CN1271774A - 固态发酵果渣、菜渣制备果胶酶 - Google Patents

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Abstract

本发明为一种制备果胶酶的方法,属于微生物发酵领域。发明以水果加工过程产生的废渣或甜菜糖生产过程中产生的废渣作为碳源,以无机氮作为氮源,接种黑曲霉PE1650,(菌种保存中心命名登记号:Aspergillus niger CGMCC0455),于31—33℃、接触空气条件下,固态发酵60—72小时达到产酶高峰。发酵后熟物经自来水浸提,即获得果胶酶溶液。经果胶脱胶试验法测定酶活力,果胶酶产率(酶单位数/克原料)最高达到1596单位/克原料;提取酶后的残渣含16.7%的蛋白质。

Description

专利 固态发酵果渣、菜渣制备果胶酶
果胶酶是一种工业用酶制剂，它的主要性质是降解果胶物质。果胶酶这一性质主要应用于果汁加工和果酒酿造。此外，果胶酶用于橘子脱囊衣、麻料脱胶以及反刍动物的饲料添加剂也有报导。
目前制备果胶酶的主要方法是微生物粮食碳源液态发酵，该法投资大且生产成本较高。本发明是一种以水果加工过程产生的废渣如桔皮、菠萝渣或甜菜糖生产过程中产生的废渣作为碳源，通过特定的微生物固态发酵制备果胶酶的一种方法，该方法主要特点如下：1、以水果加工过程产生的废渣如菠萝渣、桔皮或甜菜糖生产过程中产生的废渣作为碳源；2、以无机氮硫酸铵、硝酸铵、氯化铵和尿素作为氮源；3、接种黑曲霉PE1650(菌种保存中心命名登记号：Aspergillus niger CGMCC0455)，于31-33℃、接触空气条件下，固态发酵48-72小时达到产酶高峰；4、发酵后熟物经自来水浸提，过滤弃残渣，即获得果胶酶溶液；5、提取果胶酶后的残渣富含16％的蛋白质，可考虑作为配混饲料使用；6、经果胶脱胶试验法测定酶活力，果胶酶产率(酶单位数/克原料)达到1596单位/克原料。该方法制备果胶酶所用原料价廉，菌种发酵效率高，发酵过程容易控制，具有工业化开发价值。
本发明所述的果胶酶制备方法内容如下：1.黑曲霉PE1650菌种选自于腐烂的菜渣，该菌种保存于察氏培养基，其培养基组成如下(g/L)：NaNO3 3；K2HPO4 1；MgSO47H2O 0.5；KCl 0.5；FeSO4 0.01；蔗糖30；琼脂20；水稀释至1升。2.产酶培养基组成比例(w/w)如下：含果胶废渣50；氮1。3.固态发酵操作方法如下：按2所述的原料比配制培养基，加自来水浸泡，含水量70-85％(w/w)。培养基被分装于1升的三角瓶中，每瓶20克(按干重计)，于0.1Mpa压力下蒸汽灭菌20分钟，取出降至室温后，接种1所述方法制备的菌种，于30-33℃恒温培养72小时，然后以10倍培养物的自来水分二次提取，压滤除渣，所得的上清夜即为果胶酶溶液。4.果胶酶测定采用果胶脱胶法，测定方法如下：取5ml实验当天配制的标准果胶溶液置于φ25×250mm的试管中，加入pH4.2、0.05mol/l的柠檬酸/柠檬酸三钠缓冲液10ml，试管置于40℃恒温水浴平衡5分钟，加入5ml事先稀释到合适浓度(预实验确定)的酶液，并立即开始计时，反应3分钟后取样1ml放入事先准备好的试管，立即加入2滴1％的I2/KI溶液，摇匀，再加入2ml异丙醇，不摇动而转动试管，观察胶体沉淀是否消失，准确记录脱胶时间。在上述操作条件下，30分钟使1mg果胶完全脱胶所需的酶量为一个活力单位。5.蛋白质测定采用凯氏定氮法，即Kjeldahl方法，所测定的蛋白氮乘以6.25即为样品蛋白质含量。
实施例1：最佳原料甜菜渣产酶实验
菌种黑曲霉PE1650(Aspergillus niger CGMCC 0455)保存于冰箱内4℃察氏培养基，半年转接一次。使用前转接到新配制的斜面。
固态发酵产酶实验：甜菜废渣100克，硫酸铵10克，混匀，每瓶25克分装于1升三角瓶中，加自来水浸泡，含水量70-85％(w/w)，0.1Mpa压力下蒸汽灭菌20分钟，取出降至室温后，接种上述新鲜制备的菌种黑曲霉PE1650，于30-33℃恒温培养72小时，然后以10倍培养物的自来水分二次提取，压滤除渣，所得的上清夜即为果胶酶溶液，所测得的酶活性结果如下表(表1)：
                         表1样品编号              酶活性(单位/克原料)         蛋白质含量(％)P01                   1609                        16.5P02                   1652                        16.9P03                   1541                        17.1P04                   1582                        16.4平均                  1596                        16.7实施例2不同氮源对产果胶酶的影响
菌种黑曲霉PE1650(Aspergillus niger CGMCC 0455)保存于冰箱内4℃察氏培养基，半年转接一次。使用前转接到新配制的斜面。
固态发酵产酶实验：甜菜废渣与氮的比例：50/1，所用氮源有：硫酸铵、硝酸铵、氯化铵和碳酸铵。不同的氮源化合物分别加入到1升三角瓶中，每瓶25克原料(按干重计)，加自来水浸泡，含水量70-85％(w/w)，0.1Mpa压力下蒸汽灭菌20分钟，取出降至室温后，接种上述新鲜制备的菌种黑曲霉PE1650，于30-33℃恒温培养72小时，然后以10倍培养物的自来水分二次提取，压滤除渣，所得的上清夜即为果胶酶溶液，所测得的酶活性结果如下表(表2)：
                           表2
        氮  源                         酶活性(单位/克原料)
        硫酸铵                         1636
        硝酸铵                         1552
        氯化铵                         1248
        碳酸铵                         1310实施例3发酵桔皮及菠萝渣对产果胶酶的影响
菌种黑曲霉PE1650(Aspergillus niger CGMCC 0455)保存于冰箱内4℃察氏培养基，半年转接一次。使用前转接到新配制的斜面。
固态发酵产酶实验：桔皮或菠萝渣与氮的比例：50/1，所用氮源为硫酸铵。不同原料的培养基分别加入到1升三角瓶中，每瓶25克原料(按干重计)，加自来水浸泡，含水量70-85％(w/w)，0.1Mpa压力下蒸汽灭菌20分钟，取出降至室温后，接种上述新鲜制备的菌种黑曲霉PE1650，于30-33℃恒温培养72小时，然后以10倍培养物的自来水分二次提取，压滤除渣，所得的上清夜即为果胶酶溶液，所测得的酶活性结果如下表(表3)：
                           表3
        原料种类                       酶活性(单位/克原料)
        桔皮                           678
        菠萝渣                         575

