CN1278921A - dsRNA/dsRNA结合蛋白方法及组合物 - Google Patents

dsRNA/dsRNA结合蛋白方法及组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN1278921A
CN1278921A CN98811079A CN98811079A CN1278921A CN 1278921 A CN1278921 A CN 1278921A CN 98811079 A CN98811079 A CN 98811079A CN 98811079 A CN98811079 A CN 98811079A CN 1278921 A CN1278921 A CN 1278921A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dsrna
compound
rna
albumen
conjunction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN98811079A
Other languages
English (en)
Inventor
亚历山大·S·贝尔耶夫
托马斯·韦恩·布鲁斯
辛西娅·A·爱德华兹
柯克·E·弗赖伊
莉萨·M·图林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genelabs Technologies Inc
Original Assignee
Genelabs Technologies Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genelabs Technologies Inc filed Critical Genelabs Technologies Inc
Publication of CN1278921A publication Critical patent/CN1278921A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C07K14/43577—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from flies
    • C07K14/43581—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from flies from Drosophila
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了筛选用于鉴别能破坏dsRNA结合蛋白或蛋白复合物与dsRNA结合的化合物的方法,还公开了用这种化合物治疗病毒感染的方法。

Description

dsRNA／dsRNA结合蛋白方法及组合物
本申请要求并入参考的，申请于1997年9月12日的美国临时申请号No．60／058,740之优先权。
此研究部分由防御先进研究计划管理局(Defense AdvancedResearch Proiects Administration)(准予号N65236-98-1-5400)提供资金。由此美国政府在此发明可拥有一定权利。
发明领域
本发明涉及一种筛选方法，用于鉴别能与双螺旋dsRNA结合，尤其能破坏dsRNA结合蛋白或蛋白复合物与dsRNA结合的化合物。本发明还涉及由此筛选鉴别的化合物的多联体组合物，以及应用此化合物治疗机能失调及如病毒或类病毒感染之类疾病的方法。
发明背景
现已提出并实施了许多用于调节基因表达，包括在DNA转录水平及多肽翻译水平调节的方法。例如，利用DNA介导的mRNA合成中间物可将反义分子导向有机体内的mRNA上。
尽管此反义及基于蛋白质的技术可用于调节体外基因表达，但通常认为小有机分子更适于药物研制。此类分子更易于通过细胞膜，并影响体内生物学应答。另外，由于每个新mRNA及蛋白质靶均具有独特的折叠结构，通常要求相当深入的药物开发尝试，以鉴别直对特异序列的药物。
基因表达的调节在控制病毒及类病毒感染方面具有特殊效用。尽管它们经常应用宿主细胞机制的组分以复制，但许多病毒及类病毒的遗传物质不同于宿主细胞的遗传物质，且因而是为治疗控制的潜在靶。
例如，RNA病毒通过具有单链或双链RNA作为其主要基因组物质而被区别。但在复制期间，RNA病毒必须经过双螺旋双链RNA(双螺旋dsRNA)形成的阶段。如下所述，双螺旋dsRNA可从在宿主中发现的RNA中分辨出，这是通过其具有不间断的Waston-Crick碱基对的规范dsRNA的含量加以分辨的。另外，一些RNA(及DNA)病毒具有长的，完全保守的茎-环结构，其中的茎是不间断的dsRNA。相反，宿主有机体缺乏双螺旋dsRNA的长序列；而代以只具有非常短的序列(通常少于6-10碱基对)的无缺陷双链RNA序列，如在单链转录的RNA自身折叠中形成的(Doudna，J．A．Nature 388：830-831，1997)。
干扰素(IFNs)是一细胞因子家族，该家族由脊椎动物对病毒感染及其它细胞性应激的应答产生。INF与在INF应答细胞表面的受体结合触发信号级联放大，其导致多于30种IFN-可诱导蛋白质的诱导(Sen G．C．和Ranshoff R．M．，Adv．Virus Res．42；57-63，1993；JaramilloM．L．，et a1．，Cancer Invest．，13：327-338，1995)。干扰素诱导的蛋白质包括dsRNA-激活的蛋白激酶(PKR)。PKR被长dsRNA激活是干扰素诱导的细胞免疫应答的一重要因素，其是动物宿主内抗病毒感染的第一道防线。PKR的激活呈现抑制病毒蛋白质合成。PKR呈现与dsRNA结合并磷酸化eIF-2转录因子的α-亚单位。磷酸化的eIF-2是失活的，且在病毒感染的细胞中的蛋白合成被阻断(Katze，M．G．Semin．Virol：4：259-268，1993)。
在一些方式中，病毒通过dsRNA中和PKR的激活。这表明在病毒感染的细胞中dsRNA普遍存在，其是大量各种病毒中观察到的特征及PKR在对病毒感染的细胞应答中起的主要作用。
例如，腺病毒及Epstein-Barr病毒产生RNA分子，其是PKR-dsRNA结合反应的竞争性抑制剂。相似地，痘苗病毒蛋白K3L及丙型肝炎病毒蛋白NS5A作为假底物阻断PKR-dsRNA相互作用。流感、痘苗及呼肠病毒分别产生的NS1，E3L，及σ3蛋白与dsRNA结合。流感病毒还导致细胞蛋白p58的产生，其是PKR的天然抑制剂，脊髓灰质炎病毒感染导致PKR蛋白酶解。一些病毒发挥多重机制破坏通过dsRNA对PKR的激活。例如，HIV Tat蛋白降低PKR的表达。HIV TAR RNA结合蛋白与PKR结合，并抑制其激酶活性，且是dsRNA结合的一竞争性抑制剂(Gale，M．，et a1．，Pharmacol．Ther．78：29-46，1998)。
明显地，在病毒进化过程中，病毒已发育了各种破坏通过dsRNA对干扰素诱导的PKR的激活的有效机制。由于这些机制，干扰素已不是对病毒感染非常有效的治疗方法。但是，在治疗病毒感染中，干扰素是一广谱抗病毒药，因为其识别dsRNA，dsRNA是许多病毒复制的内在特征。有必要开发能识别长dsRNA及抑制病毒复制的广谱药。
发明概述
宿主细胞中较长双螺旋dsRNA靶区域的相对缺乏，使靶向dsRNA的长序列的化合物不大可能在哺乳动物细胞中引起基于任何机制的毒性。如此化合物因而是有用治疗剂的候选者。
本发明包括一双螺旋dsRNA：蛋白质结合分析，其用于筛选化学性或生物性衍生的合成或天然产物化合物的库。测试化合物的改变dsRNA结合蛋白与dsRNA测试序列的不依赖于碱基对序列的结合的能力。化合物可抑制或促进dsRNA结合蛋白与dsRNA的结合。此分析用于筛选化合物，其随后被用于构建新的，更有效的结合剂和／或输送有效修饰从而失活靶双螺旋dsRNA的“弹头”的制剂。该制剂从而可通过阻碍链分离，破坏基本蛋白与RNA的结合，或通过灭活dsRNA来干扰dsRNA的复制。
除了复制中间体，长dsRNA还可在一些RNA病毒的基因组转录期间产生，尤其节段及非节段负链RNA病毒及双义RNA病毒(RoizmanB．& Palese，P．病毒复制综述，见区域病毒学，卷1，Lippinvott-Raver出版社，Philadelphia,纽约，1996，pp．101-111)。从负链病毒RNA模板中产生mRNA可产生长dsRNA序列。因而在负链及双义RNA病毒感染的细胞中存在的dsRNA在本发明的实施中也是有用的。
用本发明的方法选择的双链结合剂尤其用于治疗病毒及类病毒感染，这是因为这些感染剂在其生命周期期间利用相对较长的dsRNA分子。本发明的分析尤其用于发现及开发小分子药物，其可识别dsRNA并干扰RNA病毒的增殖，最低限度干扰宿主细胞功能。但本发明方法及组合物非限于此目的。哺乳动物及其它真核细胞以及原核细胞，也包括某些也可作为根据本发明发现并构建的化合物的靶的dsRNA区域。
本发明一般涉及筛选并选择影响dsRNA结合蛋白或蛋白复合物与dsRNA的碱基对序列非依赖性结合的化合物的方法。在一实施方案中，本发明方法涉及筛选破坏如此结合的化合物。在一更一般的实施方案中，本发明包括筛选影响dsRNA功能如参与细胞功能的dsRNA区段的化合物。在另一实施方案中，由本发明鉴定的化合物用于检测动物及其它生物体内的感染。如下所述，本发明更特别的实施方案涉及发现并构建靶向RNA病毒及类病毒的化合物。
根据本发明的一实施方案，筛选方法包括以下步骤：(a)形成一反应混合物，其由(ⅰ)dsRNA结合蛋白或蛋白复合物，(ⅱ)结合蛋白可不依赖于dsRNA碱基对序列而与之结合的dsRNA组成；(b)基于在存在及不存在测试化合物的情况下观测到的结合之差异比选定值大或小，检测在有或无测试化合物的情况下，dsRNA结合蛋白与dsRNA片段的结合水平；(c)如果检测的结合水平与对照反应混合物(无测试化合物)中所测明显不同，由于其能改变结合而选择此测试化合物。在一相关实施方案中，此方法用于鉴别选择性地结合dsRNA的化合物，即此化合物呈现结合dsRNA比结合单链RNA(ssRNA)，单链DNA(ssDNA)及双链DNA(dsDNA)的亲和性至少高2-3倍。
在一实施方案中，分析中存在的dsRNA-结合蛋白或蛋白复合物的浓度是足以达到至少25％饱和分数的量，意为反应混合物中至少25％ dsRNA在没有测试化合物情况下与dsRNA结合蛋白复合。或者，RNA结合蛋白的存在量足以达到至少50％或75％的饱和分数。优选地，RNA结合蛋白的浓度是足以达到至少90％饱和分数的量，优选地，本发明的化合物以序列非特异性方式与dsRNA结合。或者本发明的化合物可以序列特异性方式与dsRNA结合。
本方法还进一步包括测试如上选择的任何化合物对哺乳动物细胞的毒性，及进一步筛选有用的治疗剂。
在一优选的实施方案中，用于分析的dsRNA片段长度大约10-100碱基对，优选大约16-50碱基对，更优选30-50碱基对。
在更优选的实施方案中，本发明方法用于鉴别抗病毒化合物。根据本发明的此实施方案，用于分析的dsRNA结合蛋白是病毒起源的，如E3L或σ3蛋白。该蛋白(或其结构域)可根据本领域已知方法重组产生。
根据本发明的另一实施方案，dsRNA结合蛋白也可以是细胞蛋白如PKR，DRAF1，DRAF2，RNAase H，Z-DNA结合蛋白，La(SS-B)，TRBP，及dsRNA-特异性腺苷脱氨酶。
分析中的结合水平可通过直接测定结合复合物(蛋白：dsRNA)的形成，或测定下游或附属事件，如在产生自dsRNA结合事件的级联反应中一或多个底物的磷酸化而加以检测。直接检测的实例包括(ⅰ)凝胶条带的移位分析，(ⅱ)闪烁亲近测定法，(ⅲ)滤膜结合试验。
测定下游事件的实例包括依赖dsRNA的蛋白激酶级联，其中，例如当反应混合物中存在适当试剂如ATP时，指作PKR的干扰素诱导的蛋白激酶的自动磷酸化，或eIF-2和／或另一种可磷酸化指示蛋白的磷酸化发生。或者，可测定dsRNA结合蛋白的比活性，其中该活性在对结合的应答中被刺激或降低。关于此的一实例是PKR或其底物eIF-2的上述蛋白激酶介导的自动磷酸化。
在一相关的实施方案中，本发明包括一种治疗用RNA病毒感染的个体或细胞的方法。根据本发明的此方面，将根据本发明的筛选分析选择或形成的化合物，以抑制dsRNA结合蛋白与个体细胞中存在的所述dsRNA区域结合的有效量施用于个体。此方法可包括鉴别此病毒基因组中一特异性dsRNA碱基对序列，其可是化合物的靶，且其可根据本文所述的选择碱基对序列特异性化合物的分析方式而被选择。但这种序列特异性是非必需的，因为在更普通方式中，本发明的分析法选择以序列非特异性方式识别双螺旋dsRNA的化合物。在此，不限于任何特殊机制理论，据认为化合物可识别并结合双螺旋dsRNA结构。在此基础上选择的化合物尤其可用于对抗未知病原学和／或组成的病毒的感染。
本发明的另一方面包括一种检测生物样品中病毒因子存在与否的方法。由本文揭示的方法鉴别的dsRNA结合化合物可用于确定生物样品是否含有病毒因子。在这一实施方案中，分离自生物样品的病毒或类病毒因子被检测以确定病毒因子是否与由这些方法鉴别的化合物结合。由于这些化合物可以非依赖序列方式与dsRNA结合，因而可测定生物样品中未鉴别的病毒因子存在与否。
在本申请内列出的是病毒及类病毒病原体的一部分，分析中选择的针对其的药物可被检测并应用。在另一实施方案中，在被测试而用于生物体，如人之前，该化合物要进行毒性测试。
本发明还包括一种筛选能与双螺旋dsRNA中3-16，3-8或更特异地与3-5个碱基对区域碱基特异性结合的化合物的方法。此方法包括：(a)形成一反应混合物，包括(ⅰ)测试化合物，(ⅱ)dsRNA结合蛋白或蛋白复合物，(ⅲ)双螺旋dsRNA片段，其包括在不存在测试化合物的情况下结合蛋白与之结合的区域，其中此区域含有至少一个由约3-16(或3-8)个碱基对组成的测试序列；(b)检测混合物中dsRNA结合蛋白与dsRNA片段的结合水平；(c)如果混合物中结合蛋白与dsRNA的结合水平比在无测试化合物的反应混合物中所测水平明显较低，由于其能与dsRNA序列结合而选择此测试化合物。
在一实施方案中，上述分析可用于鉴别与dsRNA中的序列的化合物特异性结合。在此，将化合物加入双螺旋dsRNA片段中，所述片段优选以等摩尔量含掺入片段内的多组合3-16(或3-8)个碱基对序列。在结合之后，分离结合及未结合的dsRNA，如通过制备条带移位迁移性凝胶分析分离，并用扩增技术如PCR，优选如本文所述的迭代形式鉴别未结合dsRNA片段的序列。
由此方法鉴别的化合物可用于检测或治疗含鉴别的化合物特异性序列的特异性RNA病毒。
在一相关的方面中，本发明也包括多聚体RNA结合剂，其与dsRNA选择性结合。如此制剂是通过共价连接至少两种dsRNA结合化合物，每种都根据本发明的分析而选择，而形成的线性多联体。优选地，此化合物即不是寡核苷酸也不是肽；但它们可通过任何适当的连接物例如但非限于多糖、肽或寡核苷酸连接在一起。根据优选的实施方案，此组合物包括dsRNA修饰剂，其有效地修改或破坏dsRNA功能。
在另一相关的实施方案中，本发明包括评价所选择的化合物结合双螺旋dsRNA的能力的方法，以及采用本文所述dsRNA选择及鉴别方法和／或组合物的诊断试剂盒。
本发明的这些及其它方面及特征通过阅读以下详细内容及附图将更加清楚。
附图简述
图1示出表达作为与GST的融合蛋白的Staufen，E3L，mPKR及hPKR蛋白的dsRNA结合结构域(dsRBDs)的质粒载体的克隆及构建图式。
图2为示出E3L与放射标记的30-mer dsRNA的结合的凝胶放射自显影的计算机成像图。
图3A及3B为示出E3L与dsRNA，SSRNA和RNA／DNA杂交分子结合的凝胶放射自显影的计算机成像图。
图4为示出E3L结合19-，22-，26-及30-mer dsRNA片段的凝胶放射自显影的计算机成像图，其中E3L浓度为67nM，12nM及2nM。
图5A-5D示出dsRNA结合蛋白与dsRNA片段结合的图式。
图6A-6B为示出各种浓度的溴化乙锭(EtBr)在普通凝胶(A)及含3．3μM EtBr的凝胶上对E3L与dsRNA(30mer)结合的竞争作用的凝胶放射自显影的计算机成像图。
图7A-7G示出本发明的各种dsRNA构建物图式，包括显示所有三聚体结构的可能变换的如SEQ ID NO：1(7A)所示的34-merdsRNA。
图8示出细胞事件的依赖于dsRNA的蛋白激酶PKR级联。
图9(A-C)示出应用链亲和素-SPA珠及生物素标记的dsRNA的闪烁亲近测定法。
图10示出一起提供4个核苷酸长的寡核苷酸的所有256种可能组合的10种寡核苷酸(30-mer)，该10种寡聚体衍生自包括256种可能组合的一个连续序列。
