CN1266164C - 灵芝孢子粉多糖、生产方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从经微波软化处理过的中药灵芝孢子粉中提取的多糖、其生产方法和用途。本发明采用水浸泡获得灵芝孢子粉水提液，有机溶剂沉淀、沉淀用水溶解，上清液经透析或膜分离，浓缩干燥获得总糖，灵芝孢子粉总糖经分级沉淀和柱层析获得灵芝孢子粉多糖LzPS-1，其化学结构为：见右式，其中n＝2～4。本发明方法工艺简单、产率高，适宜工业化生产。经生物活性试验表明，该灵芝孢子粉多糖无毒副作用。具有抗肿瘤及增强免疫功能的作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术从中药材中提取的多糖同系混合物，特别是涉及从经微波软化处理的灵芝孢子粉中提取的灵芝孢子粉多糖LzPS-1、其生产方法和用途。
技术背景
灵芝是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌赤芝和紫芝的总称，具有扶正固本等功效，被《本经》称为上品。近年来，随着灵芝人工栽培技术的发展，规模收集其生殖细胞—孢子的难题得到了解决，这就对其化学成分及药用价值的研究开发提供了稳定的原料来源。据报道，灵芝孢子具有降血糖作用[章灵华，等.中草药，1993，24(5)：246]，能够调节肌体免疫功能[章灵华，等.中国免疫学杂志，1994，10(3)：169]，对磷酸肌酸激酶(CPK)在免疫性肌炎大鼠肌肉中的下降及血清中的上升也有拮抗作用[刘耕陶.中国药理通讯，1993，9(3)：4]，临床试用治疗萎缩性肌强直等疑难疾病有较满意效果。[侯翠英，等.植物学报，1988，30(1)：66]。文献报道，[赵东旭，等.中草药，1999，30(4)：305]，灵芝孢子化学成分有蛋白质、氨基酸类、糖肽类、维生素类、胡萝卜素、甾醇类、三萜类、生物碱类、脂肪酸类、内酯和无机离子等。孢子粉生药和破壁孢子粉中多糖成分的研究已有报道，而对微波软化处理过的孢子粉中多糖的研究尚未见报道。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种灵芝孢子粉多糖LzPS-1及其生产方法和用途，一种包含灵芝孢子粉多糖LzPS-1的灵芝孢子粉总糖。
本发明是从经微波软化处理的灵芝孢子粉中提取获得的多糖，其结构为
其中n＝2～4，Glcp为吡喃型葡萄糖，α-Glcp(1→为非还原末端葡萄糖，→3)β-Glcp(1→为1，3连接的葡萄糖，→6)β-Glcp(1→为1，6连接的葡萄糖，→3，6)β-Glcp(1→为1，3，6连接的葡萄糖，→4)β-Glcp(1→为1，4连接的葡萄糖。
本发明的灵芝孢子粉多糖或总糖是通过如下方法制备的：将经微波软化处理的灵芝孢子粉用水浸泡，采用有机溶剂沉淀，透析或膜分离，浓缩干燥获得总多糖。灵芝孢子粉总糖经分级沉淀，再经离子交换柱和凝胶柱层析纯化得灵芝孢子粉多糖纯品LzPS-1。
该多糖经完全酸水解、还原、乙酰化和GC分析，结果表明它由葡萄糖一种单糖组成。由HPLC分析测得其分子量范围为5000～11000。其谱图数据如下面所述：δ(ppm)：1H-NMR：5.33、5.32为α-Glcp(1→，4.77～4.69为→3)β-Glcp(1→，4.53～4.47为→6)β-Glcp(1→、→3，6)β-Glcp(1→、→4)β-Glcp(1→。13C-NMR：103.93～103.80为→3，6)β-Glcp(1→，→4)β-Glcp(1→、→6)β-Glcp(1→，103.54为→3)β-Glcp(1→，100.42为α-Glcp(1→。
从LzPS-1甲基化、还原、乙酰化衍生物的GC-MS图谱分析得知，LzPS-1含有碎片→3)β-Glcp(1→、→6)β-Glcp(1→、→3，6)β-Glcp(1→、α-Glcp(1→、→4)β-Glcp(1→其摩尔比为9∶2∶2∶2∶1。根据甲基化、NMR等分析，可以推断LzPS-1具有以下的单元结构：
其中n＝2-4
本发明的制备方法包括将经微波软化处理的灵芝孢子粉干燥后，用水浸泡，采用有机溶剂沉淀，透析或膜分离，浓缩干燥获得灵芝孢子粉总糖。灵芝孢子粉总糖经分级沉淀，再经离子交换柱和凝胶柱层析纯化可得灵芝孢子粉多糖纯品LzPS-1。
