CN1275035C

CN1275035C - 电泳分离装置及其使用方法

Info

Publication number: CN1275035C
Application number: CN 00131582
Authority: CN
Inventors: 田昭武; 林华水; 周勇亮
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2000-10-28
Filing date: 2000-10-28
Publication date: 2006-09-13
Anticipated expiration: 2020-10-28
Also published as: CN1351258A

Abstract

涉及一种用电泳法分离和分析(生物)化学体系的装置与方法。设有分离通道，通道的首尾两端各有至少一个入水口与出水口，且入、出水口区各有一个电极，分离通道至少包括两个区段，区段通过接点依序相互连接，接点提供电学连接，通过用离子导电体隔开通道与储液池实现，储液池与通道分隔开，储液池设有电极。分离效率高、高效廉价、可微型化使之成为芯片***，使用安全简便。

Description

电泳分离装置及其使用方法

本发明涉及一种用电泳法分离和分析(生物)化学***的装置与方法。

许多现代药学、环境保护及材料开发生产的发展可以归因于化学分析体系的发展，使得不同化学组份可以得到分离、鉴定、表征及定量。在分析过程中，样品混合物的组份分离往往是一个关键过程。分离的组份可以分别地进行鉴定及定量。

样品化学组份的电泳分离是基于在沿着分离通道施加的电场作用下各组份具有独特的迁移率。水溶液中大量的生物或化学分子/大分子在适当的pH下带有电荷。例如蛋白质是两性分子，随着pH的变化，它所带的电荷可以从正电荷变为负电荷。电泳分离方法基于在电场下电泳介质中的样品各个组份有不同的迁移率。各个组份的电迁移率是其在给定外电场中获得的速度，对应于组份电荷与摩擦阻力的比值。样品以狭窄的区带加入并施加电场开始电泳。每个组份以独特的速度沿着电泳通道移动，形成区带。每个区带可以用峰高(组份浓度最大的地方)与峰宽(峰两边某两点的距离，该两点的浓度为某一阈值)来表示。样品区带的宽度决定于所加入的样品区带宽度及其后扩散对电泳区带宽度的影响。

以下是通常评价电泳分离方法效率的重要标准：

·分辨率。两个组份的迁移距离差远大于它们电泳区带半峰宽的总和时，它们得到了分离。

·检测限。一个给定样品其分离的区带宽度越小，其检测限越低。越窄的区带意味着区带中组份的浓度越高，越有利于检测。

·速度和处理量。处理量正比于平行分离的数量(如阵列的分离通道数)，反比于一次分离所需的时间。

·方便性、实用性及性价比。微型毛细管电泳，如芯片形式，可以完全满足这些要求(REF)。这些标准对于毛细管电泳在关心点及使用点的应用是非常重要的。

减小分离组份区带宽度可从根本上满足高分辨和低检测限的要求。有两个主要因素制约电泳区带的宽度，一是加入样品区带的宽度，另一个是电泳过程中由于扩散引起的区带展宽。加入样品区带的宽度决定于欲检测组份所必需的体积。大多数的实际样品，如制药、环境或生物工程监测的样品，是浓度局限的，换言之，样品中欲分析的组份的量是由其在样品中的浓度决定的，而不是由可得到样品的体积大小决定。

通常浓度局限样品的高分辨、高灵敏电泳分离需要(前)浓缩步骤。构成本发明基础的一个问题就是在微型毛细管电泳装置及方法中简便地实现浓缩步骤。到目前为止，浓缩步骤可以通过在电泳通道中填充不连续电泳介质来实现，如在聚丙烯酰胺盘状电泳中，样品在不同的胶及缓冲液(REF)的界面浓缩。毛细管电泳的不连续电泳介质需用笨重繁杂的技术来实现，并且每个样品只能使用一次。

