者，被转化的宿主细胞优选真核细胞，更优选植物细胞、酵母细胞或真菌细胞。酵母细胞优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。植物细胞优选苜蓿，苹果，香蕉，大麦，菜豆，花椰菜，甘蓝，胡萝卜，蓖麻，芹菜，柑桔，三叶草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黄瓜，大蒜，葡萄，亚麻子，甜瓜，燕麦，油橄榄，洋葱，棕榈，防风，豌豆，花生，胡椒，马铃薯，萝卜，油菜籽，稻，黑麦，高梁，大豆，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，烟草，番茄或小麦的细胞。转化的宿主细胞更优选canola，玉米(maize)，或大豆的细胞；最优选大豆的细胞。
大豆细胞优选大豆优良品系。“优良品系”是经过育种和筛选而得到的具有出色的农艺表现的任何品系。优良品系的实例有面向农民或大豆种植者出售的品系，如HARTZTM品种H4994，HARTZTM品种H5218，HARTZTM品种H5350，HARTZTM品种H5545，HARTZTM品种H5050，HARTZTM品种H5454，HARTZTM品种H5233，HARTZTM品种H5488，HARTZTM品种HLA572，HARTZTM品种H6200，HARTZTM品种H6104，HARTZTM品种H6255，HARTZTM品种H6586，HARTZTM品种H6191，HARTZTM品种H7440，HARTZTM品种H4452 Roundup Ready，HARTZTM品种H4994 Roundup Ready，HARTZTM品种H4988 Roundup Ready，HARTZTM品种H5000 RoundupReadyTM，HARTZTM品种H5147 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H5247Roundup Ready，HARTZTM品种H5350 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H5545 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H5855 Roundup Ready，HARTZTM品种H5088 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H5164 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H5361 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H5566 RoundupReadyTM，HARTZTM品种H5181 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H5889Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H5999 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H6013 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H6255 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H6454 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H6686 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H7152 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H7550 RoundupReadyTM，HARTZTM品种H8001 Roundup Ready(HARTZ SEED，Stuttgart，Arkansas，U.S.A.)；A0868，AG0901，A1553，A1900，AG1901，A1923，A2069，AG2101，AG2201，A2247，AG2301，A2304，A2396，AG2401，AG2501，A2506，A2553，AG2701，AG2702，A2704，A2833，A2869，AG2901，AG2902，AG3001，AG3002，A3204，A3237，A3244，AG3301，AG3302，A3404，A3469，AG3502，A3559，AG3601，AG3701，AG3704，AG3750，A3834，AG3901，A3904，A4045AG4301，A4341，AG4401，AG4501，AG4601，AG4602，A4604，AG4702，AG4901，A4922，AG5401，A5547，AG5602，A5704，AG5801，AG5901，A5944，A5959，AG6101，QR4459和QP4544(Asgrow Seeds，Des Moines，Iowa，U.S.A.)；DeKalb品种CX445(DeKalb，Illinois)。
转基因植物优选苜蓿，苹果，香蕉，大麦，菜豆，花椰菜，甘蓝，胡萝卜，蓖麻，芹菜，柑桔，三叶草，椰子，咖啡，玉米(com)，棉花，黄瓜，大蒜，葡萄，亚麻子，甜瓜，燕麦，油橄榄，洋葱，棕榈，防风，豌豆，花生，胡椒，马铃薯，萝卜，油菜籽，稻，黑麦，高梁，大豆，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，烟草，番茄或小麦。转化的宿主植物更优选canola，玉米(maize)，大豆的细胞；最优选大豆植物。
转基因大豆植物优选性能优良的大豆植物。“性能优良的大豆植物”是经过育种和筛选而得到的具有出色的农艺表现的大豆品系所产生的任何植物。性能优良的植物的实例包括面向农民或大豆种植者出售的商品，如HARTZ品种H4994，HARTZTM品种H5218，HARTZTM品种H5350，HARTZ品种H5545，HARTZTM品种H5050，HARTZTM品种H5454，HARTZTM品种H5233，HARTZTM品种H5488，HARTZTM品种HLA572，HARTZTM品种H6200，HARTZTM品种H6104，HARTZTM品种H6255，HARTZTM品种H6586，HARTZTM品种H6191，HARTZTM品种H7440，HARTZ品种H4452RoundupReady，HARTZ品种H4994Roundup Ready，HARTZTM品种H4988RoundupReady，HARTZTM品种H5000Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H5147Roundup ReadyTM，HARTZ品种H5247 Roundup Ready，HARTZTM品种H5350Roundup Ready，HARTZTM品种H5545 Roundup Ready，HARTZTM品种H5855Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H5088 Roundup ReadyTM HARTZTM品种H5164 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H5361 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H5566 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H5181 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H5889 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H5999 RoundupReadyTM，HARTZTM品种H6013 Roundup ReadyTM，HARTZTM品种H6255Roundup Ready，HARTZTM品种H6454 Roundup Ready，HARTZTM品种H6686Roundup Ready，HARTZTM品种H7152 Roundup Ready，HARTZTM品种H7550Roundup Ready，HARTZTM品种H8001 Roundup Ready(HARTZ SEED，Stuttgart，Arkansas，U.S.A.)；A0868，AG0901，A1553，A1900，AG1901，A1923，A2069，AG2101，AG2201，A2247，AG2301，A2304，A2396，AG2401，AG2501，A2506，A2553，AG2701，AG2702，A2704，A2833，A2869，AG2901，AG2902，AG3001，AG3002，A3204，A3237，A3244，AG3301，AG3302，A3404，A3469，AG3502，A3559，AG3601，AG3701，AG3704，AG3750，A3834，AG3901，A3904，A4045AG4301，A4341，AG4401，AG4501，AG4601，AG4602，A4604，AG4702，AG4901，A4922，AG5401，A5547，AG5602，A5704，AG5801，AG5901，A5944，A5959，AG6101，QR4459和QP4544(Asgrow Seeds，Des Moines，Iowa，U.S.A.)；DeKalb品种CX445(DeKalb，Illinois)。
其它生物
可将上述任一种启动子和结构核酸序列引入任何细胞或生物，如哺乳动物细胞，哺乳动物，鱼的细胞，鱼，鸟的细胞，鸟，藻类的细胞，藻类，真菌的细胞，真菌，或细菌的细胞。优选的宿主和转化体包括：真菌细胞如曲霉菌，酵母，哺乳动物(尤其牛和猪)，昆虫，细菌和藻类。转化这类细胞或生物的方法是本领域已知的(EP 0238023；Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A)，81：1470-1474(1984)；Malardier等，Gene，78：147-156(1989)；Becker和Guarente，在：Abelson和Simon(eds.，)，Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology中，Methods Enzymol.，Vol.194，pp.182-187，AcademicPress，Inc.，New York；Ito等，J.Bacteriology，153：163(1983)；Hinnen等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，75：1920(1978)；Bennett和LaSure(eds.)，MoreGene Manipulations in Fungi，Academic Press，CA(1991)，它们都全文引入本文作为参考)。从这类生物体产生本发明的蛋白的方法也是已知的(Kudla等，EMBO，9：1355-1364(1990)；Jarai和Buxton，Current Genetics，26：2238-2244(1994)；Verdier，Yeast，6：271-297(1990)；MacKenzie等，JournaZ ofGen.Microbiol.，139：2295-2307(1993)；Hartl等，TIBS，19：20-25(1994)；Bergeron等，TIBS，19：124-128(1994)；Demolder等，J.Biotechnology，32：179-189(1994)；Craig，Science，260：1902-1903(1993)；Gething和Sambrook，Nature，355：3345(1992)；Puig和Gilbert，J.Biol.Chem.，269：7764-7771(1994)；Wang和Tsou，FASEB Journal，7：1515-1517(9193)；Robinson等，BiolTechnology，1：381-384(1994)；Enderlin和Ogrydziak，Yeast，10：67-79(1994)；Fuller等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，86：1434-1438(1989)；Julius等，Cell，37：1075-1089(1984)；Julius等，Cell，32：839-852(1983)，它们都全文引入本文作为参考)。
