CN1271923C

CN1271923C - 一种薰衣草组织培养方法

Info

Publication number: CN1271923C
Application number: CN 200410085334
Authority: CN
Inventors: 许耀祖; 王晓军; 赵明安; 赵海清; 韦彦余; 刘敏
Original assignee: Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry of CAS
Current assignee: Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry of CAS
Priority date: 2004-10-11
Filing date: 2004-10-11
Publication date: 2006-08-30
Anticipated expiration: 2024-10-11
Also published as: CN1586176A

Abstract

本发明涉及一种薰衣草组织培养方法，该方法根据植物叶片再生原理，以叶片为外植体，建立生长迅速的愈伤组织悬浮系，进而建立高频稳定再生体系。本发明采用固体-液体悬浮-固体培养的方法，提供了一种薰衣草离体快繁的方法，是在MS培养基上培养薰衣草叶片，建立生长迅速的愈伤组织悬浮培养体系，最后再生薰衣草幼苗，得到薰衣草无性系。本发明薰衣草芽分化率可达92.5%，生根率可达100%。与固体培养相比，本发明不仅能够提高愈伤组织生长速度和芽分化率，而且具有操作简便，劳动量少和劳动强度小，接种量大的特点，为薰衣草规模化快繁和遗传转化体系的建立奠定基础。

Description

一种薰衣草组织培养方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及植物组织培养技术，具体地说是一种薰衣草组织培养方法。

背景技术

薰衣草(Lavandula angustifolia，cv.Munstead)是唇形科薰衣草属多年生半灌木，有强烈芳香气味，原产于地中海。其生长迅速，根系发达，喜光耐旱，适合在广袤的干旱地区种植。薰衣草油是从薰衣草的全草经提炼得到的，具有安宁镇静、洁净心身、清热解毒、散淤消肿、超风发汗之效，广泛应用于医药、食品、饮料、烟草、牙膏、化妆品、香皂、洗涤剂、消毒剂和其它加香产品等工业领域。近年来，薰衣草油的需求量日益剧增。野生的薰衣草因生态环境受到严重破坏，日益减少，远远不能满足市场需求。新疆是薰衣草的种植基地，其种植面积占全国的95％以上，但目前生产上栽培的都是60年代育成的老品种，退化严重，薰衣草油质量严重下降，影响了其国际竞争力。此外，薰衣草不能度过新疆等干旱地区严寒的冬天，使得薰衣草的生产成本大大提高。因此，为了促进薰衣草种植业的发展，追求低成本，高品质和高效益，开发新的繁育方式，引进新的优良品种，已成为当今薰衣草市场发展的热点问题。运用细胞工程手段，通过植物组织培养方法快速繁殖薰衣草，可以固定杂种优势，保持品种特异性。利用薰衣草组织在合适的培养基上进行离体繁殖，可加速品种繁殖速度，快速扩大种质资源，保持优良品种的性状，用较少的空间，较少个体和时间获得遗传上与亲本植株相同的大量再生无毒苗。这种繁殖方式为薰衣草的产业化发展开拓了一条有效途径，其经济效益和社会效益是巨大的。此外，组织培养技术结合转基因技术，可以提高薰衣草抗旱抗寒的能力，改善薰衣草油的质量，从而降低生产成本，提高经济效益。组培快繁转基因薰衣草的关键是建立高效的受体***如愈伤组织和植株高频再生***。目前，薰衣草组织培养已有少量报道，C.Sudria等通过茎尖培养获得了薰衣草(Lavandula dentate L.)的再生植株(Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1999，58)，Jordan AM等通过茎段培养获得了薰衣草(Lavandula dentate L.)的再生植株(Biotech，1998，73(1))，但通过愈伤组织悬浮培养进而分化出芽而获得再生植株的研究国内外尚未见报。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效的薰衣草组织培养方法，为薰衣草规模化快繁和遗传转化体系的建立奠定基础。经过大量的实验研究，根据植物叶片再生原理，发明了以叶片为外植体，建立生长迅速的愈伤组织悬浮系，进而建立高频稳定再生体系。本发明采用固体—液体悬浮—固体培养的方法，提供了一种薰衣草离体快繁的方法，是在MS培养基上培养薰衣草叶片，建立生长迅速的愈伤组织悬浮培养体系，最后再生薰衣草幼苗，得到薰衣草无性系。本发明薰衣草芽分化率可达92.5％，生根率可达100％。与固体培养相比，本发明不仅能够提高愈伤组织生长速度和芽分化率，而且具有操作简便，劳动量少和劳动强度小，接种量大的特点，其发展前景十分看好。