Claims (7)

1.以水果加工过程产生的废渣和甜菜糖生产过程中产生的废渣作为碳源，辅加无机氮源，接种黑曲霉PE1650((菌种保存中心命名登记号：Aspergillus nigerCGMCC 0455)产酶菌，在一定的温度、湿度下进行固态发酵，发酵后熟物经自来水浸提，制备了果胶酶水溶液。
2.  在权利要求第1项所述的方法中，作为制备果胶酶的微生物发酵碳源是水果加工过程产生的废渣和甜菜糖生产过程中产生的废渣，所述的水果加工过程产生的废渣指桔皮、菠萝残渣，而甜菜糖生产过程中产生的废渣又称甜菜废粕或颗粒粕(加工成含水12％以下的颗粒状态，易于储存)。
3.在权利要求第1项所述的方法中，黑曲霉PE1650(菌种保存中心命名登记号：Aspergillus niger CGMCC 0455)为产果胶酶的唯一菌种，该菌种发酵产酶效率因原料不同、控制条件不同而变化。
4.在权利要求第1项所述的方法中，黑曲霉PE1650(菌种保存中心命名登记号：Aspergillus niger CGMCC 0455)能利用第2项所述的碳源发酵产酶，而不必补充其它碳源。
5.在权利要求第1项所述的方法中，辅加的无机氮源指硫酸铵、硝酸铵、氯化铵和碳酸铵。在发酵培养基中，氮的含量占培养基总重量的5‰-2％。
6.在权利要求第1项所述的方法中，固态发酵的温度为30-33℃，相对湿度95-100％。
7.在权利要求第1项所述的方法中，发酵后熟物指发酵产酶达高峰后停止发酵时的产物。该产物经自来水浸提后，压榨过滤，即获得果胶酶液制品。另根据使用要求，该酶液可于40℃之下减压浓缩成高浓度果胶酶产品。
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