制备转化的宿主细胞的方法
本发明还涉及制备转化的宿主细胞的方法，所述宿主细胞包含按照5’至3’方向排列的启动子以及与其可操作相连的异源结构核酸序列。还可将其它序列与启动子和结构核酸序列一起引入所述宿主细胞中。所述其它序列可包括3’转录终止子，3’聚腺苷酸化信号，其它非翻译序列，转位或靶向序列，选择标记，增强子，以及操纵子。
优选的重组载体，结构核酸序列，启动子，以及其它调节元件已在上文中描述。启动子优选具有在严格条件下与SEQ ID NO：1或其互补序列杂交的核酸序列；或者至少与SEQ ID NO：1有94％相同。在另一实施方案中，所述启动子具有在严格条件下与SEQ ID NO：2或其互补序列杂交的核酸序列；或者至少与SEQ ID NO：2有94％相同。在另一实施方案中，所述启动子具有在严格条件下与SEQ ID NO：14或其互补序列杂交的核酸序列；或者至少与SEQ ID NO：14有94％相同。
所述方法通常包括选择适当的宿主细胞，用重组载体转化该宿主细胞，和获得转化的宿主细胞等步骤。
有多种方法可将核酸引入宿主细胞。适当的方法包括细菌感染(例如土壤杆菌)，二元细菌人工染色体载体，DNA的直接运送(例如经由PEG-介导的转化，干燥/抑制作用-介导的DNA摄入，电穿孔，用碳化硅纤维进行的搅拌，以及对DNA包被的粒子进行加速，等等(见Potrykus等，1991的综述)。
将DNA引入细胞的技术为本领域技术人员所熟知。这些方法通常被归类为4类：(1)化学方法(Graham和van der Eb，1973；Zatloukal等，1992)；(2)物理方法如显微注射(Capecchi，1980)，电穿孔(Wong和Neumann，1982；Fromm等，1985；美国专利5,384,253)和粒子加速(Johnston和Tang，1994；Fynan等，1993)；(3)病毒载体(Clapp，1993；Lu等，1993；Eglitis和Anderson，1988)；以及(4)受体-介导的机制(Curiel等，1992；Wagner等，1992)。或者，可以直接将核酸引入花粉，方法是直接注射植物的繁殖器官(Zhou等，1983；Hess，1987；Luo等，1988；Pena等，1987)。也可以将核酸注入未成熟的胚(Neuhaus等，1987)。
用于转化宿主细胞的重组载体按照5’至3’方向包含：指导结构核酸序列转录的启动子，结构核酸序列，3’转录终止子，和3’聚腺苷酸化信号。该重组载体还可包含非翻译核酸序列，转位和靶向核酸序列，选择标记，增强子，或操纵子。
合适的重组载体，结构核酸序列，启动子，以及其它调节元件已在上文中描述。
转化的宿主细胞通常为能与本发明相容的任何细胞，优选原核细胞，更优选细菌细胞，还更优选土壤杆菌、节杆菌(Arthrobacter)、固氮螺菌(Azospyrillum)、棍状杆菌(Clavibacter)、埃希氏菌、假单胞菌、根瘤杆菌(Rhizobacterium)的细胞，最优选大肠埃希氏菌的细胞。或者，转化的宿主细胞优选真核细胞，更优选植物、酵母、或真菌细胞，最优选苜蓿，香蕉，大麦，菜豆，甘蓝，胡萝卜，蓖麻，芹菜，三叶草，椰子，玉米(corn)，棉花，黄瓜，亚麻子，甜瓜，油橄榄，棕榈，防风，豌豆，花生，胡椒，马铃薯，萝卜，油菜籽，稻，大豆，菠菜，向日葵，烟草，番茄或小麦植物的细胞。转化的宿主细胞更优选canola，玉米(maize)，或大豆的细胞；最优选大豆细胞。大豆细胞优选优良大豆的细胞(如上述)。
制备转基因植物的方法
本发明还涉及制备转基因植物的方法，所述植物包含按照5’至3’方向排列的启动子以及与其可操作相连的异源结构核酸序列。还可将其它序列与启动子和结构核酸序列一起引入所述植物中。所述其它序列可包括3’转录终止子，3’聚腺苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转位或靶向序列，选择标记，增强子，以及操纵子。
优选的重组载体，结构核酸序列，启动子，以及其它调节元件已在上文中描述。启动子优选具有在严格条件下与SEQ ID NO：1或其互补序列杂交的核酸序列；或者至少与SEQ ID NO：1有94％相同。在另一实施方案中，所述启动子具有在严格条件下与SEQ ID NO：2或其互补序列杂交的核酸序列；或者至少与SEQ ID NO：2有94％相同。在另一实施方案中，所述启动子具有在严格条件下与SEQ ID NO：14或其互补序列杂交的核酸序列；或者至少与SEQ ID NO：14有94％相同。
所述方法通常包括选择合适的植物细胞，用重组载体转化该植物细胞，获得转化的宿主细胞，在能有效产生植物的条件下培养该转化的宿主细胞。
转基因植物一般可以是任何类型的植物，优选具有农艺、园艺、观赏、经济、或商业价值的植物，更优选苜蓿，苹果，香蕉，大麦，菜豆，花椰菜，甘蓝，胡萝卜，蓖麻，芹菜，柑桔，三叶草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黄瓜，道格拉斯冷杉(Douglas fir)，桉树，大蒜，葡萄，火炬松(Loblollypine)，亚麻子，甜瓜，燕麦，油橄榄，洋葱，棕榈，防风，豌豆，花生，胡椒，杨树，马铃薯，萝卜，Radiata pine，油菜籽，稻，黑麦，高梁，Southernpine，大豆，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，枫香(Sweetgum)，茶，烟草，番茄，turf，或小麦。转化的植物更优选canola，玉米(maize)，大豆的细胞；最优选大豆植物。大豆植物优选优良大豆植物。优良植物是来源于优良品系的任何植物。优良品系如上所述。
从转化植物的原生质体或外植体再生、发育和培养植物的方法为本领域熟知(Weissbach和Weissbach，1988；Horsch等，1985)，在该方法中，通常在能选择成功转化的细胞并诱导植物苗枝再生的选择培养基存在的条件下培养转化体(Fraley等，1983)。这些苗枝通常在2-4个月内获得。
然后将苗枝转移至合适的根-诱生培养基中，该培养基中包含选择试剂以及阻止细菌生长的抗生素。大多数苗枝将发育出根。然后将它们移植到土壤或其它基质中，以使根继续发育。以上概述的方法常常根据所用具体植物株系的不同而有变动。
优选再生的转基因植物能自花授粉，从而提供纯合型转基因植物。或者，可将所述再生转基因植物的花粉与非-转基因植物杂交，优选农艺上重要的物种的近交系。反过来，可用非-转基因植物的花粉对所述再生转基因植物授粉。
转基因植物可将编码抗真菌蛋白的核酸传给它的后代。转基因植物优选为抗真菌蛋白的编码核酸的纯合型，能通过有性繁殖将该序列传递给它的所有后代。后代可以从转基因植物所产生的种子发育而成。这些另外的植物然后可通过自花授粉产生纯种植物品系。
可对这些植物的后代进行评估，例如，评估其基因表达。基因表达可通过多种常用方法来检测，如western印迹，northern印迹，免疫沉淀，和ELISA。
融合蛋白
上述任一种结构核酸序列及其修饰形式可与附加的核酸序列相连，以编码融合蛋白。所述附加的核酸序列优选编码至少一个氨基酸，肽，或蛋白。融合蛋白的制备是本领域的常规技术，有多种可能的融合组合。
例如，融合蛋白可提供便于检测该融合蛋白的“标记”表位，如GST，GFP，FLAG，或polyHIS。这类融合优选编码1-50个氨基酸，更优选5-30个附加的氨基酸，还更优选5-20个氨基酸。
或者，所述融合可提供调节功能、酶活性、细胞信号传递功能、或细胞内转运功能。例如，可添加编码叶绿体转运肽的序列，以便将融合蛋白引向植物细胞内部的叶绿体。这类融合配对物优选编码1-1000个附加的氨基酸，更优选5-500个附加的氨基酸，还更优选10-250个氨基酸。
序列分析
本发明中，序列相似性或同一性优选用Sequence Analysis SoftwarePackage(Version 10；Genetics Computer Group，Inc.，University of WisconsinBiotechnology Center，Madison，WI)中的“Best Fit”或“Gap”程序来确定。“Gap”程序利用Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch，1970)寻找两个序列之间能使匹配数最大而使空隙数最小的对比排列。“BestFit”程序是对两个序列之间相似性的最佳节段进行最佳对比排列。用Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith和Waterman，1981；Smith等，1983)，通过***空隙，使匹配数最大化，可找出最佳对比排列。
上述Sequence Analysis Software Package还包含数个另外的序列分析工具，它们可用于鉴定本发明核苷酸和氨基酸序列的同源性。例如，“BLAST”程序(Altschul等，1990)在特定的数据库(例如，National Center forBiotechnology Information(NCBI)，Bethesda，Maryland，USA的数据库)中搜索与查询(query)序列(肽或核酸)相似的序列；“FastA”(Lipman和Pearson，1985；see also Pearson and Lipman，1988；Pearson等，1990)对查询序列与一组相同类型的序列(核酸或蛋白)之间的相似性进行Pearson and Lipman搜索；“TfastA”对查询序列与任意组核苷酸序列之间的相似性进行Pearson andLipman搜索(它先翻译出所有6个读码框中的核苷酸序列，然后进行比较)；“FastX”对核苷酸查询序列与一组蛋白序列之间的相似性进行Pearson andLipman搜索，它考虑了移码效应；“TfastX”对蛋白查询序列与任意组核苷酸序列之间的相似性进行Pearson and Lipman搜索，它考虑了移码效应(它先对核酸序列的两条链都进行翻译，然后进行比较)。
探针和引物
本发明中，可制备并利用能与互补核酸序列特异性杂交的短核酸序列。这些短核酸分子可作为探针用于鉴定给定的样品中互补核酸序列的存在。因此，通过构建与特定核酸序列的一小部分互补的核酸探针，可检测和评估该核酸序列的存在。
这些探针的应用可大大促进对含本文公开之启动子和结构核酸序列的转基因植物的鉴定。这些探针还可用于在cDNA文库或基因组文库中筛选与本文公开之启动子和结构核酸序列相关或同源的其它核酸序列。