本发明所述的一种薰衣草组织培养方法，按下列步骤进行：

a、选择一年生薰衣草幼嫩叶片为外植体，先用75％酒精表面灭菌15-25秒，再用0.1％升汞溶液浸泡2-5分钟，然后用无菌水冲洗至干净，切割成片状，将其接入琼脂固化MS+2，4-D 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L的愈伤组织诱导培养基，15-25天后，得到愈伤组织；

b、将新鲜、松散的愈伤组织接入液体培养基MS+2，4-D 0.01-0.1mg/L+6-BA 0.5-1.0mg/L，在25±1℃、无光、100r/min的条件下振荡培养14-18天，建立了生长迅速的薰衣草愈伤组织悬浮培养体系；

c、将愈伤组织从液体培养基中取出，接入琼脂固化MS+NAA 0.1-0.5mg/L+6-BA 2.0-3.0mg/L的芽分化培养基，35-40天后，得到薰衣草分化组培苗；

d、将分化出的组培苗接种到琼脂固化MS+NAA 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L的芽继代培养基，进行继代培养，15-20天，得到大量的组培苗；

e、在1/2MS+IAA 0.2-0.5mg/L+6-BA 0-0.1mg/L+1.0g/L活性炭的固体培养基上，对组培苗进行生根培养，35-45天，形成生根小植株。

所选的薰衣草叶片是具有25-35天苗龄的幼嫩叶片，将其切割成0.2-0.7cm²的小片状，背面朝下进行接种。

固体培养的条件是2500-3500lx日光灯照射，光照10-15h/d，25±1℃下培养，湿度保持65±5％。

固体培养接种量是100mL三角瓶3-5个外植体，每个三角瓶含35-45mL琼脂固化的培养基。

再生的组培苗长到3-6cm，转到琼脂固化的生根培养基上进行生根。

固体培养基需添加琼脂0.5％-0.6％。

液体培养愈伤组织接种量是25-75g/L，250mL三角瓶含100mL液体培养基。

本发明所述的一种薰衣草组织培养方法，根据本发明中的方法与固体培养相比，愈伤组织的生长速度可提高3-4倍，芽分化率可提高60％-70％，继代培养时的接种量可提高2-3倍。此外，本发明的培养周期可相应的减少1-4个月。由此，就可以低成本的大规模的繁殖薰衣草苗。

以下将本发明方法与传统固体培养方法的主要区别概括如表1

表1

方法	接种量	生长速率	芽分化率	芽数/外植体	劳动量	培养周期
方法	接种量	生长速率	芽分化率	芽数/外植体	劳动量	培养周期	固体培养本发明	少固体继代培养最适接量是12.5g/L多液体悬浮培养最适接种量是50g/L	慢固体继代培养愈伤组织生长速率最大达5.84g/L·d快液体悬浮培养愈伤组织生长速率最大达24.14g/L·d	低愈伤组织不继代，芽不分化，继代培养2～4代，芽分化率可达57.5％高液体悬浮培养12～18d，转接至固体分化培养基，芽分化率可达92.5％	少0.9～1.6个芽/外植体多1.8～2.6个芽/外植体	多加琼脂、化胶操作烦琐，费时费力，培养基分装费时费力少液体悬浮培养减少了加琼脂、化胶这一工序，培养液分装简便	长固体继代培养每代25～30天，2～4代50～120d，整个周期5～7月短液体悬浮培养12～18d，整个周期3～4月

