CN1259522A - 新颖的来自大叶性肺炎放线杆菌的蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及来自大叶性肺炎放线杆菌(APP)的五种新的小分子量蛋白质,其能够诱导或有助于诱导猪抗APP的保护性免疫应答。本发明进一步涉及具有编码该蛋白质的核苷酸序列的多核苷酸分子,以及包含该蛋白质或多核苷酸分子的疫苗,和制备与使用它们的方法。

Description

新颖的来自大叶性肺炎放线杆菌的蛋白质
本发明属于动物保健领域，涉及保护猪抗大叶性肺炎放线杆菌的疫苗。更确切地说，本发明涉及新颖的被多血清型大叶性肺炎放线杆菌共享的抗原蛋白质、编码该蛋白质的DNA分子、包含该蛋白质的抗APP疫苗和诊断试剂。
大叶性肺炎放线杆菌(以下称之为“APP”)是一种革兰氏阴性球杆菌，被公认是最主要的猪肺炎病原体之一(Shope，R.E.，1964，《实验医药杂志》119：357-368；Sebunya，T.N.K.和Saunders，J.R.，1983，《美国兽医学会会志》182：1331-1337)。已经得到确认的有十二种不同的血清型，它们具有不同的地域分布(Sebunya，T.N.K.和Saunders，J.R.，1983，出处同上；Nielsen，R.，1985，《Proc.Am.Assoc.Swine Pract.》18-22；Nielsen，R.，1986，《斯堪的纳维亚兽医学报》27：453-455)。对于抗APP疫苗接种的免疫应答主要是血清型特异的，这暗示了疫苗诱导的免疫是针对血清型特异的荚膜抗原的(Maclnnes，J.I.和Rosendal，S.，1988，《加拿大兽医杂志》29：572-574；Fedorka-Cray，P.J.，等，1994，《Comp.Cont.Educ.Pract.Vet.》16：117-125；Nielsen，R.，1979，《北欧兽医》31：407-413；Rosendal，S.等，1986，《兽医微生物学》12：229-240)。
相形之下，对任意一种血清型的天然免疫似乎在拮抗由其他血清型所导致的疾病上带来了有效的保护作用，这暗示了自然暴露诱导对共享抗原的交叉反应性免疫(Sebunya，T.N.K.和Saunders，J.R.，1983，出处同上；Maclnnes，J.I.和Rosendal，S.，1988，出处同上；Fedorka-Cray，P.J.等，1994，出处同上；Nielsen，R.，1979，出处同上；和Rosendal，S.等，1986，出处同上)。
有人建议把也许有助于交叉保护作用的毒力因子作为可能的候选疫苗，包括外毒素(Apx)(Nakai，T.等，1983，《美国兽医研究杂志》44：344-347；Frey，J.等，1993，《通用微生物学杂志》139：1723-1728；Fedorka-Cray，P.J.等，1993，《兽医微生物学》37：85-100)；荚膜抗原(Rosendal，S.等，1986，出处同上)；外膜蛋白质(OMP)(Denee，H.和Potter，A.，1989，《传染免疫》57：798-804；Niven，D.F.等，1989，《分子微生物学》3：1083-1089；Gonzalez，G.等，1990，《分子微生物学》4：1173-1179；Gerlach，G.F.等，1992，《传染免疫》60：3253-3261)；脂多糖(LPS)(Fenwick，B.W.和Osborn，B.，1986，《传染免疫》54：575-582)。不过，由这些组分诱导的交叉反应性/交叉保护作用方式没有覆盖所有十二种APP血清型。而且，用来自APP的分离的单独组分或单独组分的组合所进行的免疫法迄今为止未能给来自某些异源血清型感染带来保护作用(未出版的观察结果)。因此可以假定，由天然感染诱导的交叉保护性应答仅限于特定的血清型群。
另一种情况是，某些引起在天然感染后所观察到的交叉保护作用的抗原尚未被确定，这也是可能的。大多数关于APP抗原的研究都把焦点集中在对使用抗体在恢复期血清中检测到的免疫优势抗原所进行的特征描述上。这样一种方法未能鉴别出在初次应答对二次应答过程中所表现出来的抗体特异性之间可能存在的差异，也未能鉴别出感染部位中经第二次遭遇病原体而可能引起保护作用的优势特异性。
普遍接受的观点是，在初次感染过程中培养淋巴细胞，以便在二次暴露于病原体时，宿主能够更好地预防疾病(MacKay，C.R.，1993，《免疫学进展》53：217-240)。引起该活性的记忆细胞(有抗原体验的T淋巴细胞和B淋巴细胞)可持续存在较长时间阶段，并且能够在适当的后来的遭遇抗原之后再活化。与原初细胞相比，它们一般显示出更快速的应答时间、专门的组织定位和更有效的抗原识别与效应器功能(MacKay，C.R.，1993，出处同上；Linton，P.和Klinman，N.R.，1992，《Sem.Immun.》4：3-9；Meeusen，E.N.T.等，1991，《欧洲免疫学杂志》21：2269-2272)。
在二次应答的产生过程中，能够对特定抗原产生应答的前体细胞频率高于初次应答出的细胞。二次应答后，记忆细胞亚群的运输方式也不同于原初细胞。原初细胞相对均匀地移行至次生淋巴组织，但是它们返回非淋巴组织是不充分的。相反，记忆细胞显示出不均匀的运输方式，并且在某些情况下，移行目标限制为某些次生淋巴组织和非淋巴组织(MacKay，C.R.，1993，出处同上；Gray，D.，1993，《免疫学年刊》11：49-77；Picker，L.S.等，1993，《免疫学杂志》150：1122-1136)。对啮齿动物和绵羊进行的研究表明，来自肠的淋巴细胞优先移行回到肠，而从皮肤或***引流的细胞优先移行回到皮肤或***(Gray，D.，1993，出处同上；Picker，L.S.等，1993，出处同上)。因此，一旦再次遭遇病原体，对细胞介导的免疫性和抗体分泌特异的效应器细胞能够更有效地返回到感染部位和局部***(Meeusen E.N.T.等，1991，出处同上)。其结果是，在再次感染早期，浸润的淋巴细胞将快速增生，它们的特异性也将占主导地位。
一些研究人员在再次感染后立即从组织中回收局部B细胞和引流***，得到了特异性范围更窄的抗体(Meeusen，E.N.T.和Brandon，M.，1994，《免疫方法学杂志》172：71-76)。这些抗体已被成功地用于把可能的保护性抗原确定为几种病原体(Meeusen，E.N.T.和Brandon，M.，1994，出处同上；Meeusen，E.N.T.和Brandon，M.，1994，《欧洲免疫学杂志》24：469-474；Bowles，V.M.等，1995，《免疫学》84：669-674)。以下公开的发明以这种方法的改进为基础，其中，回收与局部记忆应答有关的抗体分泌细胞(ASC)探针，该应答是在同种与异种APP感染后引起的。异种感染后从支气管***(BLN)培养物中得到的抗体确认出四种先前未被确认的、存在于所有十二种APP血清型中的蛋白质。得到了每种蛋白质的部分氨基酸序列，用来产生PCR引物，可供鉴别五种新的APP蛋白质和编码这些蛋白质的多核苷酸分子。
本发明提供了五种新颖的从APP分离的小分子量蛋白质，本文分别称之为“Omp20”、“OmpW”、“Omp27”、“OmpA1”和“OmpA2”。这些“APP蛋白质”和编码这些蛋白质的多核苷酸分子既可用作保护猪抗APP疫苗中的抗原组分，也可用作诊断试剂，用来鉴别猪是否或者已经被APP感染，或者用来鉴别猪是否已经接种过本发明的疫苗。
Omp20的氨基酸序列是由pER416质粒的编码Omp20的ORF所编码的，该质粒存在于Pz416菌株(ATCC 98926)的宿主细胞中；它的推导氨基酸序列是以SEQ ID NO：2存在的，包含了从氨基酸残基1至19的信号序列。OmpW的氨基酸序列是由pER418质粒的编码OmpW的ORF所编码的，该质粒存在于Pz418菌株(ATCC 98928)的宿主细胞中；它的推导氨基酸序列是以SEQ ID NO：4存在的，包含了从氨基酸残基1至21的信号序列。Omp27的氨基酸序列是由pER417质粒的编码Omp27的ORF所编码的，该质粒存在于Pz417菌株(ATCC 98927)的宿主细胞中；它的推导氨基酸序列是以SEQ ID NO：6存在的，包含了从氨基酸残基1至27的信号序列。OmpA1的氨基酸序列是由pER419质粒的编码OmpA1的ORF所编码的，该质粒存在于Pz419菌株(ATCC 98929)的宿主细胞中；它的推导氨基酸序列是以SEQ ID NO：8存在的，包含了从氨基酸残基1至19的信号序列。OmpA2的氨基酸序列是由pER420质粒的编码OmpA2的ORF所编码的，该质粒存在于Pz420菌株(ATCC 98930)的宿主细胞中；它的推导氨基酸序列是以SEQ ID NO：10存在的，包含了从氨基酸残基1至19的信号序列。本发明提供了基本上为纯化形式的所有这些APP蛋白质。
本发明进一步提供了基本上为纯化的多肽，它们和本发明的任意上述APP蛋白质是同源的。本发明进一步提供了任意本发明的APP蛋白质或同源多肽的肽片段。本发明进一步提供了融合蛋白，它包含本发明的APP蛋白质、同源多肽、或肽片段，它们连接于载体或融合配偶体。本发明进一步提供了本发明APP蛋白质、同源多肽、肽片段、或融合蛋白的类似物和衍生物。
本发明进一步提供了分离的多核苷酸分子，包含一个编码APP蛋白质Omp20的核苷酸序列，其中具有或没有信号序列。在一种优选的实施方案中，本发明的分离的编码Omp20的多核苷酸分子包含从约nt 329至约nt 790的SEQ ID NO：1核苷酸序列。在更优选的实施方案中，本发明的分离的编码Omp20的多核苷酸分子包含从约nt 272至约nt 790的SEQ ID NO：1核苷酸序列。
本发明进一步提供了分离的多核苷酸分子，包含一个编码APP蛋白质OmpW的核苷酸序列，其中具有或没有信号序列。在一种优选的实施方案中，本发明的分离的编码OmpW的多核苷酸分子包含从约nt 439至约nt 1023的SEQ IDNO：3核苷酸序列。在更优选的实施方案中，本发明的分离的编码OmpW的多核苷酸分子包含从约nt 376至约nt 1023的SEQ ID NO：3核苷酸序列。
本发明进一步提供了分离的多核苷酸分子，包含一个编码APP蛋白质Omp27的核苷酸序列，其中具有或没有信号序列。在一种优选的实施方案中，本发明的分离的编码Omp27的多核苷酸分子包含从约nt 238至约nt 933的SEQ ID NO：5核苷酸序列。在更优选的实施方案中，本发明的分离的编码Omp27的多核苷酸分子包含从约nt 157至约nt 933的SEQ ID NO：5核苷酸序列。
本发明进一步提供了分离的多核苷酸分子，包含一个编码APP蛋白质OmpA1的核苷酸序列，其中具有或没有信号序列。在一种优选的实施方案中，本发明的分离的编码OmpA1的多核苷酸分子包含从约nt 671至约nt 1708的SEQ ID NO：7核苷酸序列。在更优选的实施方案中，本发明的分离的编码OmpA1的多核苷酸分子包含从约nt 614至约nt 1708的SEQ ID NO：7核苷酸序列。
本发明进一步提供了分离的多核苷酸分子，包含一个编码APP蛋白质OmpA2的核苷酸序列，其中具有或没有信号序列。在一种优选的实施方案中，本发明的分离的编码OmpA2的多核苷酸分子包含从约nt 254至约nt 1306的SEQ ID NO：9核苷酸序列。在更优选的实施方案中，本发明的分离的编码OmpA2的多核苷酸分子包含从约nt 197至约nt 1306的SEQ ID NO：9核苷酸序列。
本发明进一步提供了分离的多核苷酸分子，它和本发明的任意上述多核苷酸分子是同源的。本发明进一步提供了分离的多核苷酸分子，包含编码一种多肽的核苷酸序列，该多肽和本发明的任意APP蛋白质是同源的。本发明进一步提供了由一种核苷酸序列组成的分离的多核苷酸分子，该核苷酸序列是本发明的任意上述多核苷酸分子的实质性部分。在一种非限制性实施方案中，本发明多核苷酸分子的实质性部分编码了本发明APP蛋白质或同源多肽的肽片段。本发明进一步提供了多核苷酸分子，包含编码一种融合蛋白的核苷酸序列，该融合蛋白包含本发明的APP蛋白质、同源多肽、或肽片段，它们连接于载体或融合配偶体。
本发明进一步提供了可用作引物或诊断试剂的寡核苷酸分子，该引物用于扩增本发明的任意多核苷酸分子。这种寡核苷酸分子的特殊而非限制性实施方案包括具有以下核苷酸序列的寡核苷酸分子：该核苷酸序列选自由任意SEQ IDNOS：15-47和49-93组成的组。
本发明进一步提供了用于克隆和表达本发明的任意多核苷酸分子的组合物和方法，包括重组克隆载体和重组表达载体，它们包含了本发明的多核苷酸分子，还提供了用任意所述载体转化的宿主细胞和由此派生出的细胞系。
本发明进一步提供了由本发明多核苷酸分子所编码的重组表达的APP蛋白质、同源多肽、肽片段、或融合蛋白。
本发明进一步提供了用于保护猪抗APP的疫苗，包含免疫学上有效量的一种或几种本发明的抗原和兽医上可接受的载体或稀释剂，该抗原选自由本发明的APP蛋白质、同源多肽、肽片段、融合蛋白、类似物、衍生物、或多核苷酸分子组成的组，其能够诱导或有助于诱导猪的抗APP的保护性应答。本发明的疫苗可进一步包含佐剂或其他免疫调节组分。在一种非限制性实施方案中，本发明的疫苗可以是保护猪抗APP的联合疫苗，任选地还可以对抗一种或几种其他能够影响猪的疾病或病理学状态，该联合疫苗的第一种组分包含免疫学上有效量的一种或几种本发明的抗原，该抗原选自由本发明的APP蛋白质、同源多肽、肽片段、融合蛋白、类似物、衍生物、或多核苷酸分子组成的组，其能够诱导或有助于诱导猪的抗APP的保护性应答；第二种组分包含免疫学上有效量的另一种抗原，其能够诱导或有助于诱导对抗能够影响猪的疾病或病理学状态的保护性应答；该联合疫苗还包含兽医上可接受的载体或稀释剂。
本发明进一步提供了制备能够保护猪抗APP的疫苗的方法，该方法包括将免疫学上有效量的一种或几种本发明的抗原和兽医上可接受的载体或稀释剂混合成适合于对猪给药的剂型，该抗原选自由本发明的APP蛋白质、同源多肽、肽片段、融合蛋白、类似物、衍生物、或多核苷酸分子组成的组，其能够诱导或有助于诱导猪的抗APP的保护性应答。
本发明进一步提供了抗APP的猪疫苗接种的方法，该方法包括将本发明的疫苗对猪给药。
本发明进一步提供了用于抗APP的猪疫苗接种的疫苗试剂盒，该试剂盒包括一个容器，容器中含有免疫学上有效量的一种或几种本发明的抗原，该抗原选自由本发明的APP蛋白质、同源多肽、肽片段、融合蛋白、类似物、衍生物、或多核苷酸分子组成的组，其能够诱导或有助于诱导猪的抗APP的保护性应答。该试剂盒可以进一步包括第二种容器，容器中含有兽医上可接受的载体或稀释剂。
本发明进一步提供了与本发明APP蛋白质特异性结合的抗体。
本发明进一步提供了诊断试剂盒。在一种非限制性实施方案中，诊断试剂盒包括第一容器，容器中含有本发明的APP蛋白质、同源多肽、肽片段、融合蛋白、类似物、或衍生物，这些物质将与猪的直接抗APP蛋白质的抗体特异性结合；还包括第二容器，容器中含有针对猪的抗APP抗体的第二抗体。该第二抗体优选地含有可检测到的标记。这样一种诊断试剂盒可用于检测当前或者已经被APP感染的猪，或可用于检测由于接种本发明的疫苗而发生血清转变的猪。在另一种非限制性实施方案中，该诊断试剂盒包括第一容器，容器中含有与本发明APP蛋白质结合的初级抗体；还包括第二容器，容器中含有第二抗体，该第二抗体与APP蛋白质上不同的表位结合，或者与初级抗体结合。第二抗体优选地含有可检测到的标记。在另一种非限制性实施方案中，诊断试剂盒包括一个容器，容器中含有本发明的多核苷酸分子或寡核苷酸分子，可用于特异性地扩增本发明APP特异的多核苷酸分子。后两种诊断试剂盒可用于检测当前被APP感染的猪。
图1：来自803号猪的(a)血清和(b)支气管***(BLN)组织外植体上清液中存在的抗体的蛋白质印迹分析，该动物用APP血清型5感染过，再用APP血清型7异种感染。培养24或48小时后收集的所有BLN组织外植体上清液都含有特异性识别APP蛋白质的抗体。来自BLN组织外植体上清液的抗体显出了几种存在于APP血清型1、5和7中的小分子量蛋白质。
图2：来自803号猪的BLN组织外植体上清液中存在的抗体交叉反应性的蛋白质印迹分析，该抗体拮抗来自所有十二种不同的APP血清型的全部细菌细胞抗原，分析结果证明，在所有十二种APP血清型中存在至少三种被由异种再感染诱发的抗体识别的小分子量蛋白质。特定BLN上清液中存在的抗体也识别了其他蛋白质带。
图3：证明来自803号猪的BLN组织外植体上清液中存在的抗体的反应性的蛋白质印迹分析，该抗体拮抗小分子量蛋白质的反应性局限于细胞沉淀(细胞)中存在的蛋白质，而不是细菌细胞上清液(上清液)中存在的蛋白质。
图4：来自803号猪的(a)BLN组织外植体上清液和(b)血清中的抗体的反应性的蛋白质印迹分析，该抗体拮抗用连续流动电泳法从APP血清型7中提纯的蛋白质。用这种操作步骤鉴别了四条蛋白质带，其分子量分别为约19-20、约23、约27和约29kDa。
图5：APP OmpA1和APP OmpA2蛋白质的推导氨基酸序列的排列。这两种蛋白质的氨基酸一致性为73.1％。
图6：来自霍乱弧菌的OmpW蛋白质和来自APP的OmpW蛋白质的排列。这两种蛋白质的氨基酸一致性为44.9％。
5.1.被多重APP血清型共享的新颖蛋白质
本发明是基于五种新颖的来自APP的小分子量蛋白质(以下称之为“APP蛋白质”)的发现而作出的。这些APP蛋白质在本文中分别表示为“Omp20”、“OmpW”、“Omp27”、“OmpA1和“OmpA2”。
Omp20的氨基酸序列是由pER416质粒的编码Omp20的ORF所编码的，该质粒存在于Pz416菌株(ATCC 98926)的宿主细胞中。Omp20的推导氨基酸序列是以SEQ ID NO：2存在的。SEQ ID NO：2中所示蛋白质的前19个氨基酸代表一个信号序列，本发明涵盖了仅具有SEQ ID NO：2的氨基酸残基20至172(即，缺少信号序列)的Omp20蛋白质和具有SEQ ID NO：2序列(即，包括信号序列)的Omp20蛋白质。本发明因此提供了基本上为纯化的蛋白质，它包含SEQ IDNO：2的约氨基酸残基20至约氨基酸残基172的氨基酸序列。本发明进一步提供了基本上为纯化的蛋白质，它包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
OmpW的氨基酸序列是由pER418质粒的编码OmpW的ORF所编码的，该质粒存在于Pz418菌株(ATCC 98928)的宿主细胞中。OmpW的推导氨基酸序列是以SEQ ID NO：4存在的。SEQ ID NO：4中所示蛋白质的前21个氨基酸代表一个信号序列，本发明涵盖了仅具有SEQ ID NO：4的氨基酸残基22至215(即，缺少信号序列)的OmpW蛋白质和具有SEQ ID NO：4序列(即，包括信号序列)的OmpW蛋白质。本发明因此提供了基本上为纯化的蛋白质，它包含SEQ ID NO：4的约氨基酸残基22至约氨基酸残基215的氨基酸序列。本发明进一步提供了基本上为纯化的蛋白质，它包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
Omp27的氨基酸序列是由pER417质粒的编码Omp27的ORF所编码的，该质粒存在于Pz417菌株(ATCC 98927)的宿主细胞中。Omp27的推导氨基酸序列是以SEQ ID NO：6存在的。SEQ ID NO：6中所示蛋白质的前27个氨基酸代表一个信号序列，本发明涵盖了仅具有SEQ ID NO：6的氨基酸残基28至258(即，缺少信号序列)的Omp27蛋白质和具有SEQ ID NO：6序列(即，包括信号序列)的Omp27蛋白质。本发明因此提供了基本上为纯化的蛋白质，它包含SEQ IDNO：6的约氨基酸残基28至约氨基酸残基258的氨基酸序列。本发明进一步提供了基本上为纯化的蛋白质，它包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
OmpA1的氨基酸序列是由pER419质粒的编码OmpA1的ORF所编码的，该质粒存在于Pz419菌株(ATCC 98929)的宿主细胞中。OmpA1的推导氨基酸序列是以SEQ ID NO：8存在的。SEQ ID NO：8中所示蛋白质的前19个氨基酸代表一个信号序列，本发明涵盖了仅具有SEQ ID NO：8的氨基酸残基20至364(即，缺少信号序列)的OmpA1蛋白质和具有SEQ ID NO：8序列(即，包括信号序列)的OmpA1蛋白质。本发明因此提供了基本上为纯化的蛋白质，它包含SEQ IDNO：8的约氨基酸残基20至约氨基酸残基364的氨基酸序列。本发明进一步提供了基本上为纯化的蛋白质，它包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
OmpA2的氨基酸序列是由pER420质粒的编码OmpA2的ORF所编码的，该质粒存在于Pz420菌株(ATCC 98930)的宿主细胞中。OmpA2的推导氨基酸序列是以SEQ ID NO：10存在的。SEQ ID NO：10中所示蛋白质的前19个氨基酸代表一个信号序列，本发明涵盖了仅具有SEQ ID NO：10的氨基酸残基20至369(即，缺少信号序列)的OmpA2蛋白质和具有SEQ ID NO：10序列(即，包括信号序列)的OmpA2蛋白质。本发明因此提供了基本上为纯化的蛋白质，它包含SEQ ID NO：10的约氨基酸残基20至约氨基酸残基369的氨基酸序列。本发明进一步提供了基本上为纯化的蛋白质，它包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
本发明的APP蛋白质，即Omp20、OmpW、Omp27、OmpA1和OmpA2的分子量，基于它们的电泳移动率，分别为约19-20、约23、约27、约29和约29kDa，基于它们不含信号序列的推导氨基酸序列，分别为约20、约23、约27、约35和约35kDa。
本发明进一步提供了与本发明APP蛋白质同源的多肽。本文针对多肽使用的术语“同源”指其他的多肽，它所具有的氨基酸序列选自由SEQ ID NOS：2、4、6、8和10组成的氨基酸序列组，或具有相同的氨基酸序列、但没有其天然的信号序列，其中一种或几种氨基酸残基已经被一个不同的氨基酸残基保守置换，其中用任何标准的氨基酸序列分析算法(例如GENBANK的BlastP算法之一)测定的结果表明，该同源多肽所具有的氨基酸序列具有约70％、更优选地约80％、最优选地约90％的序列一致性，术语“同源”还指这样的多肽，它所具有的氨基酸序列选自由SEQ ID NOS：2、4、6、8和10组成的氨基酸序列组，其中所得同源多肽可用于实施本发明。保守氨基酸置换是本领域所熟知的。进行这种置换的规则尤其包括Dayhof，M.D.所述，见1978，《国家生物医学研究基金》，华盛顿特区，卷5增刊3。更确切地说，保守氨基酸置换一般是在一族具有酸性、极性或侧链大小相关的氨基酸内发生的。基因编码的氨基酸一般分为四组：(1)酸性的＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性均＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性的＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电极性的＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸也共同被分入芳族氨基酸类。任意特定组内的一种或几种取代一般对多肽的功能或免疫原性没有显著影响，例如用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、或用谷氨酸取代天冬氨酸、或用色氨酸取代苏氨酸、或用结构相关的氨基酸残基取代任意其他的氨基酸残基，例如具有相似酸性、极性、侧链大小或类似其组合的氨基酸残基。
正如本文所用，多肽是“可用于实施本发明的”，其中该多肽：(a)是免疫原性的，也就是说，能够用在疫苗组合物中，既可以单用来诱导猪抗APP的保护性应答，也可以与本发明的其他抗原结合使用，引发对猪抗APP的保护性应答的诱导作用；或(b)当对许多种类的哺乳动物给药后，能够用来诱导APP特异的抗体产生，该抗体可用作诊断试剂；或(c)能够用作诊断试剂，检测被APP感染或接种本发明疫苗的猪的血液或血清样本中抗APP抗体的存在与否。
本发明进一步提供了本发明APP蛋白质或同源多肽的肽片段。本文所用的“肽片段”指由对应的全长APP蛋白质的不完整氨基酸序列组成的多肽，其中具有或没有信号序列，或其同源多肽，但是包含该氨基酸序列的至少约10个、更优选地至少约20个、最优选地至少约30个氨基酸残基的亚序列，该肽片段可用于实施本发明，其有用性如上述多肽所定义。本发明的肽片段能够包含一个以上的本发明全长APP蛋白质或同源多肽的亚序列。例如，可以把两个或多个来自全长APP蛋白质或同源多肽的不同亚序列集合在一起，并使它们在肽片段中彼此邻接，而它们在APP蛋白质或同源多肽中是不邻接的。在一种优选的实施方案中，本发明的肽片段包含一个或几个亚序列，它们代表一个或几个APP蛋白质或同源多肽的表位、或一个表位的多个复本，并且能够产生拮抗它们的抗体。
在非限制性实施方案中，本发明提供了本发明APP蛋白质的肽片段，该肽片段包含APP蛋白质的天然信号序列。在一种优选的实施方案中，该肽片段由氨基酸序列组成，该序列选自由下列序列组成的组：SEQ ID NO：2(Omp20)的约氨基酸残基1至约氨基酸残基19、SEQ ID NO：4(OmpW)的约氨基酸残基1至约氨基酸残基21、SEQ ID NO：6(Omp27)的约氨基酸残基1至约氨基酸残基27、SEQ ID NO：8(OmpA1)的约氨基酸残基1至约氨基酸残基19和SEQ ID NO：10(OmpA2)的约氨基酸残基1至约氨基酸残基19。这样的信号序列、以及编码它们的多核苷酸分子可用于多种目的，包括指导APP或其他细菌宿主细胞中表达的重组蛋白质的细胞运输，或者作为诊断探针，用于检测感染动物体液或组织样本中APP特异的多核苷酸分子。
本发明进一步提供了全长APP蛋白质或同源多肽，其中它们的亚序列以不同于天然分子的彼此相对顺序排列，目的在于增加、改变或改进多肽的抗原性。
本文所用的术语“抗原”、“抗原的”等等指的是含有一个或几个表位的分子，该表位刺激宿主的免疫***，以产生体液和/或细胞抗原特异的应答。该术语也可用来与“免疫原”互换。本文所用的“表位”或“表位区域”指的是特异性抗体分子与之结合的抗原或半抗原上的部位。该术语也可用来与“抗原决定簇”互换。
本发明进一步提供了融合蛋白，包含本发明的具有或没有其天然信号序列的APP蛋白质配偶体、它的同源多肽、或肽片段，它们连接成载体或融合配偶体，该融合蛋白可用于实施本发明，其有用性如上述多肽所定义。参见下面第5.4.1部分融合配偶体的例子。融合蛋白是有用的，其原因有多种，包括提高重组表达的APP蛋白质的稳定性，可用作APP疫苗中的抗原组分，用来产生拮抗特定APP蛋白质配偶体的抗血清、研究APP蛋白质配偶体的生物化学性质、改造具有不同或改进的抗原性质的APP蛋白质、充当诊断试剂、或者帮助鉴别或纯化被表达的APP蛋白质配偶体，如下面第5.4.1部分所述。
利用标准工艺，能够将本发明的融合蛋白进一步改造为含有特异的蛋白酶切割位点，以便通过特异性蛋白酶的处理，能将特定的APP蛋白质配偶体从载体或融合配偶体中释放出来。例如，本发明的融合蛋白尤其可包含凝血酶或Xa因子切割位点。
本发明进一步提供了本发明的APP蛋白质、同源多肽、肽片段或融合蛋白的类似物和衍生物，其中该类似物和衍生物可用于实施本发明，其有用性如上述多肽所定义。制备类似物的操作既可以在基因水平上进行，也可以在蛋白质水平上进行，或者二者皆有，以改进或改变用来制备类似物的特定多肽的生物学或免疫学性质。例如，在基因水平上，编码本发明APP蛋白质的克隆DNA分子可以通过一种或几种已知方法进行修饰，以编码该蛋白质的类似物。这样的修饰包括但不限于内切核酸酶消化，和产生或破坏翻译、起始或终止序列的突变、或在编码区域产生变异的突变，或它们的组合。这样的技术尤其描述在Maniatis等，1989，《分子克隆，实验室手册》冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Ausubel等，1989，《分子生物学现状》Greene Publishing Associates和Wiley Interscience，纽约；Sambrook等，1989，《分子克隆：实验室手册》第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Innis等(eds)，1995，《PCR战略》Academic Press，Inc.，San Diego；Erlich(ed)，1992，《PCR技术》牛津大学出版社，纽约，全部结合在此作为参考。
另一种选择是，或者另外，本发明的类似物可以通过在蛋白质水平上将本发明APP蛋白质或其他多肽的进行修饰而制备。可以利用已知工艺进行蛋白质的一种或几种化学修饰，包括但不限于一种或几种下列方法：用相应的D氨基酸、氨基酸类似物、或氨基酸模拟物取代蛋白质的一个或几个L氨基酸，目的在于生成-例如-肼基甲酸盐或三级中心；或特异性化学修饰，例如用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶或V8蛋白酶进行蛋白质裂解作用，或用NaBH4或溴化氰处理，或乙酰化、甲酰化、氧化或还原作用等。
本发明的APP蛋白质或其他多肽可通过与一种或几种化学基团的偶联进行衍生，化学基团尤其包括但不限于乙酰基、硫桥连基、糖基、脂质、和磷酸盐，和/或本发明的第二种APP蛋白质或其他多肽、或另一种蛋白质，例如血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、或商业上活化的BSA，或聚氨基酸(例如聚赖氨酸)、或聚多糖(例如琼脂糖凝胶、琼脂糖、或改性或未改性的纤维素)。这样的偶联优选为共价连接方式，连接部位在氨基酸侧链和/或APP蛋白质的N端或C端。进行这种偶联反应的方法是蛋白质化学领域众所熟知的。
可用于实施权利要求的发明的衍生物也包括这样的衍生物，其中有一种水溶性聚合物、例如聚乙二醇，它与本发明APP蛋白质或其他多肽偶联，或与其类似物偶联，从而提供附加的所需特性，而同时至少在部分程度上保留或提高了APP蛋白质的免疫原性。这些附加的所需特性例如包括在水溶液中的溶解度增加、储藏稳定性增加、抗蛋白降解作用增加、和体内半衰期增加。适合与本发明APP蛋白质或其他多肽偶联的水溶性聚合物包括但不限于聚乙二醇均聚物、聚丙二醇均聚物、乙二醇与丙二醇的共聚物，其中所述的均聚物和共聚物在具有烷基的一端是未取代的或取代的，还包括聚氧乙基化的多元醇、聚乙烯醇、多糖、聚乙烯基乙基醚、和α，β-聚[2-羟乙基]-DL-天冬酰胺。聚乙二醇是特别优选的。制备水溶性聚合物与多肽的偶联物的方法是本领域已知的，尤其如下所述：美国专利3,788,948；美国专利3,960,830；美国专利4,002,531；美国专利4,055,635；美国专利4,179,337；美国专利4,261,973；美国专利4,412,989；美国专利4,414,147；美国专利4,415,665；美国专利4,609,546；美国专利4,732,863；美国专利4,745,180；欧洲专利(EP)152,847；EP98,110；和日本专利(JP)5,792,435，这些专利结合在此作为参考。