或者，可用上述短核酸序列作为寡核苷酸引物，利用PCR技术使互补核酸序列扩增或突变。这些引物还可促进对相关互补核酸序列的扩增(例如来自其它物种的相关核酸序列)。
短核酸序列可用作探针，尤其是作为PCR探针。PCR探针是在与另一核酸所形成的双链结构中能启动聚合酶活性的核酸分子。确定PCR探针的结构的各种方法以及PCR技术都是本领域已知的。例如，可用诸如Primer3( www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi)，STSPipeline(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/www.STS_Pipeline)，或GeneUp(Pesole等，1998)等计算机搜索程序来鉴定潜在的PCR引物。
引物或探针通常与将要被鉴定、扩增、或突变的核酸序列的一部分互补。引物或探针的长度应足以与其互补体形成稳定的序列特异性双链分子。引物或探针的长度优选为约10-200个核苷酸，更优选为约10-100个核苷酸，还更优选为约10-50个核苷酸，最优选为约14-30个核苷酸。
引物或探针可直接化学合成，通过PCR(美国专利4,683,195和4,683,202)制备，或通过从较大的核酸分子中切出特异性核酸片段而制备。
实施例
以下实施例用于举例说明本发明，不应理解为对本发明范围的任何限制。本领域技术人员将认识到，可对本文所述的方法和基因进行各种修饰，截短，附加，但不背离本发明的精神和范畴。
实施例1：制备Arcelin启动子
从USDA种子贮藏中心(USDA，ARS，Washington State University，Regional Plant Introduction Station，59 Johnson Hall，P.O.Box 646402，Pullman，Washington，USA 99164-6402)获得菜豆引进的基因型G02771的含Arcelin-5种子蛋白的种子。设计并优化PCR方法，以获得来自Arcelin-5核酸序列的片段。得到以下6种Arcelin-5片段：
启动子区(1.8Kb)；转录起始位点上游的启动子区(TATA盒)(1.7Kb)；3′UTR区(终止子)(1.3Kb)；含取代的5′UTR(dSSU大豆5′UTR)的启动子区(1.8Kb)；基因组克隆(4Kb)；以及编码区。
类似地获得含有其它Arcelin启动子(例如，Arcelin-3(PI 41683)，Arcelin-4(PI 417775)的引进型基因型。用上述PCR方法对Arcelin-3和Arcelin-4启动子进行克隆。图1和4a-e显示了Arcelin-3，-4，和-5启动子序列的比对。Arcelin3和Arcelin-4核酸序列有99％相同。Arcelin-5启动子核酸序列与Arcelin-3和Arcelin-4核酸序列有93％相同。核酸序列之间的具体差异也示于图1中。
另外还构建了Arcelin-5启动子的一种缺失突变体。该启动子核酸序列缺失了近600个碱基对。该截短的核酸序列被命名为T-Arc5(SEQ ID NO：1)。表2列出了各种Arcelin和7Sα’启动子构建体。pMON55540是可用于表达GUS或Arcelin 5基因的代表性构建体，其质粒图谱示于图6中。启动子7S-1A，7S-2A，和7S-3A可参见2001年9月5日提交的题为“Improved SeedSpecific 7sa Promoter for Expression of Genes in Plants”的美国临时专利申请60/316,975，该申请全文引入本文作为参考。
表2  Arcelin和7Sα’启动子构建体
  质粒命名   启动子   编码区   3’UTR   5’UTR   注
  pMON13773(阳性对照)   7Sα’   GUS   NOS   天然
  pMON 55524   P-PvArc5   GUS   NOS   天然   Arcelin-5启动子
  pMON 55525   P-PvArc5   GUS   NOS   天然   拟南芥载体
  pMON 55526   P-PvArc5   GUS   NOS   天然   大豆载体
  pMON 55527   T-Arc5   GUS   NOS   天然   截短的Arcelin-5启动子
  pMON 55528   P-PvArc5   GUS   Arc.5   天然
  pMON 55529   T-Arc5   GUS   NOS   dSSU
  pMON 55533   P-PvArc5   GUS   E9   天然
  pMON 55534   T-Arc5   GUS   ADR12   天然
  pMON 55535   T-Arc5   GUS   E9   天然
  pMON 55536   T-Arc5   GUS   NOS   PetHSP70
  pMON 55537   T-Arc5   GUS   NOS   GmHSP17.9
  pMON 55538   P-PvArc5   GUS   NOS   天然   Arcelin-3启动子
  pMON 55539   P-PvArc5   GUS   NOS   天然   Arcelin-4启动子
  pMON 55540   T-Arc5   GUS   E9   GmHSP17.9
  pMON 55541   T-Arc5   GUS   NOS   天然   拟南芥载体
  pMON 55542   T-Arc5   GUS   NOS   天然   大豆载体
  pMON 55543   P-PvArc5   GUS   Arc.5   天然   大豆载体
  pMON 55544   P-PvArc5   GUS   ADR12   天然
  pMON 55545   P-PvArc5   GUS   Arc.5   天然   拟南芥载体
  pMON 55546   7S-2A   GUS   NOS   天然   新的7Sα启动子
  pMON 55547   7S-3A   GUS   NOS   天然   新的7Sα启动子
  pMON 55548   7S-1A   GUS   NOS   天然   新的7Sα启动子
  pMON 55550   Arcelin-5   Arc.5   Arc.5   Arc5   拟南芥载体
  pMON 55551   Arcelin-5   Arc.5   Arc.5   Arc5   大豆载体
实施例2：转化大豆子叶
大豆子叶用pMON58100，13773，55524，55527，55538，和55539(见表2)经粒子轰击法进行瞬时转化。简短说，Asgrow A3244大豆植物于播种的25-28天后收获种子。将种子在添加了50mM谷氨酰胺，11mM麦芽糖，125mM棉籽糖，125mM甘露醇，和3g/L纯化琼脂的Gamborg′s Media(G5893，SigmaAldrich Company，St.Louis，MO)，pH 5.6中进行渗透处理，25℃避光过夜。所得半种子用2μg/μl Arcelin和7Sα’启动子构建体进行轰击。每种启动子构建体以1∶1的比例含有e35S驱动的萤光素酶构建体作为内部对照。受轰击的组织在25℃保温48小时。
实施例3：分析Arcelin启动子的活性
分析经轰击后的组织中GUS和萤光素酶活性的表达。从6种经轰击的大豆子叶中提取蛋白，所用的1ml提取缓冲液含有0.1M磷酸钾(pH 7.8)，10mM DTT，1mM EDTA，5％甘油，以及蛋白酶抑制剂混合物(1片/50ml；#1697498，Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)。将蛋白提取物分为100μl的等份试样，按照厂家(Steady-GloTM，#E2510，Promega Corporation，Madison，WI)建议测试其萤光素酶活性。GUS活性用50μl等份试样按照标准方法略经修改(Maiiga等，1995，：Methods in Plant Molecular Biology，ALaboratory Course Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第29页)进行测定。GUS活性参照作为内部对照的萤光素酶活性进行标准化。图2提供了三次独立实验(平行进行)的结果。这些结果表明，Arcelin-5启动子显著强于作为基准的7Sα’启动子。Arcelin-3和Arcelin-4启动子至少与作为基准的7Sα’一样强。
实施例4：转基因大豆中由Arcelin启动子启动的表达
为进一步鉴定Arcelin启动子，培养了多株转基因大豆植物，它们分别含有Arcelin-5启动子/GUS/NOS转基因表达盒(pMON55526)或7Sα’启动子/GUS/NOS转基因表达盒(pMON39319)。对这些植物进行初步筛选，以排除不表达转基因者。然后分析表达pMON55526的17个品种和表达pMON39319的6个品种的GUS活性。
简短说，从每个品种选出4个种子，研成细粉。将约20mg经研磨的种子粉末与含0.1M磷酸钾(pH 7.8)，10mM DTT，1mM EDTA，5％甘油，以及蛋白酶抑制剂混合物(1片/50ml；#1697498，Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)的0.2ml提取缓冲液混合。将混合物室温保温，然后于4℃以6000xg离心20分钟。收集约0.1ml上清，用于测定蛋白浓度和GUS活性。蛋白浓度用Bio-Rad Protein Assay(#500-0006，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)测定。GUS活性按照略经改动的标准方法(Maliga等，1995，Methods in Plant Molecular Biology，A Laboratory Course Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，第29页)测定。
图3显示了每种种子的GUS活性，经标准化后表示为其相应的蛋白含量。这些结果表明，Arcelin-5启动子比作为基准的7Sα’启动子强2-4倍。
实施例5：用T-Arc5启动子在大豆子叶中表达GUS
测试了6种构建体在大豆子叶中对GUS报告基因的表达。所用方法同上述实施例1-4。图5显示了6种具有不同于上述(SEQ ID NO：1)的T-Arc5启动子(SEQ ID NO：2)以及GUS编码序列的构建体。这些构建体的5′UTR为GmHSP 17.9(SEQ ID NO：3)，PetHSP70(SEQ ID NO：4)，GmdSSU(SEQ IDNO：5)或Arcelin-55′UTR。3’终止子为ADR12(SEQ ID NO：6)，E9(SEQ IDNO：7)，或Arcelin-53’终止子(SEQ ID NO：8)。pMON55540如图6所示的质粒图谱是一例可用于在大豆子叶中表达图5所示构建体的载体实例。GUS活性分析结果见图7。
尽管本发明的组合物和方法以优选实施方案的方式予以描述，但显然本领域技术人员可以理解，在不背离本发明的概念、精神和范围的前提下，可对本文所述方法进行各种修饰。所有这类对本领域技术人员显而易见的相似取代和修饰都将包括在本发明的精神、范围和概念中。
参考文献
本文中为了举例说明或为了其它详细补充的目的所引用的以下文献都特别引入本文作为参考。
Ainley等，Plant Mol.Biol.14：949，1990.