附图说明

图1为本发明在液体培养基中所形成的愈伤组织悬浮培养体系的图；

图2为本发明在三角瓶中培养基上分化组培苗的图；

图3为本发明所得的生根小植株的图；

图4为本发明所得的移栽至花盆的生根小植株的图。

本发明要建立悬浮系必须先获得愈伤组织；选择具有25-35天苗龄的薰衣草幼嫩叶片为外植体，将叶片先用75％酒精表面灭菌15-25秒，再用0.1％升汞溶液浸泡2-5分钟，然后用无菌水冲洗至干净，把叶片切成0.2-0.7cm²左右的小片状，接入琼脂固化MS+2，4-D 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L的愈伤组织诱导培养基，15-25天后，得到愈伤组织；挑取新鲜、松散的愈伤组织以25-75g/L的接种量接入含100mL液体培养基MS+2，4-D 0.01-0.1mg/L+6-BA 0.5-1.0mg/L的250mL三角瓶中，在(25±1)℃、无光、100r/min的条件下振荡培养14-18天，建立了生长迅速的薰衣草愈伤组织悬浮培养体系(图1)；

将愈伤组织从液体培养基中取出，接入琼脂固化MS+NAA 0.1-0.5mg/L+6-BA 2.0-3.0mg/L的芽分化培养基，35-40天后，得到薰衣草分化组培苗(图2)；

把分化出的组培苗接种到琼脂固化MS+NAA 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L的芽继代培养基，进行继代培养，15-20天，得到大量的组培苗；在1/2MS+IAA 0.2-0.5mg/L+6-BA 0-0.1mg/L+1.0g/L活性炭的固体培养基上，对3-6cm以上分化组培苗进行生根培养，35-45天，形成生根小植株(图3)。

固体培养的培养条件是，2500-3500lx日光灯照射，光照12h/d，(25±1)℃下培养，湿度保持(65±5)％。

培养基需添加蔗糖1.5-3.0％，琼脂0.5％-0.6％，并调pH值5.80-5.90。

固体培养接种量是100mL三角瓶3-5个外植体，每个三角瓶含40mL琼脂固化的培养基。

具体实施方式

下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但不能解释为本发明被下面这些实施例所限制。

实施例1

愈伤组织诱导

实验材料：薰衣草(Lavandula angustifolia，cv.Munstead)种苗，法国引进新品种，取叶片为外植体。

a、选择一年生薰衣草嫩叶片为外植体，具体选择具有25天苗龄的薰衣草幼嫩叶片，将叶片先用75％酒精表面灭菌15秒，再用0.1％升汞溶液浸泡2min，然后用无菌水冲洗至干净，把叶片切成0.2cm²的小片状，接入含0.5％琼脂的愈伤组织诱导培养基MS+2，4-D 0.1mg/L+6-BA0.5mg/L，在光照2500lx、光照时间10h/d、(25±1)℃、湿度(65±5)％的条件下培养15天，叶片全部出现愈伤组织，诱导率达到100％，所出愈伤组织大多为质地致密、绿色或浅绿色愈伤组织，少部分为黄色、疏松的愈伤组织，黄色、疏松愈伤组织的比例为20％。

愈伤组织悬浮系的建立

b、将新鲜、松散的愈伤组织以25g/L的接种量接入含100mL液体培养基MS+2，4-D 0.01mg/L+6-BA 0.5mg/L的250mL三角瓶中，在25±1℃、无光、100r/min的条件下振荡培养14天，建立了生长迅速的薰衣草愈伤组织悬浮培养体系，其生长速率可达18.68g/L·d(愈伤组织生长速率＝(该接种量下第14天的收获量-接种量)/(每瓶培养液体积×14)，单位g/L·d)。

芽分化和芽继代

c、将光滑、颗粒状的愈伤组织从液体培养基中取出，接入含0.5％琼脂的芽分化培养基MS+NAA 0.1mg/L+6-BA 2.0mg/L，35天，大部愈伤组织可分化，芽分化率85.0％；

d、把分化出的组培苗接种到含0.5％琼脂的芽继代培养基MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.5mg/L，进行继代培养，15天，可得到大量的组培苗。