以下所有关于“APP蛋白质”等的说明都意在包括本发明的APP蛋白质、同源多肽、肽片段、融合蛋白、类似物和衍生物，除非另有指示，这些术语如上所定义。5.2.  编码新颖的APP蛋白质的多核苷酸分子
本发明进一步提供了分离的多核苷酸分子，包含编码APP蛋白质的核苷酸序列。本文所用的术语“多核苷酸分子”、“多核苷酸序列”、“编码序列”、“可读框(ORF)”等等，意在指代DNA和RNA分子，它们既可以是单链的，也可以是双链的；这些术语可以包括一种或几种原核细胞序列、cDNA序列、基因组DNA序列(包括外显子和内含子)、或化学合成的DNA与RNA序列；这些术语可以包括有义链和反义链。本文所用的术语“ORF”指的是编码本发明特定APP蛋白质、而不***任何终止密码子所需的最小核苷酸序列。多核苷酸编码序列的边界一般是由5’(氨基)端上起始密码子和3’(羧基)端上翻译终止密码子的出现来决定的。
下文公开的多核苷酸分子和寡核苷酸分子的产生和操作是在本领域技术人员知识范围内的，并且可以按照所述重组技术进行，尤其如下所述：Maniatis等，1989，出处同上；Ausubel等，1989，出处同上；Sambrook等，1989，出处同上；Innis等，1995，出处同上；和Erlich，1992，出处同上。5.2.1.编码Omp20的多核苷酸分子
除非另有指示，以下涉及来自SEQ ID NO：1的核苷酸序列以及其被选择和实质性的部分的内容也用来指pER416质粒对应的涉及Omp20的核苷酸序列，该质粒存在于Pz416菌株(ATCC 98926)的宿主细胞中。另外，除非另有指示，以下涉及SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列和其肽片段的内容也用来指被pER416质粒的涉及Omp20的核苷酸序列所编码的对应氨基酸序列。
本发明提供了分离的多核苷酸分子，包含编码APP蛋白质、即Omp20的核苷酸序列，具有或没有信号序列。在一种优选的实施方案中，本发明的分离的编码Omp20的多核苷酸分子包含SEQ ID NO：1从约nt 329至约nt 790的核苷酸序列。在更优选的实施方案中，本发明的分离的编码Omp20的多核苷酸分子包含SEQ ID NO：1从约nt 272至约nt 790的核苷酸序列。在非限制性实施方案中，本发明的分离的编码Omp20的多核苷酸分子包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
本发明进一步提供了分离的多核苷酸分子，它与本发明的编码APP Omp20的多核苷酸分子是同源的。用来指编码Omp20的多核苷酸分子的术语“同源”指具有这样一种核苷酸序列的多核苷酸分子：(a)它编码与SEQ ID NO：1从nt329至nt 790的核苷酸序列相同的氨基酸序列，但是根据遗传密码的简并性，它包括一种或几种对该核苷酸序列的沉默变化；或(b)在适当严格的条件下，它可与多核苷酸分子的互补体杂交，该多核苷酸分子具有编码SEQ ID NO：2的氨基酸残基20至172的核苷酸序列，也就是说，在65℃的0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中与滤膜结合的DNA杂交，并在42℃的0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤(见Ausubel等(编)，1989，《分子生物学现状》第1卷，Green Publishing Associates，Inc.，以及John Wiley和Sons，Inc.，纽约，p.2.10.3)，且可用于实施本发明。在一种优选的实施方案中，在非常严格的条件下，同源多核苷酸分子可与多核苷酸分子的互补体杂交，该多核苷酸分子具有编码SEQ ID NO：2的氨基酸残基20至172的核苷酸序列，也就是说，在65℃的0.5M NaHPO4、7％ SDS、1mM EDTA中与滤膜结合的DNA杂交，并在68℃的0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤(Ausubel等，1989，出处同上)，可用于实施本发明。在更优选的实施方案中，同源多核苷酸分子在非常严格的条件下可与多核苷酸分子的互补体杂交，该多核苷酸分子由SEQ ID NO：1从nt 329至nt 790的核苷酸序列组成，可用于实施本发明。
本文所用的多核苷酸分子是“可用于实施本发明”的，其中：(a)该多核苷酸分子编码可被用在疫苗组合物中的多肽，该多肽本身或结合一种或几种其他抗原诱导猪抗APP的保护性应答；或者(b)该多核苷酸分子可被直接用在DNA疫苗组合物中，本身或结合一种或几种其他多核苷酸分子或一种或几种其他抗原诱导猪抗APP的保护性应答；或者(c)该多核苷酸分子编码能在对许多种类的哺乳动物给药后用来诱导APP特异的抗体产生的多肽，该抗体可用作诊断试剂；或者(d)该多核苷酸分子编码可被用作诊断试剂的多肽，以检测猪血液或血清样本中APP特异的抗体的存在；或者(e)该多核苷酸分子可被用作诊断试剂，以检测APP感染的猪体液或组织样本中APP特异的多核苷酸分子的存在。
本发明进一步提供了分离的多核苷酸分子，它包含编码与本发明Omp20蛋白质同源的多肽的核苷酸序列，“同源多肽”如上第5.1部分所定义。
本发明进一步提供了由核苷酸序列组成的多核苷酸分子，该核苷酸序列是任意上述本发明涉及Omp20的多核苷酸分子的实质性部分。本文所用的涉及Omp20的多核苷酸分子的“实质性部分”指这样一种多核苷酸分子，它由特定的涉及Omp20的全长多核苷酸分子的不完整核苷酸序列组成，但是包含该特定的涉及Omp20的全长多核苷酸分子的至少约10％、更优选地至少约20％的核苷酸序列，可用于实施本发明，其“有用性”如上述多核苷酸分子所定义。在非限制性实施方案中，涉及Omp20的多核苷酸分子的实质性部分编码任意上述本发明的涉及Omp20的蛋白质或多肽的肽片段，术语“肽片段”如上所定义。
本发明进一步提供了包含核苷酸序列的多核苷酸分子，该核苷酸序列编码SEQ ID NO：2从约氨基酸残基1至约氨基酸残基19的天然Omp20信号序列。在一种优选而非限制性实施方案中，编码Omp20信号序列的多核苷酸分子包含SEQ ID NO：1的约nt 272至约nt 328。
本发明进一步提供了包含核苷酸序列的多核苷酸分子，该核苷酸序列编码一种融合蛋白，其中包含Omp20蛋白质、同源多肽、或肽片段，融合为载体或融合配偶体。5.2.2.编码OmpW的多核苷酸分子
除非另有指示，以下涉及来自SEQ ID NO：3的核苷酸序列以及其被选择和实质性的部分的内容也用来指pER418质粒对应的涉及OmpW的核苷酸序列，该质粒存在于Pz418菌株(ATCC 98928)的宿主细胞中。另外，除非另有指示，以下涉及SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列和其肽片段的内容也用来指被pER418质粒的涉及OmpW的核苷酸序列所编码的对应氨基酸序列。
本发明提供了分离的多核苷酸分子，包含编码APP蛋白质、即OmpW的核苷酸序列，具有或没有信号序列。在一种优选的实施方案中，本发明的分离的编码OmpW的多核苷酸分子包含SEQ ID NO：3从约nt 439至约nt 1023的核苷酸序列。在更优选的实施方案中，本发明的分离的编码OmpW的多核苷酸分子包含SEQ ID NO：3从约nt 376至约nt 1023的核苷酸序列。在非限制性实施方案中，本发明的分离的编码OmpW的多核苷酸分子包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
本发明进一步提供了分离的多核苷酸分子，它与本发明的编码APP OmpW的多核苷酸分子是同源的。用来指编码OmpW的多核苷酸分子的术语“同源”指具有这样一种核苷酸序列的多核苷酸分子：(a)它编码与SEQ ID NO：3从nt439至nt 1023的核苷酸序列相同的氨基酸序列，但是根据遗传密码的简并性，它包括一种或几种对该核苷酸序列的沉默变化；或(b)在适当严格的条件下，它可与多核苷酸分子的互补体杂交，该多核苷酸分子具有编码SEQ ID NO：4的氨基酸残基22至215的核苷酸序列，也就是说，在65℃的0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中与滤膜结合的DNA杂交，并在42℃的0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤(Ausubel等，1989，出处同上)，且可用于实施本发明，其“有用性”如上述多核苷酸分子所定义。在一种优选的实施方案中，在非常严格的条件下，同源多核苷酸分子可与多核苷酸分子的互补体杂交，该多核苷酸分子具有编码SEQ ID NO：4的氨基酸残基22至215的核苷酸序列，也就是说，在65℃的0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中与滤膜结合的DNA杂交，并在68℃的0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤(Ausubel等，1989，出处同上)，且可用于实施本发明。在更优选的实施方案中，同源多核苷酸分子在非常严格的条件下可与多核苷酸分子的互补体杂交，该多核苷酸分子由SEQ ID NO：3从nt 439至nt1023的核苷酸序列组成，且可用于实施本发明。
本发明进一步提供了分离的多核苷酸分子，包含编码与本发明OmpW蛋白质同源的多肽的核苷酸序列，“同源多肽”如上所定义。
本发明进一步提供了由核苷酸序列组成的多核苷酸分子，该核苷酸序列是任意上述本发明涉及OmpW的多核苷酸分子的实质性部分。本文所用的涉及OmpW的多核苷酸分子的“实质性部分”指这样一种多核苷酸分子，它由特定的涉及OmpW的全长多核苷酸分子的不完整核苷酸序列组成，但是包含该特定的涉及OmpW的全长多核苷酸分子的至少约10％、更优选地至少约20％的核苷酸序列，可用于实施本发明，其“有用性”如上述多核苷酸分子所定义。在非限制性实施方案中，涉及OmpW的多核苷酸分子的实质性部分编码任意上述本发明的涉及OmpW的蛋白质或多肽的肽片段，术语“肽片段”如上所定义。
本发明进一步提供了包含核苷酸序列的多核苷酸分子，该核苷酸序列编码SEQ ID NO：4从约氨基酸残基1至约氨基酸残基21的天然OmpW信号序列。在一种优选而非限制性实施方案中，编码OmpW信号序列的多核苷酸分子包含SEQID NO：3的约nt 376至约nt 438。
本发明进一步提供了包含核苷酸序列的多核苷酸分子，该核苷酸序列编码一种融合蛋白，其中包含OmpW蛋白质、同源多肽、或肽片段，融合为载体或融合配偶体。5.2.3.编码Omp27的多核苷酸分子
除非另有指示，以下涉及来自SEQ ID NO：5的核苷酸序列以及其被选择和实质性的部分的内容也用来指pER417质粒对应的涉及Omp27的核苷酸序列，该质粒存在于Pz417菌株(ATCC 98927)的宿主细胞中。另外，除非另有指示，以下涉及SEQ ID NO：6中所示氨基酸序列和其肽片段的内容也用来指被pER417质粒的涉及Omp27的核苷酸序列所编码的对应氨基酸序列。
本发明提供了分离的多核苷酸分子，包含编码APP蛋白质、即Omp27的核苷酸序列，具有或没有信号序列。在一种优选的实施方案中，本发明的分离的编码Omp27的多核苷酸分子包含SEQ ID NO：5从约nt 238至约nt 933的核苷酸序列。在更优选的实施方案中，本发明的分离的编码Omp27的多核苷酸分子包含SEQ ID NO：5从约nt 157至约nt 933的核苷酸序列。在非限制性实施方案中，本发明的分离的编码Omp27的多核苷酸分子包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列。
本发明进一步提供了分离的多核苷酸分子，它与本发明的编码APP Omp27的多核苷酸分子是同源的。用来指编码Omp27的多核苷酸分子的术语“同源”指具有这样一种核苷酸序列的多核苷酸分子：(a)它编码与SEQ ID NO：5从nt238至nt 933的核苷酸序列相同的氨基酸序列，但是根据遗传密码的简并性，它包括一种或几种对该核苷酸序列的沉默变化；或(b)在适当严格的条件下，它可与多核苷酸分子的互补体杂交，该多核苷酸分子具有编码SEQ ID NO：6的氨基酸残基28至258的核苷酸序列，也就是说，在65℃的0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中与滤膜结合的DNA杂交，并在42℃的0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤(Ausubel等，1989，出处同上)，且可用于实施本发明，其“有用性”如上述多核苷酸分子所定义。在一种优选的实施方案中，在非常严格的条件下，同源多核苷酸分子可与多核苷酸分子的互补体杂交，该多核苷酸分子具有编码SEQ ID NO：6的氨基酸残基28至258的核苷酸序列，也就是说，在65℃的0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中与滤膜结合的DNA杂交，并在68℃的0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤(Ausubel等，1989，出处同上)，且可用于实施本发明。在更优选的实施方案中，同源多核苷酸分子在非常严格的条件下可与多核苷酸分子的互补体杂交，该多核苷酸分子由SEQ ID NO：5从nt 238至nt933的核苷酸序列组成，且可用于实施本发明。
本发明进一步提供了分离的多核苷酸分子，包含编码与本发明Omp27蛋白质同源的多肽的核苷酸序列，“同源多肽”如上所定义。
本发明进一步提供了由核苷酸序列组成的多核苷酸分子，该核苷酸序列是任意上述本发明涉及Omp27的多核苷酸分子的实质性部分。本文所用的涉及Omp27的多核苷酸分子的“实质性部分”指这样一种多核苷酸分子，它由特定的涉及Omp27的全长多核苷酸分子的不完整核苷酸序列组成，但是包含该特定的涉及Omp27的全长多核苷酸分子的至少约10％、更优选地至少约20％的核苷酸序列，可用于实施本发明，其“有用性”如上述多核苷酸分子所定义。在非限制性实施方案中，涉及Omp27的多核苷酸分子的实质性部分编码任意上述本发明的涉及Omp27的蛋白质或多肽的肽片段，术语“肽片段”如上所定义。
本发明进一步提供了包含核苷酸序列的多核苷酸分子，该核苷酸序列编码SEQ ID NO：6从约氨基酸残基1至约氨基酸残基27的天然Omp27信号序列。在一种优选而非限制性实施方案中，编码Omp27信号序列的多核苷酸分子包含SEQ ID NO：5的约nt 157至约nt 237。
本发明进一步提供了包含核苷酸序列的多核苷酸分子，该核苷酸序列编码一种融合蛋白，其中包含Omp27蛋白质、同源多肽、或肽片段，融合为载体或融合配偶体。5.2.4.编码OmpA1的多核苷酸分子
除非另有指示，以下涉及来自SEQ ID NO：7的核苷酸序列以及其被选择和实质性的部分的内容也用来指pER419质粒对应的涉及OmpA1的核苷酸序列，该质粒存在于Pz419菌株(ATCC 98929)的宿主细胞中。另外，除非另有指示，以下涉及SEQ ID NO：8中所示氨基酸序列和其肽片段的内容也用来指被pER419质粒的涉及OmpA1的核苷酸序列所编码的对应氨基酸序列。
本发明提供了分离的多核苷酸分子，包含编码APP蛋白质、即OmpA1的核苷酸序列，具有或没有信号序列。在一种优选的实施方案中，本发明的分离的编码OmpA1的多核苷酸分子包含SEQ ID NO：7从约nt 671至约nt 1708的核苷酸序列。在更优选的实施方案中，本发明的分离的编码OmpA1的多核苷酸分子包含SEQ ID NO：7从约nt 614至约nt 1708的核苷酸序列。在非限制性实施方案中，本发明的分离的编码OmpA1的多核苷酸分子包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列。
本发明进一步提供了分离的多核苷酸分子，它与本发明的编码APP OmpA1的多核苷酸分子是同源的。用来指编码OmpA1的多核苷酸分子的术语“同源”指具有这样一种核苷酸序列的多核苷酸分子：(a)它编码与SEQ ID NO：7从nt671至nt 1708的核苷酸序列相同的氨基酸序列，但是根据遗传密码的简并性，它包括一种或几种对该核苷酸序列的沉默变化；或(b)在适当严格的条件下，它可与多核苷酸分子的互补体杂交，该多核苷酸分子具有编码SEQ ID NO：8的氨基酸残基20至364的核苷酸序列，也就是说，在65℃的0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中与滤膜结合的DNA杂交，并在42℃的0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤(Ausubel等，1989，出处同上)，且可用于实施本发明，其“有用性”如上述多核苷酸分子所定义。在一种优选的实施方案中，在非常严格的条件下，同源多核苷酸分子可与多核苷酸分子的互补体杂交，该多核苷酸分子具有编码SEQ ID NO：8的氨基酸残基20至364的核苷酸序列，也就是说，在65℃的0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中为滤膜结合的DNA杂交，并在68℃的0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤与(Ausubel等，1989，出处同上)，且可用于实施本发明。在更优选的实施方案中，同源多核苷酸分子在非常严格的条件下可与多核苷酸分子的互补体杂交，该多核苷酸分子由SEQ ID NO：7从nt 671至nt 1708的核苷酸序列组成，且可用于实施本发明。
本发明进一步提供了分离的多核苷酸分子，包含编码与本发明OmpA1蛋白质同源的多肽的核苷酸序列，“同源多肽”如上所定义。
本发明进一步提供了由核苷酸序列组成的多核苷酸分子，该核苷酸序列是任意上述本发明涉及OmpA1的多核苷酸分子的实质性部分。本文所用的涉及OmpA1的多核苷酸分子的“实质性部分”指这样一种多核苷酸分子，它由特定的涉及OmpA1的全长多核苷酸分子的不完整核苷酸序列组成，但是包含该特定的涉及OmpA1的全长多核苷酸分子的至少约10％、更优选地至少约20％的核苷酸序列，可用于实施本发明，其“有用性”如上述多核苷酸分子所定义。在非限制性实施方案中，涉及OmpA1的多核苷酸分子的实质性部分编码任意上述本发明的涉及OmpA1的蛋白质或多肽的肽片段，术语“肽片段”如上所定义。
本发明进一步提供了包含核苷酸序列的多核苷酸分子，该核苷酸序列编码SEQ ID NO：8从约氨基酸残基1至约氨基酸残基19的天然OmpA1信号序列。在一种优选而非限制性实施方案中，编码OmpA1信号序列的多核苷酸分子包含SEQ ID NO：7的约nt 614至约nt 670。
本发明进一步提供了包含核苷酸序列的多核苷酸分子，该核苷酸序列编码一种融合蛋白，其中包含OmpA1蛋白质、同源多肽、或肽片段，融合为载体或融合配偶体。5.2.5.编码OmpA2的多核苷酸分子
除非另有指示，以下涉及来自SEQ ID NO：9的核苷酸序列以及其被选择和实质性的部分的内容也用来指pER420质粒对应的涉及OmpA2的核苷酸序列，该质粒存在于Pz420菌株(ATCC 98930)的宿主细胞中。另外，除非另有指示，以下涉及SEQ ID NO：10中所示氨基酸序列和其肽片段的内容也用来指被pER420质粒的涉及OmpA2的核苷酸序列所编码的对应氨基酸序列。
本发明提供了分离的多核苷酸分子，包含编码APP蛋白质、即OmpA2的核苷酸序列，具有或没有信号序列。在一种优选的实施方案中，本发明的分离的编码OmpA2的多核苷酸分子包含SEQ ID NO：9从约nt 254至约nt 1306的核苷酸序列。在更优选的实施方案中，本发明的分离的编码OmpA2的多核苷酸分子包含SEQ ID NO：9从约nt 197至约nt 1306的核苷酸序列。在非限制性实施方案中，本发明的分离的编码OmpA2的多核苷酸分子包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列。
本发明进一步提供了分离的多核苷酸分子，它与本发明的编码APP OmpA2的多核苷酸分子是同源的。用来指编码OmpA2的多核苷酸分子的术语“同源”指具有这样一种核苷酸序列的多核苷酸分子：(a)它编码与SEQ ID NO：9从nt254至nt 1306的核苷酸序列相同的氨基酸序列，但是根据遗传密码的简并性，它包括一种或几种对该核苷酸序列的沉默变化；或(b)在适当严格的条件下，它可与多核苷酸分子的互补体杂交，该多核苷酸分子具有编码SEQ ID NO：10的氨基酸残基20至369的核苷酸序列，也就是说，在65℃的0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中与滤膜结合的DNA杂交，并在42℃的0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤(Ausubel等，1989，出处同上)，且可用于实施本发明，其“有用性”如上述多核苷酸分子所定义。在一种优选的实施方案中，在非常严格的条件下，同源多核苷酸分子可与多核苷酸分子的互补体杂交，该多核苷酸分子具有编码SEQ ID NO：10的氨基酸残基20至369的核苷酸序列，也就是说，在65℃的0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中与滤膜结合的DNA杂交，并在68℃的0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤(Ausubel等，1989，出处同上)，且可用于实施本发明。在更优选的实施方案中，同源多核苷酸分子在非常严格的条件下可与多核苷酸分子的互补体杂交，该多核苷酸分子由SEQ ID NO：9从nt 254至nt 1306的核苷酸序列组成，且可用于实施本发明。
本发明进一步提供了分离的多核苷酸分子，包含编码与本发明OmpA2蛋白质同源的多肽的核苷酸序列，“同源多肽”如上所定义。
本发明进一步提供了由核苷酸序列组成的多核苷酸分子，该核苷酸序列是任意上述本发明涉及OmpA2的多核苷酸分子的实质性部分。本文所用的涉及OmpA2的多核苷酸分子的“实质性部分”指这样一种多核苷酸分子，它由特定的涉及OmpA2的全长多核苷酸分子的不完整核苷酸序列组成，但是包含该特定的涉及OmpA2的全长多核苷酸分子的至少约10％、更优选地至少约20％的核苷酸序列，可用于实施本发明，其“有用性”如上述多核苷酸分子所定义。在非限制性实施方案中，涉及OmpA2的多核苷酸分子的实质性部分编码任意上述本发明的涉及OmpA2的蛋白质或多肽的肽片段，术语“肽片段”如上所定义。
本发明进一步提供了包含核苷酸序列的多核苷酸分子，该核苷酸序列编码SEQ ID NO：10从约氨基酸残基1至约氨基酸残基19的天然OmpA2信号序列。在一种优选而非限制性实施方案中，编码OmpA2信号序列的多核苷酸分子包含SEQ ID NO：9的约nt 197至约nt 253。
本发明进一步提供了包含核苷酸序列的多核苷酸分子，该核苷酸序列编码一种融合蛋白，其中包含OmpA2蛋白质、同源多肽、或肽片段，融合为载体或融合配偶体。5.3.  寡核苷酸分子
本发明进一步提供了寡核苷酸分子，它可与任意上述本发明的多核苷酸分子杂交，或者可与具有一种核苷酸序列的多核苷酸分子杂交，该核苷酸序列是任意上述本发明的多核苷酸分子的互补体。该寡核苷酸分子的长度优选为至少约10至15个核苷酸，但是可以延长到SEQ ID NOS：1、3、5、7或9、或其同源多核苷酸分子的任意亚序列的长度，并且在非常严格的条件下能够与一种或几种上述多核苷酸分子杂交。对短些的寡核苷酸分子来说，非常严格的条件的例子包括在约37℃(对约14碱基的寡核苷酸)、约48℃(对于约17碱基的寡核苷酸)、约55℃(对于约20碱基的寡核苷酸)和约60℃(对于约23碱基的寡核苷酸)的6×SSC/0.5％焦磷酸钠中洗涤。对于较长的寡核苷酸分子来说(即大于约100nts)，非常严格的条件的例子是由上文第5.2部分提供的。按照本领域所已知的，可以决定和调整其他适当的杂交条件，这取决于所用的特定寡核苷酸和多核苷酸分子。
在一种优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸分子在非常严格的条件下可与由一种核苷酸序列组成的多核苷酸分子杂交，该核苷酸序列选自由SEQ IDNOS：1、3、5、7或9组成的组，或者可与由一种核苷酸序列组成的多核苷酸分子杂交，该核苷酸序列是选自SEQ ID NOS：1、3、5、7或9的核苷酸序列的互补体。
在非限制性实施方案中，本发明的寡核苷酸分子包含一种核苷酸序列和所述序列的互补体，该核苷酸序列选自由SEQ ID NOS：15-47和49-93组成的组。在非限制性实施方案中，该寡核苷酸分子由一种核苷酸序列和所述序列的互补体组成，该核苷酸序列选自由SEQ ID NOS：15-47和49-93组成的组。
本发明的寡核苷酸分子可用于多种目的，包括作为在编码APP蛋白质的多核苷酸分子的扩增中的引物，例如用在不同疾病的诊断中，或者用来编码或充当可用于基因调节的反义分子。扩增可被用来检测被感染动物的组织或体液样本(例如粘液或支气管液)中编码APP蛋白质的多核苷酸分子的存在。特异性扩增产物的产生能有助于APP细菌感染的诊断，而缺少扩增产物则表示没有这种感染。本文公开的寡核苷酸分子也能被用来从放线杆菌属的其他种类或菌株、或其他细菌中分离同源基因。
借助标准技术，例如聚合酶链反应(PCR)，结合使用适当设计的寡核苷酸分子可以进行扩增，不过也可使用其他本领域已知的扩增技术，例如连接酶链反应。例如，对PCR来说，按照标准方案制备和加工一种混合物，该混合物包含适当设计的引物、含有待扩增核苷酸序列的模板、以及本领域已知的适当的PCR酶和缓冲剂，以扩增特异的涉及APP的多核苷酸序列模板。进行PCR的方法尤其如下所述：Innis等(编)，1995，出处同上；和Erlich(编)，1992，出处同上。5.4.  重组表达***5.4.1 克隆和表达载体
本发明进一步提供了用于克隆和表达任意本发明的多核苷酸分子的组合物，包括包含本发明多核苷酸分子的重组克隆载体和重组表达载体、用任意所述载体转化的宿主细胞、和由此派生出的细胞系。本发明的重组载体、特别是表达载体优选经这样构造，使多核苷酸分子的编码序列(以下称之为“APP编码序列”)与一种或几种调节元件有效结合，该调节元件是转录和翻译APP编码序列以生成多肽所必需的。
本文所用的术语“调节元件”包括但不限于编码下列成分的核苷酸序列：诱导型和非诱导型启动子、增强子、操纵基因和其他本领域已知的能够驱动和/或调节多核苷酸编码序列表达的元件。而且，本文所用的APP编码序列是与一种或几种调节元件“有效结合”的，其中该调节元件有效地调节和允许编码序列的转录或其mRNA的翻译，或二者皆有。
构建重组载体的方法是本领域所熟知的，载体中含有与适当调节元件有效结合的特定编码序列，该方法包括体外重组技术、合成技术、和体内基因重组。例如参见下述工艺：Maniatis等，1989，出处同上；Ausubel等，1989，出处同上；Sambrook等，1989，出处同上；Innis等，1995，出处同上；和Erlich，1992，出处同上。
本领域已知有多种表达载体可被用来表达任意本发明的APP编码序列，包括含有APP编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA、和粘粒DNA表达载体。能被加工为含有本发明APP编码序列的典型原核表达载体质粒尤其包括pUC8、pUC9、pBR322和pBR329(Biorad实验室，Richmond，CA)、pPL和pKK223(Pharmacia，Piscataway，NJ)、pQE50(Qiagen，Chatsworth，CA)、和pGEX系列质粒(Pharmacia)。能被加工为含有本发明APP编码序列的典型真核表达载体质粒尤其包括蜕皮激素诱导型哺乳动物表达***(Invitrogen，Carlsbad，CA)、基于巨细胞病毒启动子-增强子的***(Promega，Madison，WI；Stratagene，La Jolla，CA；Invitrogen)、基于杆状病毒的表达***(Promega)、和基于植物的表达***。
这些和其他载体的调节元件可以具有不同的强度和特异性。根据所用宿主/载体***的不同，可以使用任意的许多适合的转录和翻译元件。例如，当在哺乳动物细胞***中进行克隆时，可以使用从哺乳动物细胞基因组分离的启动子、例如小鼠金属硫蛋白启动子，或者从生长于这些细胞中的病毒分离的启动子、例如牛痘病毒7.5K启动子或莫洛尼氏鼠肉瘤病毒的长末端重复。也可以使用通过重组DNA或合成技术得到的启动子，以用于被***的编码序列的转录过程。另外，在特定诱导剂的存在下，能够促进来自某些启动子的表达，该诱导剂例如用于金属硫蛋白启动子的锌和钙离子。转录调节区域或启动子的非限制性例子尤其是对细菌来说，包括β-gal启动子、T7启动子、TAC启动子、λ左与右启动子、trp与lac启动子、trp-lac融合启动子等；对酵母菌来说，包括糖酵解酶启动子，例如ADH-I和II启动子，还包括GPK启动子、PGI启动子、TRP启动子等；对哺乳动物细胞来说，包括SV40早期和晚期启动子、腺病毒主要晚期启动子。
特异的起始信号也是被***的编码序列的充分翻译所需要的。这些信号尤其包括ATG起始密码子和邻近的序列。在包括自身的起始密码子和邻近序列的本发明APP编码序列被***适当的表达载体中的情况下，不需要另外的翻译控制信号。不过，在只有一部分APP编码序列被***的情况下，可能需要外源性翻译控制信号，包括ATG起始密码子。这些外源性翻译控制信号和起始密码子可从多种来源得到，包括天然的和合成的。而且，起始密码子必须与编码区域的阅读框架正确连接，以确保全部***序列的框架内翻译。
表达载体也能被构建为表达融合蛋白，该融合蛋白包含融合于载体或融合配偶体的任意的本发明涉及APP的多肽。该融合蛋白可被用于多种目的，例如提高重组表达的APP蛋白质的稳定性、产生抗APP蛋白质的抗血清、研究APP蛋白质的生物化学特性、加工具有不同免疫学特性的APP蛋白质、或者帮助鉴别或纯化重组表达的APP蛋白质。可能的融合蛋白表达载体包括但不限于结合了编码保护性肽的序列的载体，例如下文第8.2部分所述，以及β-半乳糖苷酶和trpE融合体、麦芽糖结合蛋白融合体、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合物和聚组氨酸融合体(载体区域)。可被用来构建编码这些及其他融合蛋白的表达载体的方法是本领域所熟知的。