Altschul等，″Basic local alignment search tool.″Journal of Molecular Biology215：403-410，1990.
Andreas等，Theor.Appl.Genet.，72，123-128，1986.
Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，1995.
Battraw and Hall，Plant Sci.86(2)：191-202，1992.
Back等，PZantMol.Biol.17：9，1991.
Bauer等，Gene，37：73，1985.
Bent等，Science，265：1856-1860，1994.
Bol等，Ann.Rev.Phytophathol，28：13-138，1990.
Bowles，Ann.Rev.Biochezn，59：873-907，1990.
Braun and Hemenway，Plant Cell，4(6)：735-744，1992.
Broekaert等，Critical Reviews in Plant Sciences，16(3)：297-323，1997.
Bustos，M.M.等，EMBO J.10：1469-1479，1991.
Castresana，C.等，EMBO J.7：1929-1936，1988.
Capecchi，Cell，22(2)：479-488，1980.
Cashmore等，Gen.Eng.of Plants，Plenum Press，New York，29-38，1983.
Cerda-Olmedo等，J.Mol.Biol.33：705-719，1968.
Chau等，Science，244：174-181.1989.
Christensen等，Plant Mol.Biol.，18：675，689，1992.
Christon等，Plant Physiol.，87：671-674，1988.
Christou等，Bio/Technology 9：957，1991.
Clapp，Clin.Perinatol.，20(1)：155-168，1993.
Costa等Methods Mol.Biol.57：31-44，1996.
Craik，BioTech7ziques，3：12-19，1985.
Curiel等，Hum.Gen.Ther.，3(2)：147-154，1992.
Davey等，Sump.Soc.Exp.Biol.40：85-120，1986.
Davey等，Plant Mol.Biol.13(3)：273-285，1989.
De Kathen and Jacobsen，Plant Cell Rep.9(5)：276-9，1990.
Dellaporta等，Stadler Symposium 11：263-282，1988.
Dela Pena等，Nature 325：274，1987.
Deng and Nickloff，Anal.Biochem.200：81，1992.
Doyle，J.J.等，J.Biol.Chem.261：9228-9238，1986.
Eglitis and Anderson，Biotechniques，6(7)：608-614，1988.
Ellis等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，92：4185，1995.
Feinbaum，R.L.等，Mol.Gen.Genet.226：449-456，1991.
Fitchen and Beachy，Ann.Rev.Microbiol.47：739-763，1993.
Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：4803，1983.
Frits Eckstein等，Nucleic Acids Research，10：6487-6497，1982.
Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82(17)：5824-5828，1985.
Fromm等，BiolTechnology 8：833，1990.
Fynan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90(24)：11478-11482，1993.
Gasser and Fraley，Science 244：1293，1989.
Glick等Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，CRC Press，Boca Raton，Fla.，1993.
Goossens等，Eur.J.Biochem.，225，787-95，1994.
Goossens等，Plant Physiol.，120，1095-1104，1999.
Gordon-Kamm等，Plant Cell，2：603，1990.
Graham and Van der Eb，Virology，54(2)：536-539，1973.
Grant等，Plant Cell Rep.15(3/4)：254-2581995.
Grant等，Science，269：843-846，1995.
Greener等Mol.Biotechnol.7：189-195，1997.
Guerola等Nature New Biol.230：122-125，1971.
Harlow and Lane，In：Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，New York，1988.
Hershey，H.P.and Stoner，T.D.，Plant Mol.Biol.17：679-690，1991Hess，Intern Rev.Cyrol.，107：367，1987.
Hinchee等，Bio/Technology 6：915-922，1988.
Horsch etal.，Science，227：1229-1231，1985.
Ikatu等，Bio/Technol.8：241-242，1990.
Jefferson(I)，Plant Mol.Biol，Rep.5：387-405，1987.
Jefferson(II)等，EMBO J.6：3901-3907，1987.
Johnston and Tang，Methods Cell Biol.，43(A)：353-365，1994.
Jones等，Science，266：789-793，1994.
Kares等，Plant Mol.Biol.15：905，1990.
Katz等，J.Gen.Microbiol.129：2703-2714，1983.
Kawasaki E.S.，In：PCR TMProtocols，A Guide to Methods and Applications，Innis等，Eds.，Academic Press，San Diego，21-27，1990.
Kay等，Science，236：1299，1987.
Keller，etal.，EMBOL.，8：1309-1314，1989.
Knutzon等，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.89：2624-2628，1992.
Koziel等，Bio/Technology 11：194，1993.
Kridl等，种子Sci.Res.1：209，1991.
Kuby，″Immunology，″2d Edition.W.H.Freeman and Company，New York，1994.
Kuhlemeier等，Plant Cell 1：471，1989.
Kunkel，T.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：488-492，1985.
Kyte and Doolittle，J.Mol.Biol.，157：105-132，1982.
Lam，E.and Chua，N.H.，J.Biol.Chem.266：17131-17135，1990.
Lam and Chua，Science 248：471，1991.
Laemmli，Nature，227：680-685，1970.
Lioi and Bollini，Bean Improvement Cooperative，32：28，1989.
Lipman，D.J.and Pearson，W.R.，″Rapid and Sensitive Protein SimilaritySearches，″Science，227：1435-1441，1985.
Lindstrom等，Developmental Genetics，11：160，1990.
Linthorst，Crit.Rev.Plant Sci.，10：123-150，1991.
Logemann等，Plant Cell，1：151-158，1989.
Lu，etal.，J.Exp.Med.，178(6)：2089-2096，1993.
Luo，etal.，PlantMolBiol.Reporter，6：165，1988.
Maloy等，″Microbial Genetics″2nd Edition，Jones and Barlett Publishers，Boston，MA，1994.
Mandel等，Plant Mol.Biol，29：995-1004，1995.
McCabe等，Bioteclvraolgy，6：923，1988.
McElroy等，Plant Cell，2：163-171，1990.
Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，″A General Method Applicable to theSearch for Similarities in the Amino Acid序列of Two Proteins，″Journal ofMolecular Biology 48：443-453，1970.
Neuhaus等，Theor.Appl.Genet.，75：30，1987.
Odell等，Nature，313：810，1985.
Osborn等，Theor.Appl.Genet.，71，847-55，1986.
Osuna等，Critical Reviews In Microbiology，20：107-116，1994.
Ou-Lee等，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.83：6815，1986.
Ow等，Science 234：856-859，1986.
Pearson，W.R.and Lipman，D.J.(1988).Improved Tools for BiologicalSequence Analysis.Proceedings of the National Academy of Sciences USA85，2444-2448.
Pearson，W.R.，″Rapid and  Sensitive序列Comparison with FASTP andFASTA.″In Methods in Enzymology，(R.Doolittle，ed.)，183，63-98，Academic Press，San Diego，California，USA，1990.
Pearson，W.R.(1995).Comparison of Methods for Searching Protein SequenceDatabases.Protein Science 4，1145-1160.
Pena等，Nature，325：274，1987.
Perlak等，Bio/Bechnology，8：939-943，1990.
Perlak等，Plant Molecular Biology，22：313-321，1993.
Pesole等，BioTechniques 25：112-123，1998
Poszkowski等，EMBO J.，3：2719，1989.
Potrykus等，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，42：205，1991.
Potrykus等，Mol.Gen.Genet.199：183-188，1985.
Pyee等，Plant J.，7：49-59，1995.
Rhodes等，Science 240：204，1988.
Richins等，Nucleic Acids Res.20：8451，1987.
Rodriguez等Vectors：A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses，Butterworths，Boston，1988.
Rogan and Bessman，J.Bacteriol.103：622-633，1970.