具体来说，将经微波软化处理的灵芝孢子粉，用水浸泡，其中灵芝孢子粉与水浸泡的重量比推荐是灵芝孢子粉∶水＝1∶10～15，尤其推荐用10～12倍重量或更多的水，浸泡24～36小时。所述水推荐为无离子水。浸泡液的pH值推荐保持在5.0～8.0。
过滤，滤液经或不经浓缩，用有机溶剂沉淀后离心。离心所得沉淀用水溶解，推荐用1～5倍重量的水溶解。
离心，上清液透析或膜分离，透析时间推荐为24～72小时，透析用透析膜、透析袋，其孔径推荐截留分子量在1000以下，尤其推荐截留分子量为500。
浓缩干燥获得总糖，其中干燥或减压浓缩温度推荐低于60℃进行，最好采用低温真空浓缩或冷冻干燥，例如在30～60℃干燥或浓缩，压强推荐控制在0.08～0.1MPa。
所述灵芝孢子粉总糖加水溶解，其中推荐1～5倍重量的水溶解。然后用乙醇分级沉淀，经DEAE-Cellulose柱层析，用无离子水洗脱后收集，再经Sephadex凝胶柱纯化，最后采用冷冻干燥获得灵芝孢子多糖纯品LzPS-1纯度可达到96％以上。
前述的用有机溶剂沉淀，所述有机溶剂推荐与水互溶的有机溶剂，可以是低碳链的醇或酮，例如C1～C6的醇或酮等，尤其推荐丙酮，例如用2～6倍体积的75％～95％的丙酮；沉淀时间推荐为12～72小时。
经生物活性试验，研究结果表明灵芝孢子粉多糖LzPS-1具有较好的抑制S180肉瘤和Lewis肺癌的效果，并具有增强免疫活性的作用。本发明提取的灵芝孢子粉总糖或纯品可用于制备抗肿瘤和增强免疫活性的药物。
本发明首次从经微波软化处理的灵芝孢子粉中提取灵芝孢子粉多糖LzPS-1。本发明的提取分离方法简便，产率高和适于工业化生产。本发明取得到的灵芝孢子粉总糖或纯品能够有效的用于制备抗肿瘤和增强免疫活性的药物。
附图说明
图1是灵芝孢子总糖的HPLC图。仪器为Shimadzu CLASS-VP V5.032。分析柱为BIOSEP-S4000，洗脱液：双蒸水，流速：1mL/min，检测器：RI，主峰含量69％。
| 峰 | 保留时间 | 面积 | 面积比 |
| 1 | 5.782 | 13301 | 0.33 |
| 2 | 7.758 | 634305 | 15.60 |
| 3 | 9.035 | 362204 | 8.91 |
| 4 | 9.560 | 212006 | 5.21 |
| 5 | 13.633 | 2844056 | 69.95 |
| 总计 | 4065873 | 100.00 |
图2是灵芝孢子多糖LzPS-1的HPLC图。分析柱为BIOSEP-S4000，洗脱液：双蒸水，流速：1mL/min，检测器：RI，分析得到单一对称峰，主峰含量96％。
| 峰 | 保留时间 | 面积 | 面积百分比 | 高度 | 高度百分比 |
| 1 | 7.739 | 385520 | 3.705 | 11402 | 5.536 |
| 2 | 13.774 | 9997512 | 96.081 | 194238 | 94.315 |
| 3 | 18.442 | 22225 | 0.214 | 307 | 0.149 |
| 总计 | 10405257 | 100.000 | 205947 | 100.000 |
图3是HPLC法测定多糖分子量的标准葡聚糖(Sigma)的1gMw与Rt标准曲线图，线性方程为：1gMw＝8.47877-0.33031Rt(r＝-0.9996)。通过线性方程计算表明LzPS-1分子量范围为5000～11000。
图4是灵芝孢子多糖LzPS-1的红外光谱图。仪器为Bio-Rad FTS-185。890cm-1为β构型的特征吸收，840cm-1为α构型的特征吸收，1078cm-1、1039cm-1为吡喃环的特征吸收。
图5是灵芝孢子多糖LzPS-1的1H-核磁共振(NMR)图谱。1H-NMR：5.33、5.32为α-Glcp(1→，4.77～4.69为→3)β-Glcp(1→，4.53～4.47为→6)β-Glcp(1→、→3，6)β-Glcp(1→、→4)β-Glcp(1→。
图6是灵芝孢子多糖LzPS-1的13C-核磁共振(NMR)图谱。13C-NMR：103.93～103.80为→3，6)β-Glcp(1→，→4)β-Glcp(1→、→6)β-Glcp(1→，103.54为→3)β-Glcp(1→，100.42为α-Glcp(1→。