融合蛋白可被用来帮助纯化所表达的蛋白质。在非限制性实施方案中，例如结合APP蛋白质-麦芽糖的融合蛋白能用直链淀粉树脂纯化；APP蛋白质-GST融合蛋白能用谷胱甘肽-琼脂糖珠粒纯化；APP蛋白质-聚组氨酸融合蛋白能用二价镍树脂纯化。另一种选择是，抗载体蛋白或肽的抗体可被用于融合蛋白的亲和色谱法纯化。例如，对单克隆抗体的目标表位编码的核苷酸序列可被改造为与调节元件有效结合的表达载体，并且其定位使所表达的表位融合于本发明的APP蛋白质。在非限制性实施方案中，为FLAGTM表位标记(国际生物技术公司)这种亲水性标记肽编码的核苷酸序列可用标准工艺在对应于APP蛋白质的氨基或羧基端的点上***表达载体中。然后，被表达的多肽-FLAGTM表位融合产物可用商业上可得到的抗FLAGTM抗体进行检测和亲和纯化。
本发明的表达载体也能被加工为含有编码特异的蛋白酶切割位点的多接头序列，以使所表达的APP蛋白质通过用特异性蛋白酶处理，能从载体区域或融合配偶体中释放出来。例如，融合蛋白载体尤其可包括编码凝血酶或Xa因子切割位点的核苷酸序列。
利用已知方法，具有APP编码序列的阅读框架上游和其中的信号序列能被改造进入表达载体，以指导所表达的APP多肽的运输和分泌。信号序列的非限制性例子尤其包括本文公开的对本发明APP蛋白质天然的以及来自α因子、免疫球蛋白、外膜蛋白、青霉素酶、和T细胞受体的信号序列。
为了帮助选择用本发明重组载体转化或转染的宿主细胞，载体可被改造为进一步包含报道基因产物或其他可选择标记的编码序列。如上所述，这样一种编码序列优选与调节元件有效结合的。可用于实施本发明的报道基因是本领域所熟知的，尤其包括编码氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿荧光蛋白质、萤火虫萤光素酶、和人生长激素的报道基因。编码可选择标记的核苷酸序列是本领域所熟知的，包括编码基因产物的核苷酸序列，该基因产物赋予抗生素或抗代谢物抗性，或者包括供应营养缺陷体的需要的核苷酸序列。这样的序列的例子包括编码胸苷激酶活性的序列或抗药性序列，尤其对抗氨甲蝶呤、氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、zeocin、四环素、和羧苄青霉素的抗药性。
在具体而非限制性实施方案中，本发明提供了下列质粒克隆载体，其构造如下第11部分所述，它们存在于已被美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏的宿主细胞中：pER416质粒，存在于Pz416菌株(ATCC 98926)的宿主细胞中，该质粒包含omp20的ORF；pER418质粒，存在于Pz418菌株(ATCC 98928)的宿主细胞中，该质粒包含ompW的ORF；pER417质粒，存在于Pz417菌株(ATCC98927)的宿主细胞中，该质粒包含omp27的ORF；pER419质粒，存在于Pz419菌株(ATCC 98929)的宿主细胞中，该质粒包含ompA1的ORF；pER420质粒，存在于Pz420菌株(ATCC 98930)的宿主细胞中，该质粒包含ompA2的ORF。5.4.2.宿主细胞的转化
本发明还提供了用本发明的多核苷酸分子或重组载体转化的宿主细胞，以及由其来源的细胞系。用于实施本发明的宿主细胞既可以是原核生物，也可以是真核生物。这种转化的宿主细胞包括但不限于微生物，例如用重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌细胞；或用重组表达载体转化的酵母细胞；或动物细胞，诸如用重组病毒表达载体、其中例如杆状病毒感染的昆虫细胞，或用重组病毒表达载体、其中例如腺病毒或牛痘病毒感染的哺乳动物细胞。
通常优选细菌细胞作为宿主细胞。尤其可使用大肠杆菌的菌株，诸如象可从Gibco BRL，Life Technologies(Gaithersburg，MD)得到的菌株DH5α，或如下所述的大肠杆菌菌株LW14。也可有效地使用真核宿主细胞，包括酵母细胞和诸如来自小鼠、仓鼠、猪、母牛、猴子、或人细胞系的哺乳动物细胞。可用于表达本发明的重组蛋白质的真核宿主细胞的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如ATCC登记第CCL61号)和NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH/3T3(例如ATCC登记第CRL 1658号)。
本发明的重组载体优选转化或转染到细胞的基本上同源的培养物的一个或多个宿主细胞中。该载体通常按照已知技术引入宿主细胞，诸如象通过磷酸钙沉淀、氯化钙处理、显微注射、电穿孔、通过与重组病毒接触而转染、脂质粒介导的转染、DEAE-葡聚糖转染、转导、接合、或微粒轰击。转化体的选择可以利用标准方法进行，诸如通过选择与该重组载体有关的、表达选择性标记如抗生素抗性的细胞。
一旦该载体被引入到该宿主细胞中，可以用标准技术来证实APP编码序列在该宿主细胞基因组或附加体中的整合与维持，例如利用Southern杂交分析，限制酶分析，PCR分析，包括逆转录酶PCR(rt-PCR)，或利用免疫学测定来检测预期的蛋白质产物。含有和/或表达该APP编码序列的宿主细胞可以利用至少四种普通方法中的任何一种来鉴定，这些方法是本领域中众所周知的，包括：(i)DNA-DNA、DNA-RNA、或RNA一反义RNA杂交；(ii)检测“标记”基因功能的存在；(iii)评估转录的水平，该转录是利用APP特异性mRNA转录物在该宿主细胞中的表达来测定的；和(iv)检测利用例如免疫测定来测量的成熟APP蛋白质产物的存在。5.4.3.重组多肽的表达
一旦该APP编码序列已稳定地引入到适当的宿主细胞中，就将该转化的宿主细胞进行克隆繁殖，并让所得细胞在有助于该APP蛋白质最大产生的条件下生长。这种条件一般包括使这些细胞生长到较高密度。当该表达载体包含诱导型启动子时，根据需要可以采用适当的诱导条件来诱导表达，诸如象温度变动、养分的耗尽、义务诱导物(例如碳水化合物的类似物，象异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG))的加入、过量代谢副产物的积累，等等。
当该重组表达的APP蛋白质保持在该宿主细胞内时，将这些细胞收获并裂解，并将该APP蛋白质基本上纯化或与该裂解物分离开，此操作在本领域中已知的使蛋白质最小化降解的提取条件下进行，例如在4℃下，或在蛋白酶抑制剂存在下，或者在4℃和蛋白酶抑制剂的存在下。当该重组表达的APP蛋白质从该宿主细胞中分泌出来时，可以简单地收集该耗尽的营养培养基并将该APP多肽基本上纯化或从其分离出来。
在适当的时候，可以利用标准方法将该重组表达的APP蛋白质部分或基本上纯化或从细胞裂解物或培养基分离，这些方法包括但不限于以下方法的任意组合：硫酸铵沉淀、大小分级、离子交换层析、HPLC、密度离心、和亲和层析。本发明的APP多肽的纯度的升高可以基于例如大小、或与该APP多肽的特异性抗体的反应性来确定，或者利用融合标记物的存在来确定。为了用于实施本发明，例如用于疫苗组合物，该APP蛋白质可以以分泌到该培养液中的、或存在于宿主细胞或细胞裂解物中的未纯化态使用，或者以基本上纯化或分离的形式使用。在本文中，当一种APP蛋白质在一个特定制剂中构成了该蛋白质的约20wt％以上，则其是“基本上纯化的”。同样，当一种APP蛋白质在一个特定制剂中构成了该蛋白质的至少约80wt％，则其是“分离的”。
因此，本发明提供了一种制备本发明的APP蛋白质、同源多肽、肽片段或融合蛋白的方法，该方法包含培养一种用重组表达载体转化的宿主细胞，所述重组表达载体包含一个多核苷酸分子，该分子包含一个对以下物质编码的核苷酸序列：(a).包含SEQ ID NO：2、4、6、8或10的氨基酸序列的APP蛋白质，带有或不带其天然信号序列；或(b).与(a)所述的APP蛋白质同源的多肽；或(c).(a)所述的APP蛋白质或(b)所述的同源多肽的肽片段；或(d).包含(a)所述的APP蛋白质、(b)所述的同源多肽、或(c)所述的肽片段的、与一融合配偶体融合的融合蛋白；该多核苷酸分子与控制该多核苷酸分子在该宿主细胞中的表达的一个或多个调节元件是有效结合的，该方法在有益于生成APP蛋白质、同源多肽、肽片段或融合蛋白的条件下进行，并从该细胞培养物中回收该APP蛋白质、同源多肽、肽片段或融合蛋白。
一旦已得到足够纯度的本发明的APP蛋白质，就可利用标准方法描绘其特性，包括利用SDS-PAGE、大小排阻层析、氨基酸序列分析、血清学反应性等。该APP蛋白质的氨基酸序列可以利用标准肽测序技术来确定。该APP蛋白质还可利用亲水性分析(参见：例如，Hopp和Woods，1981，《美国国家科学院院报》78：3824)、或类似软件算法来进一步描绘其特性，以确定疏水和亲水区域。还可以进行结构分析来确定该APP蛋白质的呈现特异性二级结构的区域。还可以利用生物物理学方法如X射线晶体学(Engstrom，1974，《生化实验与生物学》11：7-13)、计算机造模(Fletterick和Zoller(编辑)，1986，“本年度分子生物学通讯(Current Communications in Molecular Biology)”，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)、核磁共振(NMR)、和质谱法来描绘该蛋白质的特性。从这些研究中得到的信息可以用于，例如，设计更有效的疫苗组合物，或用于选择仅包含该APP蛋白质的特异性部分的疫苗。
用于实施本发明的APP蛋白质是一种多肽，它是：(a)免疫原性的，即，当将其给猪使用时，它能由自身诱导，或能与其他APP蛋白质或其他APP相关抗原结合，共同诱导对抗APP的保护性应答；或者(b)当将其给多种哺乳动物种类使用时，它能诱导抗APP抗体的产生；或者(c)它可以用作诊断剂，以检测用APP感染的猪或用本发明的疫苗进行了接种的猪的血液或血清样品中抗APP抗体的存在。一旦制备出这样一种蛋白质后，就可利用本领域中熟知的常规筛选方法进行鉴定。例如，通过将单独的APP蛋白质或与其他APP蛋白质或其他APP相关抗原结合的APP蛋白质分别给猪使用，并检验所产生的APP中和抗体的诱导情况、或检验与未接种的对照动物相比，接种的动物抵抗随后的APP感染的能力，就可确定诱导、或有助于诱导对抗APP的保护性免疫应答的能力。通过将该APP蛋白质给模型动物使用，诸如小鼠、猪、绵羊、山羊、马、母牛等，并利用标准技术检验这些动物的血清中APP特异性抗体的存在，就可以确定诱导APP特异性抗体产生的能力。通过令该APP蛋白质与先前或当前用APP感染的动物、或先前用本发明的疫苗进行了接种的动物的血液或血清样品进行接触，并利用标准技术，诸如用ELISA测定来检测与这些样品中的APP特异性抗体的APP蛋白质的结合，就可以决定该APP蛋白质用作诊断剂的能力。5.5.APP疫苗
本发明还提供了一种用于保护猪对抗APP的疫苗，它包含免疫学有效量的一种或多种以下物质：(a).一种APP蛋白质，它包含选自由SEQ ID NO.2、4、6、8或10组成的组中的氨基酸序列，带有或不带其天然信号序列；(b).与(a)所述的APP蛋白质同源的多肽；(c).由(a)所述的APP蛋白质或(b)所述的同源多肽的亚序列组成的肽片段；(d).包含(a)所述的APP蛋白质、(b)所述的同源多肽、或(c)所述的肽片段的、与一融合配偶体融合的融合蛋白；(e).(a)所述的APP蛋白质、(b)所述的同源多肽、(c)所述的肽片段、或(d)所述的融合蛋白的类似物或衍生物；或(f).包含对(a)所述的APP蛋白质、(b)所述的同源多肽、(c)所述的肽片段、(d)所述的融合蛋白、或(e)所述的类似物或衍生物编码的核苷酸序列的多核苷酸分子；这些APP蛋白质、同源多肽、肽片段、融合蛋白、类似物、衍生物或多核苷酸分子，可以由自身诱导、或与一种或多种其他这样的抗原结合，共同在猪身上诱导对抗APP的保护性应答；疫苗中还包括兽医上可接受的载体。在本文中，术语“免疫学有效量”是指在单剂给药或多剂给药后，能在猪身上诱导、或有助于诱导对抗APP的一种或多种APP的血清型的保护性免疫应答的抗原的量。
短语“能诱导保护性免疫应答”在本文中被广义地使用，其义包括在猪身上响应接种的任何以免疫为基础的应答的诱导或增加，包括抗体或细胞介导的免疫应答，或二者均有，它们可用来保护该经接种的动物对抗APP。本文中所用的术语“保护性免疫应答”、“保护”等类似用语不限于对APP相关的猪肺炎的绝对保护，或对APP感染的猪的绝对保护，但还可指与未接种的、感染的对照动物相比，被病原体感染的程度或速率的任何降低，或疾病严重程度或因病原体感染而导致的任何症状或病情的任何减轻，包括例如肺部病变的任何可检测的减少。
本发明的疫苗组合物可以利用标准缓冲剂、载体、稳定剂、稀释剂、防腐剂和加溶剂按照可接受的惯例进行配制，也可以配制成有利于持续释放的剂型。稀释剂可以包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等渗性的添加剂可以包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、和乳糖等。稳定剂包括白蛋白等。
该疫苗中还可以可选地使用佐剂。佐剂的非限制性实例包括RIBI佐剂***(Ribi公司)、明矾、氢氧化铝凝胶、水包油型乳剂、油包水型乳剂，诸如象弗氏完全和不完全佐剂、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron，Emeryville CA)、AMPHIGEN佐剂、皂甙、Quil A、QS-21(剑桥生物技术公司，剑桥MA)、或其他皂苷组分、SEAM-1、一磷酰脂A、Avridine脂-胺佐剂、来自大肠杆菌(重组体或其它)的不耐热的肠毒素、霍乱毒素、或胞壁酰二肽等等。该疫苗还可包含一种或多种其他免疫调制剂，诸如象白介素、干扰素、或其他细胞因子。
对于本领域技术人员来说，适合的兽医学上可接受的疫苗溶媒、载体、和添加剂是公知的，或将是显而易见的；参见：例如，《Remington’s药物科学》，第18版，1990年，Mack出版发行，其结合在此作为参考。该疫苗可以以溶液形式、或以在给药前用无菌稀释溶液重新构成的冻干形式贮藏。
本发明还提供了用于持续释放该抗原的疫苗制剂。这样的缓释制剂的实例包括与生物相容聚合物，诸如聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、甲基纤维素、透明质酸、胶原蛋白等的组合物结合的抗原。在多篇出版物包括A.Domb等，1992年，《用于先进技术的聚合物》3：279-292中已评论了在药物递送载体中可降解的聚合物的结构、选择和用途，该文结合在此作为参考。在M.Chasin和R.Langer(编辑)，1990年，《药物与药物科学》第45卷，M.Dekker，纽约，“作为药物释放***的生物降解性聚合物”一章中，可以找到有关在药物制剂中选择和使用聚合物的其他指导，该文也结合在此作为参考。还有，或另外，该抗原可以用微囊包封以改善给药和效能。微囊包封抗原的方法是本领域中众所周知的，并包括除了其他地方以外，在美国专利3,137,631；3,959,457；4,205,060；4,606,940；4,744,933；5,132,117；以及国际专利申请WO95/28227中描述的技术，这些文章均结合在此作为参考。
脂质粒和脂质粒衍生物(例如蜗状物，小泡)也可用于该抗原的持续释放。除了其他地方以外，在美国专利4,016,100；4,452,747；4,921,706；4,927,637；4,944,948；5,008,050；和5,009,956中可以找到有关怎样制备和使用脂质粒制剂的细节，这些文章均结合在此作为参考。
在一个非限制性的实施方案中，本发明的疫苗可以是一种用于保护猪对抗APP、或者任选地对抗可使猪难受的一种或多种其他疾病或病理学状态的联合疫苗，该联合疫苗包含一种第一成分，该成分包含免疫学上有效量的本发明的抗原，该抗原选自由本发明的APP蛋白质、同源多肽、肽片段、融合蛋白、类似物、衍生物或多核苷酸分子组成的组，它们能在猪身上诱导、或有助于诱导对抗APP的保护性应答；一种第二成分，该成分包含一种免疫学上有效量的、与第一成分中的抗原不同的抗原，它能诱导、或有助于诱导对抗可使猪难受的疾病或病理学状态的保护性应答；以及兽医上可接受的载体或稀释剂。
该联合疫苗的第二成分，是基于其诱导、或有助于诱导对抗APP或可使猪难受的另一种病原体、疾病或病理学状态的保护性应答的能力来选择的，它们是本领域中已知的。现今已知或在未来将确定用于猪的疫苗组合物的任何免疫原性组合物都可以用于该联合疫苗的第二成分。这样的免疫原性组合物包括但不限于能提供对抗猪放线杆菌、多杀巴斯德氏菌、猪霍乱沙门氏菌、猪链球菌、猪红斑丹毒丝菌、钩端螺旋体、猪葡萄球菌、副猪嗜血菌、支气管炎博德特氏菌、猪肺炎枝原体、细胞内散沫花素(Lawsonia intracellularis)、大肠杆菌、猪生殖和呼吸道综合征病毒、猪流感病毒、可传递胃肠炎病毒、猪细小病毒、脑心肌炎病毒、冠状病毒、假狂犬病病毒和环状病毒(circovirus)的保护的那些。在一个非限制性的实施方案中，该联合疫苗包含包括一种或多种本发明的APP蛋白质的成分与一种或多种诸如APXI、ApxII和OmIA等的其他APP细菌成分的混合物。
包含第二成分的抗原可以选择性地共价键合到第一成分的抗原上，以生成嵌合分子。在一个非限制性实施方案中，该第二成分的抗原包含半抗原，其免疫原性通过接合到该第一成分的抗原上可检测到升高。包含该联合疫苗的第一和第二成分的共价键合抗原的嵌合分子可以利用本领域中已知的一种或多种技术合成。例如，利用标准化学合成方法，使用商业上可获得的肽合成仪，就可合成制得嵌合分子(参见：例如，Merrifield，1985年，《科学》232：341-347)。另一方面，正如本领域中已知的，这些分离抗原可以分开合成，然后利用化学连接基键合到一起。另外，还可以利用重组DNA技术来生产嵌合分子，例如，具有对该嵌合分子的不同抗原编码的序列的分离多核苷酸分子被符合读框地剪接到一起，并在适当的用于该嵌合融合多肽的随后分离的转化宿主细胞中表达。当本发明的疫苗包含多核苷酸分子而不是多肽时，该已剪接的多核苷酸分子自身可以用于该疫苗组合物。除了别的地方以外，在Maniatis等，1989年，同上；Ausubel等，1989年，同上；Sambrook等，1989年，同上；Innis等，1995年，同上；以及Erlich，1992年，同上，中提供了进行这样的重组技术的大量指导。
本发明还提供了用于保护猪对抗APP的疫苗的制备方法，该方法包含：将免疫学上有效量的一种或多种本发明的抗原，与兽医上可接受的载体或稀释剂结合，制成适于对猪给药的形式，其中抗原选自由能在猪身上诱导或有助于诱导对抗APP的保护性应答的本发明的APP蛋白质、同源多肽、肽片段、融合蛋白、类似物、衍生物、或多核苷酸分子组成的组。
本发明还提供了给猪接种对抗APP的疫苗的方法，该方法包含给猪施用本发明的疫苗。抗原的给药量取决于诸如进行接种的动物的年龄、体重、健康和一般身体特性、以及将给予的特定疫苗组合物等因素。每种参数的最佳剂量可以利用常规方法来确定，例如根据经验所得。APP蛋白质的给药量范围将优选约0.1μg-约10mg多肽，更好的优选为约10μg-约1mg，最佳优选为约25μg-约0.1mg，对于DNA疫苗，多核苷酸分子的量将优选约0.05μg-约500mg，更好的优选为约0.5μg-约50mg，此外，该疫苗的一般给药体积将是约0.5ml-约5ml/剂/动物。
动物可以在任何适当的时间进行接种，包括在出生后的1周内，或在断奶年龄时，或就在生育之前或生育之时，或在一个动物群中的一个或多个动物首先开始出现APP感染时。可能需要补充给药或加强免疫来达到完全保护。确定是否已在动物体内达到足够的免疫保护的方法是本领域中众所周知的，包括例如确定血清转变。
该疫苗可以利用任何适当的途径给药，例如通过口服、鼻内、肌内、***内、皮内、腹膜内、皮下、直肠或***给药，或利用多种途径结合给药。熟练技术人员将很容易根据所选用的途径来配制该疫苗组合物。
本发明还提供了用于给猪接种对抗由APP引起的感染或疾病的疫苗的疫苗试剂盒，它包含一个第一容器，该容器包含免疫学有效量的一种或多种本发明的抗原，该抗原选自由能在猪身上诱导或有助于诱导对抗APP的保护性应答的本发明的APP蛋白质、同源多肽、肽片段、融合蛋白、类似物、衍生物、或多核苷酸分子组成的组。该试剂盒可以可选地进一步包含一个第二容器，该容器包含兽医学上可接受的载体或稀释剂。该疫苗组合物可以贮藏在该第一容器中，或者为溶液的形式，或是将利用该第二容器中的载体或稀释剂重新构成的冻干形式。5.6.抗-APP抗体
本发明还提供了与本发明的APP蛋白质结合的分离抗体。这样的抗体可用于多种目的，包括例如作为亲和试剂来纯化该APP蛋白质，或用于检测该APP蛋白质在从APP感染的动物身上采集的细胞、组织或体液样品中的存在，例如利用ELISA或蛋白质印迹测定，或作为治疗剂来预防、控制或治疗APP感染。
可以按照已知方法，通过将适当的本发明的抗原给予一个选自猪、母牛、马、兔子、山羊、绵羊和小鼠等的宿主动物可以产生抗本发明的APP蛋白质的抗体，可以使用各种佐剂(诸如上文中描述的那些)来增强抗体的生成。本发明的抗体可以是多克隆的，或单克隆的。多克隆抗体可以利用标准技术从进行了免疫接种的动物的血清制备和分离，并测试其抗APP蛋白质的特异性。另一方面，对抗APP蛋白质的单克隆抗体可以利用能使连续传代细胞系在培养物中产生抗体分子的任何技术进行制备和分离，这些包括但不限于由Kohler和Milstein最初描述的杂交瘤技术(自然，1975年，256：495-497)；人B-细胞杂交瘤技术(Kosbor等，1983年，今日免疫学4：72；Cote等，1983年，美国国家科学院院报80：2026-2030)；和EBV-杂交瘤技术(Cole等，1985年，单克隆抗体与癌症治疗，Alan R.Liss Inc.，第77-96页)，另外，描述用于生产单链抗体的技术(参见：例如，美国专利4,946,778)也适于生产APP蛋白质特异性单链抗体。
本发明的范围内还包括含有本发明的APP蛋白质的特异性结合位点的抗体片段。这样的片段包括但不限于F(ab’)2片段，它能通过完整抗体分子的胃蛋白酶消化作用而产生，和Fab片段，它能通过还原该F(ab’)2片段的二硫键而产生。另外，可以构造Fab和/或scFv表达文库(参见：例如，Huse等人，1989年，科学246：1275-1281)，以迅速识别对本发明的APP蛋白质具有预期特异性的片段。
用于生产和分离单克隆抗体和抗体片段的技术是本领域中众所周知的，并且除了其他地方以外，还在Haelow和Lane，1988年，抗体：实验室手册，ColdSpring Harbor实验室，和在J.W.Goding，1986年，单克隆抗体：原理与实践，学院出版社，伦敦中作了描述。以上引用的所有出版物均结合在此作为参考。5.7.诊断试剂盒
本发明还提供了诊断试剂盒。在一个非限制性实施方案中，本发明的该诊断试剂盒包含一个第一容器，该容器包含能特异性结合到针对该APP蛋白质的抗体上的、本发明的APP蛋白质、同源多肽、肽片段、融合蛋白、类似物或衍生物；和一个第二容器，该容器包含一个针对猪抗体的第二抗体。该第二抗体优选包含一个可检测的标记。这样的诊断试剂盒可用于检测当前感染了APP的、或以前已感染了APP的、或接种了本发明的疫苗后已产生了血清转变的猪。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种诊断试剂盒，它包含一个第一容器，该容器包含一个与APP蛋白质结合的初级抗体；和一个第二容器，该容器包含一个与该APP蛋白质上的不同表位结合的、或针对该初级抗体的第二抗体。该第二抗体优选包含一个可检测的标记，在另一个实施方案中，该诊断试剂盒包含一个容器，该容器包含本发明的能与APP特异性多核苷酸分子特异性杂交或增强APP特异性多核苷酸分子的多核苷酸分子或寡核苷酸分子。后两种诊断试剂盒可用于检测当前感染了APP的猪。5.8.反义寡核苷酸和核酶
本发明还提供了寡核苷酸分子，它包括起结合、降解和/或抑制APP蛋白质编码mRNA的翻译作用的反义寡核苷酸、硫代磷酸酯和核酶。
反义寡核苷酸，包括反义RNA分子和反义DNA分子，作用是通过与靶mRNA结合而直接阻断mRNA的翻译，并由此防止蛋白质翻译。例如，可以通过例如常规磷酸二酯技术来合成至少约15个碱基并与编码APP蛋白质的该mRNA转录物序列的单一区域互补的反义寡核苷酸。
核酶是能催化RNA的特异性切割的酶促RNA分子。核酶的作用机制涉及该核酶分子与互补靶RNA的序列特异性杂交，然后内部核酸切割。能特定并有效催化APP蛋白质mRNA序列的内部核酸切割的基因工程锤头状基元核酶分子也在本发明的范围内。
在任何潜在靶RNA中的特异性核酶切割位点最初是通过扫描该靶分子的核酶切割位点而确定的，它们包括以下序列，GUA、GUU和GUC。一旦确定后，就可评估在约15到20个核糖核苷酸之间的、对应于含有该切割位点的靶基因区域的短RNA序列的预期结构特性，诸如二级结构，它能使该寡核苷酸的序列不适宜。候选目标的适宜性也可通过利用例如核糖核酸酶保护测定来测试它们与互补寡核苷酸杂交的可达性来进行评估。
本发明的反义寡核苷酸和核酶都可用已知方法制备。这些方法包括化学合成技术，诸如象利用固相亚磷酰胺化学合成。另一方面，反义RNA分子可以通过编码该RNA分子的DNA序列的体外或体内转录而产生。这样的DNA序列可以掺入到各种各样的载体中，这些载体能掺入合适的RNA聚合酶启动子诸如T7或SP6聚合酶启动子。
对于本发明的寡核苷酸的各种修饰可以作为提高胞内稳定性和半衰期的方法引入。可能的修饰包括但不限于将核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的侧翼序列加入到该分子的5’和/或3’端，或在该寡核苷酸的主链中使用硫代磷酸酯或2’-O-甲基而不是磷酸二酯酶键，
以下实施例仅是为了阐述而不是限制本发明的范围。6.实施例：新的APP蛋白质的鉴定
下列实验的结果证明了当以前受到过APP血清型-5攻击的猪，在受到APP血清型-7的异源性再次攻击时所诱导的局部抗体应答的特异性。利用该抗体特异性来鉴定以前未识别的APP蛋白质，利用蛋白质印迹分析显示，它们中的三种(Omp20，OmpW，Omp27)存在于所有12种APP血清型中。另两种新的蛋白质(OmpA1，OmpA2)在蛋白质组分分离和浓缩后确定(参见下文中6.1.6部分)。6.1.材料与方法6.1.1.细菌攻击
用于制备猪攻击物质的APP血清型-5培养物(菌株K-17)从R.A.Schultz，博士Avoca，IA，美国得到。用于制备猪攻击物质的APP血清型-7培养物(菌株WF-83)从E.Jones博士，Swedeland，PA，美国得到。
临床上健康的7-8周龄杂交繁殖的猪从Nebraska的以前没有APP感染史的一个猪群中得到，并按照IACUC准则，将它们圈养在Pfizer AnimalHealth，Lincoln，NE的隔离装备中。让兽医检查这些动物，确定它们在开始该研究之前的健康情况。经过两周适应期后，利用100mg/ml Telazol、50mg/ml赛拉嗪、和50mg/ml***的混合物以约1ml/50磅体重的比例给药而将这些猪麻醉，并鼻内接种2.6×106cfu的APP血清型-5。初次攻击后7至8天，将存活的6只已证明患有临床APP疾病但已恢复的猪如上所述再次麻醉。这6只猪中的第一和第二只用1×107cfu的APP血清型-5再次鼻内攻击(同源再攻击)；第三和第四只用1×108cfu的APP血清型-7再次鼻内攻击(异源再攻击)；第五和第六只猪仅用细菌生长培养基鼻内接种(对照)。所有攻击接种物的给药量为1ml(0.5ml/鼻孔)。
所有猪在再攻击48小时后处死，采集它们的血清和器官，将这些器官的组织碎片在体外培养24或48小时，如下文中6.1.2和6.1.3部分所述。将这些组织外植块培养物的含有抗体的上清液用于对比由异源再攻击引起的记忆抗体图与由同源再攻击或单一攻击(对照)引起的记忆抗体图。由该组织外植块体外生成的抗体的特异性利用针对一批代表所有12种APP血清型的整个细菌细胞制剂的蛋白质印迹分析来确定。该分析确立了在异源再攻击后抗体图的存在，它们与在同源再攻击或单一攻击(对照)后的抗体图不同。
用于制备用于蛋白质印迹的物质的APP血清型-1(菌株4074)、血清型-2(菌株4226)、血清型-3(菌株1421)、血清型-4(菌株M62)、血清型-5(菌株K-17)、血清型-6(菌株Femo FE 171D)、血清型-7(菌株WF-83)、血清型-8(菌株405)、血清型-9(菌株CVJ-13261)、血清型-10(菌株13039)、血清型-11(菌株56153)、和血清型-12(菌株8329)参比培养物从B.Fenwick博士，堪萨斯州立大学，曼哈顿，KS，美国得到。6.1.2.组织收集
进行再攻击前获取猪的血清样品，并在尸体剖检前(再攻击后48小时)再次取样。再攻击后48小时通过静脉注射过量戊巴比妥将这些猪处死。将肺移出并检查可归因于APP感染的特征性肉眼可见的损害，并对所有主要器官进行彻底地肉眼检查。收集肺、***(肠系膜的、膝后弯的和支气管的)、派伊尔氏淋巴集结和扁桃体的组织样品，用70％乙醇洗涤，并用RPMI转运培养基(添加有10mM HEPES、5％FBS、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI培养基(Gibco/BRL，Grand Island，NY))冲洗三次。洗涤后，将这些组织置于含有10ml转运培养基的50ml离心管中，放在冰上，直到在实验室中进行实验(在收集后的3小时内)。其他组织样品用液氮冷冻，以用于未来的mRNA分离和免疫组织化学，或者用***固定，以用于组织病理学。还将一份肺组织样品提交给内布拉斯加大学林肯分校的诊断实验室进行细菌鉴定。6.1.3.组织外植块培养物
将这些组织置于含有约5ml转运培养基的单独的陪替氏培养皿中。用解剖刀片和/或剪刀从该原始样品上切下约2×2mm的小组织片段，并将它们置于含有2ml洗涤培养基(添加有10mM HPES和50μg/ml庆大霉素的、不含Ca2+和Mg2+的Hanks平衡盐溶液(HBSS))的12或24孔培养板(Costar，Cambrige，MA)的单独孔中。这些组织片段用该洗涤培养基漂清并转移到另一个含有洗涤培养基的孔中。此洗涤/漂清操作重复四次，然后将这些组织片段转移到含有添加了10％FBS、10mM HPES、2mM谷氨酰胺、50μg/ml庆大霉素、62μg/ml两性霉素B、40μg/ml脱氧胆酸钠、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI培养基的孔中。这些培养板在有5％CO2的潮湿室中在38.5℃下培养24或48小时。培养完后，去掉上清液并在-70℃下冷冻。6.1.4.蛋白质印迹分析