Rogers等，Meth.In Enzymol，153：253-277，1987.
Samac等，Plant Cell，3：1063-1072，1991.
Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989.
Schroeder等，Plant J.，2：161-172，1992.
Schroeder等，PlantPhysiol.101(3)：751-757，1993.
Schulze-Lefert等，EMBO J.8：651，1989.
Simpson，Science，233：34，1986.
Singer and Kusmierek，Ann.Rev.Biochem.52：655-693，1982.
Slighton and Beachy，Planta 172：356，1987.
Smith等，In：Genetic Engineering：Principles and Methods，Setlow等，Eds.，Plenum Press，N.Y.，1-32，1981.
Smith，T.F.and Waterman，M.S.，″Comparison of Bio-Sequences，″Advances inApplied Mathematics，2：482-489，1981.
Smith，T.F.，Waterman，M.S.，and Sadler，J.R.，″Statistical Characterization ofNucleic Acid Sequence Functional Domains，″Nucleic Acids Research 11：2205-2220，1983.
Somers等，Bio/Technology，10：1589，1992.
Stalker等，J.Biol.Chem.263：6310-6314，1988.
Sutcliffe等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)75：3737-3741，1978.
Thillet等，J.Biol.Chem.263：12500-12508，1988.
Vandeyar等Gene 65：129-133，1988
Van Tunen等，EMBO J.7：1257，1988.
Vasil，Biotechnology，6：397，1988.
Vasil等，Bio/Technology 10：667，1992.
Vodkin等，Cell，34：1023，1983.
Vogel等，J.Cell Biochem.，(Suppl)13D：312，1989.Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(13)：6099-6103，1992.
Watkins，Handbook of Insecticide Dust Diluents and Carriers，Second Edition，Darland Books，Caldwell，N.J.
Weissbach and Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，(Eds.)，Academic Press，Inc.，San Diego，CA，1988.
Weisshaar等，EMBO J.10：1777-1786，1991.
Wenzler，etal.，PlantMol.Biol.，12：4l-50，1989.
whitham等，Cell，78：1101-1115，1994.
Williams等，Biotechnology 10：540-543，1992.
Winnacker-Kuchler，Chemical Technology，Fourth Edition，Volume 7，HanserVerlag，Munich，1986.
Wolf等，Compu.Appl.Biosci，4(1)：187-91，1988.
Wong and Neumann，Biochim.Biophys.Res.Commun.，107(2)：584-587，1982.
Wu等，Plant Cell，7(9)：1357-1368，1995.
Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：4144-48，1990.
Yamaguchi-Shinozaki等，Plant Mol.Biol.15：905，1990.
Zatloukal等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，660：136-153，1992.
Zhang and Wu，Theor.Appl.Genet.76：835，1988.
Zhou等，Methods in Enzymology，101：433，1983.
Zukowsky等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)80：1101-1105，1983.zU.S.Pat.Nos.3,959,493；4,533,557；4,554,101；4,683,195；4,683,202；4,713,245；4,757,011；4,769,061；4,826,694；4,940,835；4,971,908；5,384,253；and 5,689,052.
European Patent Application Nos.0154204；0218571；0255378；and 0385962.
                             序列表
<110>王琦(wang，qi)
     帕特里克.杜波依斯(Dubois，Patrice)
     梁继红(Liang，Jihong)
     蒂姆.乌尔马索夫(Oulmassov，Tim)
<120>Arceline-5启动子及其应用
<130>13587.106
<150>US 60/255879
<151>2000-12-18
<160>14
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1148
<212>DNA
<213>菜豆(Phaseolus vulgaris)
<400>1
taggatcctt caatagaaaa tgtgttattt cctcatcacc agacaaaggg gcaacagtta    60
acaaaacaaa tttatgtttc atttgagatt aaggaaggta aggaagaaaa aagattaaaa    120
aaaatgtcct tatctctttg tttctgtaat aataatataa gagacttaaa cttttaatat    180
aataattgta attaggtttt ctagtcatga gcaccactca gagacaagat ttcaagaaaa    240
caattttgtt aaacatctta ttagaaactt ttagttaagt cttgaagtta gaattaaaca    300
aaaaaaatta cacacgagaa acacaataaa cccactaccg tcaggttatc ataaggatga    360
aatgttttga tatcattaaa tataacacac acaaaaatac atctaattat aacaatatat    420
gttatacata tatttttgta aaaacttaga gtttttcaaa acattctaat acatgattag    480
agtttataga aatacaaata tttaaaaaat ataattttaa aaaaacattc taaagtcatt    540
cagatcctct cacacctgtg tgatcattta gtcatgtatg tagtacaatc attgtagttc    600
acaacagagt aaaataaata aggataaact agggaatata tataatatat acaattaaat    660
aaaaaaggga aaatcaaatt agaatttttg attccccaca tgacacaact caccatgcac    720
gctgccacct cagctccctc ctctccacac atgtctcatg tcactttcga ctttggcttt    780
ttcactatga cacaactcgc catgcatgtt gccacgtgag ctccttcctc ttcccatgat    840
gacaccactg ggcatgcatg ctgccacctc agctcccacc tcttctcatt atgagcctac    900
tggccatgca cactgccacc tcagcactcc tctcacttcc cattgctacc tgccaaaccg    960
cttctctcca taaatatcta tttaaattta aactaattat ttcatatact tttttgatga    1020
cgtggatgca ttgccatcgt tgtttaataa ttgttaattt ggagttgaat aataaaatga    1080
aagaaaaaag ttggaaagat tttgcatttg ttgttgtata aatagagaag agagtgatgg    1140
ttaatgca                                                             1148
<210>2
<211>1122
<212>DNA
<213>菜豆(Phaseolus vulgaris)
<400>2
ggatccttca atagaaaatg tgttatttcc tcatcaccag acaaaggggc aacagttaac    60
aaaacaaatt tatgtttcat ttgagattaa ggaaggtaag gaagaaaaaa gattaaaaaa    120
aatgtcctta tctctttgtt tctgtaataa taatataaga gacttaaact tttaatataa    180
taattgtaat taggttttct agtcatgagc accactcaga gacaagattt caagaaaaca    240
attttgttaa acatcttatt agaaactttt agttaagtct tgaagttaga attaaacaaa    300
aaaaattaca cacgagaaac acaataaacc cactaccgtc aggttatcat aaggatgaaa    360
tgttttgata tcattaaata taacacacac aaaaatacat ctaattataa caatatatgt    420
tatacatata tttttgtaaa aacttagagt ttttcaaaac attctaatac atgattagag    480
tttatagaaa tacaaatatt taaaaaatat aattttaaaa aaacattcta aagtcattca    540
gatcctctca cacctgtgtg atcatttagt catgtatgta gtacaatcat tgtagttcac    600
aacagagtaa aataaataag gataaactag ggaatatata taatatatac aattaaataa    660
aaaagggaaa atcaaattag aatttttgat tccccacatg acacaactca ccatgcacgc    720
tgccacctca gctccctcct ctccacacat gtctcatgtc actttcgact ttggcttttt    780
cactatgaca caactcgcca tgcatgttgc cacgtgagct ccttcctctt cccatgatga    840
caccactggg catgcatgct gccacctcag ctcccacctc ttctcattat gagcctactg    900
gccatgcaca ctgccacctc agcactcctc tcacttccca ttgctacctg ccaaaccgct    960
tctctccata aatatctatt taaatttaaa ctaattattt catatacttt tttgatgacg    1020
tggatgcatt gccatcgttg tttaataatt gttaatttgg agttgaataa taaaatgaaa    1080
gaaaaaagtt ggaaagattt tgcatttgtt gttgtataaa ta                       1122
<210>3
<211>76
<212>DNA
<213>大豆(Glycine max)
<400>3
acacagaaac attcgcaaaa acaaaatccc agtatcaaaa ttcttctctt tttttcatat    60
ttcgaaagat tt aaaa                                                   76
<210>4
<211>91
<212>DNA
<213>茄(Petunia sp.)
<400>4
aacagaaaaa tttgctacat tgtttcacaa acttcaaata ttattcattt atttgtcagc    60
tttcaaactc tttgtttctt gtttgttgat t                                   91
<210>5
<211>15
<212>DNA
<213>大豆(Glycine sp.)
<400>5
ctaagaagaa gaacc                                                     15
<210>6
<211>1123
<212>DNA
<213>大豆(Glycine sp.)