图11示出示于图10的一种寡核苷酸的33p末端标记，生物素化及与互补寡核苷酸的退火。
图12示出应用Staufen，E3L，mPKR及hPKR作为RNA结合蛋白的SPA生物素保护性实验的结果。这些结果见实施例6所述。
图13示出应用hPKR及指明的RNA结合化合物的SPA结果，这些结果见实施例6所述。
图14示出从组合的化学文库中筛选新化合物的结果。图14A示出筛选44系列1a化合物(化合物A2-12，B2-12，C2-12，D2-12)的结果。图14B示出筛选54系列1b化合物(化合物A2-12，B2-12，C2-12，D2-12及E2-11)的结果。这些结果见实施例7所述。
图15示出为检测化合物B5(1a平板)是否先与指明的多核苷酸结合而进行的荧光／猝灭分析结果，如实施例8所述。
发明详述：
Ⅰ．定义
本文所用术语“小分子”指生物或化学合成的有机或无机化合物，其分子量通常小于10，000，更通常小于1，000。小分子优选能通透过细胞，且通常不是多肽或多核苷酸。
本文所用术语“多肽”指20个天然发生的氨基酸的聚合物。
本文所用术语“多核苷酸”指腺苷，胞嘧啶、鸟苷、胸苷及尿嘧啶的5种天然发生的核苷酸的聚合物。
本文所用术语“多联体”指小分子的线性装配以形成多聚体小分子。本发明所用多联体可包括通过一或多个聚酰胺键共价键连的小分子。
本文所用“双螺旋dsRNA”指规范dsRNA的长链(至少10个碱基对)，其全长均为Watson-Crick碱基对而没有错配、环、凸起、内在碱基配对等。双螺旋dsRNA通过许多dsRNA病毒的基因组而被例证。但小分子的结合位点，不论序列非特异性还是序列特异性，可跨越3-6个碱基对，7-10个碱基对，或10-20个碱基对。
“RNA修饰剂或组分”指一化合物，当其接触RNA时，影响RNA裂解或以其它方式修饰其或使其失去功能。例如但非限于烷化剂，如氮芥子试剂，反应前环丙基官能化的聚异芳香族试剂、补骨脂素、Lewis酸与金属螯合的复合物、ene-dynes，及激活的高价金属-氧基复合物。
在dsRNA分子领域，所用术语“相邻的”指由短如0，但不超过大约20个碱基对分离的区域。
术语“双螺旋dsRNA碱基对特异性结合”指与dsRNA中核糖核苷酸的特异性序列结合的化合物。相反，术语“双螺旋dsRNA碱基对非特异性结合”及“双螺旋dsRNA结构性结合”指不依赖于RNA中特殊序列的存在，但呈现依赖于特征性二级或三级结构的存在而与双螺旋dsRNA结合。
术语“双螺旋dsRNA选择性结合”指分子与双螺旋dsRNA之间结合亲和性高于(优选至少高大约2-3倍)分子与dsDNA，ssDNA，或ssRNA的结合亲和性。根据本领域熟知方法，及本文实施例3中例证的方法可进行亲和性测定或估计。
本文所用“结合”通常指蛋白质或小分子与RNA分子的非共价缔合。用一或多种已知结合分析，包括但非限于凝胶迁移率变动分析测定蛋白质与dsRNA的功能结合。
本文中“结合比”(on-rate)指在所给定单位时间内，从其单体前体中形成的多聚体复合物的量。
“平衡时间”在此指两种分子达到缔合及解离稳态所需时间，如RNA：蛋白质复合物。
“解离比”(off-rate)在本文中指在所给定单位时间内解离的多聚体复合物的量。
“解离”是一过程，其中两种(或更多)分子停止相互作用或结合，此过程通常在特异条件下以固定的平均比率发生。
“半衰期”在此指缔合的复合物，如RNA：蛋白质复合物的一半发生解离所需时间。
本文所用“饱和分数”是指RNA结合蛋白或蛋白复合物与至少某限定分数的所利用的适当dsRNA结合的浓度。为达到50％饱和分数，RNA结合蛋白的所需浓度是热力学结合常数Kd，如果RNA浓度明显低于Kd值。为达到90％饱和分数，所需浓度比Kd至少高10倍。因此，对于Kd为1×10-9M的RNA结合蛋白，为达到90％饱和分数，所需RNA结合蛋白的量至少为10×10-9M。
“单体亚单位分子(或化合物)”是与跨越大约3-16个碱基对的双链RNA上的位点结合的小分子。它们可呈现或不呈现序列特异性结合。
“二聚体分子(或化合物)”是由两个共价化学键合的单体亚单位分子组成的小分子。此分子与产生其的单体相比与较大结合位点结合，且通常但非必需以更高亲和性与dsRNA结合。
“序列特异性结合”指RNA结合分子呈现对完全配对双链RNA中存在的特异性碱基对序列的强RNA序列优选性。
“测试序列”是限定或被允许在RNA结合蛋白结合的关联结合位点的RNA序列。从本发明的上下文来看，测试序列优选完全包埋在测试双螺旋dsRNA片段中。
术语“聚合酶链反应”及“PCR”指扩增一或多个特异性核酸序列的方法，其中(ⅰ)确定待扩增的序列末端的寡核苷酸引物与测试样品中单链核酸退火，(ⅱ)核酸聚合酶延伸退火的引物的3’末端，以产生序列互补于引物与之退火核酸的核酸链，(ⅲ)将所得双链核酸变性以产生两个单链核酸，(ⅳ)将引物退火，引物延伸，及产物变性的程序重复足够次数，以产生易于鉴别的及测定量的由引物限定的序列。依次的退火、延伸及变性步骤受反应容器的温度变化控制，通常以重复循环方式进行。退火及延伸典型地在40-80℃间进行，而变性要求温度在大约80-100℃之间。“热循环仪”如Perkin Elmer 9600型，典型地用于调节反应。
本文所用术语“多核苷酸”指具有支持能与典型多核苷酸氢键键合的核酸碱基主链的多聚体分子，其中多聚体主链以允许该氢键在多聚体分子及典型多核苷酸之间以序列特异性方式键合的方式表现碱基。如此碱基典型地是肌苷，腺苷、鸟苷、胞嘧啶、尿嘧啶及胸苷。多聚体分子包括双及单链核糖核酸(RNA)及脱氧核糖核酸(DNA)，也可包括具有主链修饰如甲基膦酸键的聚合物。
术语“载体”指一核苷酸序列，其能同化新核酸，并在合适的宿主中将那些新序列增殖。载体包括但非限于重组质粒及病毒。包含本发明核酸的载体(如质粒或重组病毒)可在载体中，如与蛋白质复合的质粒，与基于脂类的核酸转导***复合的质粒，或其它非病毒载体***。
本文所用术语“多肽”指由以肽键连接的20个天然氨基酸残基的单链组成的化合物。本文氨基酸残基以其标准单字母标记“A，丙氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，蛋氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸。术语“蛋白质”可与术语“多肽”同义，或另外可指两或多个多肽的复合物。结合本发明上下文，“蛋白质复合物”指与单核糖核苷酸片段结合的一种或多种蛋白质的复合物。此复合物可以是同源或异源的。一般地，但非绝对地，多肽及蛋白质主要是由天然发生的氨基酸形成。
本文以其标准碱基标记代表核酸亚单位：T 胸腺嘧啶；A 腺苷；C 胞嘧啶；G 鸟嘌呤；U 尿嘧啶；以标准IUPAC缩写代表可变化位置；W，A或T／U；R，A或G；S，C或G；K：G或T／U(37CFR§1．822)。
“不依赖于碱基对序列的结合”指dsRNA-结合蛋白或蛋白复合物与dsRNA间的结合，其结合亲和性不依赖于或基本上不依赖于dsRNA序列。
Ⅱ．dsRNA：dsRNA结合蛋白置换分析
A．分析综述
本发明的分析涉及检测能破坏双链RNA(dsRNA)及与之特异性结合的结合蛋白之间结合的化合物。在此，术语“特异性结合”意为该结合蛋白优先与dsRNA结合，而非与ssRNA，ssDNA，dsRNA，或RNA／DNA杂交体优先结合。此分析还适合检测化合物与dsRNA中特殊RNA序列的序列优选性和／或序列特异性结合。
此分析可用于检测各种用于治疗的化合物。但这些用途中最重要的是鉴别用作抗病毒剂的化合物的用途，这是由于此分析特别选择破坏与双螺旋dsRNA的结合，双螺旋dsRNA是长度超过大约30个核苷酸的dsRNA，其卷曲成双螺旋构型。即已知许多侵入病毒病原体在其某些或全部生命周期期间，含有互补双链RNA的长段序列，而在大多数真核细胞，包括哺乳动物细胞中，转录的RNA单链的自身折叠很少产生无任何缺陷(即错配、凸起及内环)的几个碱基对长双链序列更长的序列。因此该分析特别实用于选择对宿主细胞的细胞机制影响最小的抗病毒剂。
为进行本发明的分析方法，一般要测试所测化合物改变选定的dsRNA结合蛋白或蛋白复合物与结合蛋白与之结合的dsRNA片段的结合的能力，或改变此结合相互作用的亲和性的能力。化合物可抑制或增强dsRNA结合蛋白或蛋白复合物与dsRNA片段的结合。将有化合物存在时的结合水平与没有此测试化合物存在时所测水平相对比，如果有此化合物存在时的结合水平高于选择的限度如只1/2或1／3，则选择此化合物。
本发明的这些特点在以下及实施例3中详细阐述，以下章节阐述形成基本分析混合物的各种组分的设计及选择。
B．分析的组分
基本结合分析包括一反应混合物，其由(ⅰ)dsRNA结合蛋白，(ⅱ)结合蛋白以非依赖于碱基对序列方式与之结合的dsRNA片段，(ⅲ)测试化合物。监测此反应在有或无测试化合物的情况下，dsRNA结合蛋白的不同结合水平。
1、dsRNA结合蛋白
尽管许多dsRNA结合蛋白已从细胞或病毒来源中分离出并鉴定，但对这些蛋白质的研究未揭示出已知dsRNA结合蛋白，或更特别地，dsRNA结合蛋白结构域(dsRBD)与dsRNA的结合的序列特异性。另外，对至少一类分子而言，特别是痘苗病毒E3L和PKR，尽管单独的蛋白单体可以很小〔跨越小于约10-20bp〕，但结合蛋白或结构域趋于形成协作结合单位，如此两或多个蛋白质亚单位与RNA序列结合的亲和性比任何蛋白质单体或蛋白质结构域要高。
支持本发明进行的试验表明，单蛋白质型几乎可用于分析任何RNA序列，其是通过将相应的序列(测试序列)置入限定的dsRNA片段中进行，如下所述。通过蛋白质与含该序列的dsRNA片段及与含不同测试序列的其它dsRNA片段的结合特征加以比较，可以检测与测试序列特异结合的小分子。
在选择用于本发明的dsRNA结合蛋白时，需考虑以下相关事情：
(ⅰ)蛋白质优选与dsRNA特异结合，而不与ssRNA，dsDNA，或ssDNA结合，或可能与RNA／DNA杂交体结合。
(ⅱ)依于分析模式，dsRNA：蛋白质复合物的半衰期应足够短，以在适当时间内完成此分析。具有非常长解离时间的复合物的药物介导的破坏难以测定。或者或另外，可以“竞争”方式进行分析，其中通过将测试化合物及结合蛋白同时暴露于测试dsRNA片段，或通过将测试分子及dsRNA分子混合，随后立刻加入结合蛋白而测定结合竞争，而不是结合置换。
(ⅲ)复合物的半衰期应足够长，以在适当的时间内测定未结合的RNA，例如，游离RNA的水平通过测定游离RNA所需时间与在测定时间期间，由于复合物解离天然发生的游离RNA的量之间的比率来表明。
鉴于上述两项考虑，实用的RNA：蛋白质半衰期在大约2分钟～几天范围内，较短半衰期可通过更快的或“实时”检测法调节，较长半衰期可通过使分析的结合条件不稳定而调节。
a．病毒dsRNA结合蛋白
现有技术中描述了一些衍生自病毒的dsRNA结合蛋白。但要意识到，选择的去置换特定dsRNA结合蛋白结合的化合物不限于用于抗结合蛋白的病原来源，而可更广泛用作抗病毒剂，甚至细胞调节剂。
例如但非限于，用于本发明分析的一dsRNA结合蛋白，是痘苗病毒E3L dsRNA结合蛋白。用于本发明的其它dsRNA结合蛋白是人PKR(hPKR)及鼠PKR(mPKR)。在支持本发明进行的一试验中，E3L，hPKR，mPKR及Staufen的dsRNA结合结构域是重组产生的，如实施例1所述，并在用作结合分析的组分之前被纯化(实施例2)。
图1示出E3L，hPKR，mPKR及Staufen的dsRNA结合片段的克隆及构建图式。概括地，应用基于开放读框(ORF)的已知序列及ORF内dsRNA结合结构域的位置选择的正向和反向PCR引物，可以获得编码这些蛋白质dsRNA结合结构域的PCR片段(例如，Ho，C．K．，et al．，Virology 217：272-284，1996)。将限制性内切酶位点(见图1表明)导入引物中，以促进PCR片段的克隆。如图所示，将PCR片段与载体连接以提供在可诱导启动子控制下的表达(如pGEX-2T载体中的tac启动子)。在转化适当的宿主细胞系后，dsRNA结合结构域被表达为融合蛋白，然后经标准方法将其纯化，如实施例2和6所述。
衍生自病毒的一些其它合适的dsRNA结合蛋白或其片段可用于本发明之分析。在用于选择特异定向破坏病毒dsRNA-dsRNA结合蛋白间结合的治疗剂时，最好但非必需利用衍生自病毒的dsRNA结合蛋白。
例如，呼肠病毒σ3蛋白是呼肠病毒颗粒的主要外壳体组分，其也呈现dsRNA结合活性，在其C-末端具有dsRNA结合结构域(dsRBD)其由365个残基序列的大约233～305位氨基酸的大约85个氨基酸组成，(Yue，Z．，et al．，J．Virology 70：3497-3501，1996)。σ3已表明对晚期病毒mRNA的翻译有体外刺激作用(Mabrouk，etal．，Biochem．Cell Biol．73：137-145，1995)。全长σ3蛋白可被克隆及稳定表达，如根据公布的方法在哺乳动物(HeLa)细胞系中进行表达。(Yue，Z，et al．，J．Virology 70：3497-3501，1996，引入本文作参考)。对该程序修改，应用上述细胞系，可用于生产C-末端区衍生的dsRBD，其也可用于本发明的分析法。
非病毒dsRNA结合蛋白包括，但非限于衍生自鸡肺的140，000道尔顿的Z-DNA结合蛋白(Herbert，et a1．，Nucleic Acids Symp．Ser．33：16-19,1995)：酿酒酵母RNase H1 N-末端结合结构域(Cerritelli，S．M．，RNA 1：3，246-259，1995)；La(SS-B)自身免疫抗原，其解旋dsRNA，并从而抑制dsRNA激活的蛋白激酶(PKR)(Xiao，Q．，etal，Nucleic Acids Research，22：2512-2518，1994)；衍生自HeLa细胞的与HIV-1 Rev-反应元件RNA结合的TRBP(Park，H．，et a1．，Proc．Natl．Acad．Sci．91：4713-7，1994)；人K88克隆的dsRNA特异性腺苷脱氨酶(两种形式：一种干扰素可诱导的，另一为组成型的；Patterson，et al．，Mol．Cell．Biol 15(10)：5376-5388，1995)；DRAF1及DRAF2，其参与对腺病毒或dsRNA的应答中而致的，干扰素刺激的基因的活性转录(Daly，C．，et al．，Mol．Cell．Biol．13(6)：3756-3764，1993)。
b．测试dsRNA片段
为用于本发明之分析，dsRNA片段优选是一小双螺旋RNA分子，优选长度在大约10～50个核苷酸。大部分通过用于此分析的dsRNA结合蛋白测定dsRNA片段的最佳长度。以下所述的支持本发明进行的试验提供了用于优化本发明分析中所用的dsRNA片段长度的指导。
为检测与测试化合物的序列优选或特异性结合，可构建dsRNA片段以包括一或多个可变化的，限定的碱基对序列。
可通过许多方式产生dsRNA。例如，根据熟知方法在标准寡核苷酸合成仪上，可单独化学合成互补链，并混合实现退火以形成dsRNA。或者，另一种使用互补于位于测试寡核苷酸顶链3’末端的引发位点的引物的合成方法，可以用于产生dsRNA。该合成的寡核苷酸通常用在预筛选阶段，以区分序列特异性及序列非特异性RNA结合分子。
RNA分子也可在体外转录***中合成，其中发夹寡核糖核苷酸合成自DNA模板(即：线性序列包括茎的上链、环序列，然后下链互补于茎上链)。应用此型策略使自身退火的dsRNA寡核苷酸与特异性内在测试位点结合，该位点通常长度为3-8bp。对于具有混合碱基测试位点的寡核苷酸，部分发夹序列可转录自DNA模板(即上链茎，环，及部分下链茎)，使之退火并用于引发剩余主干结构的合成。
许多dsRNA结合蛋白具有辨别长完全互补双链RNA及较短dsRNA或其二级结构中有缺损的RNA的能力。例如，在支持本发明进行的试验中，发现30mer的dsRNA为E3L dsRNA结合区(dsRBD)的高效结合所需，而与较短分子如19mer的分子结合，只检出非常低的水平(如果有的话)(图4)。
明显地，对hPKR与dsRNA结合，蛋白质以协作方式与dsRNA结合，这是由于随RNA大小增加结合效力也提高。hPKR的单一dsRNA结合区占据dsRNA上的大约11个碱基对位点，相当于A型dsRNA的一转角。但与如此短dsRNA结合只在饱和蛋白质浓度下可被证实。相对较好的结合是在与16mer的dsRNA结合中观测到的，与长度为22～24个碱基对的RNA的结合亲和性明显增加，该RNA可适合PKR二聚体。与更长的dsRNA结合可观测到进一步增加的结合。30个碱基对提供更强结合，并且是用dsRNA激活PKR的最小大小(Manche L．，et al．，Mol．Cell．Biol．12：5238-5248，1992；Schmedt C．，et al．，J．Mol．Biol249：29-44，1995；Bevilacqua P．C．et al．，Biochemistry 35：9983-9994，1996)。