利用如下所述的蛋白质印迹分析检查这些组织外植块上清液中的回收抗体的特异性。12种APP血清型每一种的典型分离物各自单独生长，以产生用于检验该上清液的所有细菌细胞抗原。每个菌株用添加有10μg/ml β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-NAD)的基本培养基-3(MM3)(1.8％菌苗HP培养基、1.7％乳酸、0.3％甘油、0.05MHEPES、0.011M L-谷氨酸(一钠盐)、5×10-5M烟酰胺和0.2％酪蛋氨基酸)在37℃和180转/分下培养(1％接种)5-6小时，直到OD560约为0.5-0.6。这些细胞通过以12,000×g离心10分钟而沉淀，保留该培养基用于分析，这些沉淀则再悬浮于5ml Dulbecco磷酸缓冲盐溶液(DPBS)中。在进行蛋白质测定前，将该再悬浮沉淀于-20℃下冷冻，然后解冻，以裂解任何完整细菌细胞。每种制剂的蛋白质浓度利用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce，Rockford，IL)来确定。将APP抗原制剂(5μg/泳道)加载到4-20％ Tris-甘氨酸凝胶(Novex，San Diego，CA)上，蛋白质在室温下利用20mA的恒电流进行电泳而分离开。
分离的蛋白质利用半干性石墨电吸墨纸(Milliblot，Millipore，Seattle，WA)转移到ProBlotTM膜(Applied Biosystems，FosterCity，CA)上。转移在室温下在200mA恒电流下进行30分钟。转移完成后，这些膜通过在室温下用缓冲液A(50mM Tris HCl、150mM NaCl，pH7.4和5％(w/v)脱脂奶粉)培养过夜而封闭起来。然后将该封闭缓冲液轻轻倒出，替换为在缓冲液A中的血清(1∶100稀释)或组织外植块培养物上清液(1∶3稀释)，并将这些膜在室温下温育1小时，接着用缓冲液B(含有0.2％(v/v)曲通X-100的缓冲液A)洗涤10分钟，用缓冲液A洗涤两次，每次10分钟。洗涤完成后，这些膜在室温下用已用缓冲液A以1∶1000稀释的磷酸酶偶联的山羊抗猪抗体(Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)温育1小时。然后这些膜用缓冲液A洗涤10分钟，并与5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/氮蓝四唑(BCIP/NBT)底物***(Kirkegaard & Perry Laboratories)温育15分钟。6.1.5.APP血清型-7膜的制备
将APP血清型-7的等分试样接种(1％)到添加有10μg/ml β-NAD的MM3中，并在37℃(180转/分)下培养过夜。将该过夜培养物的一部分接种到新鲜培养基中(细菌接种物为总体积的3％)，培养5-6小时或直到培养物密度为274克莱特单位。通过在10℃下以4,500转/分的速度离心40分钟而使这些细胞沉淀，移去上清液，该沉淀用足够的PMSF(苯甲基磺酰氟)再悬浮于5ml 50mMTris-HCl，pH8.0中，直到终浓度为1mM PMSF。利用弗氏压碎器在一个40K磅每平方英寸的压碎器(Sim Aminco.，Rochester，NY)中在16,000磅每平方英寸的条件下使这些细菌细胞裂解。破碎后的细胞在1,000×g下离心15分钟以除去大的细菌碎片。通过在18℃下以45,000转/分的速度离心60分钟而收集粗制总膜。将上清液丢弃，沉淀再悬浮于50mM Tris-HCl，pH8.0中，并利用Bradford标准蛋白质测定来确定蛋白质。
向体积为3ml的15mg粗制膜中加入30μl 100mM PMSF和750μl 2.5％肌氨酰，并将其充分混合。在冰上温育30分钟后，通过在10℃下在200,000×g下离心15分钟而使这些膜沉淀。除去该沉淀膜级分的上清液，并将该沉淀再悬浮于3ml 50mM Tris-HCl/100mM NaCl，pH8.0中。然后将该代表APP血清型-7膜抗原的膜制剂储存于-20℃下。6.1.6.膜蛋白的分级分离与纯化
用于N-末端测序的APP蛋白质的纯化利用BioRad 491型PrepCell(BioRad，Richmond，CA)通过连续洗脱SDS-PAGE而实现。10ml体积(4.5mg总蛋白质)的APP血清型-7膜蛋白级分与等体积的非还原性样品缓冲液(125mM Tris-HCl，pH6.8，4％SDS，20％甘油，和0.1％溴酚蓝)混合。将该蛋白质-缓冲液混合物煮沸5分钟并应用于3％堆积胶/15％分离胶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶。这些样品在20mA恒电流下电泳72小时(开始电压175-250V，终极电压200-300V)。在整个操作中以1ml/分的流速收集约800×5ml级分，并利用分光光度测定法在A280下分析蛋白质含量。每第10个级分用SDS-PAGE和银染色法(Bio-Rad，Richmond，CA)进行分析。将通过分子量推定含有相同蛋白质的级分合并，在4℃下储存。合并后的样品脱盐并浓缩于用于N-末端测序的制剂中。脱盐是通过将合并后的样品的等分试样应用于有10ml床体积的PrestoTM脱盐柱(Pierce，Rockfordm IL)而进行的。每种合并蛋白质的3ml等分试样应用于分离的柱上并用ddH2O洗脱于10×2ml级分中。该操作对每种合并蛋白质重复10次，直到30ml样品已脱盐。通过蛋白质印迹分析测定，大多数脱盐蛋白质出现于2号级分中。因此，将每一种单独蛋白质的、从10次洗脱中得到的2号级分合并。将所得20ml样品冷冻干燥并再悬浮于0.5ml ddH2O中，用于N-末端测序。在Pfizer中心研究分子科学测序设备(Pfizer CentralResearch Molecular Sciences Sequence Facility)上得到N-末端序列。6.2.结果6.2.1.再攻击后的临床征兆与病理检查所见
在同源(血清型-5)或异源(血清型-7)再攻击后，猪来显示出任何临床疾病征兆。病理学检查确认，这些动物没有发生应与再攻击后的急性APP感染一致的肺损害。但是，与用血清型-5进行同源再攻击的动物相比，或与对照动物相比，用血清型-7再攻击的这些动物的支气管***出血并增大了。6.2.2.由再攻击引起的抗体的特异性
存在于血清和组织外植块上清液中的抗体的特异性利用如上所述的蛋白质印迹分析来评定。培养24或48小时后收集含有能特异性识别APP蛋白质的抗体的所有组织来源的上清液。一般说来，对血清型-5抗原的反应性大于对血清型-7或血清型-1抗原的反应性。然而，多数组织来源的上清液的反应性比血清的反应性弱且谱较窄(图1a)。一般说来，组织外植块上清液的反应性没有特定模式。然而，从一个具体动物(803号，用血清型-7异源再攻击)获得的组织外植块上清液的蛋白质印迹反应性的模式是强烈的，并显示出存在于APP血清型-1、-5和-7中的数种低分子量蛋白质(图1b)。该上清液用作抗体源来进一步描绘开始已用APP血清型-5进行了攻击的猪，后又用APP血清型-7进行异源再攻击而引起的继发(记忆)抗体应答的交叉反应性的程度。
使用用12种不同APP血清型中的每一种制得的全部细菌细胞抗原，通过蛋白质印迹分析来评定从803号猪获得的BLN组织外植块上清液中的抗体的交叉反应性程度。该分析显示，由该抗体识别的三种低分子量蛋白质存在于所有12种血清型中(图2)。存在于该BLN组织外植块上清液中的抗体也识别其他蛋白质带。存在于血清型-1、2、4、5、6、7、8和9中的高分子量带，它们可对应于外毒素、Apx II(参见Nakai，1983年，同上)和存在于血清型2、5、8和10中的另一种蛋白质带，代表第二多的交叉反应模式。APP细胞沉淀和上清液的蛋白质印迹分析显示，该BLN组织外植块上清液中的抗体对该低分子量蛋白质的反应性仅限于存在于该细胞沉淀中的蛋白质(图3)，这表明这些蛋白质与该细菌细胞有关，并且不是分泌的。6.2.3.由交叉反应性抗体识别的蛋白质
这些低分子量蛋白质如上所述进行纯化，得到含有该目标蛋白质的部分纯化的制剂，该蛋白质是利用(a)从803号猪获得的BLN组织外植块上清液；或(b)从803号猪获得的血清，通过蛋白质印迹分析法确定的(图4)。当膜蛋白分级分离后，利用该方法确定分子量分别为约19-20、约23、约27和约29KDa的四个蛋白质带。
对这四个带中的蛋白质的N-末端序列分析得到的一级序列和暂定残基(在圆括号中)如下表1中所示，并在其中被命名为“Pep-1”(SEQ ID NO：11)、“Pep-2”(SEQ ID NO：12)、“Pep-3”(SEQ ID NO：13)和“Pep-4”(SEQID NO：14)。观察到了偶然的次级信号，可能是由于存在少量杂质(数据未显示)。用表1中显示的部分N-末端序列来设计探针和引物，以得到编码该交叉反应性APP蛋白质的一级DNA序列。序列同源性对比结果提示，由异源再攻击后引起的显性局部抗体应答识别的这四种蛋白质是以前未描述过的APP蛋白质。表1低分子量APP蛋白质的N-末端氨基酸序列
肽(SEQ ID NO) 近似分子量(KDa) 蛋白质名称 序列1(NH2到COOH)
Pep-1(11) 19-20  Omp20 Ala-Pro-Val-Gly-Asn-Thr-Phe-Thr-Gly-Val-(Lys)-Val-(Tyr)-Val-Asp-Leu-Thr-Xaa-Val-Ala
Pep-2(12) 23  OmpW His-Gln-Ala-Gly-Asp-Val-Ile-Phe-Arg-Ala-Gly-Ala-Ile-Gly-Val-Ile-Ala-Asn-Ser-Ser-Ser-Asp-Tyr-(Gln)-Thr-(Gln)-Ala-Asp-Val-(Asn/Val)-Leu-Asp-Val-Asn-Asn
Pep-3(13) 27  Omp27 Ala-Glu-Ile-Gly-Leu-Gly-(Gly)-Ala-Arg-Glu-(Ser)-(Ser)-Ile-Tyr-Tyr-(Ser)-Lys-His-Lys-Val-Ala-Thr-Asn-Pro-Phe-Leu-Ala-Leu-Asp-Leu
Pep-4(14) 29  OmpA Ala-(Asp/Glu)-Pro-Glu-Asn-Thr-Phe-Tyr-Pro-Gly-Ala-Lys-Val-Xaa-Xaa-(Ser)-Xaa-(Phe)-(His)
1Xaa表示在该特定位置上的氨基酸残基未能确定。7.实施例：编码该APP蛋白质的DNA的分子克隆7.1.染色体DNA的分离和基因组文库的构建
利用溴化十六烷基三甲铵(CTAB)-蛋白酶K法(Ausubel等人，1988年，Curt.Protocols Mol.Biol.Wiley Interscience，NY)，或DNA分离物基因组DNA分离试剂(Genosys Biotechnologies公司，The Woodlands，Texas)，将12种APP血清型的每一种的基因组DNA各自分离出来。将该APP的DNA以小于1μg/ml的量溶解于TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mMEDTA)，并通过紫外分光光度法定量。
为了促进编码Omp20、OmpW、Omp27和OmpA的APP基因序列的克隆，构建几个基因组文库。这些文库通过将已知序列(Vectorette IITM，GenosysBiotechnologies公司，The Woodlands，TX)基本上按照该供应商的推荐连接到限定的DNA片段的5’和3’端而特定地修饰。由此，通过在37℃下用限制性内切核酸酶BamHI、BglII、HindIII、EcoRI、DraI或HpaI将得自APP 7-1(血清型7，1代)的2μg染色体DNA各自消化一夜，从而构建出Vectorette文库。然后该反应中再掺加新鲜的限制性酶并调节到2mM ATP、2mM DTT终浓度。Vectorette加尾通过加入T4 DNA连接酶(400U)加3pMol适当的匹配Vectorette接头(BamHI Vectorette：BamHI，BglII；HindIII Vectorette：HindIII；EcoRI Vectorette：EcoRI；平端Vectorette：DraI，HpaI)而进行。该混合物在20℃，60分钟；37℃，30分钟下培养三个周期，以完成该加尾反应，然后用dH2O调节到200μl并储存于-20℃下。7.2.omp20的分子克隆
对该Vectorette文库进行筛选以得到编码Omp20和侧翼区的DNA片段。以该蛋白质的N-末端氨基酸序列(表1，Pep-1(SEQ ID NO：11)，aa 1-9)为基础设计简并寡核苷酸ER49(SEQ ID NO：39)。
对于该omp20基因片段的PCR扩增，寡核苷酸ER49(SEQ ID NO：39)与一种Vectorette特异性引物，ER70(SEQ ID NO：48)结合用于含有1×PCR缓冲液II(Perkin Elmer)、1.5mM MgCl2、200μM每一种脱氧NTP、100pMol每一种引物、和2.5U AmpliTaq金(Perkin Elmer)热稳定聚合酶的50μl反应物中。多个单一反应用5μl该Vectorette文库作为DNA模板完成。按如下所述进行扩增：变性(95℃，9分钟)；变性(95℃，30秒)、复性(55℃，1分钟)和聚合(72℃，3分钟)循环35次；接着是最后的延伸(72℃，7分钟)。
该扩增产物通过在1.2％琼脂糖胶(Sigma)上分离而显形。该EcoRIVectorette文库的扩增得到433-bp产物。将该片段克隆到pGEM-T Easy PCR克隆载体(Promega，Madison，WI)中并测序。该序列的分析确认了基于该N-末端氨基酸序列(Pep-1)部分编码Omp20的片段的特性。
在该部分基因的最近确定的序列的基础上，设计特异性引物ER67(SEQ IDNO：46)和ER68(SEQ ID NO：47)，以通过该Vectorette文库的第二轮筛选，利用如上所述的PCR扩增，得到另外的5’和3’侧翼序列。采用ER68(SEQID NO：47)加ER70(SEQ ID NO：48)，通过PCR筛选EcoRI、HindIII、DraI和HpaI Vectorette文库，导致了得自该DraI Vectorette文库的约600-bp片段的成功扩增。对该片段测序以确定该omp20基因的3’端。由于在利用ER67(SEQ ID NO：46)加ER70(SEQ ID NO：48)对这些文库进行筛选的过程中没有观察到独特性产物，设计另外的特异性引物ER71(SEQ ID NO：49)、ER72(SEQ ID NO：50)、ER76(SEQ ID NO：52)和ER77(SEQ ID NO：53)，以得到位于该ER49结合位点的5’侧的DNA片段。反复进行这种从大量Vectorette DNA文库扩增的“基因组行走”，直到描绘出该ORF的外边界(即，翻译起始和终止密码子以及侧翼核苷酸序列)的特征。一般说来，将PCR产物直接测序或在序列分析前克隆到pGEM-T Easy PCR克隆载体中。7.3.omp27的分子克隆
基本上按照上述针对omp20的方法，筛选omp27的Vectorette文库，只是采用简并寡核苷酸ER50(SEQ ID NO：40)，它是基于该纯化Omp27蛋白质的N-末端氨基酸序列(表1，Pep-3(SEQ ID NO：13)，aa 13-24)设计的。在如上所述的Vectorette文库的PCR扩增后，基于Pep-3(SEQ ID NO：13)的N-末端氨基酸序列确认152-bp片段编码了部分Omp27。利用BamHI、BglII、HindIII、EcoRI、HpaI和DraI Vectorette文库和特异性引物ER88(SEQ IDNO：64)和ER89(SEQ ID NO：65)进行第二轮基因组行走，导致了得自该DraI文库的约2kb片段、和得自该HindIII文库的约1.5kb片段的PCR扩增。将这些DNA片段克隆到pGEM-T Easy PCR克隆载体中，使得该omp27基因的核苷酸序列5’和3’分别衍生。7.4.ompA1和ompA2的分子克隆
用从纯化29kDa蛋白质(表1，Pep-4(SEQ ID NO：14))得到的N-末端氨基酸序列来设计简并N-末端引物RA22(SEQ ID NO：73)和RA34(SEQ IDNO：77)，它们将用于来自APP染色体DNA的编码该29kDa蛋白质的基因的直接PCR扩增。利用BlastP计算机对比程序(国家生物技术信息中心)与GenBank蛋白质数据库进行对比(Altschul等，1990年，分子生物学杂志215：403-10.)来分析Pep-4的序列，结果发现它显示出与几种不同真细菌，诸如多杀巴斯德氏菌、溶血巴斯德氏菌、杜氏嗜血菌、睡眠嗜血菌、流感嗜血菌、伴放线放线杆菌、大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌的OmpA蛋白质的同源性。将从该巴斯德氏菌科获得的OmpA相关蛋白质的N-末端序列进行排列，以产生共有序列Ala-Pro-Gln-Ala/Glu-Asn-Thr-Phe-Tyr-Ala/Val-Gly-Ala-Lys-Ala(SEQID NO：94)。对这些排列进行分析并用于设计几种另外的N-末端简并引物。寡核苷酸引物RA53(SEQ ID NO：81)、RA54(SEQ ID NO：82)、RA55(SEQ ID NO：83)、RA56(SEQ ID NO：84)和RA57(SEQ ID NO：85)彼此重叠，并设计与该共有肽的分别编码aa4-11、aa5-12、aa3-10、aa1-8和aa1-7的区域结合。
将该OmpA相关蛋白质的C-末端区域排列后设计其他简并寡核苷酸引物。此排列显示了接近C-末端的高度保守区域，它包括氨基酸序列Cys-Leu-Ala-Pro-Asp-Arg-Arg-Val-Glu-Ile(SEQ ID NO：95)。设计反向引物RA49(SEQ IDNO：78)和RA50(SEQ ID NO：79)与OmpA的此区域中的DNA负链结合。这些反向引物应用于二维基质中，其中RA49(SEQ ID NO：78)和RA50(SEQ ID NO：79)在带有复合Klen Taql和Pfu聚合酶的HotStart 50TM管(分子生物制品公司，San Diego，CA)中各自与RA22(SEQ ID NO：73)、RA34(SEQ ID NO：77)、RA53(SEQID NO：81)、RA54(SEQ ID NO：82)、RA55(SEQ ID NO：83)、RA56(SEQ ID NO：84)和RA57(SEQ ID NO：85)配对结合。下列参考文献描述了“热启动(hot start)”方法：D’Aquila等，1991年，核酸研究19：3749；和Horton等，1994年，生物技术16：42-43。该PCR的循环程序是“触地(touehdown)PCR”方案的变体，它按照下述方法进行变性(94℃，5分钟)；变性(94℃，30秒)、复性(起始周期为59℃，30秒，以后每增加一个周期减少0.1℃)和聚合(72℃，1分钟)，循环30次；接着是最终的延伸(72℃，15分钟)。以下参考文献描述了“触地(touchdown)PCR”方案：Roux，1994年，生物技术16：812-814；和Hecker和Roux，1996年，生物技术20：478-485。
在产生的PCR产物中，当它们各自与正向引物RA34(SEQ ID NO：77)、RA53(SEQ ID NO：81)、RA56(SEQ ID NO：84)或RA57(SEQ ID NO：85)配对结合时，通过与RA49(SEQ ID NO：78)或RA50(SEQ ID NO：79)反应可生成约950-bp带。将这些DNA片段克隆到pGEM-T Easy PCR克隆载体中并测序。对这些测序后的片段的分析显示了两种不同变体序列的存在。从代表变体A1的RA49(SEQ ID NO：78)/RA57(SEQ ID NO：85)和RA50(SEQ ID NO：79)/RA56(SEQID NO：84)衍生的产物以及该部分编码的蛋白质被命名为“OmpA1”。从代表变体A2的RA50(SEQ ID NO：79)/RA34(SEQ ID NO：77)和RA50(SEQ IDNO：79)/RA53(SEQ ID NO：81)衍生的产物以及该部分编码的蛋白质被命名为“OmpA2”。
利用前述Vectorette文库通过基因组行走使这两种类似但不同的ompA部分DNA序列伸展到包括全部ORF和侧翼5’与3’序列。该部分ompA1和ompA2 DNA序列的排列使特异性寡核苷酸引物的设计能区分这些接近的相关基因序列。如上所述，用面向外的、对ompA1的5’或3’区域具有特异性的区分引物，即ER55(SEQ ID NO：41)、ER58(SEQ ID NO：42)和对ompA2的5’或3’区域具有特异性的区分引物，即ER59(SEQ ID NO：43)、ER62(SEQ ID NO：44)，分别用于探测Vectorette文库。当用ER70(SEQ ID NO：48)分别加ER55(SEQ ID NO：41)、ER58(SEQ ID NO：42)、ER59(SEQ ID NO：43)或ER62(SEQ ID NO：44)进行探测时，从EcoRI Vectorette文库得到了约1100、400、450和280-bp的单一片段。对所得片段的序列分析可确定ompA1和ompA2 ORF的终点和侧翼区。7.5.ompW的分子克隆
用从纯化23kDa蛋白质(表1，Pep-2(SEQ ID NO：12))得到的N-末端氨基酸序列来设计RA20(SEQ ID NO：72)，它是与Pep-2的氨基酸1-8对应的简并寡核苷酸引物。
纯化APP DNA用作“基因行走PCR”方法的变体中的模板。单PCR引物RA20(SEQ ID NO：72)用于与复合KlenTaql(Ab Peptides公司，St.Louis，MO.)和Pfu(Stratagene公司，La Jolla，CA)聚合酶的‘热启动’反应。该PCR的循环程序是“触地(touchdown)PCR”方案的变体，它按照下述方法进行变性(94℃，5分钟)；变性(94℃，1分钟)、复性(起始周期为63℃，2分钟，以后每增加一个周期降低0.2℃并减少2秒钟)和聚合(72℃，1.5分钟)，循环40次；接着是最终的延伸(72℃，10分钟)。
在产生的大量PCR产物中，得到约220-bp的产物并将其克隆到pGEM-TEasy PCR克隆载体中。对此质粒***片段的序列分析确认，该克隆PCR产物编码的氨基酸相应于基于Pep-2(SEQ ID NO：12)的N-末端氨基酸序列的23kDa蛋白质的一部分。
基于此新近确定的序列产生用于下游序列的扩增的特异性引物RA23(SEQID NO：74)。通过用都能创造5’-CG突出端的TaqαI或HinP1 I进行有限消化构建出APP血清型-7DNA的基因组小型文库。该DNA连接到BspDI-切口pUC21或pUC128载体上并转化到大肠杆菌DH5α中，从而得到该基因组文库。
这些来源于质粒的基因组文库的微量制备用作使用“热启动”法的“基因行走PCR”中的模板。该特异性引物RA23(SEQ ID NO：74)与载体特异性M13正向和M13反向测序引物一起，用于与复合KlenTaq和Pfu聚合酶的反应。该PCR的循环程序按照下述方法进行：变性(94℃，5分钟)；变性(94℃，30秒)、复性(起始周期为63℃，30秒，以后每周期降低0.2℃)和聚合(72℃，30秒)，循环32次；接着是最终的延伸(72℃，7分钟)。
在产生的大量PCR产物中，将0.8kb产物和1.4kb产物克隆到pGEM-TEasyPCR克隆载体中并测序。该所得序列与上面得到的序列一起进行分析和排列，得到该成熟蛋白质的序列。为了得到该ompW基因的5’侧翼区的序列，如上所述，用特异性引物RA24(SEQ ID NO：75)和RA26(SEQ ID NO：76)来探测大量Vectorette文库。按照下述方法进行扩增：变性(95℃，9分钟)；变性(95℃，30秒)、复性(60℃，1分钟)和聚合(72℃，3分钟)，循环40次；接着是最终的延伸(72℃，7分钟)。从对HpaI和DraI Vectorette文库的探查中分别得到特异性600和700-bp产物。对该700-bp产物直接测序，得到包括该5’侧翼区并编码该23kDa蛋白质的N-末端的核苷酸序列。由于在预测的APP 23kDa蛋白质和预测的霍乱弧菌OmpW蛋白质之间的部分相似性，该APP基因片段被命名为“ompW”。7.6.编码APP蛋白质的基因的分子分析7.6.1.DNA的特异性PCR扩增
如上所述，用这些新的APP蛋白质的克隆和初步测序结果来设计用于直接从APP血清型-7染色体DNA特异性扩增完整omp20、omp27、ompA1、ompA2和ompW基因的寡核苷酸引物。由于希望消除大肠杆菌中基因片段的克隆过程中因可能的突变引起的测序假象的出现，因此该方法是优选的。因此，用位于上述完整APP基因侧翼的寡核苷酸来从染色体DNA特异性扩增那些区域。用于每种基因扩增的5’和3’引物对如下：对于omp20，该引物对是ER80(SEQ ID NO：56)和ER81(SEQ ID NO：57)；对于omp27，该引物对是ER95(SEQ ID NO：69)和ER96(SEQ ID NO：70)；对于ompA1，该引物对是ER84(SEQ ID NO：60)和ER86(SEQID NO：62)；对于ompA2，该引物对是ER87(SEQ ID NO：63)和ER66(SEQ IDNO：45)；对于ompW，该引物对是ER82(SEQ ID NO：58)和ER83(SEQ ID NO：59)。PCR反应一式三份进行，并在100μl体积的最终样品中含有260ng纯化染色体DNA，1×PCR缓冲液(Ab Peptides公司)，200μM每一dNTP，100pMol每一引物，7.5U KlenTaq1和0.15U克隆Pfu热稳定聚合酶。扩增的条件包括变性(94℃，5分钟)，接着是变性(95℃，30秒)、复性(65℃，30秒)和聚合(72℃，2分钟)，循环30次。最终的延伸(72℃，7分钟)完成了该完整靶基因区的扩增。扩增后，将这三份样品合并，并利用DyeDeoxy终止反应在ABI自动DNA测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)上进行定向序列分析之前，将该特异性产物通过琼脂糖胶电泳和自旋层析法提取(QIAquickTM，QIAGEN公司，Santa Clarita，CA)而纯化。
将合成寡核苷酸引物用于从APP血清型-7开始的扩增产物的两个DNA链的测序。用于对这些APP蛋白质基因测序的引物列在下表2中。
omp20的ORF的核苷酸序列出现在SEQ ID NO：1中，从nt 272到790。ompW的ORF的核苷酸序列出现在SEQ ID NO：3中，从nt 376到1023。omp27的ORF的核苷酸序列出现在SEQ ID NO：5中，从nt 157到933。ompA1的ORF的核苷酸序列出现在SEQ ID NO：7中，从nt 614到1708。ompA2的ORF的核苷酸序列出现在SEQ ID NO：9中，从nt 197到1306。表2
APP基因 引物(SEQ ID NO)
omp20 ER79     (55)ER80     (56)ER81     (57)AP19.1   (15)AP19.2   (16)AP19.3   (17)AP19.4   (18)AP19.5   (19)
omp27 ER88     (64)ER89     (65)ER91     (66)ER94     (68)ER95     (69)ER96     (70)
ompA1 ER84     (60)ER85     (61)ER86     (62)AP21.1   (24)AP21.2   (25)AP21.3   (26)AP21.4   (27)AP21.5   (28)AP21.6   (29)AP21.7   (30)AP21.8   (31)AP21.9   (32)
ompA2 ER66     (45)ER87     (63)AP22.1   (33)AP22.2   (34)AP22.3   (35)AP22.4   (36)AP22.5   (37)AP22.6   (38)
ompW ER82     (58)ER83     (59)AP20.1   (20)AP20.2   (21)AP20.3   (22)AP20.4   (23)
7.6.2.APP血清型-7 OmpAl和OmpA2蛋白质的相似性
将分别从SEQ ID NO：7和9推断出的OmpA1蛋白质(SEQ ID NO：8)和OmpA2蛋白质(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列进行排列，以对比它们的相似性。该推断的OmpA1蛋白质长为364个氨基酸，它比推断的OmpA2蛋白质短5个氨基酸。图5中显示的这些APP蛋白质的排列表明，这两种蛋白质有73.1％(270/369)的氨基酸相同。7.6.3.APP血清型-7 OmpW蛋白质与霍乱弧菌OmpW的比较
从编码该23kDa APP OmpW蛋白质的ORF的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)推断的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)经确定与所述的霍乱弧菌的OmpW蛋白质最相似(Jalajakumari，M.B.等人，1990年，核酸研究18(8)：2180)。利用ClustalW(yer 1.4)多序列排列公式(Thompson，J.D.等人，1994年，核酸研究22：4673-4680)对比这两种蛋白质的氨基酸序列。此对比显示，分别为215个和216个残基长的APP OmpW与霍乱弧菌OmpW蛋白质有44.9％(97/216)的氨基酸相同。这些排列好的蛋白质显示于图6中。7.7.DNA印迹杂交
在不同的APP血清型中编码Omp20、OmpW、Omp27、OmpA1和OmpA2蛋白质的DNA序列的保守性，通过利用5种不同编码序列的每一个作为针对从不同血清型得到的APP DNA的探针而进行的Southern印迹杂交分析来确定。按照制造商的指示，用PCR DIGTM探针合成试剂盒(Boehringer Mannheim公司，Indianapolis，Indiana)生产这些探针。例如，用下述方式构建ompW探针。利用ompW特异性引物和APP血清型-7 DNA生成包括该ompW编码序列的PCR产物。将APP血清型-7基因组DNA(0.2μg)、1μM MW3引物(SEQ ID NO：71)、1μM引物RA52(SEQ ID NO：80)、7.5U KlenTaq1聚合酶(Ab Peptides公司)、0.075 U Pfu聚合酶(Stratagene)、1×KlenTaq1缓冲液和0.2mM dNTPs混合成50μl体积。如下进行PCR：变性(94℃，5分钟)；变性(94℃，30秒)、复性(58℃，30秒)和聚合(72℃，1分钟)，循环35次；最终延伸(72℃，7分钟)。利用JETsorbTM试剂盒(GENOMED公司，Research Triangle Parkm NC)通过琼脂糖胶电泳将约650-bp的ompW PCR产物纯化。该纯化DNA利用低分子量DNA梯(Low Mass DNA LadderTM)分子量标准(GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD)定量。按照制造商的指示，用PCR DIGTM探针合成试剂盒，对如上所述生成的24pg ompW PCR产物进行PCR扩增，生成地高辛标记的探针，该PCR生成的探针不经纯化储存于-20℃下。