<400>6
tgagggcatg cacgcacggc ctcggagggg aaccagaaaa ttatgttaac aaaataatct    60
ggaaccctaa tgtatcagtg tcatcatcag tgtgtagttt aagctagctt tgctatggtt    120
acgttctctg agatgagagt cttgatgaac agtgccattc tgatgtattg ctttccttga    180
aagttaatgc atgcttctta tcttctgtct atagctatat gctttctttt tctttttctt    240
ttttgttaat cagaacattt gcaacttcac tccttagtat ataatagtta tccatacaaa    300
aagaaatatt atttaaggac atactgaaac ataaatatta cactttttag catccataaa    360
aaaaaattga acgaggaggg ttaaaaatat atttttaaca tttttttaat atattctttg    420
ttattgattg aatttaaaaa aaaatataaa attagctaga gagaaaatta ttaaataaaa    480
tataaccctt aaaaatttat aatatttaat aaattttaat caattaaaaa gaacactcct    540
ccagacttaa gatttggggt atggattaat tcactagtaa gtacatcatt aagattcatt    600
cgattcaatg cagcggacaa gggaaataaa agaaaatact atatgtgggt ttttttacta    660
caagaaatat tatctatgtc tacggacaaa aaccatcact agatgttaaa aatgtgtagg    720
taaatataat aaaaattttg tcctacagac attgtggtcg tcaactttga ggggacgcat    780
gtgacaccct ctatccctca catatatact aacaaaggaa taaaaattca aatattaatt    840
aaaagtattt tttttgaaca tttttaaata cgggtctttc aaagggataa aaggttcaca    900
atcactttct tctacatcat attcaaactt gtccaaataa ataataaagt catcggctcg    960
aacaaggtcg tttgagactt catacaatta atataaaacc ctatacccca atgtcacatc    1020
ctatcagagc gttgtgtctc gacgtctttc agcacaatat tccttaaagc agtttaccta    1080
gtcatcttgc tcccccgaac acagagtcca agatcatcac agg                      1123
<210>7
<211>632
<212>DNA
<213>豌豆(Pisum sp.)
<400>7
gctttcgttc gtatcatcgg tttcgacaac gttcgtcaag ttcaatgcat cagtttcatt    60
gcgcacacac cagaatccta ctgagttcga gtattatggc attgggaaaa ctgtttttct    120
tgtactattt gttgtgcttg taatttactg tgttttttat tcggttttcg ctatcgaact    180
gtgaaatgga aatggatgga gaagagttaa tgaatgatat ggtccttttg ttcattctca    240
aattaatatt atttgttttt tctcttattt gttgtgtgtt gaatttgaaa ttataagaga    300
tatgcaaaca ttttgttttg agtaaaaatg tgtcaaatcg tggcctctaa tgaccgaagt    360
taatatgagg agtaaaacac ttgtagttgt accattatgc ttattcacta ggcaacaaat    420
atattttcag acctagaaaa gctgcaaatg ttactgaata caagtatgtc ctcttgtgtt    480
ttagacattt atgaactttc ctttatgtaa ttttccagaa tccttgtcag attctaatca    540
ttgctttata attatagtta tactcatgga tttgtagttg agtatgaaaa tattttttaa    600
tgcattttat gacttgccaa ttgattgaca ac                                  632
<210>8
<211>1259
<212>DNA
<213>菜豆(Phaseolus vulgaris)
<400>8
actcccaaaa ccaccttccc tgtgacagtt aaaccctgct tatacctttc ctcctaataa    60
tgttcatctg tcacacaaac taaaataaat aaaatgggag caataaataa aatgggagct    120
catatattta caccatttac actgtctatt attcaccatg ccaattatta cttcataatt    180
ttaaaattat gtcattttta aaaattgctt aatgatggaa aggattatta taagttaaaa    240
gtataacata gataaactaa ccacaaaaca aatcaatata aactaactta ctctcccatc    300
taatttttat ttaaatttct ttacacttct cttccatttc tatttctaca acattattta    360
acatttttat tgtatttttc ttactttcta actctattca tttcaaaaat caatatatgt    420
ttatcaccac ctctctaaaa aaaactttac aatcattggt ccagaaaagt taaatcacga    480
gatggtcatt ttagcattaa aacaacgatt cttgtatcac tatttttcag catgtagtcc    540
attctcttca aacaaagaca gcggctatat aatcgttgtg ttatattcag tctaaaacaa    600
ttgttatggt aaaagtcgtc attttacgcc tttttaaaag atataaaatg acaattatgg    660
ttaaaagtca tcatgttaga tcctccttaa agatataaaa tgacagtttt gataaaaagt    720
ggtcatttta tacgctcttg aaagatataa aacgacggtt atggtaaaag ctgccatttt    780
aaatgaaata tttttgtttt agttcatttt gtttaatgct aatcccattt aaattgactt    840
gtacaattaa aactcaccca cccagataca atataaacta acttactctc acagctaagt    900
tttatttaaa tttctttaca cttcttttcc atttctattt ctatgacatt aactaacatt    960
tttctcgtaa ttttttttct tattttctaa ctctatccat ttcaaatcga tatatgttta    1020
tcaccaccac tttaaaaaga aaatttacaa tttctcgtgc aaaaaagcta aatcatgacc    1080
gtcattttag cattaaaaca acgattcttg tatcgttgtt tttcagcatg tagtccattc    1140
ttttcaagca aagacaacag ctatataatc atcgtgttat attcagtcta aaacaacagt    1200
aatgataaaa gtcatcattt taggcctttc tgaaatatat agaacgacat tcatggtaa     1259
<210>9
<211>322
<212>DNA
<213>菜豆(Phaseolus vulgaris)
<400>9
attgtttcac ctacaatgat aatatattaa aaagtgaact ttaaattaat ttacaagtta    60
aattaattca gcttgtctcc ttgatgttta tgctcttttc ggaattaatt aagttttagt    120
tgtaattgta ataattagtc acgagtgtgt atcctcaccc ctcacaaaca acatttcaag    180
aaaaataaaa ttttataaaa agggaaaatc aaattagaat ttcgttgttt gttaattgtt    240
aattttatat tattatttct ccctcaaata atattataaa agataatgat tcgattttga    300
ttttgcattt gttgttgtat aa                                             322
<210>10
<211>316
<212>DNA
<213>菜豆(Phaseolus vulgaris)
<400>10
attgtttcac ctacaatgat aatatattaa aaagtgaact ttaaattaat ttacaagtta    60
aattaattca gcttgtctcc ttgatgttta tgctcttttc ggaattaatt aagttttagt    120
tgtaattgta ataattagtc acgagtgtgt atcctcaccc ctcacaaaca acatttcaag    180
aaaaataaaa ttttataaaa agggaaaatc aaattagaat ttcgttgttt gttaattgtt    240
aattttatat tattatttct ccctcaaata atattataaa agataatgat tcgattttgc    300
atttgttgtt gtataa                                                    316
<210>11
<211>288
<212>DNA
<213>菜豆(Phaseolus vulgaris)
<400>11
atttttttca catacaatta tgataatata ttaaaaagtg aactttaaat taatttacaa    60
tatatagatt cagttaaatc aattcagctt gtctccttga tgtttctgta ataactagtc    120
atgagcacca ctcagagaca agatttcaag aaaaatatat aatatataca attaaataaa    180
aaagggaaaa tcaaattaga atttcgttgt ttaataattg ttaatttgga gttgaataat    240
aaaatgaaag aaaaaagttg gaaagatttt gcatttgttg ttgtataa                 288
<210>12
<211>1872
<212>DNA
<213>菜豆(Phaseolus vulgaris)
<400>12
ctgcagtcct acataattct tctaccgtta accgtcaaat catattttca ttattcacaa    60
atatctagta tctcatacga ataaatatat attgtttcac ctacaatgat aatatattaa    120
aaagtgaact ttaaatgtaa tttaatctca taaaatcgac ttataaaatg agatttatac    180
ctacgatcga taaaaataac tttaatatca tattaagaaa taaactttaa acctaactca    240
attttataaa accaatttat aaaataaaat ttacactcac ttatatatta taaaataaaa    300
tagtttttag gtgacgtgaa atctccatcc gattaatcaa tattttctga tgttattgtt    360
attatagaaa ctaaaaacat gccaaataat ttacaagtta aattaattca gcttgtctcc    420
ttgactaata aaacacaact ttagactatt attcagattt acacttcatc tctcatgata    480
tccctcaaag tgaatttcat tcatggcacc atttatataa tcaacaattt taaaaagatg    540
caaatttgta ctagtaaatg cttcaatgtc cctgataaac acacacaaaa aaaccttttc    600
atattttttt cttattaaat aaagaaattc attgtaagag aaattaggat ccttcaatag    660
aaaatgtgtt atttcctcat caccaggaaa aaaaggacaa cagttaacac aacaaattta    720
tgtttcattt gagattaagg aaggtaagga agaaaaaaga ttaaaaaaaa tgtccttatc    780
tctttgttta tgctcttttc ggaattaatt aagttttagt tgtaattgta ataataatat    840
aagagactta aacttttaat ataataatta taattaggtt ttttttagtc acgagtgtgt    900
atcctcaccc ctcacaaaca acatttcaag aaaacaattt tgttaaacat cttattagaa    960