图2示出痘苗病毒E3L dsRBD与具有本发明的SEQ ID No：8(5’～3’)序列的放射标记的30mer双螺旋dsRNA片段的结合。结合条件见本文实施例3所述，且通过6％阻滞凝胶的放射自显影术显示结合。如图所示，在此分析中增加E3L结合蛋白的量，导致30mer的dsRNA增加汇集成具有较高表观分子量，相应于在凝胶顶部的30mer-E3L复合物的条带。在所用条件下，计算用于结合的Kd约4-7nM。相反，即使在如400nM高的浓度，E3L蛋白也不能有效地与ssRNA(32p标记的1B)或RNA／DNA杂交体结合(图3)。
进一步的试验示出，E3L蛋白要求一最小规格的dsRNA片段以有效结合。图4示出E3L-dsRNA结合复合物的形成是dsRNA长度的函数(在凝胶顶部示出)。通过这些试验可确定30mer与E3L的结合几乎是19mer的50～100倍，且22mer和26mer的结合只比19mer略好。
c．测试化合物
尽管理论上本发明的分析可测试任何化合物，但鉴于由筛选分析鉴别的化合物的治疗目的，一些药物学考虑可影响用于筛选的分子库的选择。一般优选的是小于大约10，000分子量的小分子，更优选小于1，000分子量的小分子。此化合物优选可渗透入细胞，并优选不是多肽或多核苷酸，且其趋于对内源性细胞机制的降解敏感。但本发明的多联体可经酰胺键(肽键)连接。另外，当注射入脊椎动物，尤其是人时，小分子一般似乎不易于诱发免疫应答。许多制药公司具有小分子化合物的广泛文库，不论分立的还是混合的实体都可通过本发明的分析筛选。小分子可以是生物或化学合成的有机或无机化合物。合成的文库可经商购而得，包括但非限于Comgenex(Princeton，NJ)，Microsource(New Milford，CT)，Brandon Associates(Merrimack，NH)，Aldrich(Milwaukee，WI)。衍生自植物或动物提取物的天然化合物文库可从如Pan Labs(Bothell，WA)及MycoSearch(NC)商购。文库也可***地修饰以产生已知或易于鉴别的衍生化合物用于测试。进一步要明白的是在本发明中，通过本文所述筛选法在第一次筛选中选择的化合物，可经化学修饰并进一步选择增强的dsRNA结合活性或更为药学所适合的性质。如此选择的化学修饰的化合物也认为是通过本发明的筛选分析选择的。
C．捕捉及检测***
1、一般方法
任何本领域已知的捕捉／检测方法都可用于确定在本发明结合分析中dsRNA结合蛋白与dsRNA片段的结合量。RNA结合蛋白或测试多核苷酸片段之一或两者均可直接被标记，或间接地用指示分子如荧光染料、放射性同位素及酶，根据本领域熟知方法进行标记。通常地，在引入本文作参考的Howard，G．C．et al．，非放射性检测方法(Appleton &Lange，Norwalk，CT，1993)中可发现一些合适的方法。
在支持本发明进行的试验中使用的一典型检测***是一凝胶迁移率变动(“条带移位”，“凝胶移位”)分析，方法见于实施例3所述。在此，dsRNA片段是用32p末端标记的，并在所设计条件下将反应产物进行凝胶电泳，以检测表观分子量的不同。通过放射自显影显示凝胶，并通过与结合蛋白共迁移至凝胶中某一位置的放射活性的dsRNA的量表明结合的不同，表明相应较高的分子量。此凝胶通过可商购凝胶扫描仪(或Storm Phos phoimager，Molecular Devices，MountainView，CA)可被定量。
其它捕捉及检测方法可包括直接、间接或竞争方式，并可应用亲和性捕捉***如链亲和素／生物素结合或免疫化学试剂，其中一或多个结合蛋白及RNA片段，或这些组分的标记或标志被捕捉。如此分析用于检测在分析中dsRNA片段和dsRNA结合蛋白间结合的药物诱导的降低及增加。结合增加表示两分子间亲和性以药物诱导增加，表示结合比增加，解离比降低，或二者均有。显示此特点的药物化合物也可用于基因调节或药物定向。
一典型捕捉***利用“生物素保防护”***。在此，生物素分子与蛋白结合位点内的一碱基连接，连接方式是使蛋白质的结合不被扰乱，且当蛋白质与位点结合时，生物素被保护不与链亲和素结合，通过药物置换结合蛋白质暴露生物素，其然后与链亲和素结合。此型分析用于闪烁亲近测定法(SPA，Amersham)方式以对结合定量。在此，放射标记的(33P)dsRNA分子被用闪烁剂浸渍的链亲和素化的SPA珠捕捉。在寡核苷酸中放射性同位素(如3H，33P)对珠的亲近使珠闪烁。一信号表示有效的DNA结合分子的存在；测试序列提供较高信号表示针对不同序列的相对优势，此分析用于高通量筛选，以筛选dsRNA结合化合物(实施例7和8)。由于能高于观察基线的信号，因而此分析的直接性可筛选序列的复杂集合体。
可进行一相似的分析方式，其中其它小的可猝灭的标记物如荧光素与结合位点结合。
滤膜结合分析也可适用于本发明，此分析方式的建立及分析本领域已熟知。
其它可与本发明的分析联合使用的适当分析包括但非限于以下所示：·使用抗体的间接SPA捕捉分析·荧光偏振(各向异性；Checovich W．，et al．，Nature 375：254-256，1995)·多重质谱·酶联免疫分析(ELISA)·RNA PCR鉴定(见于以下)
此分析也能在生物芯片上进行，这能大大提高可被检测的序列的容量及复杂度。此方法以及上面所列的许多方法可用于适应本发明的dsRNA结合分析以高通量筛选。
2、RNA PCR扩增及鉴定
上述分析可与扩增方法连用(在一实施方案中，聚合酶链反应(PCR)；Mullis，K．B．，et al．，美国专利4，683，202及4，683，195；Innis等编辑，PCR方案：方法及应用指南，学术出版社公司(1991))，以完成测试分子与之结合是最优选的RNA序列的鉴别。
在本发明的此实施方案中，合成含有下述元件的dsRNA测试片段：
(ⅰ)dsRNA结合蛋白(如E3L)的结合位点，即筛选位点，
(ⅱ)包埋在筛选位点内，至少有一个由2个以上碱基对并优选少于20个碱基对(更优选3-8碱基对)组成的测试序列，以及
(ⅲ)分离选择的序列进行扩增的手段，如，在测试位点序列侧翼的足够数目的碱基以作为PCR扩增的引发位点，或作为用于促进克隆的限制位点。
引发位点也可用作双脱氧测序反应的引物结合位点，并可含有促进克隆操作的限制酶切割位点。
如此测试寡核苷酸的实例之一是图7A所示的SEQ ID NO：1，其含有所有可能的3-mer排列。此类多核苷酸可被再分以提供集合的分析。在集合的分析形式中，如可与结合序列的PCR证实连用的分析形式，如下所述，所有可能的(43=64)三聚体或(44=256)四碱基对序列应在测试dsRNA片段的集合体中以等摩尔水平呈现。从此实施例中看出，对于8个碱基对测试序列而言，所有可能的碱基对序列(48=65，536)将在此分析中以等摩尔量呈现。
就任何单链测试多核苷酸集合体而言，单链分子与引物退火，且通过引物延伸反应酶合成下链。本发明应用此分析／扩增PCR循环实施方案的优点是在此实施方案中便于研究较大的测试序列。此方案尤其适于测定最高亲和性结合序列，而不是测定所有测试序列结合的排列顺序；该排列可通过筛选如上述的单独序列而测定。
3、用dsRNA结合分析测定测试寡核苷酸混合集合体内的结合
使用双链的测试RNA片段，此基本分析基本如下所述进行(D部分)：典型地不使用放射性检测***。任何RNA：蛋白质组合可用于此分析***。一典型组合是如实施例3所述的与dsRNA分子结合应用的E3L蛋白的dsRNA结合区(dRBD)。
在本发明的此实施方案中，将E3L dRBD加入反应混合物中的测试寡核苷酸集合体的(例如，内己含有256个四碱基对测试序列的测试dsRNA多核苷酸片段，这些测试序列在上述寡核苷酸集合体中以等摩尔水平呈现)，如实施例3所述。测试候选化合物通过与测试序列结合而对E3L RNA：蛋白质复合物结合的不同破坏能力。在加入测试分子(如衍生自组合文库、发酵肉汤或真菌提取物的化合物)之后，将分析混合物温育所需时间。然后将dsRNA一结合蛋白复合物通过本领域已知方法从未结合的dsRNA中分离。一合适的分离及鉴定方法是制备凝胶条带移位分析，其中dsRNA多核苷酸片段是放射活性末端标记的，且通过非变性凝胶将混合物进行电泳，然后进行放射自显影，以显示蛋白质结合的及未结合的dsRNA片段。或者，此分析混合物可通过层析如HPLC而分离。
在此分析的一实施方案中，用PCR技术扩增未结合的dsRNA。将所得PCR扩增物的一等份再经RNA：蛋白质结合分析及PCR扩增，以检测并鉴别在结合分析期间蛋白质从中被置换的序列。应用每个顺序滤液将这些分离及反应步骤重复几次。在每次PCR扩增后，保留部分PCR扩增物进行测序分析。通过重复进行分析／扩增程序的循环，结果是被扩增的测试寡核苷酸序列含有是测试分子优选结合位点的测试序列。经过随后的分析／扩增循环，这些寡核苷酸被扩增，以代表越来越多百分比的扩增的RNA分子总群体。
概括地，优选与本发明筛选分析联合的增强的PCR策略是“迭代形式”，包括以下步骤：
1、从含序列随机药物测试区的单链RNA合成集合开始。
2、用RNA引物，NTPS，及RNA依赖型RNA聚合酶活性拷贝单链RNA，以产生双链RNA。
3、应用本发明的结合及选择分析从游离RNA中分离RNA：蛋白质复合物。这可通过天然凝胶迁移率变动分析进行。
4、用RNA结合测试化合物置换最小可检测量的蛋白质结合的RNA(即放射同位素末端标记的)，(即通过滴定)。
5、用PCR扩增药物置换的RNA。对双链DNA PCR产物进行测序，以观察测试位点内的共有序列。
6、转录双链DNA以产生筛选选择的单链RNA的集合体。
7、如果需要，重复1-6步骤，获得足够的进行检测的物质。
除了PCR，未结合的dsRNA组分可经其它方法扩增。例如，可将滤液中的RNA转录成相应DNA分子，克隆入选择的载体(如噬菌体载体，如λ噬菌体，或标准克隆载体如pBR322基或pUC基载体)。然后将此克隆的序列转化至合适的宿主内，其中选择的载体可复制(如细菌或酵母)。培养转化的宿主机体，同时扩增含克隆的序列的载体。然后通过标准程序(Maniatis，et al．，Sambrook，et al．，Ausubel et al．，)分离载体。典型地，最初得自RNA滤液的克隆的序列，通过限制酶消化及大小分级分离(例如，消化产物的电流泳分离，随后将相应克隆序列电洗脱)(Ausubel et al．，)得自载体。然后可将这些分离的扩增的测试寡核苷酸序列再经上述分析／扩增继续循环。
在另一实施方案中，原始RNA滤液中存在的寡核苷酸可被分离，测序及通过寡核苷酸拷贝的体外合成而扩增。
对扩增的DNA测序，根据本领域熟知方法，使用自动测序仪，应用例如放射标记的引物及双脱氧测序法或标准化学方法，对每个循环样品进行测序。如果扩增的序列不足以分辩获得非多义序列信息，则将所得cDNA进一步纯化并测序。
另一实施方案去除dsRNA扩增步骤。在此实施方案中，分析混合物含有寡核苷酸集合体和dsRNA结合蛋白。将测试化合物温育然后用如HPLC分离。商购的HPLC***可提供非常高的分辨率。分析混合物的HPLC组分可通过质谱分析。得自质谱的片段类型可鉴别测试化合物的优选结合序列。
4、测定下游因子的修饰
另一种评价结合的方式利用生物学事件的级联。当将dsRNA导入真核宿主细胞时，其在细胞内可激活生物学事件级联。图8示出在哺乳动物细胞中对dsRNA应答产生的dsRNA激活的蛋白激酶(PKR)级联的图示。如图所示，与dsRNA结合时，PKR进行自磷酸化，由此其使其它底物包括eIF-2和／或其它可磷酸化的指示物PKR蛋白底物磷酸化，这些底物可存在于混合物中或被加入其中，如图所表示。eIF-2的磷酸化导致蛋白质合成降低。因此，当反应混合物也含有各种组分及试剂如ATP时，对dsRNA与PKR的结合的干扰可在此途径的各步骤测定-例如，如图中所示PKR，eIF-2或指示蛋白的磷酸化水平，或蛋白质合成水平。
D．分析条件
1、基本分析条件
本发明的分析提供了一种鉴别能破坏dsRNA结合蛋白或蛋白质复合物与dsRNA的结合的化合物的方法。简而言之，将如上所述的测试化合物在存在dsRNA结合蛋白与之结合的dsRNA片段的情况下与dsRNA结合蛋白混合。在化合物存在与否的情况下测定dsRNA片段与结合蛋白的结合水平，并加以对比。如果存在药剂时，结合水平明显降低，则认为此测试化合物能破坏dsRNA：dsRNA结合蛋白的结合。或者，此分析可用于检测增强dsRNA结合蛋白与dsRNA的结合的化合物，简单地通过监测反应在存在化合物的情况下结合水平增加即可。在本发明中，用于阐述结合水平的术语“明显地”或“有效地”表示测试及对照结合水平之间有统计学上明显不同。通过本领域已知的各种方法可测定统计学显著性，只要这种方法适用于本发明分析形式。
在支持本发明进行的试验中，见于实施例3所述，用γ-32P ATP将30mer RNA多核苷酸用32P在S’末端标记。将32P标记的及未标记的寡核苷酸退火，以产生双链30mer RNA。在平行试验中，将30merRNA与互补DNA分子退火，以产生双链30mer RNA／DNA杂交体。在其它试验中，相似地产生19mer，22mer及26mer RNA双螺旋分子。
在合适的双螺旋RNA(或RNA／DNA杂交体)片段存在下，将如实施例1和2所述产生的重组E3L蛋白(1-400nM)，加入含0．2nMRNA或RNA／DNA杂交体的反应混合物中。在室温下反应30分钟后，将样品加样于6％阻滞凝胶；处理凝胶并进行放射自显影，通过观察并定量凝胶中放射标记的RNA的迁移位置监测结合的检测。
以下所述结果揭示了E3L结合双链30mer RNA寡核苷酸的能力，相比之下，E3L与ssRNA或RNA／DNA杂交体结合不足。还阐述了E3L对由至少30个碱基对组成的核糖核苷酸的优选。
2、测试化合物在分析中的作用
图5(A-D)示出dsRNA结合分析图示，其中示出dsRNA结合蛋白与30-mer结合，应理解示作结合蛋白的结构可以是单蛋白质或由两个或多个蛋白质亚单位组成的蛋白质复合物。图5B示出与30-mer dsRNA分子的中心部分结合的药物或测试化合物，该结合从而抑制dsRNA结合蛋白与30-mer的结合能力。根据不以任何方式限制本发明的一假说，dsRNA中心存在化合物产生了2个15-mer的等价物；由于预先发现结合蛋白对较小分子的结合明显明显降低(图4)，与此片段或图示的10mer片段(图5C)的结合相应地降低。图5D示出药物在dsRNA片段的末端附近结合的情况。此构建体通常被认为是本分析所不希望的，这是由于与末端区域结合不足以可测定地置换或破坏与多核苷酸序列的结合。
在支持本发明进行试验中，将一种已知嵌入剂溴化乙锭加入含30-mer dsRNA寡核苷酸的反应混合物中，温育30分钟，然后加入E3L，并将反应混合物在室温再温育30分钟。通过上述凝胶阻滞试验分析样品。
图6A和6B示出这些试验的结果，溴化乙锭在10μM浓度以上能阻止E3L与dsRNA结合(图6A)，当凝胶也含有3μM溴化乙锭时，较低浓度(3．3μM)能有效降低结合(图6B)。这些结果提示实际Kd很可能低于3μM。在与E3L温育前或后将溴化乙锭加入反应混合物的试验结果是相似的。除提供关于溴化乙锭的结合性的信息之外，此试验还作为能用于评价与dsRNA或其它多核苷酸结合亲和性的范例。
在本文所述其它试验中，将RNA结合蛋白，Staufen，E3L，mPKR及hPKR与长度为30个多核苷酸的双螺旋dsRNA培养。图12示出所有四种蛋白均高亲和性与dsRNA结合。hPKR结合亲和性最高。然后测试已知RNA结合药物对hPKR与双螺旋dsRNA结合的作用。如图14所示，当测试这些药物时，正如期望的，新霉素与dsRNA结合亲和性最高。
接着，此分析用于筛选新化合物的偏性文库，以鉴别与dsRNA结合并置换hPKR的化合物，筛选的144种化合物，有9种能与dsRNA结合并置换hPKR。
以上试验例证了当发现化合物阻止dsRNA结合蛋白与dsRNA结合时获得的结果类型。应知为使此化合物成为合适的药物候选物，应进行进一步毒性测试。例如，如上选择的化合物的毒性可在哺乳动物细胞中进行测试，以保证此化合物在没有dsRNA存在时，不能非选择性结合其它形式的宿主细胞内源性多核苷酸或以其它方式影响细胞代谢。
3、测试与特异件RNA序列的结合