通过琼脂糖胶电泳将从各个APP血清型1、2、5、7、8和9得到的EcoRI消化的APP基因组DNA(1.5μg)分离开。按照制造商的指示，用TurboblotterTM试剂盒(Schleicher & Schuell公司，Keene，New Hampshire)通过碱转移将这些DNA分布图转移到Hybond-N 0.45μm尼龙膜(amersham公司，Cleveland，OH)上。利用StratalinkerTM UV交联剂(Stratagene)在自动交联装置上通过紫外线照射(120mJ/cm2)使该DNA共价结合到该膜上。使这些印迹干燥并在室温下储存。
将尼龙DNA印迹在探针的存在下进行培养以使发生杂交，从而检测多APP血清型中的探针序列。印迹利用过量(0.2ml/cm2)1×预杂交液(GIBCO/BRL)在68℃下预杂交2.5小时。通过将5.4μl该未纯化的地高辛标记的探针加入到500μl 1×杂交液(GIBCO/BRL)中并在100℃下煮沸10分钟而制得探针-杂交液。将该探针冷却到0℃1分钟，然后加入到足够的1×杂交液中，得到总计为0.025ml/cm2印迹。这些印迹在此探针-杂交液混合物中在68℃下杂交16小时。按下述方法对这些印迹进行严格洗涤：(i)用过量(0.2ml/cm2)2×SSC/0.1％SDS在25℃下洗涤5分钟，洗涤2次；(ii)用过量(0.2ml/cm2)0.1×SSC/0.1％SDS在68℃下洗涤15分钟，洗涤2次。然后利用化学发光法，按照制造商的指示，用DIGTM高基本DNA标记和检测起子试剂盒II(High Prime DNA Labelingand Detection Starter Kit II)以及DIGTM洗涤与封闭缓冲液装置(BoehringerMannheim公司，Indianapolis，Indiana)使这些印迹显影。显影后的印迹暴露于X光片不同长度的时间，以检测杂交带。
如上所述产生的针对omp20、ompW、omp27、ompA1和ompA2序列的探针与测试的所有APP血清型(血清型1、2、5、7，8和9)中的DNA杂交。在所有血清型中检测到的ompA1和ompA2的EcoRI带的大小相同，但omp20，ompW和omp27的则不保守。
由omp20探针在每种血清型中杂交的EcoRI片段的大小如下：血清型-1、2、7和9得到5.8kb片段；血清型-5得到6.1kb片段；血清型-8得到5.0kb片段。
由ompW探针在每种血清型中杂交的EcoRI片段的大小如下：血清型-1得到1.15kb片段；血清型-2得到1.1kb片段；血清型-5得到1.0kb片段；血清型-7得到0.9kb片段；血清型-8得到1.05kb片段；血清型-9得到1.2kb片段。
由omp27探针在每种血清型中杂交的EcoRI片段的大小如下：血清型-1、2和9得到约9.5kb片段；血清型-5，7和8得到约10.5kb片段。
由ompA1探针杂交的EcoRI片段的大小在所有血清型中均为2.3kb。还检测到了0.55kb和o.85kb的较弱杂交片段。
由ompA2探针杂交的EcoRI片段的大小在所有血清型中均为0.85kb。还检测到了0.55kb和2.3kb的较弱杂交片段。8.实施例：重组APP蛋白质的表达8.1.宿主菌株
用于重组蛋白质表达的大肠杆菌宿主是大肠杆菌LW14。该菌株的基因型为λ-IN(rrnD-rrnE)1 galE：：Tn10λc/857ΔH1 bio。该菌株由SmithKline BeechamPharmaceuticals，King of Prussia，PA，美国提供，并含有温度敏感λ阻抑物λc/857，它在30℃下抑制从λ启动子开始的表达。在42℃下，该阻抑物失活并允许从λ启动子开始表达，产生高水平转录和蛋白质合成。大肠杆菌LW14在30℃下增殖。8.2.质粒表达载体
用于重组蛋白质合成的表达载体是pEA181，或被命名为pEA181KanRBS3。该载体大小为6.766kb，编码卡那霉素抗性(Kan)，并含有强λ启动子PL。该载体含有就在最佳化核糖体结合部位下游的NdeI部位；此NdeI部位的存在使得能精确安置用于最佳表达的蛋白质的Met起始密码子。该载体还编码NS1前导融合蛋白，使得表达不充分的蛋白质的表达增强。该载体由SmithKlineBeecham Pharmaceuticals提供(还参见美国专利4,925,799，和Rosenberg等人，1983年，酶学方法101：123-138)。
这5种APP蛋白质各自的编码序列通过PCR扩增，其中使用设计用于得到与该Met起始密码子(ATG)重叠的NdeI部位(CATATG)的5’特异性引物，和设计用于克隆到pEA181的3’Xbal部位的3’特异性引物。最初，将这些PCR产物分别克隆到pGEM-T Easy PCR克隆载体(Promega Corp)中，并转化到商业上可获得的感受态大肠杆菌DH5α(最大效率DH5α感受态细胞，GIBCO/BRL)中。将这些PCR产物作为NdeI-XbaI或NdeI-SpeI片段从这些质粒克隆中切除，并克隆到Ndel/Xbal切口pEA181中。由于该强λ启动子PL的存在，pEA181衍生物可以仅转化到能 利用温度敏感λ阻抑物λc/857的活性阻抑从该载体的表达的大肠杆菌LW14中。承受pEA181及其衍生物的转化体的转化和增殖在30℃下进行。利用制备冷冻感受态细胞的Hanahan法(Hanahan，1985年，载于：DNA克隆：一种实用方法(Glover，D.编)，第1卷，109-135页，IRL出版社，牛津，英国)使大肠杆菌LW14处于感受态。
由于成熟OmpW在大肠杆菌LW14中的表达困难，因此使用容许增强蛋白质合成的前导肽。基于来自Sung等，1986年，美国国家科学院院报83：561-565；Sung等，1987年，酶学方法学153：385-389；和美国专利5,460,954的信息，该前导肽，称为“保护性肽”或“pp”，可保护重组蛋白质不受蛋白酶解降解，上述这些文献均结合在此作为参考。通过设计PCR引物，使之含有该APP编码序列上游的保护性肽编码序列，而将由氨基酸序列Met-Asn-Thr-Thr-Thr-Thr-Thr-Thr-Ser-Arg(SEQ ID NO：96)组成的该保护性肽融合到每种APP蛋白质的N-末端。用这种引物完成的分离APP编码序列的扩增产生了编码融合到成熟(即，缺乏天然信号序列)APP蛋白质中的第一氨基酸上的N-末端保护性肽的序列。NdeI部位安置在该保护性肽的Met密码子上，以便它能连接到pEA181的NdeI部位上。用于该保护性肽-APP蛋白质编码序列的扩增的引物对如下：对于ompW，为MW3(SEQID NO：71)和RA52(SEQ ID NO：80)；对于ompA1，为RA78(SEQ ID NO：88)和RA71(SEQ ID NO：87)；对于ompA2，为RA78(SEQ ID NO：88)和RA69(SEQ ID NO：86)；对于omp20，为ER78(SEQ ID NO：54)和ER73(SEQ IDNO：51)；对于omp27，为ER92(SEQ ID NO：67)和ER94(SEQ ID NO：68)。8.3.重组蛋白质的表达
带有编码分别与成熟APP蛋白质OmpA1、OmpA2、Omp20、OmpW和Omp27融合的保护性肽的pEA181衍生物的大肠杆菌LW14转化体在30℃下在LB Km50(加有50μg/ml硫酸卡那霉素的Luria肉汤)中增殖过夜。该培养物以1∶100倍稀释到2X YT Km50培养基(1.6％胰胨，1％酵母提取物，0.5％NaCl，1.25mM NaOH，含有50μg/ml硫酸卡那霉素)中并在30℃下生长，直到A600为0.8-1.0。然后将该培养物移动到42℃水浴培养箱中并培养3到4小时。
通过离心从在2X YT Km50培养基中生长的5升发酵液收获表达pp-OmpA1、pp-OmpA2或pp-OmpW的大肠杆菌LW14转化体的湿细胞。将这些细胞悬浮于0.1M Tris-HCl，pH8.0中，用高压匀浆器裂解。通过离心(12,000 RCF，30分钟)收集包含体，并用比例为5∶4的2×RIPA/TET洗涤1次或2次。2×RIPA是20mM Tris(pH7.4)，0.3M NaCl，2.0％脱氧胆酸钠，和2％(v/v)IgepalCA-630TM(Sigma)。TET是0.1M Tris(pH8.0)，50mM ED TA和2％(v/v)TritonX-100。将这些包含体溶于5M盐酸胍，调整到在2.5M盐酸胍中有大于1.4mg/ml的蛋白质，并过滤除菌(0.2μm)。将该制剂用于下述接种试验。
通过离心从在2X YT Km50培养基中生长的5升发酵液收获表达pp-Omp20的大肠杆菌LW14转化体的湿细胞。将这些细胞悬浮于带有溶菌酶的25％蔗糖-50mM Tirs-HCl，pH8.0中(对于每50ml培养物，将细胞分散于0.5ml蔗糖缓冲液；对于每毫升蔗糖缓冲液，加入0.125ml 10mg/ml溶菌酶溶液)，并超声处理。通过离心(12,000 RCF，30分钟)收集包含体，并如上所述用2×RIPA/TET洗涤，再次通过离心收集，并用0.1M甘氨酸和pH11 Zwittergent 3-14(Calbiochem)洗涤。将该pH调节到7.0，该包含体通过离心收集(12,000 RCF，30分钟)，溶于3.5M盐酸胍(终蛋白质浓度为6.36mg/ml)，并过滤除菌(0.2μm)。该制剂用于下述接种试验。
如上所述，通过离心从在2X YT Km50培养基中生长的1600ml烧瓶培养物收获表达pp-Omp27的大肠杆菌LW14转化体的湿细胞。如上所述，将这些细胞悬浮于带溶菌酶的25％蔗糖-50mM Tirs-HCl，pH8.0中，超声处理，用上述2×RIPA/TET洗涤，并通过离心收集。该包含体通过离心收集(12,000 RCF，30分钟)，溶于5M盐酸胍(终蛋白质浓度为2.46mg/ml)，并过滤除菌(0.2μm)。该制剂用于下述接种试验。9.实施例：重组APP蛋白质的免疫特性描述9.1.材料与方法9.1.1.用于蛋白质印迹的APP完整细胞抗原的制备和定量
如上述6.1.4部分中所述制备完整细菌细胞抗原，只是将HP生长培养基替换为MM3培养基，且细胞悬浮于10ml DPBS而不是5ml DPBS中。每种制剂的蛋白质浓度利用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce)确定。简而言之，每种样品用无菌去离子蒸馏水(ddH2O)稀释1/10、1/20、1/40和1/80倍。将BSA(标准蛋白质)稀释到浓度为200至800μg/ml。将20μl体积的样品或标准物一式三份加入到96孔微量滴定板的孔中，并向每一孔中加入200μl用试剂A稀释了1/50倍的试剂B。该滴定板在37℃下培养30分钟。在560nm处测定样品吸光度。利用BSA标准曲线通过外推法计算每一样品的蛋白质浓度。9.1.2.抗体
用于蛋白质印迹的第二抗体包括碱性磷酸酶-偶联山羊抗-猪IgG(H+L)和山羊抗-小鼠IgG(H+L)(Kirkegaard和Perry实验室)。这些抗体用于通过蛋白质印迹分析目测检验血清或上清液样品中的APP蛋白质特异性抗体。这两种抗体在使用前用稀释缓冲液(PBS，0.05％吐温20，5％脱脂奶粉)稀释1/1000倍。9.1.3.接种方案
在上述8.3部分中制备的重组表达的蛋白质制剂用DPBS稀释到80μg/ml，然后以1∶1的比例与2×浓缩SEAM-1佐剂(80μg/ml Quil A，16μg/ml胆固醇，5％角鲨烯，1％司盘85，0.1％醋酸维生素A，0.1％乙醇和0.01％硫柳汞)混合。雄性CF1小鼠皮下注射相当于10μg重组蛋白质、10μg Quil A和2μg胆固醇的0.25ml蛋白质/佐剂制剂。阴性(佐剂)对照组接受与佐剂1∶1混合的0.25ml DPBS。该小鼠在初次接种后20-22天时用相同的蛋白质制剂进行第二次接种。第二次接种两周后，这些动物用CO2麻醉，并从肱动脉或通过心脏穿刺采血。分离出每种血液样品的血清，将相同组中小鼠的血清合并，储存于-20℃下。9.1.4.蛋白质印迹分析
将相当于10μg蛋白质的APP完整细菌细胞裂解物(来自APP血清型1、2、5、7或9；如上述9.1.1部分所述制备)与水混合到终体积为10μl，并加入2μl5×还原样品缓冲液(Pierce)。用类似的方式，制备重组蛋白质(参见上述8.3部分)的等分试样(蛋白质加载量为变量)。这些样品在100℃下加热5分钟，然后将整个体积加载到15孔、1.5mm厚、14％Tris-甘氨酸凝胶(Novex)的隔开的孔中。每个凝胶中还包括预染的、宽范围分子量的标准参照物(5μl/孔)(BioRad)。选定凝胶中的分离蛋白质用考马斯蓝染色。
用SDS-PAGE分离的蛋白质转移到PVDF膜(BioRad)上，在200mA恒电流下进行1.5小时。这些印迹是：(i)直接用封闭缓冲液(5％脱脂奶粉和0.05％吐温20在PBS中)温育；或(ii)在室温下干燥，在-20℃下冷冻储存到需要使用时，然后再用甲醇水化，用水漂清，随后于封闭缓冲液中温育。这些膜在温和搅拌下用封闭缓冲液(也用作稀释缓冲液)温育过夜。除去该封闭缓冲液，并将稀释血清或上清液样品加入到该膜中，接着在室温下温育1小时。除去测试样品后，这些膜用PBST(加有0.05％吐温20的PBS)洗涤三次，每次5至10分钟。将碱性磷酸酶偶联抗鼠或抗猪IgG(H+L)抗体稀释，加入到洗涤后的膜中，并在室温下培养1小时。这些膜用PBST洗涤，将底物BCIP/NBT(Kirkegaard和Perry实验室)加入到这些膜中，在温和搅拌下培养，直到合适的颜色反应显色。然后这些膜用水漂清以终止该反应，并在室温下干燥。9.2.结果
这些新的APP蛋白质的抗原特性利用下述三种方法来确定。第一种方法使用猪抗体探针，即猪恢复期血清或ASC上清液，作为含有该重组表达的APP蛋白质的蛋白质印迹中的免疫探针(表3)，该探针是从用APP血清型-1或血清型-5感染的实验动物、或用血清型-5感染后又用血清型-7再攻击的实验动物得到的。第二种方法使用用该重组表达的APP蛋白质进行了免疫的小鼠的血清来探查含有APP抗原(完整细菌细胞颗粒)的蛋白质印迹(表4)。第三种方法使用用该重组表达的APP蛋白质进行了免疫的小鼠的血清来探查含有该重组表达的APP蛋白质的蛋白质印迹(表5)。每种方法的结果如下所述。9.2.1.针对APP血清型产生的猪抗体探针对重组APP蛋白质的识别
用APP血清型-1或血清型-5攻击、或用血清型-5攻击后再用血清型-7再攻击实验从猪身上得到抗体探针(血清或ASC上清液)。该血清用于这些新的APP蛋白质的最初确定(图1-4)。表3中总结了通过蛋白质印迹法测定的这些抗体探针与该重组表达的APP蛋白质的反应性。用血清型-5攻击并用血清型-7再攻击后产生的ASC探针可识别OmpW、OmpA1、OmpA2和Omp20重组蛋白质。这些ASC探针不与重组Omp27发生免疫学反应。相反，从用血清型-1或血清型-5攻击、或用血清型-5攻击后用血清型-7再攻击的动物得到的血清仅识别OmpA1和OmpA2重组蛋白质。从一头未经攻击的对照猪(780号)得到的ASC探针不与任何一种重组表达的蛋白质反应。但是，从另一头未经攻击的对照猪(779号)得到的ASC探针与所有重组表达的蛋白质反应。此外，从一头未经攻击的对照猪(1421号)得到的血清与OmpA1和OmpA2反应。这后两只动物怀疑已亚临床感染了APP。9.2.2.针对重组APP蛋白质产生的小鼠抗血清对APP蛋白质的识别
将从用重组表达的APP蛋白质进行了免疫的小鼠得到的抗血清用于探查含有从细菌细胞沉淀得到的APP抗原的蛋白质印迹。结果总结于表4中。用重组pp-OmpW或pp-OmpA1或pp-OmpA2免疫的小鼠产生了能识别与该特定APP蛋白质的预测分子量一致的特异性带的血清抗体。不过，用重组Omp20或Omp27进行免疫的小鼠的血清不与测试的任何血清型中的特定天然蛋白质发生特异性反应。9.2.3.针对重组APP蛋白质产生的小鼠抗血清对重组APP蛋白质的识别
将从用重组表达的新蛋白质进行了免疫的小鼠得到的抗血清用于探查含有该重组APP蛋白质的蛋白质印迹。结果总结于表5中。用重组OmpW免疫的小鼠的血清，或作为GST或作为pp融合蛋白，识别了重组OmpW、OmpA1和OmpA2蛋白质。用重组OmpA1或重组OmpA2免疫的小鼠的血清与OmpA1和OmpA2免疫原均发生强烈反应。用重组Omp20免疫的小鼠的血清与重组Omp20发生强烈反应，与OmpA1和OmpA2的反应程度较小。相反，用重组Omp27免疫接种的小鼠的血清不识别重组Omp27，但与重组OmpA1和OmpA2反应。用PBS免疫接种的对照小鼠的血清与重组OmpA1和OmpA2的反应非常弱，且不识别重组OmpW、Omp20和Omp27。
总之，已在实验上用APP感染的猪产生了识别OmpW、OmpA1、OmpA2和Omp20重组蛋白质的局部抗体(ASC探针)，然而血清抗体仅与重组OmpA1和OmpA2反应，正如蛋白质印迹法证明的那样(表3)。因此，在免疫反应性方面，血清显得比ASC探针有更多局限。无论是血清还是ASC探针都不识别重组表达的Omp27。在蛋白质印迹测定中未识别出Omp27可能是由于该测定的变性条件导致的。
重组OmpW、OmpA1和OmpA2的免疫特性显示，这些蛋白质可诱导能识别在血清型1、2、5、7、8和9中发现的天然蛋白质(基于预测的分子量)(表4)、以及能识别这些蛋白质的重组衍生型(表5)的血清抗体，其中还能识别重组Omp20。
将用重组Omp20或Omp27免疫接种的小鼠的血清用来探查含有从体外生长的APP血清型1、2、5、7、8和9得到的完整细菌细胞抗原的蛋白质印迹(表4)。在所检查的任何一种APP血清型中，这些血清都不识别与它们的天然型一致的带。有可能Omp20和Omp27代表仅在体内表达的APP的抗原，因此不会存在于该实验室中制备的细菌细胞沉淀中。另一方面，这两种蛋白质可能已用蛋白质印迹法变性，并使其不能识别特异性抗体。表3猪恢复期血清和ASC上清液对重组APP蛋白质的反应性
Ab源2 动物序号 APP攻击3 重组蛋白质1
OmpW OmpA1 OmpA2 Omp20  Omp27
血清 1157 血清型1 -4 + + - -
血清 642 血清型5 - + + - -
血清 803 血清型5&7 - + + - -
血清 1421 无 - + + - -
ASC探针 803 血清型5&7 + + + + -
ASC探针 808 血清型5&7 + + + + -
ASC探针 779 无 + + + + ND5
ASC探针 780 无 - - - - ND
1 每种重组蛋白质含有保护性肽(pp)，缺乏天然信号序列，并从包含体(IB)得到。2 血清，稀释1/125倍，或ASC探针，稀释1/4倍，测试对每种重组蛋白质的抗体特异性。3 动物用所示APP血清型攻击。803号和808号动物用血清型-5攻击，使其从感染中恢复，然后用血清型-7再攻击。4 (+)表示出现与所示重组蛋白质对应的带；(-)表示该血清或ASC探针不与该被命名重组蛋白质反应。5 ND＝未确定。表4用重组APP蛋白质免疫的小鼠的血清对APP完整细胞制剂的反应性
免疫原2 APP抗原1
血清型-1 血清型-2 血清型-5 血清型-7 血清型-8 血清型-9
OmpW-GST3 +4 + + + + +
pp-OmpW + + + + + +
pp-OmpA1 + + + + + +
pp-OmpA2 + + + + + +
pp-Omp20 - - - - - -
pp-Omp27 - - - - - -
PBS - - - - - -
1 完整细菌细胞制剂中的蛋白质(10μg/泳道)利用SDS-PAGE分离，转移到PVDF膜中，并用小鼠血清(1/50)探测。2 小鼠用重组APP蛋白质制剂或PBS(对照)皮下免疫接种两次。3 用于小鼠免疫的所有重组APP蛋白质是溶解的包含体制剂。除了作为OmpW-GST融合蛋白或pp-OmpW融合蛋白使用的OmpW以外的所有APP蛋白质含有保护性肽。4 (+)表示出现与用于动物免疫的重组蛋白质一致的带；(-)表示未出现特异性带。表5用重组APP蛋白质免疫的小鼠的血清对重组APP蛋白质的反应性
免疫原2 抗原1
OmpW3 OmpA1 OmpA2 Omp20 Omp27
OmpW-GST4 +5 + + - ND5
pp-OmpW + + + - ND
pp-OmpA1 - ++ ++ - ND
pp-OmpA2 - ++ ++ - ND
pp-Omp20 - + + ++ ND
pp-Omp27 - + + - -
PBS - +/- +/- - -
1 用SDS-PAGE分离的重组蛋白质转移到PVDF膜上并用小鼠血清(1/50)探测。2 小鼠用重组蛋白质制剂或PBS(对照)皮下接种2次。3 SDS-PAGE凝胶中的每种重组APP蛋白质含有保护性肽(pp)而缺乏天然信号序列。4 用于小鼠免疫的所有重组APP蛋白质来自溶解的包含体制剂。除了作为OmpW-GST融合蛋白或pp-OmpW融合蛋白使用的OmpW以外的所有蛋白质含有保护性肽，且所有蛋白质缺乏天然信号序列。5 (+)表示测试血清与特定重组蛋白质反应；(-)表示未出现特异性带；对于PBS对照，(+/-)表示这些带是可见的，但与免疫动物的血清相比非常微弱。(++)表示非常强的免疫反应性。6 ND＝未确定。实施例10：测试各种抗原组合物效力的动物研究10.1.材料与方法
从没有APP疾病或疫苗接种史的兽群中得到50只外观健康的杂种猪(约6.5周龄)。将这些动物打乱并通过窝和ApxII溶细胞中和抗体滴度而随机分配成5个组，每组10只猪(在研究开始前，有98％的动物的血清中和效价≤1∶200)。研究开始前让这些猪适应一周。
当这些猪约7.5周大时，在第0天，通过肌内途径(IM；左颈肌肉)给这些动物接种2ml合适的疫苗(带有pp而没有信号序列的APP蛋白质)或安慰剂。3周后，这些动物用第二个2ml剂量加强免疫(IM；右颈肌肉)。表6确定了这5组猪的第一次和第二次免疫所用的疫苗。表6
疫苗组  疫苗成分
A  75μg pp-OmpW75μg pp-OmpA175μg pp-OmpA275μg pp-Omp2075μg pp-Omp2775μg rApxI75μg rApxII75μg rOmlA(5)佐以500μg Quil A/200μg胆固醇
B  75μg rApxI75μg rApxII75μg rOmlA(5)佐以500μg Quil A/200μg胆固醇
C  75μg pp-OmpW75μg pp-OmpA175μg pp-OmpA275μg pp-Omp2075μg pp-Omp27佐以500μg Quil A/200μg胆固醇
D  带有Emulsigen佐剂的市售疫苗(含有血清型1、5和7的完整细胞APP菌苗)
E  佐以500μg Quil A/200μg胆固醇的磷酸缓冲盐水
免疫接种后约1小时内，观察所有猪出现的呕吐、抑郁、腹泻、共济失调、呼吸增加和震颤情况。此外，在第一次和第二次接种后每日进行观察，连续3天。记录接种前一天、就在免疫接种前、接种后6小时和接种后1天的直肠温度。
第二次接种后两周，这些猪用APP血清型-1的活强毒培养物(ATCC菌株27088)进行鼻内攻击，该培养物会导致未免疫猪达到约50％死亡率。使用含有1.5×107cfu/ml的1.0ml培养物(每个鼻孔0.5ml)。将所有动物麻醉，然后用由50mg/ml telazol、50mg/ml赛拉嗪、和50mg/ml***组成的混合物以1.0ml/50磅体重的比例经肌内注射进行攻击。10.2.结果
在用本发明的重组蛋白质进行了第一次或第二次接种后，未看到明显的体温升高。与所有其他组相比，接受市售疫苗的动物观察到显著的接种后部位反应(表7)。没有一只接受单独的新的APP蛋白质的动物(C组)显示出接种后部位反应，接受新的APP蛋白质的第二次接种和接受ApxI/ApxII/OmlA(5)组合物的组(A组)中只有1只动物出现了接种后部位反应。表7
疫苗组 第一次接种部位反应(CM3)*(受影响的动物％) 第二次接种部位反应(CM3)*(受影响的动物％)
A 0(0) 2(10)
B 2(10) 17(30)
C 0(0) 0(0)
D 16(30) 68(70)
E 0(0) 0(0)
*数目代表组平均数
用所有新的APP蛋白质加ApxI/ApxII/OmlA(5)进行接种的组A的死亡率比其他任何一组都低，包括市售疫苗组(30％比60％)(表8)。与组B、C和对照组相比，组A的肺破坏数量(％损害)也少，但与接受市售疫苗组(组D)的动物的肺破坏情况类似。表8
疫苗组 平均损害(％) 死亡率(％)
A 58 30
B 73 70
C 67 70
D 55 60
E 73 60
这些结果显示，由本发明的新APP蛋白质结合毒素抗原组成的疫苗提供了对抗异源APP攻击的保护作用，这种保护等效或优于商品疫苗。11.实施例：质粒和保藏物的制备
制备编码每种APP蛋白质的分离的质粒构成物，以用于美国菌种保藏中心(ATCC)保藏。每种构成物含有编码带有其天然信号序列的特定APP蛋白质的总ORF。将这些ORF***乳糖启动子相对方向的pCR2.1Topo的TA克隆部位。利用下表9中所列的引物通过PCR从APP血清型-7基因组DNA得到这些ORF。宿主细胞是大肠杆菌Top10。宿主细胞和载体都可从Invitrogen(Carlsbad，CA)得到。所有5’引物均从各ORF的ATG起始密码子开始。
如上所述制备并列于下表9中的菌株于1998年10月15日在ATCC保藏，地址为10801 University Blvd，Manassas，VA，20110，美国；登记号如下所列。表9
蛋白质  5’引物(SEQ ID NO) 3’引物(SEQ ID NO) 构成物名称  菌株名称  ATCC登记号
Omp20  ER218(89) ER73(51) pER416  Pz416  98926
Omp27  ER219(90) ER94(68) pER417  Pz417  98927
OmpW  ER220(91) RA52(80) pER418  Pz418  98928
OmpA1  ER221(92) RA71(87) pER419  Pz419  98929
OmpA2  ER222(93) RA69(86) pER420  Pz420  98930
上文中引用的所有专利、专利申请和出版物均以其整体结合在此作为参考。
本发明并不限于所述具体实施方案的范围，这些实施方案只是作为本发明的单个方面的个别阐述。功能上等效的组合物和方法都在本发明范围内。
             序列列表<110>辉瑞产品公司<120>新颖的来自大叶性肺炎放线杆菌的蛋白质<130>PC9854A<140><141><160>96<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1018<212>DNA<213>大叶性肺炎放线杆菌<220><221>CDS<222>(272)..(787)<400>1ggttggaaaa caccttatga agtttacttc aaaaaatcgt tgcacttggt ttgacaattc  60aagactaaaa atgaccggtc gtgagctaaa accgcatgac cgtactgtgg atgtgacgat  120tcgtcgtatt cgtaaacact ttgaagatca ccctaataca ccggaaatca ttgtaaccat  180tcatggtgaa ggttaccgtt tttgcggcga gttagagtag taattaaacg cctataagcg  240tttagcatct tctttctaaa aaggacattt t atg aaa aat tta aca gtt tta     292
                               Met Lys Asn Leu Thr Val Leu
                                 1               5gca tta gca ggt tta ttc tct gcg tcg gca ttt gcc gca ccg gtc gga    340Ala Leu Ala Gly Leu Phe Ser Ala Ser Ala Phe Ala Ala Pro Val Gly
     10                  15                  20aat acc ttt acc ggc gta ggc gta ggc gtt gat ctc acc acg gta aaa    388Asn Thr Phe Thr Gly Val Gly Val Gly Val Asp Leu Thr Thr Val Lys
 25                  30                  35tat aaa gtg gac ggt gtg aaa ggt aaa caa tca acc ggt cct gcg tta    436Tyr Lys Val Asp Gly Val Lys Gly Lys Gln Ser Thr Gly Pro Ala Leu40                  45                  50                  55gtc gta gat tac ggt atg gat tac ggt gac aat ttt gtc ggt gtt gta    484Val Val Asp Tyr Gly Met Asp Tyr Gly Asp Asn Phe Val Gly Val Val
             60                  65                  70caa ggt aaa gta aaa gta ggc agt aca aaa gta ttt agc gat gta aaa    532Gln Gly Lys Val Lys Val Gly Ser Thr Lys Val Phe Ser Asp Val Lys
         75                  80                  85caa aaa act aaa tat act gtc gct tat caa caa ggt tat cgt gta gct    580Gln Lys Thr Lys Tyr Thr Val Ala Tyr Gln Gln Gly Tyr Arg Val Ala
     90                  95                 100tct gat tta ctt ccg tat gtc aaa gtc gat gtg gcg caa agt aaa gtc   628Set Asp Leu Leu Pro Tyr Val Lys Val Asp Val Ala Gln Ser Lys Val