毛细管电泳技术是在生物科学、制药、环境、食品及其它化学分析等领域广泛使用、发展完善的技术。在毛细管电泳技术中，样品被注入载体介质中，沿着分离通道施加电场，各个组份在电场下以不同的速度移动，从而样品被分成各个组份。通过与毛细管分离通道相连的检测器检测分离的组份(如荧光检测的光学检测器)。常规高效毛细管电泳仪使用熔融石英毛细管，毛细管内径为25～75μm，长度可达1m，电压为10～30kV。通常还使用表面修饰技术，如涂层，来提高分离效率。一个典型的分离过程大约需要5～30min。

1992年微加工的微型毛细管电泳芯片开始得到应用，详见A.Manz，D.J.Harrison等发表于J.Chromatogr.593(1992)S.253的文章。一些样品(如荧光染料(见D.J.Harrison，A.Manz，Z.Fan，H.Ludi，H.M.Widmer，Anal.Chem.64(1992)S.1926及S.C.Jacobson，R.Hergenroeder，L.B.Koutny，R.J.Warmack，J.M.Ramsey，Anal.Chem.66(1994)S.1107)、荧光标记氨基酸(见D.J.Harrison，K.Fluri，K.Seiler，Z.Fan，C.S.Effenhauser，A.Manz，Science 161(1993)S.895；C.S.Effenhauser，A.Manz，H.M.Widmer，Anal.Chem.65(1993)S.2637；S.C.Jacobson，R.Hergenroeder，A.W.Moore，J.M.Ramsey，Anal.Chem.66(1994)8.4127)及金属离子复合物(S.C.Jacobson，A.W.Moore，J.M.Ramsey，Anal.Chem.67(1995)S.2059))的分离说明了微型装置可以提高分离速度超过一个数量级。后来微型毛细管电泳芯片用于生物样品的快速分析，如DNA的限制酶切片段(A.T.Wooley，R.A.Mathies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(1994)S.11348；S.C.Jacobson，J.M.Ramsey，Anal.Chem.68(1996)S.720)、DNA测序片段(A.T.Wooley，R.A.Mathies，Anal.Chem.67(1995)S.3676)、PCR产物(见S.C.Jacobson，J.M.Ramsey，Anal.Chem.68(1996)S.720)及寡核苷酸(C.S.Effenhauser，A.Paulus，A.Manz，H.M.Widmer，Anal.Chem.66(1994)S.2949)。微型化也把目标瞄准将电泳分离与总分析***(total-analysis-systems(μTAS)减芯片上实验室(lab-on-a-chip)集成。毛细管电泳的微型化除了提高分离效率外，在经济方面还有许多好处，如费用低廉、容易操作，即使未经训练的人也能得到可靠的结果。

美国专利(专利号US5,296,114)描述了一种相近的电泳分离装置及方法。该装置的分离通道基本结构是闭合环状，例如矩形。在矩形通道的每个转角处有至少一个开口并装配有电极。欲分离样品通过进样口注入充满电解质载体介质的分离通道。溶解的样品在开口处电极施加的电场作用下在分离通道中移动，进而各组份得到分离。通道中的电场是通过将开口区的电极与电压电源的不同电势连接而施加的。由于分离通道是矩形，因此不能在一块板上加工多个分离通道(阵列通道)。

总之，目前可以很方便地从浓度局限的样品中分离出区带宽度窄的组份的微型毛细管电泳分离装置还没有开发出来，这也正是本发明的目标。

本发明的目标在于为复杂样品分离提供一种快速简便、高效廉价的电泳装置及方法。在填充有均匀介质的电泳通道中实现样品在线浓缩导致电泳区带狭窄，因而有好的分离效率。

本发明的进一步目标是将该分离装置微型化，使之成为芯片***。使装置的使用及电泳分离方法的操作更容易、更安全。

本发明涉及的电泳分离装置设有分离通道，在通道两端各有至少一个入、出水口，入、出水口区各有一个电极。分离通道分成至少2个区段，各区段之间依序以接点连接；接点提供一种电学连接，电学连接通过以离子导电体隔开通道与储液池来实现；储液池中装配有电极。