图7是灵芝孢子多糖LzPS-1的GC-MS图谱中的GC图谱。其表明有5个碎片峰。
| 峰 | 保留时间(min) | 类型 | 宽度(min) | 面积(pA*s) | 高度(pA) | 面积％ |
| 1 | 14.517 | PB | 0.0567 | 153.78931 | 42.99859 | 11.39286 |
| 2 | 17.429 | BB | 0.0640 | 750.95807 | 162.18376 | 55.63168 |
| 3 | 17.721 | BB | 00574 | 85.68938 | 23.59284 | 6.34795 |
| 4 | 18.228 | BB | 0.0582 | 174.89603 | 47.18438 | 12.95646 |
| 5 | 21.125 | VB | 0.0558 | 184.54221 | 48.02483 | 13.67106 |
| 总计 | 1349.87498 | 323.98440 |
图8为Rt＝15.71min的碎片质谱图，说明含有α-Glcp(1→。
图9为Rt＝18.76min的碎片质谱图，说明含有→3)β-Glcp(1→。
图10为Rt＝18.98min的碎片质谱图，说明含有→4)β-Glcp(1→。
图11为Rt＝19.60min的碎片质谱图，说明含有→6)β-Glcp(1→。
图12为Rt＝22.57min的碎片质谱图，说明含有→3，6)β-Glcp(1→。
具体实施方式
实施例1
将经微波软化处理过的干燥灵芝孢子粉100g，用1升无离子水室温浸泡24小时，过滤。滤液50℃减压浓缩至200～300毫升。然后用95％的乙醇沉淀，乙醇终浓度为85％，沉淀24小时。离心，沉淀用200～300毫升水溶解，离心，无离子水透析48～72小时。50℃减压浓缩后冷冻干燥，即获得灵芝孢子总糖LzPS1.5g，纯度为69％。
实施例2
将经微波软化处理过的干燥灵芝孢子粉100g，用1升无离子水80～90℃水煮1小时，过滤。滤液50℃减压浓缩至200～300毫升。然后用95％的乙醇沉淀，乙醇终浓度为85％，沉淀24小时。离心，沉淀用200～300毫升水溶解，离心，无离子水透析48～72小时。50℃减压浓缩后冷冻干燥，即获得灵芝孢子总糖LzPS2.1g，纯度为67％。
实施例3
灵芝孢子总糖LzPS 1g加水150毫升溶解，在搅拌下加入2倍95％的乙醇，过夜，离心后沉淀用50毫升水溶解，经无离子水透析24小时，离心，减压浓缩，冷冻干燥后得到第一级分LzPS-a 0.26g纯度为68％，上清液加入3倍95％乙醇同上处理得到第二级分LzPS-b 0.20g纯度为76％，上清液加入5倍95％乙醇同上处理得到第三级分LzPS-c 0.21g纯度为70％，上清液加入7倍95％乙醇同上处理得到第四级分LzPS-d 0.18g纯度为88％。
实施例4
LzPS-c经DEAE-Cellulose柱层析精制，纯度可达96％。具体的分离方法：先将玻璃柱(3.5cm×20cm)用0.05mol/LNaHCO3平衡24小时，再称取LzPS-c50mg，溶于2～3mL蒸馏水中，离心(4500r/min，10min)。取上清液上玻璃柱，用无离子水洗脱，流速为10mL/15min，每管收集10mL，大约14～20管为吸收峰。收集后经无离子水透析48小时，减压浓缩，冷冻干燥后获得27mg灵芝孢子多糖纯品LzPS-1，纯度可达到96％。若需进一步提高纯度，可采用Sephadex凝胶柱做进一步纯化。
实施例5灵芝孢子多糖的生物活性研究
我们对灵芝孢子总多糖送检生物活性测定，其结果如下：
1.不同剂量灵芝孢子总多糖(LzPS)对小鼠Lewis肺癌足趾接种的疗效实验
| 样品 | 剂量mg/kg | 给药方案 | 动物只数始/终 | 动物体重g始/终 | 瘤重g始/终 | 抑制率％ |
| LzPS | 200 | ip×10qd | 10/10 | 19.6/25.7 | 0.331±0.04*** | 62.89 |
| LzPS | 100 | ip×10qd | 10/10 | 19.5/26.1 | 0.419±0.04*** | 53.03 |
| 阳性对照CTX | 30 | ip×7qd | 10/10 | 19.6/22.1 | 0.009±0.02*** | 98.99 |