培养条件为：光照2500lx、光照时间12h/d、(25±1)℃、湿度(65±5)％。

分化组培苗生根与移栽

e、挑取生长健壮，长度3cm的分化组培苗接入含0.5％琼脂的生根培养基1/2MS+IAA 0.2mg/L+1.0g/L活性炭，35天形成生根小植株，生根率可达100％。生根苗取盖炼苗2天，即可移栽到室内花盆，注意保湿，成活率可达100％，半个月可长出新的小叶，表明移栽成活，此时可移入地里种植。

实施例2

愈伤组织诱导

a、选择一年生薰衣草嫩叶片为外植体，具体选择具有30天苗龄的薰衣草幼嫩叶片，将叶片先用75％酒精表面灭菌20秒，再用0.1％升汞溶液浸泡3min，然后用无菌水冲洗至干净，把叶片切成0.5cm²的小片状，接入含0.5％琼脂的愈伤组织诱导培养基MS+2，4-D 0.1mg/L+6-BA0.5mg/L，在光照3500lx、光照时间12h/d、(25±1)℃、湿度(65±5)％的条件下培养20天，叶片全部出现愈伤组织，诱导率达到100％，所出愈伤组织大多为质地致密、绿色或浅绿色愈伤组织，少部分为黄色、疏松的愈伤组织，黄色、疏松愈伤组织的比例为38％。

愈伤组织悬浮系的建立

b、将新鲜、松散的愈伤组织以50g/L的接种量接入含100mL液体培养基MS+2，4-D 0.05mg/L+6-BA 0.5mg/L的250mL三角瓶中，在25±1℃、无光、100r/min的条件下振荡培养15天，建立了生长迅速的薰衣草愈伤组织悬浮培养体系。在该液体培养基中，愈伤组织生长较快，质量最好，其生长速率可达24.14g/L·d(愈伤组织生长速率＝(该接种量下第14天的收获量-接种量)/(每瓶培养液体积×14)，单位g/L·d)。

芽分化和芽继代

c、将光滑、颗粒状的愈伤组织从液体培养基中取出，接入含0.5％琼脂的芽分化培养基MS+NAA 0.2mg/L+6-BA 2.0mg/L，40天，大部愈伤组织可分化，芽分化率92.5％；

d、把分化出的组培苗接种到含0.5％琼脂的芽继代培养基MS+NAA2.0mg/L+6-BA 0.5mg/l，进行继代培养，20天，可得到大量的组培苗。

培养条件为：光照3500lx、光照时间12h/d、(25±1)℃、湿度(65±5)％。

分化组培苗生根与移栽

e、挑取生长健壮，长度超过5cm的分化组培苗接入含0.5％琼脂的生根培养基1/2MS+IAA0.5mg/L+1.0g/L活性炭，40天形成生根小植株，生根率可达100％。生根苗取盖炼苗3天，即可移栽到室内花盆，注意保湿，成活率可达100％，半个月可长出新的小叶，表明移栽成活，此时可移入地里种植。

实施例3

愈伤组织诱导

a、选择一年生薰衣草嫩叶片为外植体，具体选择具有35天苗龄的薰衣草幼嫩叶片，将叶片先用75％酒精表面灭菌25秒，再用0.1％升汞溶液浸泡5min，然后用无菌水冲洗至干净，把叶片切成0.7cm²的小片状，接入含0.6％琼脂的愈伤组织诱导培养基MS+2，4-D 0.1mg/L+6-BA0.5mg/L，在光照3500lx、光照时间15h/d、(25±1)℃、湿度(65±5)％的条件下培养25天，叶片全部出现愈伤组织，诱导率达到100％，所出愈伤组织大多为质地致密、绿色或浅绿色愈伤组织，少部分为黄色、疏松的愈伤组织，黄色、疏松愈伤组织的比例为30％。