浓度局限样品电泳分离效率低的问题，特别对于微型毛细管电泳而言是个突出的问题。在本发明则解决了这个问题。本发明沿填充有均匀介质的通道施加不连续的电场。电泳通道含有n个(n≥2)区段，n个区段之间依序有n-1接点。为了在操作区段上施加不同的电场，电极与接点相连。为了避免电化学反应产物及产生的气泡对电泳通道的影响，这些电极的连接是通过在电泳通道与管形瓶之间***膜状离子导电体将两者隔开来实现的。管形瓶装配有电极并充有适当的电解质溶液。通过将管形瓶-电极与直流电源相连，管形瓶与分离通道中电解质溶液的离子能够通过离子导电膜互相交换。通过选择合适的膜，可以抑制样品离子通过膜。这样在分离通道接点处实现了纯粹的离子连接。

分离过程分成几步：复杂混合物样品分离开始时，样品注入第一区段，样品可以是一个长的样品区带，样品区带甚至可以是完全占满或几乎完全占满整个第一区段，即从入水口到第一个接点的距离；第二个区段紧接着第一个区段，如果只有两个区段的话，第二个区段则为从第一个接点到出水口的通道，如有两个以上区段，则沿着分离通道有更多的接点。

在第一步或第一个时段，在第一及第二区段施加不同的电场。样品混合物中所有组份从第一区段经接点往第二区段移动。由于第一区段与第二区段的电压比为R1，R1大于1，所以各组份的区带宽度以R1的倍率压缩因而得以浓缩。同时不同的组份根据各自的电泳迁移率得以分离，更特别的是，在本装置中，不同组份还由于各组份在相应区段具有不同电泳速度而分离。当整个样品区带从第一区段移动到第二个区段时，第一步或第一时段结束。

在第二个时段，所有物种在电场的驱动下从第二个区段经过第二个接点向第三个区段移动。由于第一区段与第二区段的电压比为R2，R2大于1(通常小于R1)，每个物种的区带宽度以R2的倍率再次压缩而浓缩并得到进一步分离。当整个样品区带从第二区段移动到第三个区段时，第二时段结束。必须指出，各区段的电场在不同时段不同，同一时段各区段电场也不同。

为分析更复杂的体系，必要时，可以采用更多的区段和更多个时段，以得到更好的分辨率、更低的浓度检测限。电泳结束时，关闭电场，分离的图象可以立即以数码相机拍摄，再经计算机处理。也可以采用在分离通道的一点或多点光学方法记录对电泳过程进行实时监测。

图1为电泳分离装置结构示意图。

图2为电泳分离装置的主体B结构示意图。

图3为电泳分离装置的盖子L结构示意图。

图4为组装后的电泳分离装置顶视图。

图5为组装后的电泳分离装置顶视图。

图6为接点与电泳介质界面为环状的电泳分离装置结构示意图，其中左上图为顶视图，右上图为侧视图，下图为接点结构示意图。

图7为接点与电泳介质界面为部分环状的电泳分离装置结构示意图，其中下图为接点结构示意图。

图8为图7所述原理在芯片上实现的示意图，其中左上图为顶视图，右上图为侧视图，下图为接点结构示意图。

图1为一种电泳分离装置设有电泳通道Ch，Ch由n个区段S_n及区段间n-1个接点J_n-1依序组成(例如n＝3或4)。通道是一个整体，其两端装配有入、出水口1及2。欲分离样品通过进样口(可以是入水口1)注入电泳介质。通过入、出水口及区段间的接点处的电极在通道的各区段施加不同的电压。为防止在分离通道Ch中发生电化学反应及形成气泡，通道中的电场是通过使用离子导电体3，例如是膜状，放置在通道Ch及储液池4之间，使通道Ch与储液池4隔开。储液池4装配有电极5。电极通过耦联电路6与直流电源相连。储液池中充有或充满适当的电解质溶液作为离子源，其离子可以与电泳通道中的缓冲离子相交换。在操作区段不同电场的作用下，样品区带由于各物种具有不同的迁移速度而得到分离和压缩。本装置为高效毛细管电泳HPCE建立一种有效的电泳方法，该方法可以结合芯片技术的优势(如快速、低操作压)，并改善了分离的分辨率和检测限，加工费用低廉。