应意识到所有可能的给定长度的特异结合位点的组合，从理论上均可掺入具有限定序列的单dsRNA多核苷酸中。例如，就3-核苷酸结合位点而言，有43=64种可能的组合可掺入34-mer dsRNA序列中(图7A)。如此序列一实例见图7A所示，其中所有可能的3-mer以“+”或“-”链代表。为筛选分析之目的，34-mer序列可分成某些寡核苷酸。例如，可近于等分成2个寡核苷酸，每个具有唯一的一套3核苷酸结合位点(图7B)。提供侧翼序列以保证用于结合的dsRNA的足够大小。图7F和7G示出具有侧翼序列的两个寡苷酸，其一起提供3核苷酸结合位点的所有64种可能组合。图7F的寡核苷酸是生物素标记的，并用于闪烁亲近测定法。此32-mer集团含有没有丰余的3-mer序列的所有64种可能组合。图7A中双螺旋寡核苷酸可被认为是32-mer集团以易于分析。当此双螺旋被认为是32-mer集团时，任何两个或多个寡核苷酸可被鉴别，其一起提供3个核苷酸的所有64种可能组合。
相似地，在8个核苷酸中可提供所有可能的44=256种4-核苷酸结合位点(图11)。在另一实施方案中，每个寡核苷酸引入了两个或多个结合位点，如图7C所示。在此情况中，34-mer序列可分成2个以上寡核苷酸。例如34-mer序列可分成4个核苷酸，每个携带大约25％ 34mer序列的2个拷贝(图7C)。在每个寡核苷酸的拷贝之一中核苷酸序列可重排，以促进寡核苷酸链的精确退火。为进行此化合物的结合序列特异性研究，34-mer序列可进一步分成更多寡核苷酸，每个带单一(图7D)或多个(图7E)34-核苷酸序列的部分。
用掺入许多结合位点，如图7B、7C所示的多核苷酸，的寡核苷酸进行化合物的初步筛选(预选)。随后用类似于图7D和7E所示的寡核苷酸进行化合物序列特异性的鉴定，寡核苷酸被设计为在预选步骤结合一定化合物的核苷酸结合位点的子集。同时进行RT-PCR研究以证实dsRNA序列特异性化合物的结合位点。
Ⅲ、dsRNA结合剂
A、小分子多联体dsRNA结合剂
根据本发明的一重要特点，上述筛选分析可用于鉴别(ⅰ)与dsRNA相对较高亲和性结合(如Kd微摩尔级或之上)并从而抑制结合蛋白与RNA结合的化合物，(ⅱ)与双螺旋dsRNA序列特异性结合的化合物，或(ⅲ)非序列特异性与dsRNA结构特异结合的化合物。根据本发明，序列特异性及非序列特异性化合物均可用于形成具有增强的对dsRNA特异性的多联剂。即可从单独的序列非特异性化合物，或单独的序列特异性化合物，或从其组合中形成制剂。这二类化合物均可应用本文所述筛选分析进行鉴别，基于其特性，可按目录分类以便形成定制的多联双螺旋dsRNA结合剂。
根据此方面，更特别地可见本发明阐述并包括与dsRNA以碱基序列特异性结合及非碱基序列特异性结合的dsRNA结合剂。该制剂用衍生自结合分析的信息设计，见于下述。当鉴别靶dsRNA分子时(如通过选择其基因组已知由dsRNA结合蛋白调节的特定病毒)，RNA基因组的序列，或其部分，可被鉴别，应用通过在前述部分的分析中筛选而限定的化合物文库，设计两或多个小分子dsRNA结合化合物的多联体。可根据能序列选择性地与特别是3-16，或优选3-8个也在靶基因组中发现的碱基对序列结合选择一或多种化合物。选择第二种与病毒基因组内毗邻或附近区(在大约20个碱基内)结合的化合物，且将此第二种化合物经适当的化学连接，包括但非限于用多核苷酸接头，肽接头，多糖间隔基等与第一种化合物连接，如下所述。
或者，根据本发明的一重要方面，多联体可由与dsRNA非序列特异性结合的化合物组成。如此组合尤其用于对抗未知病原学和／或不明感染因子。更优选地，此制剂由序列特异性和非序列特异性分子的混合物组成。
所得制剂优选是由第一和第二种化合物共价连接形成的线性的，非寡核苷酸多联体，如下所述，可选择多联体中至少一种化合物以提供与靶dsRNA中3-8个碱基对区域的碱基特异性结合。为形成多联体而选择的其它化合物可呈序列非特异性结合或序列特异性(碱基特异性)结合。
如上所述，应用至少一种呈序列非特异性结合的多联体亚单位的优点是：其潜在地扩大可被此制剂靶击的有机体的范围。该广谱制剂在抗具有未知和／或高突变基因组序列的病毒性病原体(如流感病毒)中尤为重要。
此产生抗病毒剂的多联途径的优点部分依于以下分析。即分析中筛选的任何特殊RNA结合小分子只可识别2-4个碱基对位点。即使此识别是十分特异性的，该分子仍可能对宿主细胞有毒性，这是由于尽管哺乳动物细胞一般没有双螺旋RNA的长序列，例如在转移RNA(tRNA)的发夹区内确实存在短序列。但RNA结合药物的潜在毒性可通过用这些药物产生二聚体、三聚体、或多聚体而明显降低，这是由于如此多联体制剂将与较长的，可能是病毒的区域结合。
此外，从伴随着药物与dsRNA的结合的自由能变化的理论考虑，二聚体的内在结合常数应是单体结合常数的平方。三聚体化理论上产生的结合亲和性应是同源单体亚单位或异源单体亚单位的亲和性的立方，三聚化已在DNA***中产生具有高达10-12M亲和性的化合物(Laugaa，et al．，Biochemistry 23：1336，1985)。
作为一假拟实例，如果将相对弱的dsRNA结合药物X二聚体化，其与4bp位点结合亲和性为2×10-5M，此双-X药物识别8bp位点的理论亲和性将为4×10-10M。单体X和双-X形式之间的亲和性相差200，000倍。
有两种具有中等毒性的单体药物的二聚体化(或多聚体化)的直接好处。首先，由于较高亲和性，因而所需药物浓度被降低，以致甚至相对毒性分子也可用作药物。其次，由于毒性大多与与基因组和／或与转录物或核糖体RNA结合的药物分子平均数相关，由于通过增加结合位点的长度而提高对较长dsRNA结构域的特异性，从而毒性被降低。然而，优选在选择作为潜在治疗剂之前，在细胞毒性分析中测试化合物。
在此应指出，本发明的筛选方法产生一具有高组合潜力的作为dsRNA结合剂的化合物“库”，如果发现了50～100个dsRNA结合单体配体，表示与250～500个高亲和性位点及1000～2500个中度亲和性位点结合的潜力。因此，发现一些适合医学显著的靶位点的高亲和性药物结合位点的几率是很大的。另外，异源二聚体药物可被设计以匹配8或多个bp的RNA靶位点，对潜在药物提供特异性。
如上所述，一旦已知一些分子的序列优选性，此信息可用于设计具有很大序列特异性以很高结合亲和性的寡聚体分子，或多联体(同源或异源聚合体)。例如，如果一dsRNA结合分子X与4bp序列5’-ACGU-3’／5’-ACGU-3’以平衡亲和性常数为2×10-5M结合，则X的二聚体X2应以结合平衡亲和性常数为(2×10-5M)2=4×10-10M结合序列二聚体，即5’-ACGUACGU-3’／5’-ACGUACGU-3’(SEQ ID NO：2)。此dsRNA结合二聚体分子X2以较高序列特异性识别8bp序列，具有理论上比RNA结合单体X高200，000倍的结合亲和性的。
相同的论点可延伸至三聚体分子：X的三聚体X3将以理论平衡亲和性常数为8×10-15M结合12bp序列，5’-ACGUACGUACGU-3’／5’-ACGUACGUACGU-3’(SEQ ID NO：3)。用上述方法构建的RNA结合聚合物可以是亲代化合物或由亲代化合物混合的亚单位组成的寡聚化合物的同源或异源聚合物。同源聚合物是用两或多个相同单体RNA结合分子的亚单位构建的分子。异源聚合物是用两或多个不同单体RNA结合分子的亚单位构建的分子。寡聚化合物是由亲代化合物的碎片混合而构建的，并可以是异源或同源单体的。
RNA结合亚单位可被化学偶联形成异源或同源聚合物。亚单位可直接彼此连接，如偏端霉素分子的家族，或亚单位可用间隔分子如碳链或肽键连接。亚单位的偶联依于亚单位的化学特性：任二个亚单位分子的适当的偶联反应可从化学文献中确定。亚单位的选择取决于被靶击的序列，以及本申请第Ⅵ．B部分中所述方法积累的数据。
B．dsRNA修饰试剂
根据本发明一重要特点，应意识到就一些应用而言，需要使如上所述形成的多联体制剂具有附加化学反应性，当结合剂与dsRNA结合或与dsRNA非常接近时，其将选择性地(超过细胞或组织中所有其它分子)化学性地修饰dsRNA。在此，多联体分子的二聚体／多聚体部分介导与如上述的dsRNA结合。该分子的反应部分非必须参与与RNA的结合。反应部分优选应用类似于如上述产生二聚体／多聚体的接头策略与线性多聚体多联体连接。根据本发明的此实施方案，有效地设计对dsRNA的不可逆化学修饰，以干扰RNA的一些重要或基本功能，从而使之少参与其正常功能，例如病毒复制。
有一些化学反应可用于构建如此分子。不排除其它的一些优选实施方案包括(1)共价修饰(即通过氮芥子试剂或反应前的chylopropyl官功能化的聚异芳香族试剂烷基化鸟嘌呤碱基)，(2)链间交联(即通过补骨脂素)，(3)转酯化切割(即通过Lewis酸金属螯合复合物)，(4)通过其它激活的物质切割(即ene-diynes；激活的高价金属-氧基复合物)。根据本发明此方面形成的分子优点是提供比仅二聚体／多聚体结合而达到的增强的功能或应答。
Ⅳ．实用性
本发明的RNA：蛋白质分析已被设计去筛选各种长度及复杂性的全部范围的RNA序列结合的化合物。由此分析揭示的RNA结合分子具有用作分子试剂，治疗剂或治疗剂前体的潜力。序列特异性或序列非特异性dsRNA结合分子基本上是任何涉及dsRNA的疾病或病情的有效潜在治疗剂。用于分析的测试序列的实例包括 a)参与感染因子尤其是病毒、细菌、酵母及其它真菌的维持或增殖的因子的结合序列，b)导致某些病毒基因不适当表达的序列，c)参与快速生长的细胞复制的序列。
由本分析鉴别的分子作为开发具有不同特异性或不同亲和性的同类物的引导化合物是特别有价值的。
本发明的一优点是此分析能筛选针对通常的dsRNA的结合活性(如dsRNA结构特异性或dsRNA序列非特异性化合物)，或针对特异性dsRNA序列的结合活性(dsRNA序列特异性化合物)。靶序列的一个类型包括那些存在于医学或农业上有意义的病原体(分别为病毒和类病毒)的序列。
此分析也可用于筛选具有序列优选结合性的分子，以确定具有最高结合亲和性的序列，和／或用于测定大量不同序列间的相对亲和性。还可用于检测和／或设计新治疗剂。
也是本发明组成部分的是治疗或预防病毒或类病毒感染的方法。如此方法一般包括给感染的个体或给处于感染危险中的个体施用根据本文所述筛选选择的dsRNA结合化合物成由其形成的多联体。尽管一些病毒可用这些方法处理，包括未知或突变基因组序列的突变的病毒，但具有已知的ssRNA或dsRNA基因组的病毒或类病毒也可如下部分中所述进行处理。
A．制剂：靶生物体
应用本发明所述分析方法揭示的化合物以及根据本发明构建的多联体化合物，尤其适用于对抗具有病毒病原学的疾病，原因如上述。目前仅有少数有效的病毒治疗剂是可利用的。另外，随着对所有生物***，包括病毒基因组，细胞基因组，病原体基因组(细菌、真菌、真核寄生虫等)的序列数据的积累，dsRNA结合药物靶位点数在将来将大大增加。
有许多鉴别dsRNA结合药物的医学有效靶序列的方法，包括但非限于以下所述。首先，医学有效靶序列在生物界中的病原体内发现，尤其在病毒病原体内发现。其次，病原体的靶区域是已鉴定的，如在病毒的ssRNA或dsRNA序列中，影响基因组RNA分子的表达或活性的特异性靶序列是鉴定的，如参与病毒复制的位点。
如上所述，RNA病毒尤为适合本文所述的抗病毒方法及组合物。表1列出一些潜在靶病原体，包括人、动物及植物病原体。
表1 病原性RNA病毒
    基因组     科     属             种
    单链RNA 小RNA病毒科 肠道病毒属     背髓灰质炎病毒1，2，3
    正链     柯萨奇病毒A1-22，A24
    非分节段     人欧可病毒1-7，11-27，29-33
    7．2-8．4Kb     人肠道病毒68-71
    猪水泡病病毒
    猪肠道病毒1-8
    牛肠道病毒1-7
  心病毒属     脑心肌炎病毒
  鼻病毒属 人鼻病毒1-100，1A，1B，Hanks
    牛鼻病毒1-3
    马鼻病毒1和2
***病毒属 ***病毒O，A，C，SAT1-3
  肝病毒属     甲肝病毒
    单链RNA 嵌杯状病毒科 嵌杯状病毒属     诺沃克(南汉普敦，雪山，夏威夷，汤顿)
    正链     戊肝病毒(未分类)
    非分节段     猪水疱疹病毒
    7．4-7．7Kb     犬嵌杯状病毒
    牛肠道嵌杯状病毒
    猪肠道嵌杯状病毒
    水貂嵌杯状病毒
    禽嵌杯状病毒
    单链RNA 星状病毒科  星状病毒属     人星状病毒1-5
    正链     牛星状病毒1和2
    非分节段     猪星状病毒
    7．2-7．9Kb     犬星状病毒
    单链RNA 披膜病毒科   α病毒属     东部马脑炎病毒
    正链     委内瑞拉马脑炎病毒
    非分节段 新培斯病毒(Ochelobo和Babanki)
    9．7-11．8Kb     基孔贡亚病毒
    奥尼永尼永病毒
    Igbo Ora病毒
    基因组     科     属     种
    Ross River病毒
    Mayaro病毒
    Barmah森林病毒
    东部马脑炎病毒
    委内瑞拉马脑炎病毒
    东部马脑炎病毒
    西部马脑炎病毒
    盖塔病毒
风疹病毒属     风疹病毒
    单链RNA 黄病毒科 黄病毒属     黄热病毒
    正链     登革病毒1-4
    非分节段     日本脑炎病毒
    9．5-12．5Kb     西尼罗病毒
    墨累山谷脑炎病毒
    Rocio病毒
    蜱传脑炎病毒
    欧洲蜱传脑炎病毒
    远东蜱传脑炎病毒
    俄罗斯春夏脑炎病毒
    贾萨努尔森林热病毒
    鄂木斯克出血热病毒
    Luoping病病毒
    波瓦散病毒
瘟病毒属     牛病毒性腹泻病毒
    猪瘟病毒
    绵羊边界病病毒
  未命名     丙肝病毒
    庚肝病毒
    单链RNA 冠状病毒科 冠状病毒属     人冠状病毒229-E，OC43，其它
    正链     禽传染性支气管炎病毒
    非分节段     火鸡蓝冠病
    20-36Kb     猪传播性胃肠炎病毒
    猪血凝性脑脊髓炎病毒
    基因组     科     属     种
    猪流行性出血热病毒
    牛冠状病毒
    猫传染性腹膜炎病毒
    猫肠道冠状病毒
    犬冠状病毒
 Torovirus     肠道和呼吸道病毒
    Berne病毒(马)
    Breda病毒(小牛)
    牛呼吸道torovirus
    猫torovirus
    单链RNA 动脉类病毒属     Lelystad virus(猪生殖呼吸综合征病毒)
    正链
    非分节段     VR2332(猪)
    15Kb     马动脉炎病毒
    单链RNA 副粘病毒科 副粘病毒属     人副流感病毒1和3
    负链     牛副流感病毒3
    非分节段     仙台病毒
    16-20Kb  Rubulavirus     人流行性腮腺炎
    人副流感病毒2，4a和4b
    鸡新城疫病毒
    禽副粘病毒2(尤卡帕病毒)
禽副粘病毒3，4，5(Kunitachi)
    猪rubuIavirus(1a-Piedad-Michoacan-Mexico)
    猴副流感病毒
麻疹病毒属     麻疹病毒
    犬瘟热病毒
    牛瘟病毒
小反刍动物瘟病毒(山羊和绵羊)
    马麻疹病毒
肺病毒属     人呼吸道合胞病毒
    牛呼吸道合胞病毒
    小鼠肺炎病毒
    基因组     科     属     种
    单链RNA 弹状病毒科 水泡病毒属     水泡性口炎病毒
    负链     钱德普病毒
    非分节段     Piry病毒
    13-16Kb     Isfahan
狂犬病病毒属     狂犬病病毒
    欧洲蝙蝠病毒1和2
    Mokoa病毒
    Duvenhage病毒
    Lagos蝙蝠病毒
Ephemerovirus     牛暂时热病毒
SS，负义，8．9Kb 未分类 博尔纳病病毒属     博尔纳病病毒
    单链RNA 线性病毒科 线状病毒属     马堡病毒
    负链     埃博拉病毒
    非分节段     扎伊尔埃博拉病毒
    19．1Kb     苏丹埃博拉病毒
    单链RNA 正粘病毒科 流感病毒A，B 流感病毒A，B(人和许多动物)
  负义及一些双义 流感病毒C     流感病毒C(人和猪)
    分节段
    10-13．6Kb
    单链RNA 布尼病毒科 布尼病毒属     布尼亚病毒
   负义及一些双义     瓦朋病毒
    分节段     Oriboca病毒
    11-21Kb     Oropouche病毒
    Guama病毒
    LaCrosse病毒
    Jamestown Canycn病毒
    加利福尼亚脑炎病毒
     Showshoe野兔病毒(兔至人)
     Tahyna病毒
    Akabane和Aino(动物)
