CN1285338C

CN1285338C - 抗肺腺癌药物，其制备方法和其应用

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Publication number: CN1285338C
Application number: CN 200410079519
Authority: CN
Inventors: 邱明华; 孙丽荣; 卿晨; 张雁丽; 李忠荣; 周琳; 裴盛基
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2004-10-22
Filing date: 2004-10-22
Publication date: 2006-11-22
Anticipated expiration: 2024-10-22
Also published as: CN1650880A

Abstract

提供一种以有效量的化合物(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三环氧-12-乙酰氧基-27-羟基-9，19-环羊毛甾烷-3-O-β-D-吡喃木糖甙或升麻提取的活性部位BF为活性成分并配于药学上可接受的载体组成的抗肺腺癌药物，上述药物的制备方法，以及本发明活性化合物或活性成分在制备治疗肺腺癌的药物中的应用。

Description

抗肺腺癌药物，其制备方法和其应用

技术领域：本发明涉及一种抗肺腺癌药物，该药物的制备方法，以及该药物活性成分在制备治疗肺腺癌的药物中的应用。

背景技术：升麻是我国十分常用的著名中药，主要为毛茛科植物三叶升麻Cimicifuga heracleifolia Kom、兴安升麻C.dahurica Maxim、升麻或绿升麻C.foetida L.的干燥根茎，这三种药用植物的根茎已经作为中药升麻Cimicifugafoetida L.收载入《中华人民共和国药典》(2001年版)。升麻具有发表透疹，清热解毒，升举阳气的功效；常被用于风热头痛，齿痛，口疮，咽喉肿痛，麻疹不透，阳毒发斑，脱肛，子宫脱垂等病症。中药升麻Cimicifuga foetida L.主要产于云南、贵州、四川、湖北等地，是大量栽培的常用中药材。现有技术中未见有从中药升麻中提取分离的化合物(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三环氧-12-乙酰氧基-27-羟基-9，19-环羊毛甾烷-3-O-β-D-吡喃木糖甙以及提取分离的活性部位BF作为抗肺腺癌药物活性成分的报道。

发明内容：本发明的目的在于提供一种以有效量的化合物(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三环氧-12-乙酰氧基-27-羟基-9，19-环羊毛甾烷-3-O-β-D-吡喃木糖甙或升麻提取的活性部位BF为活性成分并配于药学上可接受的载体组成的抗肺腺癌药物。

本发明的另一目的在于提供上述药物的制备方法。

本发明的进一步目的在于提供本发明活性化合物或活性成分在制备治疗肺腺癌的药物中的应用。

本发明的上述目的是通过下述技术方案予以实现的：

一种抗肺腺癌的药物，其中含有有效量的化合物阿特因即(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三环氧-12-乙酰氧基-27-羟基-9，19-环羊毛甾烷-3-O-β-D-吡喃木糖甙和药学上可接受的载体。

一种抗抗肺腺癌的药物，其中含有有效量的升麻提取活性部位BF和药学上可接受的载体。

上述抗肺腺癌药物的制备方法，取升麻Cimicifuga foetida L.的根茎，粉碎后用甲醇提取三次，每次3-4小时，甲醇提取液过滤除去药渣后，减压浓缩至蒸不出甲醇，再加一定量的水稀释，用石油醚萃取2-3次，回收石油醚后，浓缩得到石油醚提取部位，然后水层再用乙酸乙酯萃取2-3次，回收乙酸乙酯，浓缩得到乙酸乙酯提取部位，用硅胶柱层析分离2-3次，洗脱液用氯仿∶甲醇或氯仿/丙酮梯度洗脱，得到活性部位BF，该活性部位BF用硅胶柱层析分离，氯仿/甲醇梯度洗脱，结晶纯化得到化合物阿特因；BF或阿特因加入药学上可接受的载体，得抗肺腺癌药物。

更具体的制备方法为取升麻Cimicifuga foetida L.的干燥根茎，粉碎后用甲醇提取三次，每次4小时，甲醇提取液过滤除去药渣后，减压浓缩至蒸不出甲醇，再加一定量的水稀释之后，用石油醚萃取三次，回收石油醚后，浓缩得到石油醚提取部位，然后水层再用乙酸乙酯萃取三次，回收乙酸乙酯，浓缩得到乙酸乙酯提取部位，再用1000g硅胶柱层析分离，洗脱液用氯仿∶甲醇从100∶0；100∶1；50∶1；20∶1到1∶1梯度洗脱，由氯仿/甲醇20∶1洗脱液洗脱得到的部位Fr.4，该分离部位Fr.4用2000g硅胶柱层析再次分离，继续用洗脱液用氯仿∶甲醇从50∶1；40∶1；30∶1；20∶1梯度洗脱，由氯仿∶甲醇40∶1洗脱液洗脱得到的部分，浓缩后得到分离部位Fr.4.1；由氯仿∶甲醇30∶1洗脱液洗脱得到的部分，浓缩后得到分离部位Fr.4.2；由氯仿∶甲醇20∶1洗脱液洗脱得到的部分，浓缩后得到分离部位Fr.4.3；Fr.4.2用1000g硅胶柱层析再次分离，用氯仿∶甲醇40∶1，30∶1洗脱液洗脱得由化合物阿特因和其他升麻甙类化合物的混合体组成的活性部位BF、分离部位Fr.4.2.1和分离部位Fr.4.2.2等；活性部位BF用300g硅胶柱层析分离，用氯仿∶甲醇40∶1洗脱液洗脱得到化合物阿特因；BF或阿特因加入药学上可接受的载体，得抗肺腺癌药物。