愈伤组织悬浮系的建立

b、将新鲜、松散的愈伤组织以75g/L的接种量接入含100mL液体培养基MS+2，4-D0.1mg/L+6-BAl.0mg/L的250mL三角瓶中，在25±1℃、无光、100r/min的条件下振荡培养18天，建立了生长迅速的薰衣草愈伤组织悬浮培养体系，其生长速率可达20.38g/L·d(愈伤组织生长速率＝(该接种量下第14天的收获量-接种量)/(每瓶培养液体积×14)，单位g/L·d)。

芽分化和芽继代

c、将光滑、颗粒状的愈伤组织从液体培养基中取出，接入含0.6％琼脂的芽分化培养基MS+NAA0.5mg/L+6-BA3.0mg/L，40天，大部愈伤组织可分化，芽分化率82.5％；

d、把分化出的组培苗接种到含0.6％琼脂的芽继代培养基MS+NAA2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L，进行继代培养，20天，可得到大量的组培苗。

分化组培苗生根与移栽

e、挑取生长健壮，长度超过6cm的分化组培苗接入含0.6％琼脂的生根培养基1/2MS+IAA 0.5mg/L+6-BA0.1mg/L+1.0g/L活性炭，45天形成生根小植株，生根率可达100％。生根苗取盖炼苗3天，即可移栽到室内花盆，注意保湿，成活率可达100％，半个月可长出新的小叶，表明移栽成活，此时可移入地里种植。

根据本发明中的方法，与固体培养相比，愈伤组织的生长速度可提高3-4倍，芽分化率可提高60％～70％，继代培养时的接种量可提高2-3倍。此外，本发明的培养周期可相应的减少1-4个月。由此，就可以低成本的大规模的生长薰衣草苗。

Claims

1、一种薰衣草组织培养方法，其特征在于按下列步骤进行：

a、选择一年生薰衣草幼嫩叶片为外植体，先用75％酒精表面灭菌15-25秒，再用0.1％升汞溶液浸泡2-5分钟，然后用无菌水冲洗至干净，切割成片状，将其接入琼脂固化MS+2，4-D 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L的愈伤组织诱导培养基，固体培养的条件是2500-3500lx日光灯照射，光照10-15h/d，25±1℃下培养，湿度保持65±5％，15-25天后，得到愈伤组织；

c、将愈伤组织从液体培养基中取出，接入琼脂固化MS+NAA 0.1-0.5mg/L+6-BA 2.0-3.0mg/L的芽分化培养基，固体培养的条件是2500-3500lx日光灯照射，光照10-15h/d，25±1℃下培养，湿度保持65±5％，35-40天后，得到薰衣草分化组培苗；

d、将分化出的组培苗接种到琼脂固化MS+NAA 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L的芽继代培养基，进行继代培养，固体培养的条件是2500-3500lx日光灯照射，光照10-15h/d，25±1℃下培养，湿度保持65±5％，15-20天，得到大量的组培苗；

e、在1/2 MS+IAA 0.2-0.5mg/L+6-BA 0-0.1mg/L+1.0g/L活性炭的固体培养基上，对组培苗进行生根培养，固体培养的条件是2500-3500lx日光灯照射，光照10-15h/d，25±1℃下培养，湿度保持65±5％，35-45天，形成生根小植株。

2、根据权利要求1所述的一种薰衣草组织培养方法，其特征是所选的薰衣草叶片是具有25-35天苗龄的幼嫩叶片，将其切割成0.2-0.7cm²的小片状，背面朝下进行接种。

3、根据权利要求1所述的一种薰衣草组织培养方法，其特征是固体培养接种量是100mL三角瓶3-5个外植体，每个三角瓶含35-45mL琼脂固化的培养基。

4、根据权利要求1所述的一种薰衣草组织培养方法，其特征是再生的组培苗长到3-6cm，转到琼脂固化的生根培养基上进行生根。

5、据权利要求1-4所述的一种薰衣草组织培养方法，其特征是固体培养基需添加琼脂0.5％-0.6％。

6、根据权利要求1所述的一种薰衣草组织培养方法，其特征是液体培养愈伤组织接种量是25-75g/L，250mL三角瓶含100mL液体培养基。