白蛉热病毒属     白蛉热-Naples病毒
    白蛉热-Sicilian病毒
    雷付脱谷热病毒
    基因组     科     属     种
内罗病毒属     克里米亚-刚果出血热病毒
汉坦病毒属     汉坦病毒
    汉城病毒(具有肾病综合征的出血热)
    Sin Nombre病毒(急性呼吸窘迫综合征)
    Puumala病毒(流行性肾病)
    单链RNA 沙粒病毒科 沙粒病毒属     淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒
 负义及一些双义     拉萨病毒
    分节段 Machupo病毒(波利维亚出血热)
    10-14Kb     Junin病毒(阿根廷出血热)
Guanarito病毒(委内瑞拉出血热)
    双链RNA 呼肠病毒科 呼肠病毒属 人呼肠病毒1，2，3致病性不是非常强
    正义     禽呼肠病毒
    分节段 环状病毒属     Orungo病毒(尼日利亚和乌干达的热病)
    16-27Kb     Kemerovo病毒(俄罗斯和埃及的热病)
    蓝舌病病毒1-25
    非洲马瘟病毒1-9
    马脑病病毒
轮状病毒属     人轮状病毒A和B群
    猪B和E群轮状病毒
    禽D群轮状病毒
    F群禽轮状病毒
Coltivirus     科罗拉多蜱传热病毒
    Eyach病毒(人)
    双链RNA  双RNA病毒科 双RNA病毒属     传染性法氏囊病病毒(家禽)
    正义     鱼传染性胰脏坏死病毒
    分节段
    5．7-5．9Kb
    单链RNA δ病毒     人肝炎δ病毒(缺陷型)
    环状
    基因组     科     属     种
    负义
    1．7Kb
    单链RNA  类病毒     马铃薯纺缍形块茎类病毒
    环状     鳄梨白斑类病毒
    250-350bp     葡萄类病毒
   感染性RNA     柑桔裂皮类病毒
    葡萄小黄斑类病毒
    酒花矮化类病毒
    花纹苹果类病毒
    番茄矮顶类病毒
    其它植物类病毒
B．治疗病毒感染的方法
如上所述，根据本发明筛选方法揭示的化合物特别适用于预防和／或治疗由RNA病毒(具有ssRNA或dsRNA作基因组的病毒)导致的病毒感染。
根据本发明的此方面，推定的病毒病原体可以检查以测定其基因组的序列或不被检查，并寻找并选择与基因组内特殊碱基对序列特异性(如果测定)或非特异性(如果未测定)结合的化合物。
本发明的一重要方面是广谱抗病毒剂。由于dsRNA的长序列只发生在病毒感染的细胞内，因而与呈dsRNA非碱基对序列特异性结合的化合物被用作广谱抗病毒剂。
根据需要测试dsRNA结合化合物可与序列特异性和／或序列非特生分子以任何组合形式形成一多联体。此化合物将与相邻的3-16或3-8个碱基对区域结合。在此，术语“相邻的”意为在彼此大约20碱基对之内。
然后从2个结合分子亚单位中形成一多联体，在适当的细胞及动物毒性试验之后，将此化合物配制在合适的药物赋形剂中进行调节研究。合适的赋形剂、剂量及剂量表和方式可根据形成多联体的化合物的类型和大小而发生变化；一旦已知多联体的组成，这种确定为本领域技术人员所熟知。然后将个体用治疗有效量的多联体(或单结合剂)治疗。
所有本申请内特别引用的参考文献及专利的全文并入参考，并特别地参考引用的内容。
以下实施例例证阐述本发明，而非限制本发明。
实施例
实施例1
E3L，Staufen，hPKR，mPKR的dsRNA结合结构域的克隆及表达
文献中阐述了许多dsRNA结合蛋白(Burd C．G．，et al．，Science265：615-621．1994)。由于不同的蛋白质的活性、溶解性、产量、稳定性及其它影响分析进行的因素各不相同，因而要表达一些RNA结合蛋白。
痘苗病毒E3L，Drosophila melanogaster Staufen及人和鼠PKR蛋白具有相似的识别dsRNA的结构域，St．Johnston等在一篇文章中提供了这些蛋白质的RNA结合结构域(St．Johnston D．，et al．，Proc．NatlAcad Sci USA 89：10979-10983，1982)。这些蛋白质的dsRNA结合结构域(dsRBD)在E．coli中被表达作谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白(Chang H-W and Jacobs B．L．，Virology 194：537-547，1993；BurdC．and Dreyfuss G．，Science 265：615-621，1995)。通过PCR获得编码这些蛋白质的dsRBD的DNA片段。通过用痘苗病毒DNA作模板，如实施例2中所述获得E3L dsRBD。用含Staufen dsRBD的dsRBD3质粒DNA作模板获得Staufen dsRBD(St Johnston D．，et al．，Proc Natl AcadSci USA 89：10979-10983，1992；St Johnson D．，et al．，Cell 66：5-63，1991)。用人及鼠cDNA和Advantage cDNA PCR试剂盒获得人及鼠PKR dsRBD。根据生产者介绍进行PCR。
以下DNA寡核苷酸在PCR反应中用作引物。限制酶位点下划线。
E3L：
正向：
GCGGGGATCCTTTGATGATGTTATTCCGG(Bam HⅠ)(SEQ ID NO：4)
反向：
GCGGAATTCAGAATCTAATGATGACT(EcoRI)(SEQ ID NO：5)
Staufen：
正向：
GCGCAGATCTATGGATGAGGGTGACAAGAA(Bgl Ⅱ)(SEQ ID NO：17)
反向：
GCGGAATTCACTTGGTGGGCGTAAGG(Eco RⅠ)(SEQ ID NO：18)
hPKR：
正向：
GCGCAGATCTGCTGGTGATCTTTCAGC(Bgl Ⅱ)(SEQ ID NO：11)
反向：
GCGCGATATCTAACCATTCATAAGCAACGAA(Eco RⅤ)(SEQ ID NO：12)
mPKR：
正向：
GCGCAGATCTGCCAGTGATACCCCAT(Bgl Ⅱ)(SEQ ID NO：13)
反向：
GCGCGATATCTAATTACTTGTCATAGACGAG(Eco RⅤ)(SEQ ID NO：14)
pGEX-2T E coli质粒表达载体用于克隆PCR片段。此载体含有在强嵌合tac启动子控制下的Schistosoma japonicum谷胱甘肽S转移酶(GST)的谷胱甘肽结合基序(Smith D．B．，et al．，Gene 67：31-40，1988)。PCR片段作为GST基序的替代物克隆进GST开放读框，且dsRBDs被表达作GST羧基末端融合蛋白。为此，用Bgl Ⅱ及Eco RⅤ限制酶切割hPKR及mPKR片段，并将其克隆入Bam HⅠ／SmaⅠ切割的载体，用Bgl Ⅱ及Eco RⅠ限制酶切割Staufen PCR片段，并克隆入BAM HⅠ／EcoRⅠ消化的pGEX-2T载体中，如下用T4 DNA连接酶进行克隆。
以1∶10的比率混合质粒及***DNA，并用T4 DNA连接酶在10℃，在50mM Tris-HCl pH7．5，7mM MgCl2，1mM DTT，1mM ATP，1μg DNA及50U／ml酶中连接过夜。用连接混合物根据厂商指导转化E．coli(Epicurian Coli XL1-Blue超感受态细胞)。用100μg／ml氨苄青霉素在培养板上分离阳性菌落，并用WizardTM minipreps DNA纯化***(Promega Madison WI)纯化质粒。用限制酶分析检验纯化的质粒保证正确***。
基本上如培养含pGEX-2T载体或其衍生物的菌株之所述(Smithand Johnson Gene 67：3l，1988)，培养表达E3L，Staufen，hPKR和mPKR蛋白的dsRBD的 E coli菌株。将E coli菌株的过夜培养物用含100mkg／ml氨苄青霉素的600ml LB培养基以1∶10稀释，并在30-33℃在可控环境培养箱摇床中(New Brunswick Scientific，Edison NJ)以150rpm振荡培养。在加入IPTG(异丙基硫代-β-硫代半乳糖苷酶；Gibco BRL，Gaithersburg，MD)至0．2mM浓度之前，细胞生长1小时，并在另外生长5小时后收集。在诱导之前及之后取细胞样品。以5000rpm将细胞在Eppendorf微离心机中离心2分钟，重悬浮于初始体积的PBS中并以相同条件再离心。将细胞粒状沉淀重悬浮于1×样品缓冲液(0．25M Tris-HCl，pH6．8，20％甘油，0．1％溴酚蓝，2．5％β-巯基乙醇，5％SDS)中，并在100℃保温5分钟，根据厂商指导在6-20％Tris-甘氨酸凝胶中经SDS-PAGE分离细胞蛋白。在诱导的细胞中检测到相当于37KD的蛋白质的条带，其接近GST-Staufen和GST-E3L融合蛋白(35KD)的期望大小，但在未诱导的细胞中未检测到。
相似地，相当于47KD和50KD蛋白质的条带在诱导的E．coliGST-mPKR和GST-hPKR的总细胞裂解物中检测到，但在未诱导的细胞裂解物中未检测到。
含各自双链结合结构域的GST-E3L，GST-Staufen，GST-mPKR和GST-hPKR融合蛋白分别被称作E3L，Staufen，mPKR和hPKR。
实施例2
E3L，Staufen，mPKR和hPKR的纯化
沉淀如实施例1所述产生的细胞培养物，并以1∶100培养体积悬浮于Dulbecco PBS中(Gibco BRL，Gaithersburg MD)。通过低转换Braun-Sonic 2000超声发生器，以最高输出量在冰上经4×30秒循环超声破坏细胞。将Triton X-100(Sigma，St Louis，MO)加至1％浓度，并将裂解物在JA-20离心机转子中以19，000rpm在5℃离心30分钟。在上清液中发现一些E3L和Staufen蛋白，其被标为“PBS组分”。大部分E3L和Staufen蛋白残留在沉淀中。mPKR和hPKR基本是可溶的，且实际上所有hPKR和大多数mPKR发现在上清液中。
通过用0．5M NaCl-40mM Tris-HCl，pH7．5在室温下提取1．5～2小时而回收沉淀中的E3L。在JA-20离心机中以19000rpm在室温离心30分钟以分离溶解的和未溶的组分。回收自上清液的E3L标记为“pH7．5组分”。将沉淀用0．5M NaCl-Tris-HCl pH8．0进一步提取，随后离心。此上清液标记为“pH8．0组分”。在更碱性pH值下，如用40mM碳酸盐缓冲液pH9．5可从沉淀中获得进一步的E3L蛋白提取物。
用水以1∶2稀释E3L pH7．5和pH8．0组分，并将稀释的组分以及PBS组分在4℃与1／20体积的谷胱甘肽Sepharose 4B珠(PharmaciaBiotech，Sweden)保温1小时。用20X体积的每种组分缓冲液将珠冲洗3次，并用5mM还原的谷胱甘肽-50mM Tris-HCl，pH8．0从珠中洗脱E3L蛋白。在洗脱物中获得的E3L蛋白是基本纯化的。将含E3L蛋白的组分集合，并用100体积的0．5M NaCl-40mM tris-HCl，pH8．0，2mM二硫苏糖醇，0．1％Triton-X-100，20％甘油透析。E3L dsRNA结合活性在组分之间检测无差异(数据未示出)。将所得蛋白质制备物等分并在-80℃冷冻。
在4℃将1／20体积的谷胱甘肽Sepharose 4B珠(Pharmacia BiotechSweden)与Staufen，mPKR和hPKR上清液组分保温1小时，用20倍体积的PBS缓冲液将珠冲洗3次，并用5mM还原的谷胱甘肽-50mM Tris-HCl pH8．0从珠中洗脱蛋白质。
经聚丙烯酰胺凝胶电泳所示，在洗脱物中获得的hPKR和mPKR蛋白是基本纯化的，且Staufen是大约50％纯化的。将含Staufen的组分集合，并用100体积的0．5M NaCl，40mM tris-HCl，pH8．0，2mM 一硫苏糖醇，0．1％ Triton-X-100，25％甘油透析。含mPKR或hPKR的组分用100体积的0．1M NaCl，40mM tris-HCl，pH8，2mM二硫苏糖醇，0．1％ Triton X-100，20％甘油透析。将所得蛋白质制备物等分并在-80℃冷冻。
实施例3
RNA结合分析
E3L结合双链RNA，但不结合ssRNA或RNA／DNA杂交体(Kiongand Shuman，Virology 217：227，1996；也见于图3)。在Cruachem Inc．Dulles VA合成进行E3L-RNA结合试验所用的RNA寡核苷酸。1T      5’-GCUGGGUUCUUGCGGUGGCUCGUGCUUUCG-3’(SEQ ID NO：6)1B      3’-CGACCCAAGAACGCCACCGAGCACGAAAGC-5’(SEQ ID NO：16)19T     5’-UUCUUGCGGUGGCUCGAGC(SEQ ID NO：7)22T     5’-GGUUCUUGCGGUGGCUCGUGCU(SEQ ID NO：8)26T     5’-UGGGUUCUUGCGGUGGCUCGUGCUUU(SEQ ID NO：9)
在Keystone Laboratorios．Inc．，Redwood City,CA合成具有与RNA寡核苷酸1T相同序列的30-mer DNA寡核苷酸1TD。1TD 5’-GCTGGGTTCTTGCGGTGGCTCGTGCTTTCG-3’(SEQ ID NO：10)。根据厂商指导用T4多核苷酸激酶(New England Biolabs，Beverly，MA)用γ-32P ATP(Amersham，Arlington Heights，IL)将寡核苷酸1B末端标记。32P标记的1B和未标记的寡核苷酸1T，19T，22T或26T，在含700nM 32P标记的1B和800nM未标记的1T，1TD，19T，22T或26T，15mM Tris-HCl，pH7．5，400mM NaCl，2．5mM EDTA的反应混合物中退火。在2小时期间，将样品缓慢从70℃冷却至室温。1T和1B寡核苷酸的退火产生完全配对的双链30-mer RNA。lTD和1B寡核苷酸的退火产生完全配对的双链30-mer RNA／DNA杂交体。19T，22T和26T和1B的退火产生的RNA，具有19，22和26个碱基对的完全配对双链RNA结构，并称作19-，22-和26-mer。
在含0．2nM RNA或RNA／DNA杂交体，50mM Tris-HCl，pH8．0，1mM EDTA，40mM NaCl，0．1％Triton X-100，5％甘油，2mM二硫苏糖醇和1-400nM E3L蛋白的反应混合物中进行E3L与寡核苷酸的结合，将反应在室温持续30分钟，之后加入70％甘油至15％浓度并将样品在6％阻滞凝胶(Novex San Diego CA)上加样。将凝胶在用0．5×TBE缓冲液充填的Novex XCellTM Mini-Cell中以100v旋转30-45分钟，并用SGD-40凝胶干燥仪(Savant Instruments，Inc．Farmingdale，N．Y．)干燥。用科学成象胶片(Scientific Imaging film，Eastman KodakCo．，N．Y)将凝胶曝光过夜。
E3L能以Kd大约为4-12nM结合双链30-mer RNA dsRNA片段多核苷酸(SEQ ID NO：6)(图2)，而其即使在高如400nM浓度也不能有效地结合ssRNA(32P标记的1B)或RNA／DNA杂交体(图3)。除了E3L是典型地双链结构特异性地与RNA结合，也需要最低限度大小的dsRNA结构以有效结合。30-mer的E3L结合比19-mer的结合的效率高大约50-100倍，且22-mer和26-mer的结合只比19-mer的略好(图4)。
实施例4：测试化合物对dsRNA：dsRNA结合蛋白结合的作用
将溴化乙锭加入如实施例2所述含30-mer dsRNA寡核苷酸的反应混合物中，保温30分钟，然后加入E3L，并在室温将反应混合物再保温30分钟，如上述通过凝胶阻滞试验分析样品。溴化乙锭在大约10μM浓度可阻止E3L与dsRNA结合(图6A)。如果凝胶含有溴化乙锭，则较低浓度，3．3μM也是有效的(图6B)，这表明实际Kd明显低于3mM。试验结果是相似的，不论溴化乙锭是在与E3L保温之前还是之后加入反应混合物(数据未示出)。
实施例5：制备dsRNA用于进行基于初始凝胶的分析和HTS分析