105                 110                 115ggc gat acc aat ttc cgt ggt tac ggt tac ggt gcc ggt gct aaa tat   676Gly Asp Thr Asn Phe Arg Gly Tyr Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Lys Tyr120                 125                 130                 135gcc gta tca agt aat gta gaa gtg ggt gcg gaa tat acg cgc agc aat   724Ala Val Ser Set Asn Val Glu Val Gly Ala Glu Tyr Thr Arg Ser Asn
            140                 145                 150tta aga aaa agc ggt gct aaa tta aaa ggt aat gaa ttt act gcg aac   772Leu Arg Lys Ser Gly Ala Lys Leu Lys Gly Asn Glu Phe Thr Ala Ash
        155                 160                 165cta ggt tac cgt ttc taattatttt tcccttatga caagcggtcg tttcttgcaa   827Leu Gly Tyr Arg Phe
    170aaaatttgcg aaaaacgacc gcttattttt ttattaatac tttatttact gagccatttt 887ttcagctacg gttagaaaac cgtctgcagt cgcatagatt tcttcaaagc cttgcgcttg 947tagaatacgg tcggacactt cacgaaatgc gccctctcca cctgcctttt ctaatatcca 1007atccgctttt g                                                      1018<210>2<211>172<212>PRT<213>大叶性肺炎放线杆菌<400>2Met Lys Asn Leu Thr Val Leu Ala Leu Ala Gly Leu Phe Ser Ala Ser1               5                  10                  15Ala Phe Ala Ala Pro Val Gly Asn Thr Phe Thr Gly Val Gly Val Gly
         20                  25                  30Val Asp Leu Thr Thr Val Lys Tyr Lys Val Asp Gly Val Lys Gly Lys
     35                  40                  45Gln Ser Thr Gly Pro Ala Leu Val Val Asp Tyr Gly Met Asp Tyr Gly
 50                  55                  60Asp Asn Phe Val Gly Val Val Gln Gly Lys Val Lys Val Gly Ser Thr65                  70                  75                  80Lys Val Phe Ser Asp Val Lys Gln Lys Thr Lys Tyr Thr Val Ala Tyr
             85                  90                  95Gln Gln Gly Tyr Arg Val Ala Ser Asp Leu Leu Pro Tyr Val Lys Val
        100                 105                 110Asp Val Ala Gln Ser Lys Val Gly Asp Thr Asn Phe Arg Gly Tyr Gly
    115                 120                 125Tyr Gly Ala Gly Ala Lys Tyr Ala Val Ser Ser Asn Val Glu Val Gly
130                 135                 140Ala Glu Tyr Thr Arg Ser Asn Leu Arg Lys Ser Gly Ala Lys Leu Lys145                 150                 155                 160Gly Asn Glu Phe Thr Ala Asn Leu Gly Tyr Arg Phe
            165                 170<210>3<211>1188<212>DNA<213>大叶性肺炎放线杆菌<220><221>CDS<222>(376)..(1020)<400>3ctaacgcata aagtaaatgt gccggttcaa tgtagttatt atcttttccg atagctaacg  60attgggcttc tgcaagggct tcttgcaatt tggtagtaaa tttttcgaaa ttcatatttt  120tactcctaaa tttcattaat ctgtatcgag cagaatttat accgcttcaa cgttttaata  180aatggagcta gtcgaactta tttcaagtga aaatgtgaaa aagatcgcaa aaaataaatt  240agtacctcgt tgtaggtact aaaatggcgt atatttgatt cttgtcaata aaagttagcc  300gaattgttct tagaatgtta ttaacgtaac gaattggtta cttttttatt tttaagaaaa  360tattaagagg tcaaa atg aaa aaa gca gta tta gcg gca gta tta ggc ggt   411
             Met Lys Lys Ala Val Leu Ala Ala Val Leu Gly Gly
               1               5                  10gcg tta tta gcg ggt tcg gca atg gca cat caa gcg ggc gat gtg att    459Ala Leu Leu Ala Gly Ser Ala Met Ala His Gln Ala Gly Asp Val Ile
     15                  20                  25ttc cgt gcc ggt gcg atc ggt gtg att gca aat tca agt tcg gat tat    507Phe Arg Ala Gly Ala Ile Gly Val Ile Ala Asn Ser Ser Ser Asp Tyr
 30                  35                  40caa acc ggg gcg gac gta aac tta gat gta aat aat aat att cag ctt    555Gln Thr Gly Ala Asp Val Asn Leu Asp Val Asn Asn Asn Ile Gln Leu45                  50                  55                  60ggt tta acc ggt acc tat atg tta agt gat aat tta ggt ctt gaa tta    603Gly Leu Thr Gly Thr Tyr Met Leu Ser Asp Asn Leu Gly Leu Glu Leu
             65                  70                  75tta gcg gca aca ccg ttt tct cac aaa atc acc ggt aag tta ggt gca    651Leu Ala Ala Thr Pro Phe Ser His Lys Ile Thr Gly Lys Leu Gly Ala
         80                  85                  90aca gat tta ggc gaa gtg gca aaa gta aaa cat ctt ccg ccg agc ctt   699Thr Asp Leu Gly Glu Val Ala Lys Val Lys His Leu Pro Pro Ser Leu
     95                 100                 105tac tta caa tat tat ttc ttt gat tct aat gcg aca gtt cgt cca tac   747Tyr Leu Gln Tyr Tyr Phe Phe Asp Ser Asn Ala Thr Val Arg Pro Tyr
110                 115                 120gtt ggt gcc ggt tta aac tat act cgc ttt ttc agt gct gaa agt tta   795Val Gly Ala Gly Leu Asn Tyr Thr Arg Phe Phe Ser Ala Glu Ser Leu125                 130                 135                 140aaa ccg caa tta gta caa aac tta cgt gtt aaa aaa cat tcc gtc gca   843Lys Pro Gln Leu Val Gln Asn Leu Arg Val Lys Lys His Ser Val Ala
            145                 150                 155ccg att gcg aat tta ggt gtt gat gtg aaa tta acg gat aat cta tca   891Pro Ile Ala Asn Leu Gly Val Asp Val Lys Leu Thr Asp Asn Leu Set
        160                 165                 170ttc aat gcg gca gct tgg tac aca cgt att aaa act act gcc gat tat   939Phe Asn Ala Ala Ala Trp Tyr Thr Arg Ile Lys Thr Thr Ala Asp Tyr
    175                 180                 185gat gtt ccg gga tta ggt cat gta agt aca ccg att act tta gat cct   987Asp Val Pro Gly Leu Gly His Val Ser Thr Pro Ile Thr Leu Asp Pro
190                 195                 200gtt gta tta ttc tca ggt att agc tac aaa ttc taagtatttt gaaactgtta 1040Val Val Leu Phe Ser Gly Ile Ser Tyr Lys Phe205                 210                 215tgagaaaggg agcgttaatc gctccctttt tgttgtaaaa aatccttgaa aaacgaccgc 1100ttgttaagca caaaaatgta ggatcatttt agtgagcaat tcacgagtcg gctcaataaa 1160ttttgtttct aaaaattcat ccggctgg                                    1188<210>4<211>215<212>PRT<213>大叶性肺炎放线杆菌<400>4Met Lys Lys Ala Val Leu Ala Ala Val Leu Gly Gly Ala Leu Leu Ala1               5                  10                  15Gly Ser Ala Met Ala His Gln Ala Gly Asp Val Ile Phe Arg Ala Gly
         20                  25                  30Ala Ile Gly Val Ile Ala Asn Ser Ser Ser Asp Tyr Gln Thr Gly Ala
     35                  40                  45Asp Val Asn Leu Asp Val Asn Asn Asn Ile Gln Leu Gly Leu Thr Gly
 50                  55                  60Thr Tyr Met Leu Ser Asp Asn Leu Gly Leu Glu Leu Leu Ala Ala Thr65                  70                  75                  80Pro Phe Ser His Lys Ile Thr Gly Lys Leu Gly Ala Thr Asp Leu Gly
             85                  90                  95Glu Val Ala Lys Val Lys His Leu Pro Pro Ser Leu Tyr Leu Gln Tyr
        100                 105                 110Tyr Phe Phe Asp Ser Asn Ala Thr Val Arg Pro Tyr Val Gly Ala Gly
    115                 120                 125Leu Asn Tyr Thr Arg Phe Phe Ser Ala Glu Ser Leu Lys Pro Gln Leu
130                 135                 140Val Gln Asn Leu Arg Val Lys Lys His Ser Val Ala Pro Ile Ala Asn145                 150                 155                 160Leu Gly Val Asp Val Lys Leu Thr Asp Asn Leu Ser Phe Asn Ala Ala
            165                 170                 175Ala Trp Tyr Thr Arg Ile Lys Thr Thr Ala Asp Tyr Asp Val Pro Gly
        180                 185                 190Leu Gly His Val Ser Thr Pro Ile Thr Leu Asp Pro Val Val Leu Phe
    195                 200                 205Ser Gly Ile Ser Tyr Lys Phe
210                 215<210>5<211>1171<212>DNA<213>大叶性肺炎放线杆菌<220><221>CDS<222>(157)..(930)<400>5tatttgagct taggctttaa taaagctcga atcctaagcc aggaaatata gaaagtacat 60taaatataat ttagtattgt attaatagag gataaagcca caaactggca agcaagaatt 120ggttttactt tttaacctca ctaaaaggag acaact atg aaa cat agc aaa ttc   174
                                    Met Lys His Ser Lys Phe
                                      1               5aaa tta ttt aaa tat tat tta att agc ttt cct ttt att act ttt gca   222Lys Leu Phe Lys Tyr Tyr Leu Ile Ser Phe Pro Phe Ile Thr Phe Ala
         10                  15                  20agt aat gtt aat gga gcc gaa att gga ttg gga gga gcc cgt gag agt    270Ser Asn Val Asn Gly Ala Glu Ile Gly Leu Gly Gly Ala Arg Glu Ser
     25                  30                  35agt att tac tat tct aaa cat aaa gta gca aca aat ccc ttt tta gca    318Ser Ile Tyr Tyr Ser Lys His Lys Val Ala Thr Asn Pro Phe Leu Ala
 40                  45                  50ctt gat ctt tct tta ggt aat ttt tat atg aga ggg act gca gga att    366Leu Asp Leu Ser Leu Gly Asn Phe Tyr Met Arg Gly Thr Ala Gly Ile55                  60                  65                  70agc gaa ata gga tat gaa caa tct ttc act gac aat ttc agc gta tca    414Ser Glu Ile Gly Tyr Glu Gln Ser Phe Thr Asp Asn Phe Ser Val Ser
             75                  80                  85ctg ttt gtt aac cca ttt gat ggt ttt tca att aaa gga aaa gac ttg    462Leu Phe Val Asn Pro Phe Asp Gly Phe Ser Ile Lys Gly Lys Asp Leu
         90                  95                 100tta cct gga tat caa agt att caa act cgc aaa act caa ttt gcc ttt    510Leu Pro Gly Tyr Gln Ser Ile Gln Thr Arg Lys Thr Gln Phe Ala Phe
    105                 110                 115ggt tgg gga tta aat tat aat ttg gga ggt tta ttc ggc tta aat gat    558Gly Trp Gly Leu Asn Tyr Asn Leu Gly Gly Leu Phe Gly Leu Asn Asp
120                 125                 130act ttt ata tcc ttg gaa gga aaa agc gga aaa cgt ggt gcg agt agt    606Thr Phe Ile Ser Leu Glu Gly Lys Ser Gly Lys Arg Gly Ala Ser Ser135                 140                 145                 150aat gtc agc tta ctt aaa tcg ttt aat atg acg aaa aat tgg aaa gtt    654Asn Val Ser Leu Leu Lys Ser Phe Asn Met Thr Lys Asn Trp Lys Val
            155                 160                 165tca cca tat att ggc tca agt tat tat tca tct aaa tat aca gat tat    702Ser Pro Tyr Ile Gly Ser Ser Tyr Tyr Ser Ser Lys Tyr Thr Asp Tyr
        170                 175                 180tac ttt ggt att aaa caa tcc gaa tta ggt aat aaa att aca tcc gta    750Tyr Phe Gly Ile Lys Gln Ser Glu Leu Gly Asn Lys Ile Thr Ser Val
    185                 190                 195tat aaa cct aaa gca gct tat gca aca cac ata ggt att aat act gat    798Tyr Lys Pro Lys Ala Ala Tyr Ala Thr His Ile Gly Ile Asn Thr Asp
200                 205                 210tat gct ttc acg aac aat ctt ggc atg ggt tta tct gtc ggt tgg aat    846Tyr Ala Phe Thr Asn Asn Leu Gly Met Gly Leu Ser Val Gly Trp Asn215                 220                 225                 230aaa tat tct aaa gaa att aag caa tct cct atc ata aaa cga gac tct    894Lys Tyr Ser Lys Glu Ile Lys Gln Ser Pro Ile Ile Lys Arg Asp Ser
            235                 240                 245caa ttt act tca tct ctt agc ctt tat tat aag ttc taaaatagaa         940Gln Phe Thr Ser Ser Leu Ser Leu Tyr Tyr Lys Phe
        250                 255tattctaggg agaatactca ttctttatct ttataaagtt aattgtttct ccctgtttct  1000atattattta gttacttgtt caaaagctac attggttatt ttgtcatttt ataaaagata  1060ataaggtggt tattttgaaa attaagaaat atattaaata taccctattt actttccttt  1120taggcatatc atatttatat tttgggggcg aaaacgaaaa ttatcaagag a           1171<210>6<211>258<212>PRT<213>大叶性肺炎放线杆菌<400>6Met Lys His Ser Lys Phe Lys Leu Phe Lys Tyr Tyr Leu Ile Ser Phe1               5                  10                  15Pro Phe Ile Thr Phe Ala Ser Asn Val Asn Gly Ala Glu Ile Gly Leu
         20                  25                  30Gly Gly Ala Arg Glu Ser Ser Ile Tyr Tyr Ser Lys His Lys Val Ala
     35                  40                  45Thr Asn Pro Phe Leu Ala Leu Asp Leu Ser Leu Gly Asn Phe Tyr Met
 50                  55                  60Arg Gly Thr Ala Gly Ile Ser Glu Ile Gly Tyr Glu Gln Ser Phe Thr65                  70                  75                  80Asp Asn Phe Ser Val Ser Leu Phe Val Asn pro Phe Asp Gly Phe Ser
             85                  90                  95Ile Lys Gly Lys Asp Leu Leu Pro Gly Tyr Gln Ser Ile Gln Thr Arg
        100                 105                 110Lys Thr Gln Phe Ala Phe Gly Trp Gly Leu Asn Tyr Asn Leu Gly Gly
    115                 120                 125Leu Phe Gly Leu Asn Asp Thr Phe Ile Ser Leu Glu Gly Lys Ser Gly
130                 135                 140Lys Arg Gly Ala Ser Ser Asn Val Ser Leu Leu Lys Ser Phe Asn Met145                 150                 155                 160Thr Lys Asn Trp Lys Val Ser Pro Tyr Ile Gly Ser Ser Tyr Tyr Ser
            165                 170                 175Ser Lys Tyr Thr Asp Tyr Tyr Phe Gly Ile Lys Gln Ser Glu Leu Gly
        180                 185                 190Asn Lys Ile Thr Ser Val Tyr Lys Pro Lys Ala Ala Tyr Ala Thr His
    195                 200                 205Ile Gly Ile Asn Thr Asp Tyr Ala Phe Thr Asn Asn Leu Gly Met Gly
210                 215                 220Leu Ser Val Gly Trp Asn Lys Tyr Ser Lys Glu Ile Lys Gln Ser Pro225                 230                 235                 240Ile Ile Lys Arg Asp Ser Gln Phe Thr Ser Ser Leu Ser Leu Tyr Tyr
            245                 250                 255Lys Phe<210>7<211>1922<212>DNA<213>大叶性肺炎放线杆菌<220><221>CDS<222>(614)..(1705)<400>7acggtaacta cttattcttc tcatgttgca acgccaattc ttgcagagaa attaatcccg  60atgttacaaa aaggcgactt aggggagccg acacctgctg ctgaaatcga caacgtttac  120ttacgtgata tcaacgatgc aatccgtaac catccggttg aattaatcgg tcaagagtta  180cgtggttata tgacggatat gaaacgtatt tcatcgcaag gttaattaaa aattaatcaa  240aagcctactt cgcaagaagt gggctttttg ttattcaagc cgcttaccgc tatcaatggt  300aagtgatatg cataatagct tataaattat aagttgtttt aagcaaatat atctctatcg  360gtaagtaaaa aattaattgt agatcattaa aaaacggata aaaaaatcta ttttttgagt  420gaattacgca taaaaaatga tctaaattat aggtttagtt gtatttttca atttttattt  480ggtagaatac aactgtaata aaagcttaat tattttgaga tacacataaa ataatttacg  540gctttattca ttatcccttt taggttaggg atttgtcttt aatagatgac gataaattta  600gaggatcatc aaa atg aaa aaa tca tta gtt gct tta aca gta tta tcg     649
           Met Lys Lys Ser Leu Val Ala Ieu Thr Val Leu Ser