此外，本发明还提供了化合物阿特因以及升麻提取活性部位BF在制备治疗肺腺癌的药物中的应用。

本发明的化合物阿特因即(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三环氧-12-乙酰氧基-27-羟基-9，19-环羊毛甾烷-3-O-β-D-吡喃木糖甙或活性部位BF用作药物上时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用，该药物组合物含有0.1-99％，优选0.5-90％的(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三环氧-12-乙酰氧基-27-羟基-9，19-环羊毛甾烷-3-O-β-D-吡喃木糖甙或BF，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

所述的药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、超填料以及药物制品辅剂。将所述的有效成分以单位体重服用量的形式使用。

本发明的药物可经口服给药。口服可用其固体或液体制剂，如片剂、散剂、糖衣剂、胶囊、针剂等。

本发明抗肺腺癌药物的制备方法可采用：取中药升麻Cimicifuga foetida L.的干燥根茎，的根茎，粉碎后用甲醇提取三次，每次3-4小时，甲醇提取液过滤除去药渣后，减压浓缩至蒸不出甲醇，再加一定量的水稀释，用石油醚萃取2-3次，回收石油醚后，浓缩得到石油醚提取部位，然后水层再用乙酸乙酯萃取2-3次，回收乙酸乙酯，浓缩得到乙酸乙酯提取部位，用硅胶柱层析分离2-3次，洗脱液用氯仿∶甲醇或氯仿/丙酮梯度洗脱，得到活性部位BF，该活性部位用硅胶柱层析分离，氯仿/甲醇梯度洗脱，结晶纯化得到化合物阿特因；BF或阿特因加入药学上可接受的载体即得抗肺腺癌药物。

具体实施方式：下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1：

1、阿特因即(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三环氧-12-乙酰氧基-27-羟基-9，19-环羊毛甾烷-3-O-β-D-吡喃木糖甙(以下简称K-314)以及活性部位BF的提取分离及制备：

取升麻Cimicifuga foetida L.的干燥根茎2.5Kg，粉碎后用甲醇提取三次，每次约4小时；甲醇提取液过滤除去药渣后，减压浓缩至蒸不出甲醇；再加一定量的水稀释之后，用石油醚萃取三次，回收石油醚后，浓缩得到187g石油醚提取部位：然后水层再用乙酸乙酯萃取三次，回收乙酸乙酯，浓缩得到214.5g乙酸乙酯提取部位。214.5g乙酸乙酯提取部位用1000g硅胶柱层析分离，洗脱液用氯仿：甲醇从100∶0；100∶1；50∶1；20∶1到1∶1梯度洗脱，由氯仿/甲醇20∶1洗脱液洗脱得到的部位Fr.4重约135g。该分离部位135g Fr.4用2000g硅胶柱层析再次分离，继续用洗脱液用氯仿∶甲醇从50∶1；40∶1；30∶1；20∶1梯度洗脱，由氯仿∶甲醇40∶1洗脱液洗脱得到的部分，浓缩后得到分离部位Fr.4.1重约30g；由氯仿∶甲醇30∶1洗脱液洗脱得到的部分，浓缩后得到分离部位Fr.4.2重约80g；由氯仿∶甲醇20∶1洗脱液洗脱得到的部分，浓缩后得到分离部位Fr.4.3重约23g。分离部位80g Fr.4.2用1000g硅胶柱层析再次分离，用氯仿∶甲醇40∶1，30∶1洗脱液洗脱得到各种部分，如由化合物K314和其他升麻甙类化合物的混合体组成的活性部位BF，分离部位Fr.4.2.1和分离部位Fr.4.2.2三部分；活性部位BF30g用300g硅胶柱层析分离，用氯仿∶甲醇40∶1洗脱液洗脱得到化合物K314，结晶析出K314的纯品约850mg。