用分子生物学技术制备的合成寡核苷酸和dsRNA均可用于本文所述分析。合成的互补寡核糖核苷酸，优选15～30个碱基长，可以退火以产生试验用dsRNA，依于分析类型，寡核苷酸可以是未修饰的或在特异位置用生物素、荧光团或猝灭剂基团修饰。合成的寡核苷酸通常用在预筛选阶段，以检测dsRNA结合分子及区别序列特异性和序列非特异性RNA结合分子。RNA分子也可在体外转录***中合成，其中从DNA模板中合成发夹寡核糖核苷酸(即，线性序列包括茎的上链，环序列，然后茎的互补下链)。应用此类策略能合成具有特异的内部4bp测试位点的自身退火的dsRNA寡核苷酸。对于具有混和的碱基测试位点的寡核苷酸而言，部分发夹序列转录自DNA模板(即，茎上链、环、部分茎下链)，使之退火并用于引发剩余茎结构的合成。此策略使得能合成充分混合的互补测试序列并也便于滤膜放射标记(如果为分析程序所需的话)。本领域已熟知实现上述合成示例的具体方法(如，Ausubel F．M．，et al．，分子生物学当前方案，John Wiley＆ Sons，Media，PA)。
实施例6：闪烁亲近测定法
闪烁亲近测定法(SPA)是熟知的分析方法(见如，美国专利4，382，074及4，271，139，在此并入参考)。在此分析中，如图9所示，放射标记的原子的空间亲近可以测定包被珠的闪烁。当一放射活性的原子衰变时，其释放亚原子粒子，如电子。这些粒子将穿经水的距离是有限的，且取决于放射活性原子的性质。如果一放射活性原子如33P与含闪烁剂的珠亲近，电子可到达珠并刺激闪烁剂发光。但如果放射活性的原子远离珠，则电子不能到达珠且无光发射。因而极亲近珠的放射活性的分子可从远离珠的分子中识别出。SPA技术已成功用于酶催化作用分析、DNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用分析、受体结合分析、放射免疫分析、通过细胞及其代谢***对化合物的吸收、筛选DNA结合药物。但RNA-蛋白质相互作用的分析或筛选dsRNA结合药物(VIRIA SPA)是SPA的新应用。
当链亲和素-SPA珠与33P标记的生物素化的dsRNA寡核苷酸混合时，生物素-链亲和素相互作用导致寡核苷酸与珠的结合。在结合后，33P原子位于非常靠近珠之处，且在33P衰变期间产生的电子到达珠内的闪烁剂。这导致光子的发射，其可用闪烁计数仪测定。但如果在dsRNA寡核苷酸与珠保温之前一种蛋白质与dsRNA寡核苷酸结合，生物素-链亲和素相互作用可被空间地阻止(生物素保护)(图9B)。当将能与dsRNA结合的dsRNA药物导入反应混合物时，含dsRNA和dsRNA结合蛋白的药物从寡核苷酸中置换dsRNA结合蛋白。然后生物素转变为能与链亲和素相互作用，并且光子的发射恢复(图9C)。
SPA不仅可用于检测dsRNA结合药物，还可用于确定这些药物是否能结合任何其它形式的核酸，如ssRNA，ssDNA或dsDNA，RNA／DNA杂交体，核酸发夹，凸起，及任何核苷酸序列、结构、大小或构象的任何的核酸形式，以及结合的程度。
在一实施方案中，一非标记的核酸竞争剂如DNA与33P标记的dsRNA一起导入反应混合物中。如果dsRNA结合药物不结合DNA，则与不含DNA的对照相比，导入DNA不影响观测的信号。dsRNA结合蛋白如E3L或PKR，除了长dsRNA之外不与任何核酸结合。但如果药物能结合RNA及DNA二者，尤其如果DNA存在量超过RNA，则信号将消失。
SPA还可用于确定两种或多种药物是否竞争dsRNA上的相同或重叠结合位点。如果非常确定至少一种竞争药物的结合位点，则可获得药物与dsRNA何处结合的数据。
SPA珠可商购自Amersham Pharmacia Biotech，并以结合特异分子的方式构建。能结合生物素化的RNA寡核苷酸的链亲和素包被的SPA珠用于一实施方案中，但能结合dsRNA结合蛋白的其它类型SPA珠，如用抗-GST抗体或蛋白A包被的珠也可用于SPA的不同修改方法中。RNA核苷酸与珠的结合可直接在融合蛋白的GST组分实现(GST包被的SPA珠)，或经GST或PKR特异性抗体实现(蛋白A包被的珠)。未生物素化的RNA寡核苷酸可用于这些情况。
生物素化的RNA寡核苷酸可商购自Cruachem。寡核苷酸优选长度接近但非限于30个核苷酸。也可使用较长和较短的RNA。可应用任何符合特异需求的核苷酸序列。例如，为序列特异性研究，所有可能的3-核苷酸序列可分配在2个34-mer dsRNA寡核苷酸之间(图7)，且所有4-核苷酸序列可分配在10个30-mer寡核苷酸之间(图11)。在合成期间，应用各种大小的间隔基，一或多种生物素组分可经dU基序附着在寡核苷酸内任何部位。在一优选的实施方案中，生物素组分经间隔基附着在接近30-mer核苷酸的中间，例如在第12位，并如图11所示与互补寡核苷酸杂交。互补RNA寡核苷可被合成，并与生物素化的寡核苷酸杂交。互补寡核苷酸或生物素化的寡核苷酸或二者均可用γ33P ATP(Amersham)和多核苷酸激酶(如T4多核苷酸激酶，New England Biolabs)在杂交之前用33P进行末端标记。标记可在熟知条件下进行。
具有dsRNA结合基序的dsRNA结合蛋白，如Drosophilamelanogaster Staufen，痘苗病毒E3L，及人或鼠PKR可用于此分析。如实施例1所述，在E coli中将这些蛋白质的dsRNA结合部分表达作与谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白(图1)。生物素保护试验
在生物素保护试验中对比E3L，Staufen，mPKR和hPKR，以评价它们在SPA中的性能。在dsRNA结合蛋白与生物素化的dsRNA结合后，RNA中的生物素预计被空间地阻止与珠内的链亲和素结合(生物素保护)。这可通过珠发射的信号减弱而检测(图9B)。不同的蛋白质预计具有不同的生物素保护活性，并在不同蛋白质浓度呈完全或不完全保护。
生物素化的33P标记的30-mer dsRNA寡核苷酸用于此试验(图11)，在Cruachem，Dulles，VA合成上及下链RNA寡核苷酸(其一是生物素化的)。RNA寡核苷酸的33P末端标记被T4多核苷酸激酶催化，其介导33P磷酸基团从33P-γ ATP转移至RNA寡核苷酸的5’末端。33P-γ ATP由Amersham生产。T4多核苷酸激酶可得自NewEngland Biolabs，Beverly，MA。根据T4多核苷酸激酶生产商指导进行标记。上或下链或二者均可用33P标记，但典型地只有生物素化的RNA寡核苷酸被标记。典型地，将2μl 50，000nM RNA寡核苷酸(Cruachem)，2．5μl 10×T4多核苷酸激酶缓冲液(New EnglandBiolabs)，15μlγ-33P ATP(10 mCi／ml)，10μl H2O，3μl T4多核酸激酶(10，000 U／ml)组合终体积为50μl。将此反应混合物在37℃保温30分钟，并通过加入50μl 25mM EDTA终止反应。根据生产者的指导，在G-25自旋柱上(5 Prime-3 Prime，Boulder，CO)通过凝胶过滤将33P标记的寡核苷酸从反应混合物的其它组分中纯化出来。将互补RNA寡核苷酸在退火缓冲液中(15mM tris-HCl，pH7．5，40mMNaCl，2．5mM EDTA)以400-500nM浓度退火。将此混合物加热至65-70℃，并在2-5小时内缓慢冷却至室温。将产生的33P标记的dsRNA寡核苷酸稀释至2nM浓度，等分并在-80℃贮存。
为进行生物素保护试验，制备反应混合物，其含有0．25nM 33P标记的生物素化的dsRNA 30-mer寡核苷酸，50mM tris-HCl pH8．0，1mMEDTA，40mM NaCl，0．1％Triton X-100，5％甘油，2mM二硫苏糖醇及0-280nM dsRNA结合蛋白。反应在96-孔Wallac培养板中进行，200μl／孔。将此反应混合物在室温保温1．5小时，之后加入50μg／孔链亲和素SPA PVT珠(Amersham)，并接着保温15分钟。将培养板密封并通过在1000g离心3分钟将珠沉淀至孔底。用Wallac培养板读数仪计数。在此生物素保护试验中，hPKR比其它蛋白质更有活性，其在0．4～1．2nM浓度接近完全保护。选择0．7nM浓度hPKR进行进一步筛选试验。其它蛋白质活性较差，mPKR要求10nM及E3L要求31～93nM浓度才接近完全保护。Staufen在评价的蛋白质中活性最低。甚至在280nM浓度也不能适合完全生物素保护(图12)。
如图12所示，所有4种结合蛋白均能阻止生物素化的dsRNA与链亲和素珠的相互作用。hPKR具有对dsRNA最高的亲和性，并在生物素保护中最有效。在0．4nM浓度，hPKR从与珠相互作用中置换基本全部dsRNA。因而hPKR用于如实施例7所述候选药物的高效率筛选。
已知与dsRNA结合的药物接下来用于证实与dsRNA结合的药物可置换RNA结合蛋白。如上所述，药物的结合置换RNA结合蛋白，并导致光子发射的增加。
在此试验中以下化合物被筛选：硫酸氨基去氧卡那霉素(Sigma)，硫酸青紫霉素A(Sigma)，硫酸新霉素(Sigma)，妥布霉素(Fluka)，硫酸庆大霉素(Fluka)，纺锤菌素(Sigma)，21x(纺锤菌素二聚体)，溴化乙锭，丫啶橙(Sigma)，偏端霉素A(Sigma)。
将这些化合物溶解于RNA结合缓冲液(RBB)中(50mM tris-HClpH8．0，1mM EDTA，40mM NaCl，0．1％ TritonX-100，5％甘油，2mM二硫苏糖醇)，将化合物加入96孔培养板内的反应混合物中，其含有0．2nM 33P标记的生物素化的dsRNA寡核苷酸及0．6nM在RBB中的hPKR。对化合物作系列稀释。所得反应混合物体积为200μl。在室温将反应保温90分钟，然后加入10μl在RBB中的链亲和素SPA珠(Amersham)至终浓度为50μg／孔，并接着保温20分钟。在700rpm将培养板离心2．5分钟，以沉淀珠，并用Micro Beta Trilux(EG&GWallac)计数仪从孔底计数闪烁。
得自SPA中的结果与公布的通过不同方法获得的化合物与dsRNA结合数据非常吻合。已知与dsRNA强结合的化合物，如嵌入剂和新霉素，在SPA中比较弱的dsRNA结合剂的结合好(图13)。SPA是一可靠的方法，其甚至能检测化合物与dsRNA结合中的轻微差异。例如，如在dsRNA-药物对dsRNA的解链试验中测定，由青紫霉素所致解链温度(ΔTm=15．2℃)和氨基去氧卡那霉素所致解链温度(ΔTm=14．3℃)之间存在小于1℃的差异，表明青紫霉素是比氨基去氧卡那霉素略强的dsRNA结合剂(Biochemistry 36：11402-11407，1997)。相似地，青紫霉素比氨基去氧卡那霉素具有略高的亲和性，并且如图13所示，药物新霉素(ΔTm=24．7℃)通过SPA示出是最强结合剂。如所预期地，DNA结合分子偏端霉素和纺锤菌素在SPA中呈最弱结合。
与dsDNA或dsRNA的二条链均结合的化合物预期通过提供链之间附加的相互作用稳定DNA或RNA双螺旋。化合物与dsRNA或dsDNA的结合越强，解链双螺旋的温度越高。因而，化合物与双链核酸的结合通过热变性常规测定。(Wilson W．D．，et al．，Biochemistry32：4098-4104，1993；McConnaughie A．W．，et al．，J．Med．Chem．37：1063-1069，1994；Chen Q．，et al．，Biochemistry 36：11402-11407，1997)。
实施例7：组合文库的高通量筛选以鉴别dsRNA结合化合物
设计并合成设计与双螺旋核酸结合的化合物的文库。到目前为止，已合成大约200个新化合物。这些化合物在凝胶条带移位分析，SPA，及荧光／猝灭分析中被筛选。目前分析的144种化合物中有12种与dsRNA结合。下表2概括了12种化合物命中物的％R值。
最强的SPA命中物在凝胶移位中也是阳性的。较弱SPA命中物明显低于凝胶移位的敏感性。图14示出通过SPA获得的一些数据。X轴，％R，表示当分析中存在此化合物时获得的相对计数除以在无化合物时获得的计数的值。％R值表示当存在化合物时，光子发射的成倍提高。因而，％R高值示出化合物强烈地从dsRNA置换hPKR。
SPA中化合物的筛选基本如实施例6所述，除了化合物被溶于DMSO至浓度约为10mM。将该化合物的DMSO溶液加入0．05mM浓度的200μl反应混合物中，此反应混合物含有0．2μM浓度33P标记的生物素化的dsRNA 30-mer和0．7nM浓度的hPKR。将96孔培养板内的反应混合物如实施例6所述保温并处理。用Microsoft Excel程序处理所得结果计算％R参数(图14)。产生比背景有统计学增强的信号的化合物被认为是“命中物”(图15)。如图14中示出8～170％R范围的9个命中物。所有12种命中物的％R值均确信在背景之上。甚至最差的1a系列命中物，其％R值低至T-检验值也是统计学显著的：A5-0．006，C10-0．0002。
该化合物也在凝胶移位中被筛选，基本如实施例6所述，除用0．7nM浓度hPKR代替E3L。筛选在2种浓度的化合物-1mM和0．2mM-进行双份试验。在SPA中最强的三种化合物B4、B5和B6也在凝胶移位中被检测。化合物B4和B5活性与强dsRNA结合抗生素新霉素相当，而化合物B6则较差。凝胶移位数据与SPA数据十分吻合，其中化合物B6也比化合物B4和B5差得多。
为研究1a系列化合物结合的dsRNA结构特异性，B4，B5和B6也通过直接监测与dsRNA和ssRNA的结合被定性。将1mM每种化合物与0．2nM dsRNA(24-mer)或ssRNA(30-mer)在室温保温1小时。将此反应混合物加样于6％RNA阻滞凝胶上，并用StormphosPhoimager加工。通过dsRNA迁移率移位可观测所有三种化合物与dsRNA结合。尽管观测到B4与ssRNA的直接结合，通过B5和B6在ssRNA中无明显移位，表明其特异于dsRNA。
表2
化合物                          ％R1a系列
A5/GEN00697                      8
A9/GEN00699                      9
A11/GEN0066                      10
B4/GEN0067                       170
B5/GEN00700                      140
B6/GEN0056                       31
B7/GEN0018                       8
C2/GEN0048                       17
C10/GEN0077                      8
D12/GEN0063                      91b系列
B11/GEN00120                     9
D8/GEN00158                      22
Figure 9881107900551
实施例8
荧光／猝灭分析
已开发一基于荧光共振能转移(FRET)的分析，以鉴别dsRNA结合化合物。FRET是一种现象，其中荧光光子可检测地从一个荧光分子转移至另一个。在大多数FRET反应中，第一种染料在给定光波长激发(激发最大值)。发射自第一染料的光被有效地转移至第二种染料，通常是由于第一种染料的发射光谱与第二种染料的激发谱明显重叠。第二种染料吸收由第一种染料发出的光子，并发射较长波长较低能量的荧光光子。
另一类常用的FRET配对是供体／猝灭剂染料配对。在此相互作用中，从第一种染料转移至第二种染料的共振能不作为第二种光发射发出，而代以热量消散进***中，因而，“猝灭”染料对荧光染料的紧密亲近导致由***发出的荧光明显降低。Dabcyl是一标记，其已成为一类“通用的”猝灭组分，是由于其能有效地猝灭许多不同荧光团的荧光。
配体与双链核酸的结合可稳定DNA或RNA的双螺旋或螺旋形式。在过去，热解链试验用于示出几乎所有配体与DNA或RNA的结合均导致Tm的升高(在非常少的已知情况中，发现配体与单链DNA结合并使之稳定)，在50年代早期示出盐使DNA的Tm升高。从那时起已示出多胺、小分子药物、肽及蛋白质在与核酸结合时均使其Tm升高。
FRET分析利用短的末端标记的互补“指示寡核苷酸”，其在标准分析条件下是单链的，配体结合推动在一些这种指示寡核苷酸中形成稳定的双螺旋结构。在双螺旋构象中，猝灭染料，Dabcyl与这些“指示寡核苷酸”中的荧光染料(荧光素或类似物)紧密亲近，导致荧光的突然降低。因此，配体与该特定的“指示寡核苷酸”的结合使荧光降低。