acttttagca aagtcttgaa gttagaatta aacaaaaaat ttacacacac gaggaacaca    1020
ataaacctac tatcgtcagg ttatcataag gatgaaatgt tttgatacca ttaaatataa    1080
cacacacaaa aatacatgta attataacaa tacatgttat acatattttt gaaaaaactt    1140
aaagtttttc aaaacattct taatacatga ttagagctta tagaaataca aatatttaaa    1200
aaatataact ttaaaaaaac atcttaaagt cctcatatcc tctcacaccg gtgaaatcat    1260
ttactcgtag tatagtaccg tgtcataata gttcacaaca cagtaaaaag aataagaata    1320
aactagtgaa tataaaattt tataaaaagg gaaaatcaaa ttagaatttt tgattcccca    1380
cataacacaa ctcaccatgc acgctgccac ctcagctccc tcctctccac acatgtctca    1440
tgtcactttc gactttggct ttttcactag gagacaactc gccatgcacg ctgccacgtc    1500
agctccttcc tcttcccatg atgacaccac tgggcatgca tgatgccacc tcagctccca    1560
cctcttctca ttatgagcct actggccatg cacactgcca cctcagcact cctctcactt    1620
cccattgcta cctgccaaac cgcttctctc tataaatatc tctttaaatt taaactaatt    1680
atttcatata cttttttgat gacgtggatg cattgccatc gttgtttgtt aattgttaat    1740
tttatattat tatttctccc tcaaataata ttataaaaga taatgattcg attttgattt    1800
tgcatttgtt gttgtataaa tagagaagag agtgatggtt aatgcatgaa tgcatgatca    1860
gatctgccat gg                                                        1872
<210>13
<211>1866
<212>DNA
<213>菜豆(Phaseolus vulgaris)
<400>13
ctgcagtcct acataattct tctaccgtta accgtcaaat catattttca ttattcacaa    60
atatctagtg tctcatacga ataaatatat attgtttcac ctacaatgat aatatattaa    120
aaagtgaact ttaaatgtaa tttaatctca taaaatcgac ttataaaatg agatttatac    180
ctacgatcga taaaaataac tttaatatca tattaagaaa taaactttaa acctaactca    240
attttataaa accaatttat aaaataaaat ttacactcac ttatatatta taaaataaaa    300
tagtttttag gtgacgtgaa atctccatcc gattaatcaa tattttctga tgttattgtt    360
attatagaaa ctaaaaacat gccaaataat ttacaagtta aattaattca gcttgtctcc    420
ttgactaata aaacacaact ttagactatt attcagattt acacttcatc tctcatgata    480
tccctcaaag tgaatttcat tcatggcacc atttatataa tcaacaattt taaaaagatg    540
caaatttgta ctagtaaatg cttcaatgtc cctgataaac acacacaaaa aaaccttttc    600
atattttttt cttattaaat aaagaaattc attgtaagag aaattaggat ccttcaatag    660
aaaatgtgtt atttcctcat caccaggaaa aaaaggacaa cagttaacac aacaaattta    720
tgtttcattt gagattaagg aaggtaagga agaaaaaaga ttaaaaaaaa tgtccttatc    780
tctttgttta tgctcttttc ggaattaatt aagttttagt tgtaattgta ataataatat    840
aagagactta aacttttaat ataataatta taattaggtt ttttttagtc acgagtgtgt    900
atcctcaccc ctcacaaaca acatttcaag aaaacaattt tgttaaacat cttattagaa    960
acttttagca aagtcttgaa gttagaatta aacaaaaaat ttacacacac gaggaacaca    1020
ataaacctac tatcgtcagg ttatcataag gatgaaatgt tttgatacca ttaaatataa    1080
cacacacaaa aatacatgta attataacaa tacatgttat acatattttt gaaaaaactt    1140
aaagtttttc aaaacattct taatacatga ttagagctta tagaaataca aatatttaaa    1200
aaatataact ttaaaaaaac atcttaaagt cctcatatcc tctcacaccg gtgaaatcat    1260
ttactcgtag tatagtaccg tgtcataata gttcacaaca cagtaaaaag aataagaata    1320
aactagtgaa tataaaattt tataaaaagg gaaaatcaaa ttagaatttt tgattcccca    1380
cataacacaa ctcaccatgc acgctgccac ctcagctccc tcctctccac acatgtctca    1440
tgtcactttc gactttggct ttttcactag gagacaactc gccatgcacg ctgccacgtc    1500
agctccttcc tcttcccatg atgacaccac tgggcatgca tgatgccacc tcagctccca    1560
cctcttctca ttatgagcct actggccatg cacactgcca cctcagcact cctctcactt    1620
cccattgcta cctgccaaac cgcttctctc tataaatatc tctttaaatt taaactaatt    1680
atttcatata cttttttgat gacgtggatg cattgccatc gttgtttgtt aattgttaat    1740
tttatattat tatttctccc tcaaataata ttataaaaga taatgattcg attttgcatt    1800
tgttgttgta taaatagaga agagagtgat ggttaatgca tgaatgcatg atcagatctg    1860
ccatgg                                                               1866
<210>14
<211>1832
<212>DNA
<213>菜豆(Phaseolus vulgaris)
<400>14
ctgcagtcct acataattct tctacagtta accttcaaat catattttca ttattcacaa    60
atatctagtc attcatacga ataaatatat atttttttca catacaatta tgataatata    120
ttaaaaagtg aactttaaat ttaatttaat cttataaaat caacttataa aatgagattt    180
ctacctacga ttaataaaaa taactttgat atcatattaa aaaataaact ttaaacctaa    240
ctcaacttta taaaaccaat ttataaaata aaatttacac tcagttatga attataaaat    300
gaaatagttt ttaggtgacg tggaatctcc atccgattaa tcaatatttg atgatgttat    360
tgttattata gaaactaaaa acatgccaaa taatttacaa tatatagatt cagttaaatc    420
aattcagctt gtctccttga ctaataaaaa aaaactttag actattattc agatttacac    480
ttcatctctc atgatatccc tcaaagtgaa tttcattcat ggcaccattt atataatcaa    540
caattttaaa aatatgcaaa tttgtaccag taaatgcttt aatgtccctg ataaacacaa    600
aaaaaaaaaa attcatattt ttttcttatt aaataaagaa gttcattgta agagaaatta    660
ggatccttca atagaaaatg tgttatttcc tcatcaccag acaaaggggc aacagttaac    720
aaaacaaatt tatgtttcat ttgagattaa ggaaggtaag gaagaaaaaa gattaaaaaa    780
aatgtcctta tctctttgtt tctgtaataa taatataaga gacttaaact tttaatataa    840
taattgtaat taggttttct agtcatgagc accactcaga gacaagattt caagaaaaca    900
attttgttaa acatcttatt agaaactttt agttaagtct tgaagttaga attaaacaaa    960
aaaaattaca cacgagaaac acaataaacc cactaccgtc aggttatcat aaggatgaaa    1020
tgttttgata tcattaaata taacacacac aaaaatacat ctaattataa caatatatgt    1080
tatacatata tttttgtaaa aacttagagt ttttcaaaac attctaatac atgattagag    1140
tttatagaaa tacaaatatt taaaaaatat aattttaaaa aaacattcta aagtcattca    1200
gatcctctca cacctgtgtg atcatttagt catgtatgta gtacaatcat tgtagttcac    1260
aacagagtaa aataaataag gataaactag ggaatatata taatatatac aattaaataa    1320
aaaagggaaa atcaaattag aatttttgat tccccacatg acacaactca ccatgcacgc    1380
tgccacctca gctccctcct ctccacacat gtctcatgtc actttcgact ttggcttttt    1440
cactatgaca caactcgcca tgcatgttgc cacgtgagct ccttcctctt cccatgatga    1500
caccactggg catgcatgct gccacctcag ctcccacctc ttctcattat gagcctactg    1560
gccatgcaca ctgccacctc agcactcctc tcacttccca ttgctacctg ccaaaccgct    1620
tctctccata aatatctatt taaatttaaa ctaattattt catatacttt tttgatgacg    1680
tggatgcatt gccatcgttg tttaataatt gttaatttgg agttgaataa taaaatgaaa    1740
gaaaaaagtt ggaaagattt tgcatttgtt gttgtataaa tagagaagag agtgatggtt    1800
aatgcatgaa tgcatgatca gatctgccat gg                                  1832

Claims (10)

1.一种转化的大豆植物细胞，它含有一种核酸分子，所述分子沿5’-3’方向依次包含：具有与SEQ ID NO：1至少94％相同的核酸序列的启动子；可操作连接至结构核酸序列；其中所述启动子与所述结构核酸序列来源不同。
2.权利要求1的转化的大豆植物细胞，其中所述启动子与SEQ ID NO：1至少99％相同。
3.权利要求1的转化的大豆植物细胞，其中所述结构核酸序列编码选自下组的蛋白：γ甲基转移酶、叶绿基异戊烯转移酶、β-酮脂酰-CoA合酶、脂酰CoA还原酶、脂酰CoA：脂醇转酰酶、邻氨基苯甲酸合酶、苏氨酸脱氨酶、乙酰羟酸合成酶、天冬氨酸激酶、二羟酸合成酶、天冬氨酸激酶、二氢吡啶甲酸合成酶、硫酯酶、7Sα’种子贮藏蛋白、11S种子贮藏蛋白、大豆球蛋白、β-conglycinin、菜豆蛋白、玉米球蛋白-1、玉米醇溶蛋白、种子清蛋白、或种子凝集素。
4.权利要求1的转化的大豆植物细胞，其中所述核酸分子还包含5’前导序列。
5.权利要求4的转化的大豆植物细胞，其中所述5’前导序列选自Arcelin-55’，dSSU 5’，PetHSP70 5’，或GmHSP17.9 5’。