2、K-314化合物的结构确定：

K-314化合物：C₃₇H₅₆O₁₁，无色棱晶，mp 232-234℃，[α]_D＝-66.0°(c 1.80，MeOH∶CHCl₃ 1∶1)。

氢核磁共振谱数据δ(ppm)(溶剂Py-d5)：5.66(1H，s，27-H)，5.05(1H，dd，J＝9,4Hz，12-H)，4.57(1H，dd，J＝14,7Hz，16-H)，3.86(1H，s，24-H)，3.42(1H，dd，J＝11,4Hz，3-H)；2.69(1H，dd，J＝16,9Hz)1.20(1H，m)(11-H)；2.23(1H，m)1.80(1H，m)(2-H)；2.20(1H，m)1.63(1H，m)(22-H)；1.93(1H，m)1.53(1H，m)(15-H)；1.80(1H，m，20-H)，1.75(1H，s，26-H)，1.72(1H，m，17-H)，1.59(1H，m，8-H)，1.34(3H，s，18-H)；1.56(1H，m)1.15(1H，m)(1-H)；1.43(1H，m)0.64(1H，m)(6-H)；1.27(3H，s，29-H)；1.23(1H，m)0.90(1H，m)(7-H)；1.22(1H，s，5-H)，0.97(3H，d，J＝6Hz，21-H)，0.96(3H，s.30-H)，0.79(3H，s，28-H)，0.59(1H，d，J＝4Hz)0.25(1H，d，J＝4Hz)(19-H)。12-COCH₃部分：2.11(3H，s，2’-COCH₃)。木糖部分：4.78(1H，d，J＝7.0Hz，1’-H)，3.94(1H，t，J＝6.7Hz？，2’-H)，4.10(1H，dd，J＝2.7，7.6Hz？，3’-H)，4.18(1H，m，4’-H)；3.67(1H，m，5’-H)，4.30(1H，dd，J＝5，10Hz，5’-H)。

碳核磁共振谱数据δ(ppm)(溶剂Py-d5)：105.84(s，23-C)，98.42(s，26-C)，88.08(d，3-C)，78.08(d，12-C)，73.06(d，16-C)，65.60(s，25-C)，63.46(s，24-C)，56.44(d，17-H)，48.74(s，13-C)，47.84(s，14-H)，46.98(s，5-C)，45.69(s，8-C)，43.57(t，15-C)，41.22(s，4-C)，37.61(t，22-C)，36.71(t，11-C)，31.91(t，1-C)，29.94(t，2-C)，29.52(t，19-C)，26.74(s，10-C)，26.00(d，20-C)，25.69(t，7-C)，25.69(q，29-C)，21.00(q，21-C)，20.10(t，6-C)，20.10(s，9-C)，19.50(s，28-C)，15.33(q，30-C)，13.54(q，18-C)，13.12(q，27-C)。12-COCH₃部分：171.61(s，CO)，21.67(q，COCH₃)。木糖部分：107.60(s，1’-C)，75.63(d，2’-C)，78.69(d，3’-C)，71.27(d，4’-C)，67.16(t，5’-C)。

红外光谱数据vmax(KBr)(cm^-1)：3500-3350(OH)，1715(C＝O).

化合物K-314的化学结构为Actein：(20R，24R)24，25-16，23-23，27-三环氧-12-乙酰氧基-27-羟基-9，19-环羊毛甾烷-3-O-β-D-吡喃木糖甙[(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-triepoxy-12-acetoxyl-27-hydroxyl-9，19-Cyclolanostanol-3-O-β-D-xylopyranoside]

K-314化合物的化学结构为：

2、抗肿瘤生物活性测定：

材料和方法

抗肿瘤活性的评价采用改良的MMT方法。MMT方法是一种日益受到重视的体外抗癌活性评价方法，此方法客观性强，能实现半自动化，比同位素核酸前体参入法简便。但以往该法多用酸化异丙醇等溶剂作为溶解液，使MMT的还原产物---甲臜和蛋白质沉淀等的溶解很不完全，造成更换培养液和剧烈振摇等涉骤烦琐，结果的可靠性也随之降低。周建军等针对MMT方法的一些缺陷，做了进一步的改良：^[3]改良的MMT方法采用了溶解作用强的三联溶解液，可以不象原来方法中，加MMT之前，需要吸弃或离心去除更换原先的培养液，达到除去其中血清蛋白等成分以免造成干扰，也不必在加MMT生成甲臜后，剧烈振荡培养板助溶。这样不仅操作烦琐，更换培养液要损失20-30％的细胞。周建军等的改良方法简化了操作，还提高了可靠性，更适合于大量抗癌药物的体外筛选和药敏测定。因而本专利中的抗肿瘤活性实验采用改良的MMT方法。