             1               5                  10gct gca gcg gta gct caa gca gcg cca caa caa aat act ttc tac gca    697Ala Ala Ala Val Ala Gln Ala Ala Pro Gln Gln Asn Thr Phe Tyr Ala
     15                  20                  25ggt gcg aaa gca ggt tgg gcg tca ttc cat gat ggt atc gaa caa tta    745Gly Ala Lys Ala Gly Trp Ala Ser Phe His Asp Gly Ile Glu Gln Leu
 30                  35                  40gat tca gct aaa asc aca gat cgc ggt acs aaa tac ggt atc aac cgt    793Asp Ser Ala Lys Asn Thr Asp Arg Gly Thr Lys Tyr Gly Ile Asn Arg45                  50                  55                  60aat tca gta act tac ggc gta ttc ggc ggt tac caa att tta aac caa    841Asn Ser Val Thr Tyr Gly Val Phe Gly Gly Tyr Gln Ile Leu Asn Gln
             65                  70                  75gac aaa tta ggt tta gcg gct gaa tta ggt tat gac tat ttc ggt cgt    889Asp Lys Leu Gly Leu Ala Ala Glu Leu Gly Tyr Asp Tyr Phe Gly Arg
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     95                 100                 105cgt cac gct gca cac ggt gcg aca atc gca tta aaa cct agc tac gaa    985Arg His Ala A1a His Gly Ala Thr Ile Ala Leu Lys Pro Ser Tyr Glu
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190                 195                 200tac cgt tcg gat atc agt tcc gta tct gca ggt tta agc tac cgt ttc    1273Tyr Arg Ser Asp Ile Ser Ser Val Ser Ala Gly Leu Ser Tyr Arg Phe205                 210                 215                 220ggt caa ggt gcg gta ccg gtt gca gct ccg gca gtt gaa act aaa aac    1321Gly Gln Gly Ala Val Pro Val Ala Ala Pro Ala Val Glu Thr Lys Asn
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270                 275                 280cgt atc ggt aaa gaa gct tca aac tta aaa ctt tca caa cgt cgt gcg    1513Arg Ile Gly Lys Glu Ala Ser Asn Leu Lys Leu Ser Gln Arg Arg Ala285                 290                 295                 300gaa aca gta gct aac tac atc gtt tct aaa ggt gct ccg gca gct aac    1561Glu Thr Val Ala Asn Tyr Ile Val Ser Lys Gly Ala Pro Ala Ala Asn
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        320                 325                 330tgt gac aaa gtt aaa ggt cgt aaa gca tta atc gct tgc tta gca ccg    1657Cys Asp Lys Val Lys Gly Arg Lys Ala Leu Ile Ala Cys Leu Ala Pro
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350                 355                 360taatttagtt aattttctaa agttaaatta gtaaccctct tgcttattta agcaagaggg  1765ttattttttt gttccatttt aattagtgct actcttcctg tgtttatatt tgtgtttatg  1825ataaactctt cataactttt attcacttat agatgaaaat gaaatacagc ttaacccctt  1885tccatacctt tcatttagcg acaaatgcaa caaaatc                           1922<210>8<211>364<212>PRT<213>大叶性肺炎放线杆菌<400>8Met Lys Lys Ser Leu Val Ala Leu Thr Val Leu Ser Ala Ala Ala Val1               5                  10                  15Ala Gln Ala Ala Pro Gln Gln Asn Thr Phe Tyr Ala Gly Ala Lys Ala
         20                  25                  30Gly Trp Ala Ser Phe His Asp Gly Ile Glu Gln Leu Asp Ser Ala Lys
     35                  40                  45Asn Thr Asp Arg Gly Thr Lys Tyr Gly Ile Asn Arg Asn Ser Val Thr
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        180                 185                 190Ser Tyr Ser Thr Leu Asn Arg Met Gly Ala Thr Asp Tyr Arg Ser Asp
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    275                 280                 285Glu Ala Ser Asn Leu Lys Leu Ser Gln Arg Arg Ala Glu Thr Val Ala
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    355                 360<210>9<211>1319<212>DNA<213>大叶性肺炎放线杆菌<220><221>CDS<222>(197)..(1303)<400>9atgtaatatt aggactggaa agttcgaaat tacaaattga tattacaaat tgattgtagt  60tttgcttttt atccttgata attaactctc ttttttctct agtgagacga gagcattaaa  120tcaaaacttt ggtgccataa gcggtgctga agtgattttg ttttattaat cgatgacaat  180ttagaggatc atcaaa atg aaa aaa tca tta gtt gct tta gca gta tta tca  232
              Met Lys Lys Ser Leu Val Ala Leu Ala Val Leu Ser
                1               5                  10gct gca gca gta gct caa gca gct cea caa caa aat act ttc tac gca    280Ala Ala Ala Val Ala Gln Ala Ala Pro Gln Gln Asn Thr Phe Tyr Ala
     15                  20                  25ggt gcg aaa gtt ggt caa tca tca ttt cac cac ggt gtt aac caa tta    328Gly Ala Lys Val Gly Gln Ser Ser Phe His His Gly Val Asn Gln Leu
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130                 135                 140Tyr Gly Ala Glu Asn Thr Asn Glu Pro Thr Glu Lys Phe His Lys Leu145                 150                 155                 160Lys Ala Ser Thr Ile Leu Gly Ala Gly Val Glu Tyr Ala Ile Leu Pro
            165                 170                 175Glu Leu Ala Ala Arg Val Glu Tyr Gln Tyr Leu Asn Lys Ala Gly Asn
        180                 185                 190Leu Asn Lys Ala Leu Val Arg Ser Gly Thr Gln Asp Val Asp Phe Gln
    195                 200                 205Tyr Ala Pro Asp Ile His Ser Val Thr Ala Gly Leu Ser Tyr Arg Phe
210                 215                 220Gly Gln Gly Ala Val Ala Pro Val Val Glu Pro Glu Val Val Thr Lys225                 230                 235                 240Asn Phe Ala Phe Ser Ser Asp Val Leu Phe Asp Phe Gly Lys Ser Ser
            245                 250                 255Leu Lys Pro Ala Ala Ala Thr Ala Leu Asp Ala Ala Asn Thr Glu Ile
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    275                 280                 285Asp Arg Ile Gly Lys Glu Ala Ser Asn Leu Lys Leu Ser Gln Arg Arg
290                 295                 300Ala Glu Thr Val Ala Asn Tyr Leu Val Ser Lys Gly Gln Asn Pro Ala305                 310                 315                 320Asn Val Thr Ala Val Gly Tyr Gly Glu Ala Asn Pro Val Thr Gly Ala
            325                 330                 335Thr Cys Asp Lys Val Lys Gly Arg Lys Ala Leu Ile Ala Cys Leu Ala
        340                 345                 350Pro Asp Arg Arg Val Glu Val Gln Val Gln Gly Ala Lys Asn Val Ala
    355                 360                 365Met<210>11<211>20<212>PRT<213>大叶性肺炎放线杆菌<220><221>位点<222>(18)<223>Xaa＝未知氨基酸<400>11Ala Pro Val Gly Asn Thr Phe Thr Gly Val Lys Val Tyr Val Asp Leu1               5                  10                  15Thr Xaa Val Ala
         20<210>12<211>35<212>PRT<213>大叶性肺炎放线杆菌<220><221>位点<222>(30)<223>Xaa＝Asn或Val<400>12His Gln Ala Gly Asp Val Ile Phe Arg Ala Gly Ala Ile Gly Val Ile1               5                  10                  15Ala Asn Ser Ser Ser Asp Tyr Gln Thr Gln Ala Asp Val Xaa Leu Asp
         20                  25                  30Val Asn Asn
     35<210>13<211>30<212>PRT<213>大叶性肺炎放线杆菌<400>13Ala Glu Ile Gly Leu Gly Gly Ala Arg Glu Ser Ser Ile Tyr Tyr Ser1               5                  10                  15Lys His Lys Val Ala Thr Asn Pro Phe Leu Ala Leu Asp Leu
         20                  25                  30<210>14<211>19<212>PRT<213>大叶性肺炎放线杆菌<220><221>位点<222>(2)<223>Xaa＝Asp或Glu<220><221>位点<222>(14)<223>Xaa＝未知氨基酸<220><221>位点<222>(15)<223>Xaa＝未知氨基酸<220><221>位点<222>(17)<223>Xaa＝未知氨基酸<400>14Ala Xaa Pro Glu Asn Thr Phe Tyr Pro Gly Ala Lys Val Xaa Xaa Ser1               5                  10                  15Xaa Phe His<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>15aaaaatttgc gaaaaacgac                                             20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>16acttctacat tacttgatac                                             20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>17tccgtatgtc aaagtcgatg                                             20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>18taaacaatca accggtcctg                                             20<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物ttaccttgta caacaccgac                                             20<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>20aaaagcagta ttagcggcag                                             20<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>21ttgatgtgcc attgccgaac                                             20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>22gttttaaact ttcagcactg                                             20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>23agttcgtcca tacgttggtg                                             20<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>24aatatatctc tatcggtaag                                             20<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>25ctaaacctat aatttagatc                                             20<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>26tgtttccgca cgacgttgtg                                             20<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>27aagtaaacgg ttacacggac                                             20<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>28atcaaccgta attcagtaac                                             20<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>29atagtcataa cctaattcag                                             20<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>30gtatgggtgc aactgactac                                             20<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>31aacacgtgcc gctaattcag                                             20<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：<400>32tgcttgagct accgctgcag                                             20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>33gcgaaagttg gtcaatcatc                                             20<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>34ataacgatca tcgtgaccag                                             20<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>35tgcgtctaaa gctgttgctg                                             20<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>36atcaagctta aaaccagcag                                             20<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>37ctataaatcc tatggtgcag                                             20<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<22Q><223>人工序列的描述：引物<400>38tgcacctaaa atagttgatg                                             20<210>39<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>39ggggatccgc dccdgtdggh aatacnttta cngg                             34<210>40<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>40ggggatccat ytattatwsw aaacataaag tdgcdacnaa tcc                   43<210>41<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>41ggggatccgt accgcgatct gtgtttttag                                  30<210>42<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>42ggggatccgg tgctccggca gctaacg                                     27<210>43<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>43ggggatccat acttacgtgt tttatcatta taacg                            35<210>44<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>44ggggatccgg tcaaaaccct gcaaacg                                     27<210>45<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>45tttgcccggg ctcttttatt gatttaagtt act                              33<210>46<211>24<212>DNA<213>人工序列 quence<220><223>人工序列的描述：引物<400>46gactaacgca ggaccggttg attg                                        24<210>47<211>31<212>DNA<213>人工序列 uence<220><223>人工序列的描述：引物<400>47ggggatccgt gggtgcggaa tatacgcgca g                                31<210>48<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>48caacgtggat ccgaattcaa gcttc                                       25<210>49<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>49gtcaccgtaa tccataccgt aatg                                        24<210>50<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>50gattgtttac ctttcacacc gtccac                                      26<210>51<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>51tcacccggga aaaatatcta gaaacgg                                     27<210>52<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>52ccgtggtgag atcaacgcct acgcctac                                    28<210>53<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>53cctttcacac cgtccacttt atattttacc gtggtgag                         38<210>54<211>68<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>54gcgcatatga acaccaccac caccaccacc tctcgtgcac cggtcggaaa tacctttacc  60ggcgtagg                                                           68<210>55<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>55caagactaaa aatgaccggt cgtg                                         24<210>56<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>56tgaatttacg accacgtaaa tgttt                                        25<210>57<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>57ctatgtgaaa gcaaaagcgg attgg                                        25<210>58<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>58ccgtccggtt gtttgactaa cgc                                          23<210>59<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>59tcgaacaagc acaccagccg gatg                                        24<210>60<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>60ggcggaatac ggtaactact tattc                                       25<210>61<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>61cgcataaaaa atgatctaaa ttatagg                                     27<210>62<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>62ggggaattca acgattttgc ttgc                                        24<210>63<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>63gaattcttgc tcgtttgaat