为实现基于本发明思想的电泳芯片，在玻璃的主体(或基板)B上微加工通道(电泳毛细管)Ch。也可使用Pyrex片、SiO₂或PMMA、PC类高分子材料等。使用的加工技术可以根据材料相应地采用刻蚀技术或微铸/热压技术。(请见图2)。在盖子部分L加工有电解质毛细管E，E垂直于主体部分的通道(电泳毛细管Ch)。在电解质毛细管的一端O及盖子L两端的S部位还加工有入、出水口(见图3)。当主体B与盖子L组装后，S部位的入、出水口与电泳通道的末端相吻合(见图4)。离子导电膜M用来将电解质储液池与电泳通道隔开，同时形成毛细管E。例如使用一种高分子膜，通过夹钳、粘结或其它结合技术夹在主体B与盖子L之间，形成类三明治结构(见图5)。最后在离子导电膜上加工小孔，使电泳通道开放。电泳通道充满电泳介质，电解质通道也填充有相应的电解质溶液。

操作时，将芯片放入电泳***中，电极(例如铂电极)通过电极孔***充有电解质溶液的储液池中。一些管子，比如用于样品注射的管或排除废液的管，与电泳芯片的入出水口相连。

为了在操作区段施加立不同的电流和电场，电流要流过接点。为避免电化学反应产物及生成的气泡干扰分离通道，电学连接是通过在电泳通道及每个储液池之间***离子导电膜来实现的。这些储液池装配有电极并充有适当的电解质溶液。通过将储液池-电极与直流电源相连，储液池中的离子可以通过接点的离子选择材料与通道中离子相交换。这样，在接点实现了电学及纯粹的离子连接。沿通道方向接点的轴向长度小于(通常是远小于)区段的长度。为在通道及储液池之间形成电学及纯粹的离子连接，接点处一小部分不导电的通道壁为导电材料所替换。

各区段通道壁内的电泳介质的形状通常是长柱状。接点处离子导电体与电泳介质的界面形状通常应使操作区段的电泳介质柱保持平滑的过渡。接点处离子导电体与电泳介质的界面形状可以是近似方环或圆环(或环的部分(图7及图8))环绕电泳介质，见图6。左上图是俯视图，右上图是侧视图，此装置类似与于图2～5的装置，但不同的是有几块离子导电膜M在垂直于电泳毛细管的延伸方向上贯穿电泳毛细管。下图是离子导电膜在芯片中组装方式的透视图。在每个接点J_n，离子导电膜M完全环绕电泳毛细管并与储液池4相连接。

如图7，8所示，离子导电膜M与通道Ch的连接仅仅是环的一部分。图7显示的是连接电泳通道Ch与几个储液池4的离子导电体M的形状象一个小的通道。图8为图7所述原理在芯片上实现的示意图。图中符号及数字意义等同于前几幅图。

本发明可以以更低的费用进行更高效的电泳，并符合使用点分析或关心点诊断对毛细管电泳装置费用低廉、高效且使用一次性或可重复使用的芯片的要求。如一种集溶液处理、分离、检测、数据存储及分析功能于一体的即插即用型集成基因电泳***。潜在的应用还包括在医院及普通开业医生的实验室中支持快速诊断的血清电泳(关心点)，或支持法医快速可靠地指认的DNA指纹分析(使用点)。环境与生物技术工程的监测也是使用点电泳分析的应用领域。

一次性毛细管电泳芯片的低加工费用的要求可以通过结合微***技术与可替换材料(如高分子材料)来满足。这样一种低成本的装置的高的分离效率是由前述的新颖电泳方法所保证的。这种方法由于其简单便及使用芯片技术而与众不同。