此分析是转让给本申请受让人的共同未决申请USSN＿＿的主题，这一共有的申请(USSN＿＿)其全部并入参考。
此分析与凝胶SPA和条带移位分析共用，可筛选结构偏性化学文库。B5与dsRNA结合的特异性也在荧光猝灭竞争分析中得以证实。在此竞争分析中，将未标记的dsRNA或ssRNA以增加的浓度加入分析混合物中。如果药物能结合任何这些未标记寡核苷酸，在药物与F／Q-RNA结合后观测到的猝灭效应降低。已知特异性与dsRNA而非dsDNA结合的青紫霉素用于测试此新分析形式；dsRNA和dsDNA用作竞争剂。只有dsRNA能使荧光信号达到原始水平，表明这是一特异性竞争分析。
接着，用1a系列B5化合物进行荧光／猝灭竞争试验，以检查其与不同形式的核酸的结合优选性。在这些试验中，B5与荧光／dabcyl标记的dsRNA的结合成功地竞争dsDNA，ssRNA和DNA／RNA杂交体的结合，就B5化合物而言，表明其优选与dsRNA结合。以下寡核苷酸用于此分析：24mer 24DB，5’-d(TTATTCTGTCGTG CTGGTTTATTC)；24mer 24DT，5’-d (GAATAAACCAGCACGACAGAATAA)；24mer 24J，5’-r (GAAVAAACCAGCACGACAGAAVAA)；24mer 24JB，5’-r(UUAUUCUGUCGUGCUGGUUUAUUC)；14mer Vir51，5’-r(FCVAGAUCUGAACUU)；及9mer Vir55，5’-r(CAGAUCUAGQ)，F指示荧光素及Q代表dabcyl。
通过以在10mM HEPES pH7．5，1mM EDTA和10mM NaCl中的终浓度为100μM混合各个寡核苷酸，将混合物加热至80℃，5分钟，并使其在3小时缓慢冷却至室温以形成dsRNA(24J+24JB)，dsRNA(24DT+24DB)和DNA／RNA杂交体(24JB+24DT)。
通过在各药物中加入25nM Vir51和40nM Vir55至总体积为200μl，对药物结合进行直接监测，所用药物浓度在附图中表明。对竞争试验而言，将竞争核酸dsRNA，dsDNA，DNA／RNA杂交体和ssRNA(24JB)以两种不同的浓度(0．5和1μM)加入Vir51／Vir55混合物中，并立即加入各浓度的药物中并测定相对荧光，所有试验均在含10mM HEPES pH7．5，1mM EDTA和10mM NaCl的缓冲液中进行，在混合后用Cytofluor荧光读数器，多孔板读数器系列4000(PerseptiveBiosystems)立即进行测定。用带宽20的激发是485，用带宽25的发射是530，放大70。在10μM B5，只有dsRNA而非dsDNA，ssRNA或DNA／RNA杂交体能使B5猝灭的信号达到原始水平，表明B5与dsRNA的结合性超过dsDNA，ssRNA和DNA／RNA杂交体(见图15A-D)。这些结果与在SPA及凝胶移位分析中所得结果一致。
尽管本发明已参考具体方法和实施方案进行了阐述，应意识到在不偏离本发明范围内可做各种修改和改变。
序列表〈110〉Alexander S．BelyaevThomas Wayne Bruicecynthia A．EdwardsKirk E．FryLisa M．Turin〈120〉dsRNA／dsRNA结合蛋白方法及组合物〈130〉4600-0127，41〈140〉未给出〈141〉〈150〉60／058，740〈151〉1997-09-12〈160〉32〈170〉FastSEQ for Windows 版本3.0〈210〉1〈211〉34〈212〉RNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc〈222〉(1)…(34)〈223〉合成的寡核苷酸〈400〉1aaaccagcac gacaucccgc cuacucaaga auaa                  34〈210〉2〈211〉8〈212〉RNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc_binding〈222〉(1)…(8)〈223〉合成的寡核苷酸探针〈400〉2acguacgu〈210〉3〈211〉12〈212〉RNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc_结合〈222〉(1)…(12)〈223〉合成的寡核苷酸〈400〉3acguacguac gc                                           12〈210〉4〈211〉28〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉引物结合〈222〉(1)…(28)〈223〉合成的寡核苷酸引物〈400〉4gcgggatcct ttgatgatgt tattccgg                         28〈210〉5〈211〉26〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉引物结合〈222〉(1)…(26)〈223〉合成的寡核苷酸引物〈400〉5gcggaattca gaatctaatg atgacg                          26〈210〉6〈211〉30〈212〉RNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉引物结合〈222〉(1)…(30)〈223〉合成的寡核苷酸引物〈400〉6gcuggguucu ugcgguggcu cgugcuuucg                        30〈210〉7〈211〉19〈212〉RNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉引物结合〈222〉(1)…(19)〈223〉合成的寡核苷酸引物〈400〉7uucuugcggu ggcucgagc                                    19〈210〉8〈211〉22〈212〉RNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉引物结合〈222〉(1)…(22)〈223〉合成的寡核苷酸引物〈400〉8gguucuugcg guggcucgug cu                                  22〈210〉9〈211〉26〈212〉RNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉引物结合〈222〉(1)…(26)〈223〉合成的寡核苷酸引物〈400〉9uggguucuug cgguggcucg ugcuuu                            26〈210〉10〈211〉30〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉引物结合〈222〉(1)…(30)〈223〉合成的寡核苷酸引物〈400〉10gctgggttct tgcggtggct cgtgctttcg                         30〈210〉11〈211〉27〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉引物结合〈222〉(1)…(27)〈223〉合成的寡核苷酸引物〈400〉11gcgcagatct gctggtgatc tttcagc                         27〈210〉12〈211〉31〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉引物结合〈222〉(1)…(31)〈223〉合成的寡核苷酸引物〈400〉12gcgcgatacc taaccattca taagcaacga a                     31〈210〉13〈211〉26〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉引物结合〈222〉(1)…(31)〈223〉合成的寡核苷酸引物〈400〉13gcgcagatct gccagtgata ccccag                             31〈210〉14〈211〉31〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉引物结合〈222〉(1)…(31)〈223〉合成的寡核苷酸引物〈400〉14gcgcgatatc taattacttg tcatagacga g                       31〈210〉15〈211〉34〈212〉RNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉引物结合〈222〉(1)…(34)〈223〉合成的寡核苷酸引物〈400〉15uuuggucgug cuguagggcg gaugaguucu uauu                    34〈210〉16〈211〉30〈212〉RNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉引物结合〈222〉(1)…(30)〈223〉合成的寡核苷酸引物〈400〉16cgacccaaga acgccaccga gcacgaaagc                       30〈210〉17〈211〉30〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉引物结合〈222〉(1)…(30)〈223〉合成的寡核苷酸引物〈400〉17gcgcagatct atggatgagg gtgacaagaa                       30〈210〉18〈211〉26〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉引物结合〈222〉(1)…(26)〈223〉合成的寡核苷酸引物〈400〉18gcggaattca cttggtgggc gtaagg                            26〈210〉19〈211〉30〈212〉RNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc_结合〈222〉(1)…(30)〈223〉合成的寡核苷酸〈400〉19acgacagaau aaaccagcac gacagaauaa                           30〈210〉20〈211〉30〈212〉RNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc_结合〈222〉(1)…(30)〈223〉合成的寡核苷酸〈400〉20uacucauccc gccuacucaa gggaugaucc                           30〈210〉21〈211〉30〈212〉RNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc_结合〈222〉(1)…30〈223〉合成的寡核苷酸〈400〉21aacuagcaug ccagcgguaa cuagcaugcc                       30〈210〉22〈211〉30〈212〉RNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc_结合〈222〉(1)…(30)〈223〉合成的寡核苷酸〈400〉22ccccggcucg augauggccc cggcucgaug                        30〈210〉23〈211〉30〈212〉RNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc_结合〈222〉(1)…(30)〈223〉合成的寡核苷酸〈400〉23cguacugcaa aaggauccgu acugcaaaag                        30〈210〉24〈211〉30〈212〉RNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc_结合〈222〉(1)…(30)〈223〉合成的寡核苷酸〈400〉24ugacguuuaa uacaagcuga cguuuaauac                         30〈210〉25〈211〉30〈212〉RNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc_结合〈222〉(1)…(30)〈223〉合成的寡核苷酸〈400〉25agauaauuca acacuacaga uaauucaaca                        30〈210〉26〈211〉30〈212〉RNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc_结合〈222〉(1)…(30)〈223〉合成的寡核苷酸〈400〉26auaggcgcga caaacauaua ggcgcgacaa                        30〈210〉27〈211〉30〈212〉RNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc_结合〈222〉(1)…(30)〈223〉合成的寡核苷酸〈400〉27aaaucauugg guacaagaaa ucauugggua                        30〈210〉28〈211〉30〈212〉RNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc_结合〈222〉(1)…(30)〈223〉合成的寡核苷酸〈400〉28gaacccucca cacucgggaa cccuccacac                        30〈210〉29〈211〉30〈212〉RNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc_结合〈222〉(1)…(30)〈223〉合成的寡核苷酸〈400〉29aggaccuuag agacaccagg accuuagaga                        30〈211〉30〈212〉RNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc_结合〈222〉(1)…(30)〈223〉合成的寡核苷酸〈400〉30ucacgcacuu cguagacuca cgcacuucgu                        30〈210〉31〈211〉30〈212〉RNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc_结合〈222〉(1)…(30)〈223〉合成的寡核苷酸〈400〉31acgacagaau aaaccagcac gacagaauaa                       30〈210〉32〈211〉30〈212〉RNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc_结合〈222〉(1)…(30)〈223〉合成的寡核苷酸〈400〉32uuauucuguc gugcugguuu auucugucgu                        30

Claims (26)

1、一种筛选化合物的方法，该化合物能改变dsRNA结合蛋白或蛋白复合物与dsRNA片段的非碱基对序列依赖性结合，该方法包括以下步骤：
(a)形成一反应混合物，其由以下组分组成：(ⅰ)所述dsRNA结合蛋白或蛋白复合物，以及(ⅱ)双螺旋dsRNA片段，所述结合蛋白与该双螺旋dsRNA片段的结合不依赖于dsRNA碱基对序列；
(b)在存在或不存在所述化合物的情况下，检测所述dsRNA结合蛋白与所述dsRNA片段的结合水平；
(c)对比在(b)步骤观测的结合；
(d)如果存在和不存在化合物时观测的结合的差异高于一选定值，则选择此化合物。
2、如权利要求1的方法，其中所述化合物与dsRNA的结合亲和性，比与选自单链RNA，单链DNA和双链DNA的多核苷酸的结合亲和性高至少2-3倍。
3、如权利要求1的方法，其中所述RNA结合蛋白或蛋白复合物的浓度为，在没有所述化合物存在时能有效与至少50％的dsRNA形成复合物的量。