tagaag                                      26<210>64<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>64ggtaattttt atatgagagg gactg                                       25<210>65<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>65caaacagtga tacgctgaaa ttgtc                                       25<210>66<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>66gcaacacaca taggtattaa tactg                                       25<210>67<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>67gcgcatatga acaccaccac caccaccacc tctcgtgccg aaattggatt gggaggagcc 60cgtgag                                                            66<210>68<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>68gtattctctc tagaatattc tattttag                                    28<210>69<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>69gccacatgaa gaattattat ttgagct                                     27<210>70<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>70acgtgaaaaa taatctcttg ataat                                       25<210>71<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>71cgccatatga acaccaccac caccaccacc tctcgtcatc aggcgggaga tgtgattttc 60<210>72<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>72caycargcdg ghgatgtdat ytt                                         23<210>73<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>73gcdgadccdg araayacdtt yta                                         23<210>74<211>22<212>DNA<213>人工序列Sequence<220><223>人工序列的描述：引物<400>74accggtacct atatgttaag tg                                          22<210>75<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>75ataggtaccg gttaaaccaa gc                                          22<210>76<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>76gttgccgcta ataattcaag acc                                         23<210>77<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>77aayacnttyt ayccdggngc naa                                         23<210>78<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>78nacdckdckr tcnggngcna rrca                                        24<210>79<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>79datytcnacd ckdckrtcng g                                           21<210>80<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>80cgctctagag attttttaca acaaaaaggg                                  30<210>81<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>81gmnaayacnt tytaygyngg ngc                                         23<210>82<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>82aayacnttyt aygynggngc naar                                        24<210>83<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>83cargmnaaya cnttytaygy ngg                                         23<210>84<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>84gcnccncarg mnaayacntt yta                                         23<210>85<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>85cgcgcnccnc argmnaayac ntt                                          23<210>86<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>86cggtcgactg atttaagtta ctaaaaccc                                    29<210>87<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>87cggtcgacgg gttactaatt taactttag                                    29<210>88<211>67<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>88gcgtcgacca tatgaacacc accaccacca ccacctctcg tgcgccacaa caaaatactt  60tytacgc                                                            67<210>89<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>89atgaaaaatt taacagtttt agcattagca gg                                32<210>90<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>90atgaaacata gcaaattcaa attatttaaa tattattt                         38<210>91<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>91atgaaaaaag cagtattagc ggcagtatta gg                               32<210>92<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>92atgaaaaaat cattagttgc tttaacagta ttatcg                           36<210>93<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>93atgaaaaaat cattagttgc tttagcagta ttatca                           36<210>94<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：来自巴斯德氏菌科的OmpA-相关蛋白
 质的N-端共有序列<220><221>位点<222>(4)<223>Xaa＝Ala或Glu<220><221>位点<222>(9)<223>Xaa＝Ala或Val<400>94Ala Pro Gln Xaa Asn Thr Phe Tyr Xaa Gly Ala Lys Ala1               5                  10<210>95<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：来自巴斯德氏菌科的OmpA-相关蛋白
 质的C-端共有序列<400>95Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile1               5                  10<210>96<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：保护性肽<400>96Met Asn Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Arg1               5                  10

Claims (67)

1.一种基本上纯化的蛋白质，它包含一种氨基酸序列，选自由下列序列组成的组：SEQ ID NO：2的约氨基酸残基20至约氨基酸残基172；SEQ ID NO：4的约氨基酸残基22至约氨基酸残基215；SEQ ID NO：6的约氨基酸残基28至约氨基酸残基258；SEQ ID NO：8的约氨基酸残基20至约氨基酸残基364；和SEQ ID NO：10的约氨基酸残基20至约氨基酸残基369。
2.权利要求1的蛋白质，它包含一种氨基酸序列，该氨基酸序列选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10组成的组。
3.一种基本上纯化的多肽，它与包含一种氨基酸序列的蛋白质是同源的，该氨基酸序列选自由下列序列组成的组：SEQ ID NO：2的约氨基酸残基20至约氨基酸残基172；SEQ ID NO：4的约氨基酸残基22至约氨基酸残基215；SEQID NO：6的约氨基酸残基28至约氨基酸残基258；SEQ ID NO：8的约氨基酸残基20至约氨基酸残基364；SEQ ID NO：10的约氨基酸残基20至约氨基酸残基369。
4.权利要求3的多肽，它与包含一种氨基酸序列的多肽是同源的，该氨基酸序列选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10组成的组。
5.一种基本上纯化的多肽，它是一种(a)或(b)的肽片段：(a)包含一种氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列选自由下列序列组成的组：SEQ ID NO：2的约氨基酸残基20至约氨基酸残基172；SEQ ID NO：4的约氨基酸残基22至约氨基酸残基215；SEQ ID NO：6的约氨基酸残基28至约氨基酸残基258；SEQID NO：8的约氨基酸残基20至约氨基酸残基364；SEQ ID NO：10的约氨基酸残基20至约氨基酸残基369；(b)与任意(a)中的多肽同源的多肽。
6.权利要求5的多肽，它是一种包含一种氨基酸序列的多肽的肽片段，该氨基酸序列选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10组成的组。
7.权利要求6的多肽，它包含一种氨基酸序列，该氨基酸序列选自由下列序列组成的组：SEQ ID NO：2的约氨基酸残基1至约氨基酸残基19；SEQ ID NO：4的约氨基酸残基1至约氨基酸残基21；SEQ ID NO：6的约氨基酸残基1至约氨基酸残基27；SEQ ID NO：8的约氨基酸残基1至约氨基酸残基19；SEQ ID NO：10的约氨基酸残基1至约氨基酸残基19。
8.一种融合蛋白，它包含连接于载体或融合配偶体的：(a)一种包含一种氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列选自由下列序列组成的组：SEQ ID NO：2的约氨基酸残基20至约氨基酸残基172；SEQ ID NO：4的约氨基酸残基22至约氨基酸残基215；SEQ ID NO：6的约氨基酸残基28至约氨基酸残基258；SEQ IDNO：8的约氨基酸残基20至约氨基酸残基364；SEQ ID NO：10的约氨基酸残基20至约氨基酸残基369；(b)一种与(a)中的多肽同源的多肽；或(c)一种(a)或(b)中的多肽的肽片段。
9.权利要求8的融合蛋白，其中的融合配偶体选自由保护性肽、β-半乳糖苷酶、trpE、麦芽糖结合蛋白质、谷胱甘肽-S-转移酶和聚组氨酸组成的组。
10.权利要求9的融合蛋白，其中的融合配偶体是一种保护性肽，它包含氨基酸序列Met-Asn-Thr-Thr-Thr-Thr-Thr-Thr-Ser-Arg(SEQ ID NO：96)。
11.一种下列物质的类似物或衍生物：(a)一种包含一种氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列选自由下列序列组成的组：SEQ ID NO：2的约氨基酸残基20至约氨基酸残基172；SEQ ID NO：4的约氨基酸残基22至约氨基酸残基215；SEQ ID NO：6的约氨基酸残基28至约氨基酸残基258；SEQ ID NO：8的约氨基酸残基20至约氨基酸残基364；SEQ ID NO：10的约氨基酸残基20至约氨基酸残基369；(b)一种与(a)中的多肽同源的多肽；(c)一种(a)或(b)中的多肽的肽片段；或(d)一种连接于载体或融合配偶体的融合蛋白，包含一种(a)或(b)的多肽或(c)的肽片段。
12.一种分离的多核苷酸分子，包含编码一种多肽的核苷酸序列，该多肽包含一种选自由下列序列组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的约氨基酸残基20至约氨基酸残基172；SEQ ID NO：4的约氨基酸残基22至约氨基酸残基215；SEQ ID NO：6的约氨基酸残基28至约氨基酸残基258；SEQ ID NO：8的约氨基酸残基20至约氨基酸残基364；SEQ ID NO：10的约氨基酸残基20至约氨基酸残基369。
13.权利要求12的分离的多核苷酸分子，它编码SEQ ID NO：2的约氨基酸残基20至约氨基酸残基172的氨基酸序列，包含SEQ ID NO：1从约nt 329至约nt 790的核苷酸序列.
14.权利要求12的分离的多核苷酸分子，它编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
15.权利要求14的分离的多核苷酸分子，包含SEQ ID NO：1从约nt 272至约nt 790的核苷酸序列。
16.权利要求15的分离的多核苷酸分子，包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
17.权利要求12的分离的多核苷酸分子，它编码SEQ ID NO：4的约氨基酸残基22至约氨基酸残基215的氨基酸序列，包含SEQ ID NO：3从约nt 439至约nt 1023的核苷酸序列。
18.权利要求12的分离的多核苷酸分子，它编码SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
19.权利要求18的分离的多核苷酸分子，包含SEQ ID NO：3从约nt 376至约nt 1023的核苷酸序列。
20.权利要求19的分离的多核苷酸分子，包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
21.权利要求12的分离的多核苷酸分子，它编码SEQ ID NO：6的约氨基酸残基28至约氨基酸残基258的氨基酸序列，包含SEQ ID NO：5从约nt 238至约nt 933的核苷酸序列。
22.权利要求12的分离的多核苷酸分子，它编码SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
23.权利要求22的分离的多核苷酸分子，包含SEQ ID NO：5从约nt 157至约nt 933的核苷酸序列。
24.权利要求23的分离的多核苷酸分子，包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列。
25.权利要求12的分离的多核苷酸分子，它编码SEQ ID NO：8的约氨基酸残基20至约氨基酸残基364的氨基酸序列，包含SEQ ID NO：7从约nt 671至约nt 1708的核苷酸序列。
26.权利要求12的分离的多核苷酸分子，它编码SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
27.权利要求26的分离的多核苷酸分子，包含SEQ ID NO：7从约nt 614至约nt 1708的核苷酸序列。
28.权利要求27的分离的多核苷酸分子，包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列。
29.权利要求12的分离的多核苷酸分子，它编码SEQ ID NO：10的约氨基酸残基20至约氨基酸残基369的氨基酸序列，包含SEQ ID NO：9从约nt 254至约nt 1306的核苷酸序列。
30.权利要求12的分离的多核苷酸分子，它编码SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
31.权利要求30的分离的多核苷酸分子，包含SEQ ID NO：9从约nt 197至约nt 1306的核苷酸序列。
32.权利要求31的分离的多核苷酸分子，包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列。
33.一种分离的多核苷酸分子，它与包含编码来自APP的Omp20、OmpW、Omp27、OmpA1或OmpA2的核苷酸序列的多核苷酸分子是同源的。
34.一种分离的多核苷酸分子，包含一种编码与一种蛋白质同源的多肽的核苷酸序列，该蛋白质具有一种选自由下列序列组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO：2的约氨基酸残基20至约氨基酸残基172；SEQ ID NO：4的约氨基酸残基22至约氨基酸残基215；SEQ ID NO：6的约氨基酸残基28至约氨基酸残基258；SEQ ID NO：8的约氨基酸残基20至约氨基酸残基364；SEQ ID NO：10的约氨基酸残基20至约氨基酸残基369。
35.一种分离的多核苷酸分子，由一种核苷酸序列组成，该核苷酸序列是下列序列的基本部分：(a)一种编码一种多肽的核苷酸序列，该多肽包含选自由下列序列组成的组的一种氨基酸序列：SEQ ID NO：2的约氨基酸残基20至约氨基酸残基172；SEQ ID NO：4的约氨基酸残基22至约氨基酸残基215；SEQID NO：6的约氨基酸残基28至约氨基酸残基258；SEQ ID NO：8的约氨基酸残基20至约氨基酸残基364；SEQ ID NO：10的约氨基酸残基20至约氨基酸残基369；(b)一种与(a)中的核苷酸序列同源的核苷酸序列；或(c)一种编码一种与(a)中的多肽同源的多肽的核苷酸序列。
36.一种分离的多核苷酸分子，包含一种编码一种氨基酸序列的核苷酸序列，该氨基酸序列选自由下列序列组成的组：SEQ ID NO：2的约氨基酸残基1至约氨基酸残基19；SEQ ID NO：4的约氨基酸残基1至约氨基酸残基21；SEQID NO：6的约氨基酸残基1至约氨基酸残基27；SEQ ID NO：8的约氨基酸残基1至约氨基酸残基19；SEQ ID NO：10的约氨基酸残基1至约氨基酸残基19。
37.权利要求36的分离的多核苷酸分子，其中的核苷酸序列选自由下列序列组成的组：SEQ ID NO：1的约nt 272至约nt 328；SEQ ID NO：3的约nt 376至约nt 438；SEQ ID NO：5的约nt 157至约nt 237；SEQ ID NO：7的约nt 614至约nt 670；和SEQ ID NO：9的约nt 197至约nt 253。
38.一种分离的多核苷酸分子，包含一种编码一种融合蛋白的核苷酸序列，该融合蛋白包含：(a)一种包含一种氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列选自由下列序列组成的组：SEQ ID NO：2的约氨基酸残基20至约氨基酸残基172；SEQ ID NO：4的约氨基酸残基22至约氨基酸残基215；SEQ ID NO：6的约氨基酸残基28至约氨基酸残基258；SEQ ID NO：8的约氨基酸残基20至约氨基酸残基364；SEQ ID NO：10的约氨基酸残基20至约氨基酸残基369；(b)一种与(a)中的多肽同源的多肽；或(c)一种(a)或(b)中的多肽的肽片段；该融合蛋白连接于载体或融合配偶体。
39.权利要求38的分离的多核苷酸分子，其中的融合配偶体选自由保护性肽、β-半乳糖苷酶、trpE、麦芽糖结合蛋白质、谷胱甘肽-S-转移酶和聚组氨酸组成的组。
40.权利要求39的分离的多核苷酸分子，其中的融合配偶体是一种保护性肽，它包含氨基酸序列Met-Asn-Thr-Thr-Thr-Thr-Thr-Thr-Ser-Arg(SEQ IDNO：96)。
41.一种寡核苷酸分子，在非常严格的条件下能够与由一种核苷酸序列组成的多核苷酸分子杂交，该核苷酸序列选自SEQ ID NOS：1、3、5、7或9，或者与一种由一种核苷酸序列组成的多核苷酸分子杂交，该核苷酸序列是选自SEQ ID NOS：1、3、5、7或9的一种核苷酸序列的互补体。
42.权利要求41的寡核苷酸分子，包含一种核苷酸序列，该核苷酸序列选自由SEQ ID NOS：15-47和49-93组成的组。
43.一种重组载体，包含权利要求12的多核苷酸分子或一种它的同源多核苷酸分子。
44.权利要求43的重组载体，包含一种包含SEQ ID NO：1从约nt 329至约nt 790的核苷酸序列的多核苷酸分子或它的同源多核苷酸分子。
45.权利要求44的重组载体，它是一种与存在于Pz416菌株(ATCC 98926)的宿主细胞中的质粒pER416相同的质粒。
46.权利要求43的重组载体，包含一种包含SEQ ID NO：3从约nt 439至约nt 1023的核苷酸序列的多核苷酸分子或它的同源多核苷酸分子。
47.权利要求46的重组载体，它是一种与存在于Pz418菌株(ATCC 98928)的宿主细胞中的质粒pER418相同的质粒。
48.权利要求43的重组载体，包含一种包含SEQ ID NO：5从约nt 238至约nt 933的核苷酸序列的多核苷酸分子或它的同源多核苷酸分子。
49.权利要求48的重组载体，它是一种与存在于Pz417菌株(ATCC 98927)的宿主细胞中的质粒pER417相同的质粒。
50.权利要求43的重组载体，包含一种包含SEQ ID NO：7从约nt 671至约nt 1708的核苷酸序列的多核苷酸分子或它的同源多核苷酸分子。
51.权利要求50的重组载体，它是一种与存在于Pz419菌株(ATCC 98929)的宿主细胞中的质粒pER419相同的质粒。
52.权利要求43的重组载体，包含一种包含SEQ ID NO：9从约nt 254至约nt 1306的核苷酸序列的多核苷酸分子或它的同源多核苷酸分子。
53.权利要求52的重组载体，它是一种与存在于Pz420菌株(ATCC 98930)的宿主细胞中的质粒pER420相同的质粒。
54.一种重组载体，包含权利要求34、35、36或38的多核苷酸分子。
55.一种转化的宿主细胞，包含权利要求43或54的重组载体。
56.一种抗APP疫苗，包含一种免疫学上有效量的本发明的抗原和一种兽医上可接受的载体或稀释剂，该抗原选自由下列物质组成的组：(a)一种包含一种氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列选自由下列序列组成的组：SEQ ID NO：2的约氨基酸残基20至约氨基酸残基172；SEQ ID NO：4的约氨基酸残基22至约氨基酸残基215；SEQ ID NO：6的约氨基酸残基28至约氨基酸残基258；SEQID NO：8的约氨基酸残基20至约氨基酸残基364；SEQ ID NO：10的约氨基酸残基20至约氨基酸残基369；(b)一种与(a)中的多肽同源的多肽；(c)一种(a)或(b)中的多肽的肽片段；(d)一种连接于载体或融合配偶体的融合蛋白，包含(a)或(b)中的多肽或(c)中的肽片段；(e)一种(a)或(b)中的多肽、或(c)中的肽片段、或(d)中的融合蛋白的类似物或衍生物；或(f)一种编码(a)或(b)中的多肽、或(c)中的肽片段、或(d)中的融合蛋白、或(e)中的类似物或衍生物的多核苷酸分子；该抗原能够诱导或有助于诱导猪抗APP的保护性应答。
57.权利要求56的疫苗，进一步包含一种免疫调节成分。
58.权利要求57的疫苗，其中的免疫调节成分是一种佐剂。
59.权利要求56的疫苗，进一步包含免疫学上有效量的另一种抗原，该抗原能够诱导或有助于诱导一种对抗能影响猪的一种疾病或病理学状态的保护性应答。
60.一种能够保护猪抗APP的疫苗的制备方法，包括将一种免疫学上有效量的本发明抗原与一种兽医上可接受的载体或稀释剂混合为一种适合于对猪给药的剂型，该抗原选自由下列物质组成的组：(a)一种包含一种氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列选自由下列序列组成的组：SEQ ID NO：2的约氨基酸残基20至约氨基酸残基172；SEQ ID NO：4的约氨基酸残基22至约氨基酸残基215；SEQ ID NO：6的约氨基酸残基28至约氨基酸残基258；SEQ ID NO：8的约氨基酸残基20至约氨基酸残基364；SEQ ID NO：10的约氨基酸残基20至约氨基酸残基369；(b)一种与(a)中的多肽同源的多肽；(c)一种(a)或(b)中的多肽的肽片段；(d)一种连接于载体或融合配偶体的融合蛋白，包含(a)或(b)中的多肽或(c)中的肽片段；(e)一种(a)或(b)中的多肽、或(c)中的肽片段、或(d)中的融合蛋白的类似物或衍生物；或(f)一种编码(a)或(b)中的多肽、或(c)中的肽片段、或(d)中的融合蛋白、或(e)中的类似物或衍生物的多核苷酸分子；该抗原能够诱导或有助于诱导猪抗APP的保护性应答。
61.一种接种猪抗APP疫苗的方法，包括将权利要求56的疫苗对猪给药。
62.一种用于猪抗APP疫苗接种的疫苗试剂盒，包括一个含有免疫学上有效量的一种或几种权利要求56中的抗原的容器。
63.权利要求62的试剂盒，进一步包括一个含有一种兽医上可接受的载体或稀释剂的第二容器。
64.一种分离的抗体，该抗体与一种包含一种氨基酸序列的多肽特异性地结合，该氨基酸序列选自由下列序列组成的组：SEQ ID NO：2的约氨基酸残基20至约氨基酸残基172；SEQ ID NO：4的约氨基酸残基22至约氨基酸残基215；SEQ ID NO：6的约氨基酸残基28至约氨基酸残基258；SEQ ID NO：8的约氨基酸残基20至约氨基酸残基364；SEQ ID NO：10的约氨基酸残基20至约氨基酸残基369。
65.一种诊断试剂盒，包括一个第一容器，容器中含有与抗APP抗原的猪抗体特异性地结合的：(a)一种包含一种氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列选自由下列序列组成的组：SEQ ID NO：2的约氨基酸残基20至约氨基酸残基172；SEQ ID NO：4的约氨基酸残基22至约氨基酸残基215；SEQ ID NO：6的约氨基酸残基28至约氨基酸残基258；SEQ ID NO：8的约氨基酸残基20至约氨基酸残基364；SEQ ID NO：10的约氨基酸残基20至约氨基酸残基369；(b)一种与(a)中的多肽同源的多肽；(c)一种(a)或(b)中的多肽的肽片段；(d)一种连接于载体或融合配偶体的融合蛋白，包含(a)或(b)中的多肽或(c)中的肽片段；或(e)(a)或(b)中的多肽、或(c)中的肽片段、或(d)中的融合蛋白的类似物或衍生物；还包括一个含有一种抗猪抗体的第二抗体的第二容器。
66.一种诊断试剂盒，包括一个第一容器，容器中含有一种与APP蛋白质结合的初级抗体，所述APP蛋白质包含一种氨基酸序列，该氨基酸序列选自由下列序列组成的组：SEQ ID NO：2的约氨基酸残基20至约氨基酸残基172；SEQID NO：4的约氨基酸残基22至约氨基酸残基215；SEQ ID NO：6的约氨基酸残基28至约氨基酸残基258；SEQ ID NO：8的约氨基酸残基20至约氨基酸残基364；SEQ ID NO：10的约氨基酸残基20至约氨基酸残基369；还包括一个第二容器，容器中含有一种第二抗体，该第二抗体与APP蛋白质上不同表位结合或者对抗初级抗体。
67.一种诊断试剂盒，包括一个容器，容器中含有一种本发明的多核苷酸分子或寡核苷酸分子，该分子能够特异性地与一种APP特异的多核苷酸分子杂交或者特异性扩增一种APP特异的多核苷酸分子。
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