| 阴性对照组 | 相应溶剂 | ip×10qd | 20/20 | 19.6/25.9 | 0.892±0.12 |
试验组与阴性对照组相比***p＜0.01
2.不同剂量灵芝孢子总多糖(LzPS)对小鼠S180肉瘤(腋皮下接种)疗效实验
| 样品 | 剂量mg/kg | 给药方案 | 动物只数始/终 | 动物体重g始/终 | 瘤重g始/终 | 抑制率％ |
| LzPS | 200 | ip×10qd | 10/10 | 20.3/25.3 | 1.13±0.15*** | 57.36 |
| LzPS | 100 | ip×10qd | 10/10 | 20.3/25.0 | 1.41±0.17*** | 46.79 |
| 阳性对照 | 30 | ip×7qd | 10/10 | 20.3/21.9 | 0.28±0.10*** | 89.43 |
| CTX | ||||||
| 阴性对照组 | 相应溶剂 | ip×10qd | 20/20 | 20.1/25.5 | 2.65±0.26*** |
试验组与阴性对照组相比***p＜0.01
3.不同剂量灵芝孢子总多糖(LzPS)对荷Lewis肺癌小鼠NK活性的影响
| 样品 | 剂量mg/kg | 给药方案 | 动物只数始/终 | #OD值X±SD | NK活性％ | 与对参照组相比NK活性％ |
| LzPS | 200 | ip×10qd | 6/6 | 0.366±0.05*** | 55.20 | 29.21 |
| LzPS | 100 | ip×10qd | 6/6 | 0.370±0.03*** | 54.47 | 28.05 |
| 阴性对照组 | 相应溶剂 | ip×10qd | 6/6 | 0.517±0.06 | 36.72 | 0.05 |
#为试验组OD均值-效应对照组OD均值
靶细胞OD均值＝0.817±0.05
与阴性对照组相比***p＜0.01
4.灵芝孢子总多糖(LzPS)对大鼠降血糖活性实验
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 动物只数始/终 | 体重(g)和血糖(mmol/L)测定值 | |||
| 第0天 | 第4天 | 第7天 | 第11天 | |||
| 正常组 | 10 | 174.0±7.43.94±0.54 | 186.5±8.22.93±0.48 | 206.9±13.73.51±0.32 | 220.5±22.24.34±0.70 | |
| 模型组 | 10 | 164.5±6.819.03±3.43 | 172.5±14.412.59±3.81 | 183.0±21.119.42±7.78 | 197.0±26.519.01±7.21 | |
| LzPS | 100 | 10 | 167.5±13.617.96±3.59 | 181.0±16.113.65±4.38 | 192.5±23.514.88±4.90 | 197.0±28.415.24±6.13 |
Claims (7)
1、一种灵芝孢子粉多糖，其结构通式为：
，其中n＝2～4。
2、如权利要求1所述的灵芝孢子粉多糖，其特征是分子量范围为5000～11000。
3、如权利要求1所述的灵芝孢子粉多糖，其特征是由葡萄糖一种单糖组成。
4、如权利要求1所述的灵芝孢子粉多糖的生产方法，其特征是通过如下1)、或者1)和2)二种方法制得：1).将经微波软化处理过的干燥灵芝孢子粉用水浸泡，浸泡液浓缩或不经浓缩，用与水互溶的有机溶剂沉淀，沉淀用水溶解，离心上清液经透析或膜分离后，浓缩干燥；2)，将1)的产物再加水溶解后，经分级沉淀、DEAE-Cellulose柱以及凝胶柱纯化、干燥。
5、如权利要求4所述的灵芝孢子粉多糖的生产方法，其特征是灵芝孢子粉与水浸泡的重量比为1∶10～15，水浸泡时间24～36小时，浸泡液的pH＝5～8。
6、如权利要求4所述的灵芝孢子粉多糖的生产方法，其特征是透析或膜分离采用的膜，其孔径控制在截留分子量500～1000。
7、如权利要求1所述的灵芝孢子粉多糖的用途，其特征是所述的灵芝孢子粉多糖用于制备具有抗肿瘤和增强免疫功能的药物。
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