试验前准备

样品用二甲亚砜溶解成10毫克每毫升的浓度作为储藏液并且在4摄氏度黑暗下保存。样品的储藏液在使用前用未免疫的盐水稀释到试验浓度。

细胞排列和培养

小鼠艾氏腹水瘤细胞株、人胃癌细胞株和人乳腺癌细胞株是来自美国模式菌种收集中心。所有的细胞在RPMI-1640介质中生长，加入10％的热钝化的无活性的免疫血清，2纳摩的L-谷氨酸盐，100效价的盘尼西林，100ug/ml的链霉素和PH7.4的10毫摩的HEPES。细胞被保存在37摄氏度下、潮湿的含5％CO₂的培养箱中。

细胞生长抑制方法

样品对肿瘤细胞的生长抑制是通过微量培养四唑分析法测量的，只有较小的调整。简单地，黏附的肿瘤细胞被播种到96孔的微量培养皿，在加入药剂之前使其粘着24小时，悬浮细胞是在药品加入前播种。每个肿瘤细胞列在不同阶段(粘着细胞是72小时，悬浮细胞是48小时)加入5个浓度(0.01，0.1，1，10，100mg/ml)的样品，并且每个浓度重复三次。在加入样品后的末期把5mg/ml的MTT加入到每个孔中，并把培养皿放在37摄氏度的条件下培养4小时，然后再加入三相混合溶液(10％的SDS，5％的异丙醇和0.012摩的盐酸)，再把培养皿放在37摄氏度下培养12-20小时。在570纳米的感光镜上读取光密度。样品对肿瘤的细胞毒性是用IC₅₀值表达的，并且用LOGIT方法进行计算。

生物活性测试参考文献：

1.Mosmman T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：Application to proliferation and cytotoxicity assays.J.Immunol，Meth.1983；65：55-63

2.Alley MC，Scudiero DA，Monks A et al.Feasibility of drug screenig withpanels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay.CancerRes.1988；48：589-601

3.Zhou JJ，Yue XF.Han JX et al.Improved MTT assay for activity ofantitumor agents.Chin J Pharm(中国医药工业杂志)1993，24(10)：455-457

从表1和表2可以看出化合物K-314具有十分显著的抑制人肺腺癌细胞株(K549)的活性，IC₅₀为0.37μg/mL；特别是化合物K-314对人肺腺癌细胞株(K549)的细胞毒活性已经超过阳性对照常用的著名抗癌药物顺铂(cis-platin)，其IC₅₀仅为0.72μg/mL。而顺铂对人类红白血病细胞株(K562)也有显著活性，IC₅₀为0.34μg/mL。但是化合物K-314对人类红白血病细胞株(K562)抑制作用非常弱，几乎没有活性，IC₅₀＞100μg/mL；说明化合物K-314的抗肿瘤活性，具有十分明显的选择性，对人肺腺癌细胞株(K549)的抑制活性远远超过著名的临床抗肿瘤药物顺铂，而化合物K-314对人类红白血病细胞株(K562)则基本上没有抑制肿瘤细胞的活性。由此可以化合物K-314与顺铂(cis-platin)的抗肿瘤活性在靶点上具有相当的不同之处和特殊性，是十分有意义的抗肿瘤化合物。

表1 化合物K-5，K-6样品对肿瘤细胞的抑制率：

A549：人肺腺癌细胞株；

K562：人类红白血病细胞株；

K-314抗肿瘤生物活性的测定结果：

表2 化合物K-314对人肺腺癌细胞株(A549)、人类红白血病细胞株

(K562)的细胞毒活性：

试验化合物	分子量(MW)	IC₅₀(μg/mL)K562	A549
试验化合物	分子量(MW)	IC₅₀(μg/mL)K562	A549	化合物K-314cis-platin(阳性对照，顺铂)	676	＞1000.34	0.370.72

实施例2：

按实施例1制得K-314，按K-314与赋形剂重量比1∶5的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例3：

片剂：K-314 20mg

淀粉 100mg

玉米浆适量

硬脂酸镁适量

实施例4：

按实施例1制得K-314，按常规胶囊制剂方法制成胶囊。

实施例5：

胶囊剂：K-314 20mg

淀粉 100mg

葡萄糖 200mg

硬脂酸镁适量

制备方法：将K-314与助剂研匀混合，过筛，在合适的容器中均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊。

实施例6：

按实施例1制得乙酸乙酯提取的活性部位BF，按BF与赋形剂重量比1∶1的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例7：

片剂：BF 1g

淀粉 150mg

玉米浆适量

硬脂酸镁适量

实施例8：

胶囊剂：BF 1g

淀粉 150mg

葡萄糖 300mg

硬脂酸镁适量

制备方法：将BF与助剂研匀混合，过筛，在合适的容器中均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊。

Claims

1、化合物阿特因即(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三环氧-12-乙酰氧基-27-羟基-9，19-环羊毛甾烷-3-O-β-D-吡喃木糖甙在制备治疗肺腺癌的药物中的应用。