6.权利要求1的转化的大豆植物细胞，其中所述核酸分子还包含3’非翻译区。
7.权利要求6的转化的大豆植物细胞，其中所述3’非翻译区选自Arcelin-5 3’，NOS 3’，E9 3’，ADR12 3’，7Sα’3’，11S 3’，或清蛋白3’。
8.权利要求1的转化的大豆植物细胞，其中按重量计所述启动子表达结构核酸序列的量占细胞总RNA或蛋白的量的2.5％以上。
9.一种制备转基因大豆植物的方法，该方法包括在能产生植物的条件下培养权利要求1的转化的大豆植物细胞。
10.一种制备转化的大豆植物细胞的方法，该方法包括提供一种核酸分子并用该核酸分子转化植物细胞，其中所述核酸分子沿5’-3’方向依次包含：具有与SEQ ID NO：1至少94％相同的核酸序列的启动子；可操作连接至结构核酸序列；其中所述启动子与所述结构核酸序列来源不同。
CNB018226620A 2000-12-18 2001-12-17 Arcelin－5启动子及其应用 Expired - Fee Related CN1288247C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25587900P 2000-12-18 2000-12-18
US60/255,879 2000-12-18

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB2006101318017A Division CN100513558C (zh) 2000-12-18 2001-12-17 Arcelin-5启动子及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1489631A CN1489631A (zh) 2004-04-14
CN1288247C true CN1288247C (zh) 2006-12-06

Family

ID=22970232

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB2006101318017A Expired - Fee Related CN100513558C (zh) 2000-12-18 2001-12-17 Arcelin-5启动子及其应用
CNB018226620A Expired - Fee Related CN1288247C (zh) 2000-12-18 2001-12-17 Arcelin－5启动子及其应用

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB2006101318017A Expired - Fee Related CN100513558C (zh) 2000-12-18 2001-12-17 Arcelin-5启动子及其应用

Country Status (7)

Country Link
US (3) US6927321B2 (zh)
CN (2) CN100513558C (zh)
AR (1) AR031928A1 (zh)
AU (1) AU2002228921A1 (zh)
BR (1) BR0116328A (zh)
TW (1) TWI319003B (zh)
WO (1) WO2002050295A2 (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002228921A1 (en) * 2000-12-18 2002-07-01 Renessen Llc Arcelin-5 promoter and uses thereof
US7161061B2 (en) * 2001-05-09 2007-01-09 Monsanto Technology Llc Metabolite transporters
EP1620540A4 (en) * 2003-05-07 2007-12-19 Renessen Llc PLANTS WITH INCREASED MIRRORS OF ONE OR MORE AMINO ACIDS
US20090130710A1 (en) * 2005-05-09 2009-05-21 Allison Kermode Enhancing vegetative protein production in transgenic plants using seed specific promoters
US7994390B2 (en) * 2006-09-29 2011-08-09 The Chinese University Of Hong Kong Use of GmRD22-like genes to protect against abiotic stress
CA2674721C (en) 2007-01-30 2018-04-03 Verenium Corporation Enzymes for the treatment of lignocellulosics, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
BRPI0701172B1 (pt) * 2007-02-05 2019-11-26 Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuaria Embrapa composições e métodos para modificar a expressão de genes usando o promotor do gene da proteína de conjugação à ubiquitina de plantas de soja
DK2337791T3 (da) 2008-10-14 2013-11-04 Monsanto Technology Llc Anvendelse af fedtsyredesaturaser fra Hemiselmis SPP
US9834778B2 (en) 2010-12-06 2017-12-05 Basf Plant Science Company Gmbh Synthetic arcelin-5 promoter and methods of use thereof

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3959493A (en) 1971-03-17 1976-05-25 Rumen Chemie, Ag Rumen bypass products comprising biologically active substances protected with aliphatic fatty acids
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
DE3311649C2 (de) 1982-04-02 1994-08-11 Nippon Soda Co Futtermittelzusatz für Wiederkäuer
US4535060A (en) 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
US4757011A (en) 1983-09-30 1988-07-12 E. I. Du Pont De Nemours And Company Herbicide resistant tobacco
EP0154204B1 (en) 1984-03-06 1994-01-12 Mgi Pharma, Inc. Herbicide resistance in plants
AU581691B2 (en) 1985-10-14 1989-03-02 Balfour Manufacturing Company Limited Process for the production of feedstuffs
US4713245A (en) 1984-06-04 1987-12-15 Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated Granule containing physiologically-active substance, method for preparing same and use thereof
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4940835A (en) 1985-10-29 1990-07-10 Monsanto Company Glyphosate-resistant plants
ATE85360T1 (de) 1985-08-07 1993-02-15 Monsanto Co Glyphosat resistente pflanzen.
NZ221259A (en) 1986-07-31 1990-05-28 Calgene Inc Seed specific transcriptional regulation
US4971908A (en) 1987-05-26 1990-11-20 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
WO1990010076A1 (en) 1989-02-24 1990-09-07 Monsanto Company Synthetic plant genes and method for preparation
US5110732A (en) * 1989-03-14 1992-05-05 The Rockefeller University Selective gene expression in plants
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
US5689052A (en) 1993-12-22 1997-11-18 Monsanto Company Synthetic DNA sequences having enhanced expression in monocotyledonous plants and method for preparation thereof
US5853973A (en) * 1995-04-20 1998-12-29 American Cyanamid Company Structure based designed herbicide resistant products
CA2410159A1 (en) * 2000-06-29 2002-01-03 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Heterologous gene expression in plants
AU2002228921A1 (en) * 2000-12-18 2002-07-01 Renessen Llc Arcelin-5 promoter and uses thereof
DE60225312T2 (de) * 2001-09-05 2009-02-26 Monsanto Technology Llc Samenspezifische 7s-alpha-promoter zur expression von genen in pflanzen

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002050295A3 (en) 2003-04-24
BR0116328A (pt) 2004-04-20
CN1932012A (zh) 2007-03-21
US20030046727A1 (en) 2003-03-06
US20050241018A1 (en) 2005-10-27
TWI319003B (en) 2010-01-01
CN100513558C (zh) 2009-07-15
US6927321B2 (en) 2005-08-09
CN1489631A (zh) 2004-04-14
US20100251433A1 (en) 2010-09-30
AR031928A1 (es) 2003-10-08
WO2002050295A2 (en) 2002-06-27
AU2002228921A1 (en) 2002-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1197970C (zh) 甘蔗杆状病毒启动子
CN1214110C (zh) 木薯叶脉花叶病毒启动子及其应用
CN1735690A (zh) 硫酯酶相关核酸序列及方法
CN1777677A (zh) 增强植物中直链淀粉产量
CN1258593C (zh) 腐胺－n－甲基转移酶启动子
CN1551916A (zh) 用于植物中基因表达的种子特异性7Sα启动子
CN1685040A (zh) 用于在植物中表达基因的种子特异性usp启动子
CN101065490A (zh) 用于植物的启动子分子
CN1398299A (zh) 控制水稻中贮藏蛋白的表达的bZIP转录因子
CN1288247C (zh) Arcelin－5启动子及其应用
CN1295621A (zh) 病原体诱导型启动子
CN101044153A (zh) 用于植物中的真核翻译起始因子基因调节元件
CN1160465C (zh) 其中areA、pepC和/或pepE基因已被灭活的真菌
CN1810977A (zh) 增强植物和真菌中的2－乙酰基－1－吡咯的合成的核酸
CN101080492A (zh) 用于调节植物中油质蛋白表达的方法
CN1594571A (zh) 百草枯抗性基因及维管束和毛状体特异性启动子
CN1728937A (zh) 用于植物中表达基因的时间特异性种子启动子
CN1719971A (zh) 转基因高色氨酸植物
CN1351669A (zh) 基于豌豆质体蓝素pete启动子的嵌合启动子
CN1216990C (zh) 植物启动子及使用所说的启动子用于基因表达的方法
CN1638785A (zh) 增强型蛋白及其应用方法
CN1795267A (zh) 胁迫－诱导的启动子及其使用方法
CN1262662C (zh) 来源于鸭跖草黄斑驳病毒和木薯叶脉花叶病毒的嵌合表达启动子
CN100342018C (zh) 功能性植物、为培育该功能性植物而使用的启动子及其应用方法
CN1623002A (zh) 基因重组体的定量检测方法和用于该方法的标准分子

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20061206

Termination date: 20151217

EXPY Termination of patent right or utility model