Claims

1.电泳分离装置，其特征在于设有分离通道，分离通道的首尾两端各有至少一个入水口与出水口，且入、出水口区各有一个电极，分离通道包括至少两个区段，区段与入水口、出水口之间以及区段之间通过接点依序相互电学连接，在每一接点处设有储液池，在分离通道之间以及储液池与分离通道之间设有离子导电体，离子导电体将分离通道，以及储液池与分离通道分隔开，储液池中设有电极。

2 如权利要求1所述的电泳分离装置，其特征在于分离通道上的接点处设开口，接点处的开口用于***离子导电体。

3.如权利要求2所述的电泳分离装置，其特征在于离子导电体是膜状。

4.如权利要求1所述的电泳分离装置，其特征在于入、出水口及接点处的电极与电源相连，使得在分离通道的相应区段可以沿其轴向施加不同的电场。

5.如权利要求1，2，4中的任何一个所述的电泳分离装置，其特征在于分离通道为毛细管，毛细管的内径为0.1μm～1mm，毛细管的长度为5～200mm。

6.如权利要求1，2，4中的任何一个所述的电泳分离装置，其特征在于分离通道的内管壁涂敷有聚合物薄膜或吸附的膜。

7.如权利要求1，2，4中的任何一个所述的电泳分离装置，其特征在于分离通道充有或充满电泳介质，电泳介质为液体或凝胶。

8.如权利要求1所述的电泳分离装置，其特征在于储液池是一个与分离通道分隔开的管形瓶，储液池中装配有电极。

9.如权利要求8所述的电泳分离装置，其特征在于管形瓶中充有或充满电解质溶液以作为离子源，可与电泳介质通道中的离子互相交换。

10.如权利要求4所述的电泳分离装置，其特征在于使用电源为直流电源。

11.如权利要求1所述的电泳分离装置，其特征在于装置是微型的并由至少两部分主体部分与盖子部分组成，主体部分有至少一个分离通道以形成电泳毛细管，而盖子部分则有入、出水口及至少一个储液池。

12.如权利要求11所述的电泳分离装置，其特征在于在主体部分与盖子部分之间夹有固体导电体，并将电泳毛细管与储液池分隔开，形成类三明治结构。

13.如权利要求11或权利要求12所述的电泳分离装置，其特征在于主体部分、盖子部分及离子导电体排列成类毛细管电泳芯片，通过粘结或夹钳组装起来。

14.如权利要求1所述的电泳分离装置，其特征在于至少有2个分离通道平行排列形成阵列。

15.一种使用如权利要求1到权利要求14中的任何一个所述的电泳分离装置的电泳分离方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：a.通过入水口将样品注入充满电泳介质的分离通道第一区段；b、然后在不同区段施加不同的电压驱动样品的各组份沿着分离通道移动进而分离。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于注入的样品混合物完全或几乎完全占据电泳通道的第一区段。

17.如权利要求15所述方法，其特征在于分离过程在至少一个时段完成，只在相应的分离通道区段施加电场，驱动样品组份从一个区段移往下一个区段。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于时段的结束标志如下：当感兴趣的样品组份中移动最慢的组份大部分已通过相应的接点进入下一个区段时；或者，当感兴趣的样品组份中移动最快的组份已达到下一个区段的末端时，该时段结束。

19.如权利要求17或18所述的方法，其特征在于在分离的第一个时段，区段1的电压E₁与区段2的电压E₂的比值为R₁，R₁不小于1。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于后续的分离时段中，第n个区段的电压En与第个n+1区段E_n+1的电压的比值为R_n，R_n不小于1。

21.如权利要求15或16所述的方法，其特征在于分离过程是连续的。

22如权利要求20所述的方法，其特征在于操作区段的电场En是沿着分离通道轴向施加的。

23.如权利要求15所述的方法，其特征在于分离的图象以光学方法记录。

24.如权利要求23所述的方法，其特征在于分离的结果以通过给分离图象照“快照”的方式记录。

25.如权利要求23所述的方法，其特征在于分离的结果以通过在分离通道的一点或多点进行连续的实时光学检测的方式记录。