4、如权利要求1的方法，其中双螺旋dsRNA片段长度大约10～100个碱基对。
5、如权利要求4的方法，其中双螺旋dsRNA片段长度大约16～50个碱基对。
6、如权利要求5的方法，其中双螺旋dsRNA片段长度大约30～50个碱基对。
7、如权利要求1的方法，用于鉴别候选抗病毒化合物，其中双螺旋dsRNA结合蛋白是一病毒蛋白。
8、如权利要求7的方法，其中病毒蛋白选自E3L，σ3，E3L dsRNA结合结构域和σ3 dsRNA结合结构域组成的一组。
9、如权利要求8的方法，其中病毒蛋白是E3L或其dsRNA结合结构域。
10、如权利要求1的方法，其中双螺旋dsRNA结合蛋白是选自PKR，DRAF1，DRAF2，RNAaseH，Z-DNA结合蛋白，La(SS-B)，TRBP和dsRNA特异性腺苷脱氨酶组成的一组的细胞蛋白。
11、如权利要求10的方法，其中所述结合蛋白是PKR。
12、如权利要求1的方法，其中RNA结合蛋白或蛋白复合物与dsRNA的结合通过凝胶条带移位分析而检测。
13、如权利要求1的方法，其中RNA结合蛋白或蛋白复合物与dsRNA的结合通过闪烁亲近测定法而检测。
14、如权利要求1的方法，其中RNA结合蛋白或蛋白复合物与dsRNA的结合通过滤膜结合分析而检测。
15、如权利要求1的方法，其中所述化合物与dsRNA的结合是碱基对序列不依赖性的。
16、一种治疗由RNA病毒感染的个体的方法，包括给予个体药物有效量的化合物，此化合物经以下步骤选择：
(a)形成一反应混合物，其由以下组分组成：(ⅰ)所述dsRNA结合蛋白或蛋白复合物，以及(ⅱ)双螺旋dsRNA片段，所述结合蛋白与该双螺旋dsRNA片段的结合不依赖于dsRNA碱基对序列；
(b)在存在或不存在所述化合物的情况下，检测所述dsRNA结合蛋白与所述dsRNA片段的结合水平；
(c)对比在(b)步骤观测的结合；
(d)如果存在和不存在化合物时观测的结合的差异高于一选定值，则选择此化合物。
17、如权利要求16的方法，其中所述化合物与dsRNA的结合亲和性，比与选自单链RNA，单链DNA和双链DNA的多核苷酸的结合亲和性高至少2-3倍。
18、如权利要求16的方法，其中所述化合物与大约10-100个碱基对的所述双螺旋dsRNA结合。
19、如权利要求16的方法，其中所述化合物与大约16-50个碱基对的所述双螺旋dsRNA结合。
20、如权利要求16的方法，其中所述化合物与大约30-50个碱基对的所述双螺旋dsRNA结合。
21、如权利要求16的方法，其中所述化合物与dsRNA的结合是碱基对序列不依赖性的。
22、如权利要求16的方法，其中所述化合物包括至少2个亚单位的多联体，每个亚单位经以下步骤选择：
(a)形成一反应混合物，其由以下组分组成：(ⅰ)所述dsRNA结合蛋白或蛋白复合物，以及(ⅱ)双螺旋dsRNA片段，所述结合蛋白与该双螺旋dsRNA片段的结合不依赖于dsRNA碱基对序列；
(b)在存在或不存在所述化合物的情况下，检测所述dsRNA结合蛋白与所述dsRNA片段的结合水平；
(c)对比在(b)步骤观测的结合；
(d)如果存在和不存在化合物时观测的结合的差异高于一选定值，则选择此化合物。
23、一多聚体dsRNA结合剂，包括通过共价连接至少第一种和第二种dsRNA结合化合物形成的线性多联体，每种化合物的选择如权利要求1的(a)-(d)步骤。
24、如权利要求23的dsRNA结合剂，其中至少一种所述dsRNA结合化合物与dsRNA的结合是碱基对序列不依赖性的。
25、如权利要求23的dsRNA结合剂，其中每种所述dsRNA结合化合物与dsRNA的结合均是碱基对序列不依赖性的。
26、如权利要求23的RNA结合剂，其进一步包括与其中一种dsRNA结合化合物共价连接的RNA修饰剂，或RNA裂解剂。
CN98811079A 1997-09-12 1998-09-11 dsRNA/dsRNA结合蛋白方法及组合物 Pending CN1278921A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5874097P 1997-09-12 1997-09-12
US60/058,740 1997-09-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1278921A true CN1278921A (zh) 2001-01-03

Family

ID=22018650

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN98811079A Pending CN1278921A (zh) 1997-09-12 1998-09-11 dsRNA/dsRNA结合蛋白方法及组合物

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP1015889A1 (zh)
JP (1) JP2001516058A (zh)
CN (1) CN1278921A (zh)
AU (1) AU757796B2 (zh)
CA (1) CA2302807A1 (zh)
IL (1) IL134862A0 (zh)
WO (1) WO1999013338A1 (zh)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6573045B1 (en) * 1998-06-05 2003-06-03 Ribotargets, Ltd. Methods and kits for discovery of RNA-binding compounds
WO2001044505A2 (en) * 1999-12-16 2001-06-21 Ribotargets Limited Methods and kits for discovery of rna-binding antimicrobials
WO2001094614A2 (en) * 2000-06-07 2001-12-13 Cyclacel Limited Methods for monitoring enzyme activity
US6808874B2 (en) 2000-06-13 2004-10-26 Cyclacel Ltd. Methods of monitoring enzyme activity
US6706474B1 (en) 2000-06-27 2004-03-16 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nucleic acid enzyme biosensors for ions
JP2005519640A (ja) * 2001-11-02 2005-07-07 ハイブリザイム コーポレーション レセプター捕捉アッセイ
US6890719B2 (en) 2002-05-10 2005-05-10 The Board Of Trustess Of The University Of Illinois Fluorescence based biosensor
US7534560B2 (en) 2002-05-10 2009-05-19 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Simple catalytic DNA biosensors for ions based on color changes
JP2006506101A (ja) * 2002-11-13 2006-02-23 ルトガーズ、ザ ステイト ユニバーシティ インフルエンザウイルス非構造タンパク質１の阻害剤を設計する方法
US7612185B2 (en) 2003-03-07 2009-11-03 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nucleic acid biosensors
US7485419B2 (en) 2004-01-13 2009-02-03 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Biosensors based on directed assembly of particles
US7892734B2 (en) 2005-08-11 2011-02-22 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Aptamer based colorimetric sensor systems
WO2007109500A1 (en) 2006-03-16 2007-09-27 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Lateral flow devices
US8415461B2 (en) 2007-01-19 2013-04-09 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Amphiphilic substances and functionalized lipid vesicles including the same
US8058415B2 (en) 2007-04-24 2011-11-15 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Aptamer- and nucleic acid enzyme-based systems for simultaneous detection of multiple analytes
WO2009012309A2 (en) 2007-07-16 2009-01-22 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nucleic acid based fluorescent sensor for divalent copper ion detection
US8568690B2 (en) 2007-07-31 2013-10-29 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois MRI contrast agents and high-throughput screening by MRI
US8367416B2 (en) 2007-08-10 2013-02-05 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nucleic acid based fluorescent sensor for mercury detection
US8062893B2 (en) 2008-10-10 2011-11-22 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Fluorescent sensor for mercury
US8815156B2 (en) 2010-07-19 2014-08-26 Andalyze, Inc. Sensor housing and reagent chemistry

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5726014A (en) * 1991-06-27 1998-03-10 Genelabs Technologies, Inc. Screening assay for the detection of DNA-binding molecules
ES2117050T3 (es) * 1991-06-27 1998-08-01 Genelabs Tech Inc Ensayo de cribado para la deteccion de moleculas de union al adn.
US5534410A (en) * 1993-01-28 1996-07-09 The Regents Of The University Of California TATA-binding protein associated factors drug screens
WO1994021825A1 (en) * 1993-03-16 1994-09-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Combinatorial oligomer immunoabsorbant screening assay for transcription factors and other biomolecule binding
WO1995011922A1 (en) * 1993-10-29 1995-05-04 Affymax Technologies N.V. In vitro peptide and antibody display libraries
US5990388A (en) * 1995-06-07 1999-11-23 Research Corporation Technologies, Inc. Resistance to viruses and viroids in transgenic plants and animals expressing dsRNA-binding protein
US5726050A (en) * 1995-06-20 1998-03-10 Massachusetts Institute Of Technology Z-DNA binding protein and applications

Also Published As

Publication number Publication date
IL134862A0 (en) 2001-05-20
CA2302807A1 (en) 1999-03-18
JP2001516058A (ja) 2001-09-25
AU757796B2 (en) 2003-03-06
AU9661898A (en) 1999-03-29
WO1999013338A1 (en) 1999-03-18
EP1015889A1 (en) 2000-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1278921A (zh) dsRNA/dsRNA结合蛋白方法及组合物
CN1205995C (zh) 具有增强药物动力特性的杂合肽
CN1324147C (zh) 细小病毒b19的诊断测试
CN1604906A (zh) 用于治疗单链rna病毒感染的抗病毒反义核酸的试剂和方法
CN1836042A (zh) 用于基因沉默的hbv和hcv保守序列
CN1617929A (zh) siRNA表达***和利用该***制备功能性基因击倒细胞的方法
CN1197966C (zh) 肿瘤坏死因子受体相关因子的调节剂、及其制备和用途
CN1268980A (zh) 用于鉴定选择性抑制丙型肝炎病毒复制的试剂的新筛选方法
CN1788088A (zh) 突变的水泡性口炎病毒及其用途
CN1471588A (zh) 核酸扩增方法
CN1134704A (zh) 药物结合蛋白质
CN1898257A (zh) 合成编码文库的方法
CN1416467A (zh) 锌指结构域及其鉴定方法
CN1961001A (zh) 参与病毒蛋白的免疫抑制作用的调节的多肽序列
CN101065501A (zh) 确定基因毒性的方法
CN1665929A (zh) 含有转录dna结合位点的环状哑铃状诱饵寡脱氧核苷酸(cdodn)
CN1871350A (zh) 用于引发肿瘤细胞致死的核酸
CN1875028A (zh) 基于 Seneca Valley 病毒的组合物以及疾病的治疗方法
CN100346826C (zh) 通过核蛋白在磷酸化位点突变的减弱狂犬病病毒用于抗狂犬病的接种以及在cns中的基因治疗
CN1650026A (zh) 平行，反平行,同源或互补结合的核酸
CN1451045A (zh) IFN－α同系物
CN1227035C (zh) 缀合物及其制备方法和用于跨生物膜转运分子的用途
CN1681842A (zh) 减毒活寄生虫疫苗
CN1214111C (zh) 定性和定量检测dna变异及这些变异的配体的方法
CN1351663A (zh) 病毒变体

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication