CN1258315A

CN1258315A - 哺乳动物细胞因子样因子7

Info

Publication number: CN1258315A
Application number: CN98805634A
Authority: CN
Inventors: S·R·普雷斯尼尔; T·吉尔伯特
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1997-04-25
Filing date: 1998-04-23
Publication date: 2000-06-28
Also published as: NO995182L; AU7152798A; EP0977861A1; CA2288360A1; EA199900869A1; ES2223127T3; JP4216343B2; IL132496A0; PL336470A1; DE69824719D1; JP2002509432A; DE69824719T2; AU736362B2; BR9809778A; NZ500885A; ATE269901T1; KR20010012111A; WO1998049310A1; NO995182D0; EP0977861B1

Abstract

新型哺乳类Zcyto7多肽,编码该多肽的多核苷酸,以及包括抗体和抗独特型抗体在内的相关组合物和方法。

Description

哺乳动物细胞因子样因子7

发明背景

多细胞生物的细胞增殖和分化是受激素和多肽生长因子控制的。这些可扩散的分子使得细胞间相互交流并共同作用形成细胞和器官，且修复和再生受损组织。激素和生长因子的例子包括类固醇激素(如***、睾酮)、甲状旁腺激素、促滤泡激素、白细胞介素、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、***(EPO)和降钙素。

激素和生长因子通过与蛋白质结合而影响细胞的新陈代谢。蛋白质可以是与细胞内信号通道相关的整合膜蛋白质，如第二信使***。其它种类的蛋白质是可溶性分子，如转录因子之类。

特别引起关注的是细胞因子，它们是可促进细胞增殖和/或分化的分子。细胞因子的例子包括***(EPO)，它刺激血红细胞的发育；血小板生成素(TPO)，它刺激巨核细胞谱系细胞的发育；以及粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，它刺激嗜中性细胞的发育。这些细胞因子在恢复贫血病人及接受癌症化疗的病人中的正常血细胞水平都是有用的。这些细胞因子已证实的体内活性说明了其它细胞因子、细胞因子激动剂和细胞因子拮抗剂具有巨大的临床潜能和需求。

发明简述

本发明提供一称为细胞因子样因子7的新多肽(在下文中指Zcyto7)和相关组合物及方法而适应这一需求。

因而，本发明的一方面是提供具如下氨基酸序列的分离Zcyto7多肽。人和小鼠的cDNA均已发现。人序列可见于SEQ ID NO：1和2。鼠核苷酸和氨基酸序列可见于SEQ ID NO：11和12。

SEQ ID NO：1的核苷酸序列包括了编码约180个氨基酸并具起始甲硫氨酸(如SEQ ID NO：1和2所述)的多肽的一个开放阅读框架。预期的信号序列包括氨基酸残基1-20，而随之产生的预期成熟Zcyto7多肽则相当于从21位的谷氨酰胺残基延伸至180位的苯丙氨酸(包括180位)残基的氨基酸序列，该序列可见于SEQ ID NO：14。肽谱数据显示成熟Zcyto7包括许多N-末端成熟变体，它们的氨基酸序列如下：从23位精氨酸残基延伸至SEQ ID NO：2的第180位氨基酸残基(包括第180位)的氨基酸序列，也可见于SEQ ID NO：36；从27位丝氨酸残基至SEQ ID NO：2的第180位氨基酸残基(包括第180位)的氨基酸序列，可见于SEQ ID NO：37；从第30位赖氨酸残基至SEQ IDNO：2的第180位氨基酸残基(包括第180位)的氨基酸序列，也可见于SEQ ID NO：38；从第28位赖氨酸残基至SEQ ID NO：2的第180位氨基酸残基(包括第180位)的氨基酸序列，也可见于SEQ ID NO：41；以及从第53位甲硫氨酸残基至第180位氨基酸残基(包括第180位)的氨基酸序列，也可见于SEQ ID NO：42。羧基端唯一观察到的断裂是从180位的苯丙氨酸处断裂开。这一断裂可发生于所有上述成熟Zcyto7多肽中，实例见SEQ ID NO：43。人Zcyto7另外的变体可参阅SEQ ID NO：15-25。在一附加的实施方案中，该多肽进一步包含一亲和标记。

SEQ ID NO：11和12描述了鼠Zcyto7，其中的成熟蛋白质是从21位组氨酸至180位苯丙氨酸残基(包括第180位)，此序列也可见于SEQ ID NO：39；或根据一可选择的剪接位点，从23位精氨酸残基至第180位氨基酸(包括第180位)，此序列也可参阅SEQ ID NO：40。本发明还包括含有与上述那些Zcyto7多肽至少具90％同一性、优选95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的多肽。

本发明的另一实施方案涉及具有Zcyto7多肽带表位之部分的氨基酸序列的肽或多肽，所说的Zcyto7多肽含上述氨基酸序列。含本发明Zcyto7多肽带表位之部分氨基酸序列的肽或多肽包括长度至少为9个氨基酸的多肽，优选至少15及更优选至少30-50个氨基酸长的多肽，本发明中还包括任何长度的带表位的多肽部分及至多达并包括上述本发明多肽的全长氨基酸序列的多肽。所说的多肽实例可参阅氨基酸序列文件SEQ ID NO：25-35。要求专利保护的还有与另一多肽或载体分子融合的任何一种上述多肽。

本发明还进一步包括SEQ ID NO：15-25中所述多肽，其中所述多肽的氨基末端被修饰并起始于第3位精氨酸残基、第7位丝氨酸残基、第8位赖氨酸残基、第10位赖氨酸残基或第33位甲硫氨酸残基。

本发明进一步包括SEQ ID NO：2、12、14-25、36-42中所述多肽，其中的氨基酸序列终止于异亮氨酸，它在SEQ ID NO：2中是第179位残基、在SEQ ID NO：14-25中是第159位残基，它相应于SEQ ID NO：36的第157位氨基酸残基、SEQ ID NO：37的第153位残基、SEQ ID NO：38的第150位残基、SEQ ID NO：39的第159位残基、SEQ ID NO：40的第157位残基、SEQ ID NO：42的第152位氨基酸残基、SEQ ID NO：42的第127位氨基酸残基。

本发明还进一步包括上述肽或多肽的含修饰过的氨基酸序列的分离肽或多肽，所述修饰包括一个或多个氨基酸残基的添加、删除和/或取代，且修饰后保持所说肽或多肽的生物学活性。

本发明更进一步的方面是提供基本上由通过肽键连接的第一和第二部分组成的嵌合多肽。嵌合多肽的第一部分基本上由(a)上述Zcyto7多肽(b)上述多肽的等位变体所组成。嵌合多肽的第二部分基本上由另一多肽组成，如亲和标记。在某一实施方案中，亲和标记是免疫球蛋白Fc多肽。本发明还提供了编码此嵌合多肽的表达载体及被转染以产生嵌合多肽的宿主细胞。

本发明的另一方面提供了分离的核酸分子，它们所包括的多核苷酸选自：(a)编码上述Zcyto7多肽的核苷酸序列；(b)编码SEQ ID NO：14-40中多肽的核苷酸序列；及(c)与(a)或(b)中任何一种核苷酸序列互补的核苷酸序列。

本发明的进一步实施方案中包括分离的核酸分子，它们所含多核苷酸或者是核苷酸序列与上述(a)、(b)或(c)的任何一种核苷酸序列至少有90％的同一性，更优选95％、97％、98％或99％的同一性，或者是在严格的杂交条件下与具上述(a)、(b)或(c)之核苷酸序列的多核苷酸能杂交的多核苷酸。本发明的另一核酸实施方案涉及含Zcyto7多肽带表位之部分的氨基酸序列的分离核酸分子。

本发明的另一方面是提供表达载体，此载体含(a)转录启动子；(b)编码上述多肽的DNA片段，及(c)转录终止子，其中的启动子、DNA片段和终止子是有效连接的。

本发明的第三方面是提供已引入如上面所公开的表达载体的培养真核细胞，所说细胞表达DNA片段所编码的蛋白质多肽。

本发明的另一实施方案是与上述Zcyto7多肽能特异结合的分离抗体。要求专利保护的还有能与Zcyto7多肽结合的抗体的生产方法，包括用Zcyto7多肽或Zcyto7带表位之多肽接种一哺乳动物，以致该动物产生此多肽的抗体；并分离所说的抗体。

本发明的这些或其它方面将在以下详述中得到更明白的说明。

发明详述

在此所引用的全部文献均全文引入作为参考文献。

术语“亲和标记”在此用于指能附着到第二种多肽上以利于第二种多肽的纯化和检测或为第二种多肽与底物的结合提供位点的多肽片段。首先，可得到抗体或其它特异结合剂的任何肽或蛋白都可用作亲和标记。亲和标记包括多聚组氨酸片段、蛋白A[Nilsson等人，EMBOJ.4：1075(1985)；Nilsson等人，酶学方法，198：3(1991)]，谷胱甘肽S转移酶[Smith和Johnson，基因67：31(1988)]、谷氨酸-谷氨酸亲和标记[Grussenmeyer等人，美国国家科学院院报82：7952-4(1985)]、P物质、FLAGTM肽(Hopp等人，生物技术学6：1204-10(1988)、链霉亲和素结合肽、或其它抗原性表位或结合结构域。通常参阅Ford等人，蛋白质表达和纯化2：95-107(1991)。编码亲和标记的DNA可从商品供应商处购得(如Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。

术语“等位变体”表示一个基因占据相同染色***点的两种或多种变换形式。等位变异是通过突变自然发生的，并可能导致种群内的表型多态性。基因突变可以是沉默的(所编码多肽无变化)或编码具有变换了的氨基酸序列的多肽。等位变体一词在本文中也用于指由基因的等位变体编码的蛋白质。

术语“表达载体”表示含与用于转录的附加片段有效连接的目的多肽编码片段的线性或环状DNA分子。这些附加片段可以包括启动子和终止子序列，并可任选地包括一个或多个复制起点、一个或多个选择性标记、一个增强子、一个聚腺苷酸化信号肽，等等。表达载体通常来源于质粒或病毒DNA，或可能两者的成分都包括。

术语“分离”在用于多核苷酸分子时，是指多核苷酸已从天然遗传环境中脱离，并因此去掉了其它外来或不想要的编码序列，是处于一种适用于基因工程化蛋白生产***的形式。这样的分离分子是那些脱离其天然环境的分子，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离DNA分子是无通常相关的其它基因，但可包括天然存在的5′和3′不翻译区，诸如启动子和终止子。相关区域的鉴定对本领域常规技术人员来说是明显的。实例见于Dynan和Tijan，自然316：774-78(1985)。当用于蛋白质时，“分离”一词指在其天然环境之外的条件中找到的，譬如从血液和动物组织中分离的蛋白。在优选的形式中，分离蛋白质基本上无其它蛋白质，尤其是动物来源的其它蛋白质。优选提供的蛋白质是高纯化形式的，即纯度超过95％，更优选纯度超过99％。

术语“有效连接”在指DNA片段时，表示片段被适当排列以使其功能与目的相一致，如转录起始于启动子并从编码序列进行到终止子。

术语“多核苷酸”表示从5′阅读至3′的单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚体。多核苷酸包括RNA和DNA，并可能分离自天然来源，在体外合成，或制备自天然和合成分子联合体。

术语“多核苷酸分子的互补物”表示具有与参照序列反向互补的碱基序列的多核苷酸分子。例如，序列5′ATGCACGGG 3′与5′CCCGTGCAT 3′是互补的。

术语“简并核苷酸序列”表示包括一个或多个简并密码子(与编码多肽的参照多核苷酸分子相比)的核苷酸序列。简并密码子包括不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基(即，GAU和GAC三联体均编码天冬氨酸)。

术语“启动子”表示基因中含有用于RNA聚合酶结合并起始转录的DNA序列部分。启动子通常位于基因的5′非编码区，但并非总是如此。

术语“分泌信号序列”表示编码一种多肽(一种“分泌肽”)的DNA序列，所述多肽作为一个更大多肽的组分，可指导该更大的多肽穿过合成它的细胞的分泌途径。在通过分泌途径转运的过程中该更大的多肽通常断裂以去除分泌肽。

术语“受体”表示可与生物活性分子(即配体)相结合并介导配体作用于细胞上的细胞结合蛋白。膜结合受体特征在于有多结构域的结构，包括一胞外配体结合结构域及一般涉及信号转导的一胞内效应子结合域。配体与受体结合导致了受体的构象转变，从而引起效应子结构域与细胞中其它分子间的相互作用。这一相互作用依次导致细胞代谢的改变。与受体-配体相互作用有关联的代谢活动包括基因转录、磷酸化、去磷酸化、环腺苷酸产量的提高、细胞钙的转移、膜脂的移动、细胞粘附、肌醇脂的水解和磷脂的水解。大部分核受体也呈现多结构域结构，包括氨基末端的反式激活结构域、DNA结合结构域及配体结合结构域。一般说来，受体可以是膜结合的、胞质的或核的；单体的(如促甲状腺素受体、β-肾上腺素能受体)或多体的(如PDGF受体、生长激素受体、IL-3受体、GM-CSF受体、G-CSF受体、***受体和IL-6受体)。

术语“互补物/反互补物对”表示在适当条件下形成非共价结合的稳定对的不同部分。例如，生物素和抗生物素蛋白(或链霉亲和素)是互补物/反互补物对的原型成员。其它例子的互补物/反互补物对包括受体/配体对、抗体/抗原(或半抗原或表位)对，有义/反义多核苷酸对，等等。在需要随后解离的互补物/反互补物对中，优选互补物/反互补物对的结合亲和力小于10⁹M^-1。

“可溶性蛋白”是不结合到细胞膜上的蛋白多肽。

在本发明的优选实施方案中，分离的多核苷酸能于严格条件下与SEQ ID NO：1的DNA或其互补序列的相似大小区域杂交。一般说来，所选择的严格条件是在确定的离子强度和pH时，比该特定序列的热熔点(Tm)低约5℃。Tm值是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交上的温度(在一定的离子强度和pH条件下)。典型的严格条件是pH7，盐浓度约0.02M或更低，温度至少约60℃。正如前面所提到的，本发明的分离多核苷酸包括DNA和RNA。用于分离DNA和RNA的方法在本领域是众所周知的。总RNA的制备可用盐酸胍抽提，随后通过氯化铯梯度离心而分离[Chirgwin等人，生物化学18：52-94(1979)]。poly(A)⁺RNA是用Aviv和Leder.[美国国家科学院院报69：1408-1412(1972)]中的方法自总RNA制得的。互补DNA(cDNA)是用已知方法制备自poly(A)⁺RNA的。随后通过例如杂交或PCR的方法鉴定和分离编码Zcyto7多肽的多核苷酸。

此外，本发明的多核苷酸可用DNA合成仪合成。通常选择的方法是亚磷酰胺法。如果应用中需要化学合成的双链DNA，如基因或基因片段的合成，那么每一互补链是分别制备的。短基因(60-80bp)的生产在技术上是直接的，并可通过合成互补链再将它们退火而完成。然而，长基因(＞300bp)的产生必须用特殊的方法，因为在DNA化学合成中每一循环的偶联效率很少能达到100％。为了克服这一问题，合成的基因(双链)是由长度为20-100个核苷酸的单链片段以模块形式装配的。除了蛋白质编码序列，合成的基因还可设计成有便于***到克隆载体的限制性内切酶位点中的末端序列，也可加入含与转录和翻译的正确起始和终止有关的信号的其它序列。

参阅Glick，Bernard R.和Jack J.Pasternak，分子生物技术学，重组DNA的原理及应用，(ASM出版社，华盛顿特区，1994)，Itakura，K等人，合成寡核苷酸的合成和用途，生物化学年鉴(Annu.Rev.Biochem.)53：323-356(1984)，和Climie，S.等人，胸苷酸合成酶基因的化学合成，美国国家科学院院报87：633-637(1990)。

本领域技术人员将认识到，公开于SEQ ID NO：1和2中的序列代表了人的一个等位基因。有许多具有断裂于不同位置之前导序列的天然成熟N-末端变体。它们包括SEQ ID NO14、36、37和38的序列。可按标准步骤探测cDNA或来自不同个体的基因组文库而克隆这些序列的等位变体。人Zcyto7的变体实例有SEQ ID NO：15-25中的多肽。

鼠Zcyto7 cDNA和蛋白质公布于SEQ ID NO：11和12中。成熟的Zcyto7多肽由SEQ ID NO：39和40表示。

本发明进一步提供了来自其它物种的相应蛋白和多核苷酸(“物种正同系物”)。目前特别感兴趣的是来自其它哺乳动物的Zcyto7多肽，包括鼠的、猪的、绵羊的、牛的、狗的、猫的、马的及其它灵长类的Zcyto7多肽。可将本发明提供的信息和组合物与常规克隆技术联合起来克隆人Zcyto7蛋白质的物种正同系物(ortholog)。例如，可用获自表达该蛋白质的组织或细胞类型的mRNA克隆cDNA。可用按本文公开序列设计的探针，通过探测Northern印迹鉴定mRNA的合适来源。随后从阳性组织或细胞系的mRNA制备文库。然后可用各种方法分离编码蛋白的cDNA，如用完全或部分的人或鼠cDNA进行探测，或用基于公开序列的一套或多套简并探针进行探测。cDNA也可用聚合酶链式反应或PCR(Mullis的美国专利第4,683,202号)方法，使用按本文公开序列设计的引物进行克隆。在另外的方法中，利用cDNA文库转化或转染宿主细胞，并用该蛋白的抗体检测目的cDNA的表达。相似技术也可用于基因组克隆的分离上。正如使用和要求专利保护的，“编码多肽的分离多核苷酸，所说的多核苷酸由SEQ ID NO：2表示”一句包括SEQ ID NO：2中多肽的所有等位变体和物种正同系物。

本发明还提供了与SEQ ID NO：2的蛋白质多肽和其物种正同系物基本同源的分离蛋白质多肽。“分离的”意指在其天然环境之外的条件中找到的蛋白质或多肽，如脱离自血液和动物组织。在一优选形式中，分离的多肽基本上无其它多肽，尤其是动物来源的其它多肽。优选提供的多肽是高度纯化形式的，即纯度高于95％，更优选纯度超过99％。本文所用的“基本同源”一词意指与SEQ ID NO：2所示序列或其物种正同系物序列同一性达50％、优选60％、更优选至少80％的多肽。这种多肽与SEQ ID NO：2或其物种正同系物优选有至少90％相同，最优选95％或更多相同。序列同一性的百分率可用常规方法测定。参阅，例如，Altschul等人，Bull.Math.Bio.48：603-616(1986)和Henikoff和Henikoff，美国国家科学院院报89：10915-10919(1992)。简短地说，就是用缺口开放罚分为10、缺口延伸罚分为1及如表2所示(氨基酸用标准单字母密码表示)Henikoff和Henikoff(同上)的“blossom62”评分矩阵，将两个氨基酸序列进行比对，以使比对评分最佳。随后同一性百分率计算如下：

利用如上所公开的比率通过相似方法测定多核苷酸分子间的序列同一性。

基本同源的蛋白质和多肽特征是具一个或多个氨基酸取代、删除或添加的蛋白质和多肽。这些改变优选影响较少的改变，即保守氨基酸取代(见表3)和其它不会显著影响蛋白质或多肽的折叠或活性的取代；小的删除，一般约1-30个氨基酸的删除；及小的氨基或羧基端延伸，诸如一个氨基端甲硫氨酸残基、一个高达约20-25个残基长的小连接肽，或一利于纯化的小延伸(一亲和标记)，诸如多聚组氨酸串、蛋白A[Nilsson等人，EMBO J.4：1075(1985)；Nilsson等人，酶学方法，198：3(1991)]、谷胱甘肽S转移酶[Smith和Johnson，基因67：31，(1988)]，或其它抗原性表位或结合结构域。通常参阅Ford等人，蛋白质表达和纯化2：95-107(1991)。编码亲和标记的DNA可购自商品供应商处(如，Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。

表3保守氨基酸取代碱性的：精氨酸

赖氨酸

组氨酸酸性的：谷氨酸

天冬氨酸极性的：谷氨酰胺

天冬酰胺疏水的：亮氨酸

异亮氨酸

缬氨酸芳香族类的：苯丙氨酸

色氨酸

酪氨酸小的：甘氨酸

丙氨酸

丝氨酸

苏氨酸

甲硫氨酸

可按本领域已知步骤鉴定本发明多肽中的必需氨基酸，诸如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变法[Cunningham和Wells，科学244：1081-1085(1989)；Bass等人，美国国家科学院院报88：4498-4502(1991)]。在后一种技术中，在分子的每一残基处引入单个丙氨酸突变，并检测产生的突变分子的生物学活性(如配体结合和信号转导)，以鉴别对分子活性起关键作用的氨基酸残基。配体-蛋白质相互作用的位点也可通过晶体结构分析得到测定，如用核磁共振、结晶学或光亲和标记等技术测定。例如，参阅de Vos等人，科学255：306-312(1992)；Smith等人，分子生物学杂志224：899-904，1992；Wlodaver等人，FEBSLett，309：59-64(1992)。也可从相关蛋白的同源性分析中推断出必需氨基酸的位置。

用已知的诱变和筛选方法可进行多个氨基酸的取代和检测，诸如那些公开于Reidhaar-Olson和Sauer，科学241：53-57(1988)或Bowie和Sauer，美国国家科学院院报86：2152-2156(1989)中的方法。简短地说，这些作者公开了使多肽中两个或多个位点同时随机化，选择功能多肽，随后将诱变的多肽测序以测定每一位置的容许取代范围的方法。其它可用的方法包括噬菌体展示，如Lowman等人，生物化学，30：10832-10837(1991)；Ladner等人，美国专利号5,223,409；Huse，WIPO公开WO 92/06204)和定位诱变，Derbyshire等人，基因46：145(1986)；Ner等人，DNA7：127(1988)。

上面公开的诱变方法可与高产量筛选方法结合以检测宿主细胞中克隆的诱变蛋白质的活性。在这一点上优选的试验包括细胞增殖试验和基于生物传感器的配体结合试验，以下对这些试验有描述。编码活性蛋白或其部分(如配体结合片段)的诱变DNA分子可从宿主细胞中回收并用现代装置迅速测序。这些方法能够快速测定目的多肽中个别氨基酸残基的重要性，并可适用于未知结构的多肽。

用上面所讨论的方法，本领域常规技术人员能制备与SEQ ID NO：2或其等位变体基本同源并保留野生型蛋白质特性的种种多肽。正如本文所表达和声称的，“SEQ ID NO：2限定的多肽”包括该多肽的所有等位变体和物种正同系物。

本发明的另一实施方案提供了包含本发明多肽带表位之部分的肽或多肽。多肽部分的表位是本发明多肽的免疫原性或抗原性表位。可结合抗体的蛋白质区域被定义为“抗原性表位”。参阅例如，Geysen，H.M.等，美国国家科学院院报81：3998-4002(1984)。

至于带抗原性表位(即包含抗体可结合的蛋白质分子区域)的肽或多肽的选择，模拟蛋白质序列一部分的相对短合成肽通常能引起可与部分模拟蛋白质反应的抗血清，这在本领域是众所周知的。参阅Sutcliffe，J.G.等人，科学219：660-666(1983)。能诱发蛋白质反应性血清的肽通常由蛋白质一级序列表示，可用一套简单的化学规则刻划其特征，且它既不局限于完整蛋白的免疫显性区域(即免疫原性表位)也不局限于氨基或羧基端。极端疏水的肽和那些有6个或少于6个残基的肽在诱导可与模拟蛋白结合的抗体中常常不太有效；更长的可溶性肽，特别是那些含脯氨酸残基的肽经常是有效的。

因此，本发明带抗原性表位的肽和多肽可用于引发能与本发明多肽特异性结合的抗体，包括单克隆抗体。本发明的带抗原性表位的肽和多肽包括本发明多肽的氨基酸序列所含的至少9个，优选15至约30个氨基酸。然而，包含本发明氨基酸序列更大部分的肽和多肽，包括30-50个氨基酸，或不超过并包括本发明多肽全长氨基酸序列的肽和多肽，对于诱发可与蛋白质反应的抗体均是有效的。优选的带表位肽的氨基酸序列是其在水溶剂中有很大溶解度的(即，序列包括相对亲水的残基，且优选避免使用疏水残基)；且尤其优选含脯氨酸残基的序列。序列表中显示的所有多肽均包含按本发明方法使用的抗原性表位，而专门设计的抗原性表位包括SEQ ID NO：27-35所限定的肽。

本发明的多核苷酸，通常为cDNA序列，编码上述多肽。编码本发明多肽的cDNA序列包含一系列密码子，多肽的每一氨基酸残基由一个密码子编码，每个密码子由3个核苷酸组成。氨基酸残基由如下所示的相应密码子编码。

丙氨酸(Ala)由GCA、GCC、GCG或GCT编码；

半胱氨酸(cys)由TGC或TGT编码；

天冬氨酸(Asp)由GAC或GAT编码；

谷氨酸(Glu)由GAA或GAG编码；

苯丙氨酸(Phe)由TTC或TTT编码；

甘氨酸(Gly)由GGA、GGC、GGG或GGT编码；

组氨酸(His)由CAC或CAT编码；

异亮氨酸(Ile)由ATA、ATC或ATT所编码；

赖氨酸(Lys)由AAA或AAG编码；

亮氨酸(Leu)由TTA、TTG、CTA、CTC、CTG或CTT编码；

甲硫氨酸(Met)由ATG编码；

天冬酰胺(Asn)由AAC或AAT编码；

脯氨酸(Pro)由CCA、CCC、CCG或CCT编码；

谷氨酰胺(Gln)由CAA或CAG编码；

精氨酸(Arg)由AGA、AGG、CGA、CGC、CGG或CGT编码；

丝氨酸(Ser)由AGC、AGT、TCA、TCC、TCG或TCT编码；

苏氨酸(Thr)由ACA、ACC、ACG或ACT编码；

缬氨酸(Val)由GTA、GTC、GTG或GTT编码；

色氨酸(Trp)由TGG编码；及

酪氨酸(Tyr)由TAC或TAT编码。

根据本发明可以认识到，当一cDNA如上所述要求专利保护时，应理解为要求专利保护的包括有义链、反义链以及有义和反义链通过各自氢键一起退火形成的双链DNA。编码本发明多肽的信使RNA(mRNA)及由上述cDNA所编码的mRNA也是要求专利保护的。信使RNA(mRNA)将用与上文规定的相同密码子编码多肽，除了每一个胸苷(T)都被一尿苷(U)所取代之外。

本发明的多肽，包括全长蛋白质、蛋白质片段(如受体结合片段)及融合蛋白质均可按常规技术在基因工程化宿主细胞中生产。合适的宿主细胞是那些能被外源DNA转化或转染并在培养中能生长的细胞类型，包括细菌、真菌及培养的高等真核细胞。优选真核细胞，尤其是多细胞生物的培养细胞。操作克隆DNA分子并将外源DNA引入各种宿主细胞的技术公开于以下文献中：Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(第二版)(冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)，及Ausubel等人，同上。

通常，在一表达载体中，编码Zcyto7多肽的DNA序列是与其表达所需的其它遗传元件有效连接的，所述元件一般包括转录启动子和终止子。尽管本领域技术人员会认为在某些***中选择标记可提供于分离载体上，且外源DNA的复制可通过整合进入宿主细胞基因组而提供，但载体通常还包含一个或多个选择标记及一个或多个复制起点。启动子、终止子、选择标记、载体及其它元件是在本领域普通技术人员水平之内的常规设计问题。许多这些元件在文献中都有描述，并可购自商品供应商处。

为了指导Zcyto7多肽进入宿主细胞的分泌途径，一般在表达载体中提供分泌信号序列(也称前导序列、前序列原或前序列)。分泌信号序列可以是该蛋白本身的，或可来自另一分泌蛋白(如t-PA)或从头合成。将分泌信号序列以正确阅读框架与Zcyto7 DNA序列连接。尽管某些信号序列可置于目的DNA序列中的其它位置(参阅，如Welch等人，美国专利号5,037,743；Holland等人，美国专利号5,143,830)，但分泌信号序列通常位于编码目的多肽之DNA序列的5′端。

在本发明中培养的哺乳动物细胞是优选的宿主。将外源DNA引入哺乳类宿主细胞的方法包括磷酸钙介导的转染，Wigler等人，细胞14：725(1978)；Corsaro和Pearson，体细胞遗传学7：603(1981)；Graham和Van der Eb，病毒学52：456(1973)，电穿孔，Neumann等人，EMBOJ.1：841-845(1982)，DEAE-葡聚糖介导的转染，Ausubel等人编，分子生物学通用手册(John Wiley和Sons，Inc.，NY，1987)，及脂质体介导的转染(Hawley-Nelson等人，Focus 15：73(1993)；Ciccarone等人，Focus 15：80(1993)。培养的哺乳类细胞中重组多肽的生产公开于如下文献中：Levinson等，美国专利号4,713,339；Hagen等人，美国专利号4,784,950；Palmiter等人，美国专利号4,579,821；及Ringold，美国专利号4,656,134。合适的培养哺乳类细胞包括COS-1(ATCC NO.CRL 1650)、COS-7(ATCC NO.CRL 1651)、BHK(ATCC NO.CRL1632)、BHK570(ATCC NO.CRL 10314)、293[ATCC NO.CRL 1573；Graham等人，普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)36：59-72(1977)]和中国仓鼠卵巢(如CHO-K1；ATCC NO.CCL61)细胞系。另外的合适细胞系在本领域中是已知的，并可获自公共保藏单位，如美国典型培养物保藏中心，洛克菲勒，马里兰州。一般说来，优选强的转录启动子，如来自SV-40或巨细胞病毒的启动子。参阅如，美国专利号4,956,288。其它合适启动子包括来自金属硫蛋白基因的启动子(美国专利号4,579,821和4,601,978)和腺病毒主要晚期启动子。

药物选择通常用于选择已***外源DNA的培养哺乳类细胞。这些细胞一般称为“转染子”。已培养于有选择剂存在的条件中并能将目的基因传给子代的细胞称为“稳定的转染子”。优选的选择标记是编码对抗生素新霉素的抗性的基因。选择在新霉素型药物(如G418等等)存在的条件下进行。选择***也可用于提高目的基因的表达水平，此过程称为“扩增”。扩增通过如下过程进行：在存在低水平选择剂的条件中培养转染子，然后增加选择剂的量以选择产生高水平引入基因产物的细胞。优选的可扩增选择标记是二氢叶酸还原酶，它赋予对氨甲喋呤的抗性。其它的药物抗性基因(如潮霉素抗性、广谱抗药性、嘌呤霉素乙酰转移酶)也可使用。

其它较高等的真核细胞也可用作宿主，包括昆虫细胞、植物细胞和鸟类细胞。昆虫细胞的转化和其中外源多肽的产生公开于下述文件中：Guarino等人，美国专利号5,162,222；Bang等人，美国专利号4,775,624；和WIPO公开WO 94/06463。作为植物细胞中表达基因的载体的发根土壤杆菌，其使用已由Sinkar等人在J.Biosci.(Bangalore)11：47-58(1987)中进行了综述。

真菌细胞，包括酵母细胞，尤其是酵母属的细胞也可用于本发明中，如用于生产蛋白质片段或融合多肽。用外源DNA转化酵母细胞并产生相应重组多肽的方法公开于下述文件，例如：Kawasaki的美国专利第4,599,311号；Kawasaki等人的美国专利第4,931,373号；Brake的美国专利第4,870,008号；Welch等人的美国专利第5,037,743号；和Murray等人的美国专利第4,845,075号。可通过由选择标记确定的表型，通常是药物抗性或在缺乏某种特殊养分(如亮氨酸)的条件下生长的能力，来选择转化细胞。用于酵母中的优选载体***是POTl载体***，公布于Kawasaki等人的美国专利第4,931,373号，该载体***可用来通过转化细胞在含葡萄糖的培养基上的生长进行选择。酵母中可用的合适启动子和终止子包括来自糖酵解酶基因(参阅，如，Kawasaki的美国专利第4,599,311号；Kingsman等人的美国专利第4,615,974号；和Bitter的美国专利第4,977,092号)和醇脱氢酶基因的启动子和终止子。也可参阅的美国专利第4,990,446号；5,063,154号；5,139,936号和4,661,454号。

本领域已知其它酵母转化***，包括：多形汉逊酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、玉蜀黍黑粉菌、巴斯德毕赤酵母、Pichia methanolica、季也蒙毕赤酵母和Candida maltosa。参阅，如，Gleeson等人，普通微生物学杂志132：3459-3465(1986)和Cregg的美国专利第4,882,279号。根据Mcknight等人的美国专利第4,935,349号中的方法可利用曲霉属细胞。转化产黄枝顶孢(Acremonium chrysogenum)的方法公开于Sumino等人的美国专利第5,162,228号中。转化脉孢菌属的方法公开于Lambowitz的美国专利第4,486,533号。

按常规步骤，在含有所选宿主细胞生长需要的养分和其它组分的培养基中培养转化或转染的宿主细胞。各种合适的培养基，包括已知成分培养基和复合培养基，在本领域中都是已知的，并通常包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。如果需要，培养基中也可包含诸如生长因子或血清之类的组分。培养基通常通过例如药物选择或缺少某种必需养分的培养基来选择含外源***DNA的细胞，这种缺少的养分可通过表达载体上携带的或共转染进入宿主细胞的选择标记而得到补充。

在本发明的一个方面，通过培养细胞产生新的蛋白质，该细胞被用于筛选此蛋白质的一个或多个受体，包括天然受体，以及天然配基的激动剂和拮抗剂。

蛋白质分离：

表达的重组多肽(或嵌合多肽)可用分级分离和/或常规纯化方法和介质进行纯化。硫酸铵沉淀及酸或离液剂提取可用于样品的分级分离中。典型的纯化步骤可包括羟基磷灰石层析、尺寸排阻层析、FPLC和反相高效液相层析。合适的阴离子交换介质包括葡聚糖衍生物、琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺、特殊性能二氧化硅，等等。PEI、DEAE、QAE和Q衍生物是优选的，特别优选DEAE Fast-FlowSepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)。典型的层析介质包括那些带苯基、丁基或辛基的介质衍生物，如苯基Sepharose FF(Pharmacia)、Toyopearl butyl 650(Toso Haas，Montgomeryville，PA)、辛基Sepharose(Pharmacia)，等等；或聚丙烯树脂，如AmberchromCG71(Toso Haas)等。合适的固相支持体包括玻璃珠、硅基树脂、纤维素树脂、琼脂糖珠、交联琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、交联聚丙烯酰胺树脂等等，它们在所要使用的条件下是不溶的。这些支持物可用反应基团修饰，所说的这些反应基团能使得蛋白质通过氨基、羧基、巯基、羟基和/或碳水化合物部分附着于支持物上。偶联化学法的例子包括溴化氰活化、N-羟基琥珀酰亚胺活化、环氧化物活化、巯基活化、酰肼活化及用于碳二亚胺偶联化学法的羧基和氨基衍生物。这些及其它固相介质在本领域中是众所周知并广泛应用的，且可购自产品供应商处。将受体多肽结合到支持介质上的方法在本领域中是众所周知的。特定方法的选择是一个常规设计的问题，它部分是由所选支持物的特性决定的。参阅例如亲和层析：原理和方法(Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，Sweden，1988)。

可利用它们的特性分离本发明的多肽。例如，固定化金属离子吸附(IMAC)层析可用于纯化富含组氨酸的蛋白质。简短地说，首先用二价金属离子使凝胶带电以形成螯合物[E.Sulkowski，Trends inBiochem.3：1-7(1985)]。富含组氨酸的蛋白质将以不同的亲和力吸附于此介质上，这决定于所用的金属离子，并通过竞争性洗脱、降低pH或使用强螯合剂而洗脱。其它的纯化方法包括用凝集素亲和层析和离子交换层析纯化糖基化蛋白质[酶学方法，Vol.182：529-39，“蛋白质纯化指南”，M.Deutscher(编)(Acad.Press.San Diego，(1990)]。或者，可以构建目的多肽和亲和标记(如，聚组氨酸、麦芽糖结合蛋白质、免疫球蛋白结构域)的融合体以方便纯化。此外，为了方便分泌型受体多肽的纯化，可将一氨基或羧基末端延伸，如聚组氨酸标记、物质P、FLAG^肽[Hopp等人，Bio/Technology 6：1204-1210(1988)；获自Eastman Kodak CO.，New Haven，CT)]、谷氨酸-谷氨酸亲和标记[Grussenmeyer等人，美国国家科学院院报82：7952-4(1985)]、或有抗体或其它特异结合剂可供使用的其它多肽或蛋白质与Zcyto7融合，以帮助纯化。

用途

Zcyto7表达的RNA印迹分析揭示Zcyto7在脊髓中特异性表达。脊髓的原位分析揭示，该表达定位于神经元和背根神经节中。因此，Zcyto7在包括神经胶质细胞或神经元的脊髓的纤维中可能起作用。这显示，Zcyto7可用于治疗各种神经变性疾病，如肌萎缩性侧索硬化(ALS)，或脱髓鞘疾病，包括多种硬化病。Zcyto7也可用于治疗感觉神经病。Zcyto7表达的组织特异性暗示Zcyto7可能是脊髓中的生长和/或维持因子。

Zcyto7基因定位于第5号染色体上，这表明Zcyto7是一种可用于调节免疫***细胞活性的细胞因子。Zcyto7也可用作脊柱中嗜中性白细胞的化学引诱物。它还可用作脊柱中感染的抗感染剂。它还可用于协助调节脊髓中的其它细胞因子。也可施用Zcyto7来治疗外周神经病，如与Zcyto7定位于同一染色体区域5q的Charcot-Marie-Tooth(CMT)疾病。

如以下实施例11和12所示之Zcyto7可抑制BAF-3和TF-1细胞生长的事实表明，Zcyto7可用于治疗自身免疫疾病，还可能用于治疗诸如白血病之类的癌症。

本发明还提供了可用于诊断应用中的试剂。例如，Zcyto7基因大量表达于脊髓中。可用含Zcyto7 DNA或RNA或其亚序列的探针进行检测，以确定Zcyto7基因是否位于第5号染色体上或是否发生了突变。

本发明还提供了有重要治疗价值的试剂。Zcyto7多肽(天然存在或重组的)及其片段、它的抗体和抗独特型抗体，以及经鉴定对Zcyto7多肽有结合亲和力的化合物，在异常生理或发育相关性疾病(包括异常增殖，如患癌或变性疾病)的治疗中是有用的。例如，与Zcyto7多肽异常表达或异常信号发送有关的疾病或失调很可能可以用Zcyto7多肽激动剂或拮抗剂进行治疗。

特别是，Zcyto7可用于治疗炎症。炎症是对感染的免疫应答或对自身抗原的自身免疫应答结果。

应确定治疗剂量以使安全性和有效性最优化。施用的方法包括静脉内、腹膜下、肌肉内、硬脑膜下、注入脊髓液或经皮给与。药学上可接受载体包括水、盐水及一些缓冲液。剂量范围通常预期为0.1μg-1mg/kg体重/天。优选1μg-100μg/天。可是，较高或较低的剂量可由具本领域常规技术的医生确定。关于药物配方和剂量范围的完整讨论可参阅Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，(MackPublishing Co.，Easton，Penn.，1990)和Goodman和Gilman’s的：ThePharmacological Bases of Therapeutics，第9版.(Pergamon Press1996)。

使用Zcyto7以促进骨和软骨的生长

已发现Zcyto7可刺激软骨细胞和成骨细胞的发育，分别可见以下实施例7和9。此外，如实施例8所示，Zcyto7也刺激软骨细胞培养物中糖胺聚糖的稳态水平。因此Zcyto7在各种不同的治疗状况中可用于刺激骨和软骨的生长。

Zcyto7可植入哺乳动物体内，以使Zcyto7与成骨细胞接触，从而引起成骨细胞增殖，刺激骨生长。例如，Zcyto7可放入一基质中[有或无骨形态发生蛋白(BMP)]。BMP会诱导间充质成骨细胞前体迁移至此位点，并进一步诱导间充质细胞分化成成骨细胞。Zcyto7随后将刺激成骨细胞的进一步增殖。合适的基质由多孔物质的颗粒组成。孔的大小必须能允许祖细胞迁移及随后的分化和增殖。理想的颗粒尺寸应为70-850mm，优选150-420mm。含Zcyto7的基质可做成包含骨缺陷在内的形状。基质材料的实例是颗粒状的、脱矿物的、经胍提取的、种特异性的骨。其它可能有用的基质材料包括凝胶原蛋白、乙醇酸和乳酸的同聚物和共聚物、羟基磷灰石、磷酸三钙和其它的钙磷酸盐。Zcyto7可以足够的浓度加入基质中，以促进成骨细胞的增殖，优选加入浓度为至少1μg/ml基质。也可将Zcyto7溶液直接注入包括骨变性区域在内的骨折或骨缺陷位置，以加速骨折或骨缺陷位置的愈合。BMP的实例及用于生产的基质的用途公开于PCT申请公开号WO 92/07073、公开号WO 91/05802、美国专利第5,645,591号和5,108,753号。

通过给个体施与治疗有效量的Zcyto7，可进一步用Zcyto7治疗骨质疏松症。优选的剂量为1μg Zcyto7/kg体重/天。

如上文所提及的，我们也已确定Zcyto7通过其刺激软骨细胞增殖的能力可用于促进软骨的产生。Zcyto7可直接注射入软骨将生长的位置。例如，可将Zcyto7直接注射入患骨关节炎的关节内或软骨磨损的其它受伤关节内。需额外软骨生长的实例是受伤运动员的肩膀和膝盖。

软骨的生长也可通过下述方法进行，首先从个体中取出软骨细胞，将它们与Zcyto7一起培养以使其增殖，将此软骨细胞再植入需生成软骨的个体中。

Zcyto7也可用于刺激由于牙周疾病而丢失的牙质或骨的再生。为达到这一目的，应彻底清洗周围组织并将Zcyto7溶液加到期望牙质再生的位置，优选采用注射的方式。

抗Zcyto7多肽的抗体可被纯化并随后给病人使用。为了治疗的用途，这些试剂可与另外的活性或惰性成分相结合，如在药学上可接受的载体或稀释液中与生理学上无害的稳定剂和赋形剂相结合。这些混合物可经无菌过滤，并通过冷冻干燥于试剂瓶或保存于稳定的水制剂中以剂量形式放置。本发明还涉及抗体及其结合片段、或包括非补体结合形式在内的单链抗体的用途。

有效治疗所必需试剂的份量取决于许多不同的因素，包括施药方式、靶位点、病人的生理学状态及施用的其它药物。因此，应确定治疗剂量以优化安全性和有效性。一般说来，这些试剂的体外使用剂量能为其体内施用的有效量提供有用的指导。治疗特殊失调的有效剂量的动物试验将提供人所用剂量的进一步预兆性指示。施药方式包括口服、静脉内、腹膜内、肌内或经皮用药。药学上可接受载体将包括水、盐水、一些缓冲液。通常预期的剂量范围是1μg-1000μg/kg体重/天。然而，剂量可以更高或更低，这可由具本领域常规技术的内科医生确定。药物配方及剂量范围的完整讨论可参阅Remington的Pharmaceutical Science，第17版(Mack Publishing Co.，Easton，Penn.，1990)，及Goodman和Gilman的：治疗的药物学基础，第9版(Pergamon Press 1996)。

基于核酸的治疗

如果哺乳动物的Zcyto7基因突变或缺失，则可将Zcyto7基因引入该哺乳动物细胞。在一实施方案中，编码Zcyto7多肽的基因在一病毒载体上被引入体内。这样的载体包括减毒或缺陷型DNA病毒，诸如(但不局限于)单纯疱疹病毒(HSV)、***瘤病毒、非洲淋巴瘤病毒(EBV)、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)，等等。优选完全或几乎完全缺失病毒基因的缺陷型病毒。缺陷型病毒在引入细胞后无感染性。使用缺陷型病毒载体允许在特定的局部区域给与细胞，而不用担心此载体会感染其它细胞。特殊的载体例子包括，但不局限于，缺陷型单纯疱疹病毒1(HSV1)载体[Kaplitt等，Molec.Cell.Neurosci.，2：320-330(1991)]、减毒的腺病毒载体，如由Stratford-Perricaudet等，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)，90：626-630(1992)所述的载体，及缺陷型腺伴随病毒载体[Samulski等，病毒学杂志，61：3096-3101(1987)；Samulki等，病毒学杂志，63：3822-3828(1989)]。

在另一实施例中，基因可在逆转录病毒载体中引入，如以下文献所述：Anderson等的美国专利第5,399,346号；Mann等，细胞，33：153(1983)；Temin等的美国专利第4,650,764号；Temin等的美国专利第4,980,289号；Markowitz等，病毒学杂志，62：1120(1988)；Temin等的美国专利第5,124,263号；国际专利公开号WO 95/07358，由Dougherty等人于1995年3月16日公开；和血液学，82：845(1993)。

或者，载体可利用脂质体通过体内脂转染法而引入。合成的阳离子脂质可用于为标记编码基因的体内转染制备脂质体[Felgner等.，美国国家科学院院报，84：7413-7417(1987)，参阅Mackey等，美国国家科学院院报，85：8027-8031(1988)]。使用脂转染法将外源基因引入体内特殊器官具有某些实用的好处。脂质体对特定细胞的分子靶向性代表了优点的一方面。很清楚，它指导向特殊细胞的转染代表了优点的又一方面。也很清楚的是，在细胞异质性组织，如胰、肝、肾和脑中，向特殊细胞类型的定向转染尤其有利。脂类可为了靶向的目的而化学偶联上其它分子。靶向肽，如，激素或神经递质，及如抗体之类的蛋白质，或非肽分子均可与脂质体化学偶联。

可以将细胞从体内取出，然后将作为裸露DNA质粒的载体引入该细胞中，并随后将此转化细胞再植入体内。以本领域已知技术可将用于基因治疗的裸DNA载体引入目的宿主细胞中，如转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、基因枪的使用或DNA载体转运蛋白的使用[参阅如Wu等，生物化学杂志(J.Bio1.Chem.)，267：963-967(1992)；Wu等，生物化学杂志，263：14621-14624(1988)]。

Zcyto7多肽也可用于制备能与Zcyto7多肽特异性结合的抗体。这些抗体随后可用于制备抗独特型抗体。本文所用的“抗体”一词包括多克隆抗体、单克隆抗体、及其诸如F(ab′)₂和Fab片段之类的抗原结合片段，等等，其中包括基因工程化抗体。若抗体与Zcyto7多肽结合的Ka≥10⁷/M，则此抗体被定义为可特异结合。本领域常规技术人员可轻易测定单克隆抗体的亲和力(参阅，如，Scatchard，同上)。

制备多克隆和单克隆抗体的方法在本领域是众所周知的(参阅，Sambrook等，分子克隆：实验室手册(第二版)(冷泉港，纽约，1989)；Hurrell，J.G.R.编，单克隆杂交瘤抗体：技术及应用(CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL，1982)。本领域常规技术人员可明显看到，多克隆抗体可产生于各种温血动物，如马、牛、山羊、绵羊、狗、小鸡、兔子、小鼠和大鼠中。可通过使用诸如弗氏完全或不完全佐剂之类的佐剂提高Zcyto7多肽的免疫原性。本领域技术熟练人员已知的各种试验均可用于检测能与Zcyto7多肽特异结合的抗体。实例性试验详述于抗体：实验室手册，Harlow和Lane(编)(Cold Spring Habor LaboratoryPress，1988)。这些试验的代表性例子包括：合并免疫电泳、放射免疫分析、放射免疫沉淀法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、斑点印迹试验、抑制或竞争试验及三明治试验。

对本领域常规技术人员显而易见的是，通过将Zcyto7多肽或其片段接种于诸如马、牛、山羊、绵羊、狗、小鸡、兔子、小鼠、仓鼠、豚鼠及大鼠之类的各种温血动物中，可产生多克隆抗体。通过使用诸如明矾(氢氧化铝)或弗氏完全或不完全佐剂之类的佐剂，可以提高Zcyto7多肽的免疫原性。可用于免疫接种的多肽还包括融合多肽，如Zcyto7或其部分与免疫球蛋白多肽或与麦芽糖结合蛋白的融合体。多肽免疫原可以是全长分子或其中一部分。若此多肽部分是“半抗原样”，则这部分可有利地加入或连接到免疫接种所用的大分子载体(诸如匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清清蛋白(BSA)或破伤风类毒素)上。

此处所用的“抗体”一词包括多克隆抗体、亲和纯化的多克隆抗体、单克隆抗体，及抗原结合片段，诸如F(ab′)₂和Fab蛋白水解片段。还有基因工程化完整抗体或片段，诸如嵌合抗体、Fv片段，单链抗体等等，以及合成的抗原结合肽和多肽均包括在内。通过将非人源CDR移植到人的构架和恒定区域内，或掺入非人源可变结构域，可将非人源抗体人源化(通过置换暴露的残基，任选地用类人表面“包藏”它们，结果是产生“镶盖”抗体)。在某些例子中，人源化抗体可在人可变区构架结构域中保留非人源残基，以增强正确的结合特性。通过抗体人源化，可提高其生物学半衰期，并降低施用于人时产生不利免疫反应的潜在危险性。

本文中产生或选择有效抗体的其它技术包括，将淋巴细胞在体外暴露于Zcyto7蛋白质或肽，并从噬菌体或相似载体的抗体展示库中选择(例如，通过使用固定化或标记的Zcyto7蛋白质或肽)。通过筛选展示于噬菌体(噬菌体展示)或细菌(如大肠杆菌)上的随机肽文库，可得到编码具潜在Zcyto7多肽结合结构域的多肽的基因。编码多肽的核苷酸序列可用多种方式获得，如通过随机诱变及随机多核苷酸合成。这些随机肽展示文库可用于筛选能与已知靶目标相互作用的肽，该靶目标可以是蛋白质或多肽，如配体或受体、生物的或合成的大分子，或有机或无机物质。建立和筛选这种随机肽展示文库的技术在本领域是已知的(Ladner等的美国专利第5,223,409号；Ladner等的美国专利第4,946,778号；Ladner等的美国专利第5,403,484号和Ladner等的美国专利第5,571,698号)，且随机肽展示文库及用于筛选这些文库的试剂盒是可购买到的，例如从Clontech(Palo Alto，CA)、Invitrogen Inc.(San Diego，CA)、New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA)和Pharmacia LKB Biotechnology Inc.(Piscataway，NJ)处。可用公开于此的Zcyto7序列筛选随机肽展示文库，以鉴定能与Zcyto7结合的蛋白质。这些能与Zcyto7多肽相互作用的“结合蛋白质”可用于标记细胞、通过亲和纯化分离同系物多肽，它们可直接或间接地与药物、毒素、放射性核素等偶联。这些结合蛋白质也可用于诸如筛选表达文库及中和活性之类的分析试验中。这些结合蛋白质也可用于诊断分析中，以测定多肽的循环水平、检测或定量测定作为隐伏病理或疾病标记的可溶性多肽。这些结合蛋白质也可作为Zcyto7的“拮抗剂”起作用，以阻断体外和体内的Zcyto7结合和信号转导。

也可在基因疗法中产生抗体。将编码Zcyto7或其免疫原性片段的DNA或RNA施用于动物以使动物，细胞被此核酸转染，并表达随后引起免疫原性应答的蛋白质。动物随后产生的抗体可以多克隆或单克隆抗体形式分离。

抗Zcyto7抗体可用于标记表达此蛋白质的细胞，用于亲和纯化，在诊断分析中用于测定可溶蛋白质多肽的循环水平，并可作为拮抗剂以阻断体外和体内的配体结合和信号转导。

放射杂交绘图是用于构建哺乳动物染色体的高分辨率连续图谱的体细胞遗传技术[Cox等，科学250：245-250(1990)]。部分或完全清楚基因序列就可设计适于染色体放射杂交绘图板使用的PCR引物。覆盖整个人基因组的放射杂交绘图板，如Stanford G3RH Panel和GeneBridge 4 RH Panel(Research Genetics，Inc.，Huntsville，AL)可购买得到。这些板可基于PCR而快速地进行染色体定位，和基因、序列标记位点(STS)及其它非多态性或多态性标志在目的区域内的排列。这包括直接建立新发现的目的基因和原先图标标志间的成比例物理距离。确知基因位置在许多方面都是有用的，包括：1)确定作一段序列是否为一已有毗连序列群一部分，并得到诸如YAC-、BAC-或cDNA克隆之类的多种形式中的其它周围遗传序列，2)为显示与相同染色体区域连锁的遗传疾病提供可能的候选基因，及3)为有助于确定特殊基因所具功能的交叉参照模型生物，诸如小鼠之类提供可能的候选基因。

本发明还提供了将在诊断应用中有用的试剂。例如，Zcyto7基因已被绘图于染色体5q31上。Zcyto7核酸探针可用于检查第5号染色体上的异常。例如，含Zcyto7 DNA或RNA或其亚序列的探针可用于检测Zcyto7基因是否存在于染色体5q31上或是否发生了突变。在Zcyto7基因位置上的可检测染色体畸变包括但不局限于非整倍体、基因拷贝数改变、***、删除、限制酶切位点改变和重排。通过分子遗传学技术，诸如限制性片段长度多态性(RFLP)分析、应用PCR技术的短串联重复(STR)分析及本领域已知的其它遗传连锁分析技术[Sambrook等，同上；Ausubel，等，同上；Marian，A.J.，Chest，108：255-265，(1995)]，用本发明的多核苷酸可检测这样的畸变。

Zcyto7作图到5q31区域，此区域是含一组细胞因子及细胞因子受体的“基因簇”。包括IL-3、IL-4、IL-5、IL-13、GM-CSF和M-CSF在内的细胞因子基因聚集于那里。此结果证实了Zcyto7为细胞因子。

以下非限制性实施例对本发明做了进一步说明。

实施例1.Zcyto7的克隆

通过它与白细胞介素-17的同源性，将Zcyto7从SEQ ID NO：3所限定的表达序列标签(EST)中鉴别出来。cDNA克隆获自人的胎儿心脏cDNA文库。含此cDNA的质粒划线培养于含100μg/ml氨苄青霉素和100μg/ml甲氧苯青霉素的LB平板上。对***的cDNA测序。此***物被确定为717个碱基对长，带有一个180个氨基酸的开放阅读框架和一推定的20氨基酸信号肽。

实施例2.RNA印迹分析

对人的多组织印迹1，2，3(Clontech)进行探测，以确定Zcyto7的组织分布。含整个Zcyto7编码区的EcoRI/NotI片段产生自EST582069克隆并被用做探针。EST582069的质粒制品是用QIAprepSpin Miniprep Kit(Qiagen)制备自含100μg/ml氨苄青霉素的5ml LB37℃过夜培养物。每100μl中取12μl，与5μl H缓冲液(BoehringerMannheim)、12.5单位的EcoRI(Gibco BRL)和12.5个单位的NotI(NewEngland Biolabs)一起在50μl的反应体系中37℃消化2小时。将消化液在0.7％TBE的琼脂糖凝胶上进行电泳，并切出所需片段。为了得到其它原料，在上述相同条件下重复此消化过程，唯一不同之处在于第二次消化中用了24μl EST582069。第二次消化液电泳于0.7％TBE琼脂糖凝胶上，并将片段切出。用QIAquick Gel ExtractionKit(Qiagen)从两胶块上提取DNA。用Multiprime DNA Labeling System(Amersham)将135ng的此DNA标记上P³²，并用NucTrap ProbePurification Column(Stratagene)除去未掺入放射性的DNA。多组织RNA印迹和人RNA主印迹与含1mg鲑精DNA的10ml ExpressHybSolution(Clontech)预杂交3小时，此鲑精DNA先被煮沸5分钟随后冰置1分钟再加入10ml ExpressHyb Solution中，混匀并加到印迹上。65℃杂交过夜。起初的清洗条件如下：2×SSC，0.05％SDS室温洗40分钟，其中多次换液，随后用0.1×SSC、0.1％SDS在50℃洗40分钟，中间换1次溶液。印迹随后在-80℃对凝胶片曝光5小时。由于有交叉杂交/背景，所以用0.1％×SSC、0.1％SDS在55℃及65℃依次进一步将印迹各洗1小时。脊髓中显示Zcyto7 mRNA有很高的表达，而气管中显示此mRNA为弱表达。转录物大小约为0.75kb。

实施例3

Zcyto7的染色体分布和定位

用可购买到的“基因桥4放射杂交板”(GeneBridge 4 RadiationHybrid Panel)(Research Genetics，Inc.，Huntsville，AL)将Zcyto7绘图于第5号染色体上。基因桥4放射杂交板包含来自93个放射杂交克隆中每一个的可PCR DNA，加上两个对照DNA(HFL供体和A23受体)。一个公众可使用的WWW服务器(http：//WWW-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl)能够用来相对于WhiteheadInstitute/MIT Center有关的基因组研究的人类基因组放射杂交图谱(人类基因组的“WICGR”放射杂交图谱)作图，所述图谱是用基因桥4放射杂交板构建的。

为了用“基因桥4放射杂交板”给Zcyto7绘图，在可PCR的96孔微滴定板(Stratagene，LaJolla，CA)上建立20μl的反应体系，将其用于“RoboCycler Gradient 96”热循环仪(Stratagene)上。95个PCR反应中的每一个组成如下：2μl 10×KlenTaq PCR反应缓冲液(CLONTECH Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)、1.6μl dNTP混合液(每种2.5mM，PERKIN-ELMER，Foster City，CA)、1μl有义引物SEQ ID NO：4、1μl反义引物SEQ ID NO：5、2μl“RediLoad”(Research Genetics，Inc.，Huntsville，AL)、0.4μl 50×AdvantageKlenTaq Polymerase Mix(Clontech Laboratories，Inc.)、来自单个杂交克隆或对照的25ng DNA，再用ddH₂O补充至总体积20μl。用等量矿物油覆盖和密封反应液。PCR循环条件如下：开始的第一个循环95℃变性5分钟，以后35个循环是95℃变性1分钟，52℃退火1分钟再72℃延伸1分钟，最后一个循环是72℃延伸7分钟。反应产物电泳分离于3％的NuSieve GTG琼脂糖凝胶(FMC Bioproducts，Rockland，ME)上。

结果显示，在WICGR放射杂交图谱上，Zcyto7位于距离人5号染色体连锁群顶端490.89cR处。相应于着丝粒而言，它最近的近侧标志是D5S413，而最近的远侧标志是WI-5208。借助于周围标志，将Zcyto7作图到完整LDB 5号染色体图谱的5q31.3-q32区域(The GeneticLocation Database，University of Southhampton，WWW服务器：http：//cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/)。

实施例4

Zcyto7表达载体的构建

两个Zcyto7构建载体的制做是将FLAG氨基酸序列(SEQ ID NO：10)***Zcyto7多肽的N-末端或C-末端。为了将FLAG氨基酸序列附着到Zcyto7的N-末端，用1μl实施例2之EST582069质粒制品的1/4倍稀释液和20pm的引物SEQ ID NO：6和20pm引物SEQ ID NO：7，制备473bp的Zcyto7 PCR DNA片段。PCR反应液在94℃保温1分钟，然后进行5个循环，每个循环包括94℃20秒和64℃2分钟。随后进行的22个循环中每个循环包括94℃20秒和74℃2分钟。反应结束前于74℃保温10分钟。用30单位BamHI(Boehringer Mannheim)和120单位XhoI(Boehringer Mannheim)将50μl PCR反应混合产物37℃消化2小时。经消化的反应混合液于1％TBE凝胶上电泳；用剃刀片将DNA带切出，并用QiaquickGel Extraction Kit(Qiagen)将DNA从凝凝胶中提取出来。将切下的DNA亚克隆入已经Bam和Xho酶切的质粒nfpzp9中。nfpzp是含一表达盒的哺乳动物细胞表达载体，该表达盒中包括小鼠金属硫蛋白-1基因启动子、编码组织纤溶酶原激动剂(TPA)前导区的序列，然后是FLAG肽(SEQ ID NO：10)，然后是多限制酶切位点。随后是人生长激素终止子、大肠杆菌复制起点及含SV40启动子、增强子和复制起点、二氢叶酸还原酶基因(DHFR)和SV40终止子的哺乳动物选择标志表达单元。

为了构建将C-端FLAG***Zcyto7多肽C端的Zcyto7基因，用1μl实施例1所述的EST582069质粒制品1/4倍稀释液和SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9引物各20pm，产生543bp的Zcyto7 PCR片段。将PCR反应液94℃保温1分钟，然后进行5个循环，每个循环包括94℃20秒和55℃2分钟。随后进行22个循环，每个循环包括94℃20秒和74℃2分钟。最后于74℃延伸10分钟结束反应。全部反应混和液于1％TBE凝胶上电泳，用剃刀片将DNA切出，并用QIAQUICK^TM提取试剂盒提取此DNA。从每35μl回收液中取20μl用10单位BamHI(BoehringerMannheim)和10单位EcoRI(Gibco BRL)37℃消化2小时。消化后的PCR混和液于1％TBE凝胶上电泳。用剃刀片将DNA带切出，再用QIAquickGel Extraction Kit(Qiagen)从凝胶中提取此DNA。将抽提出的DNA亚克隆入已由EcoRI和BamHI酶切的质粒cfpzp9中。质粒cfpzp9是含表达盒的哺乳动物表达载体，该表达盒包括小鼠金属硫蛋白-1基因启动子、用于***编码序列的多限制酶切位点、编码FLAG肽的序列SEQ ID NO：10、终止密码子、人生长激素终止子、大肠杆菌复制起点，还有含SV40启动子、增强子及复制起点、DHFR基因和SV40终止子的一个哺乳动物选择标志表达单元。

利用抗FLAG多肽的抗体，可从细胞上清液中分离FLAG标记的Zcyto7多肽。

实施例5

鼠Zcyto7的克隆

通过其与人Zcyto7的同源性，将鼠Zcyto7从EST SEQ ID NO：14中鉴定出来。从鼠胚胎cDNA库中发现此cDNA克隆，所用胚胎是13.5-14.5日龄的。得到含有带目的cDNA的质粒转染的大肠杆菌的穿刺培养形式的cDNA，随后划线培养于含100μg/ml氨苄青霉素、52μg/ml甲氧苯青霉素的LB平板上。对EST660242中的cDNA***物测序。该***物确定为785个碱基对，其中有一180个氨基酸的开放阅读框架和一推定的20氨基酸信号肽。此序列表示于SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：12中。

实施例6

鼠Zcyto7的组织分布

探测鼠多组织RNA印迹(Clontech，Palo Alto，CA)、鼠RNA斑点印迹(Clontech)、鼠胚胎RNA印迹和鼠脊髓斑点印迹，以确定鼠的Zcyto7的组织分布。

鼠胚胎RNA是用POLY(A)PUREmRNA分离试剂盒(Ambion)分离自受精后6-9天的鼠胚胎。取100mg每个鼠胚胎溶解于1ml溶解缓冲液中，匀浆并按制造商提供的说明书以分批方式进行加工。为了做RNA印迹，将2μg RNA加到含1.5％琼脂糖、2.2M甲醛的凝胶上。以60V电泳4.5小时。将RNA转移过夜至预湿于20×SSC中的Nytran膜上。用紫外光将RNA交联至膜上，并在80℃烤1小时。

鼠脊髓RNA也用POLY(A)PURE^mRNA isolation Kit(Ambion)制备。通过将1、2、3μl浓度为1μg RNA/μl的RNA打点到Nytran膜上来制备鼠脊髓的斑点印迹。

含Zcyto7整个编码区的NotI/EcoRI酶切片段产生自含SEQ IDNO：12的克隆(下文称之为SEQ ID NO：12克隆)，用作探针。SEQ IDNO：12克隆的质粒制品是用QIAPREP SPIN MINIPREP Kit(Qiagen)制备自含100μg/ml氨苄青霉素的5ml LB 37℃过夜培养物。4.66μg质粒用8μl高缓冲液(Boehringer Mannheim)、20单位NotI(Biolabs)和20单位EcoRI(Gibco BRL)以80μl反应体系在37℃消化2小时。消化液于1.0％TBE凝胶上电泳并将片段切出。用QIAQUICK^凝胶提取试剂盒(Qiagen)从凝胶板中提取此DNA。用MULTIMPRIME^DNA标记***(Amersham)将98.8ng的此片段标记上P³²，再用NUCTRAP^探针纯化柱(Stratagene)将未掺入放射性除去。

这两个RNA印迹制品和两个斑点印迹制品按如下方式65℃预杂交3小时。将1mg鲑精DNA煮沸5分钟，冰浴1分钟，与10ml EXPRESSHYB^溶液混和并加到印迹上。在65℃杂交过夜。开始的漂洗条件如下：2×SSC、0.1％SDS室温漂洗40分钟，然后用0.1×SSC、0.1％SDS 50℃洗40分钟。印迹对胶片于-80℃曝光过夜。RNA印迹及鼠斑点印迹进一步在60℃用0.1×SSC、0.1％SDS漂洗以消除背景。鼠脊髓斑点印迹在更严格的条件下于65℃用0.1×SSC、0.1％SDS再漂洗，以进一步证实原来的结果。

结果：在脊髓、颌下腺和附睾中可见小鼠Zcyto7表达。鼠胚胎显示在受精后的第12天开始表达Zcyto7，在第16天表达达到最高，第17天表达结束。转录产物大小接近1kb。

实施例7

利用Zcyto7增殖软骨细胞

进行软骨细胞的增殖检验，以确定Zcyto7对软骨细胞增殖的影响。用20％铺满的培养物进行此检验。作为一对照载体，将牛血清清蛋白代替Zcyto7加入软骨细胞培养物中。该检验测量软骨细胞中新生DNA的3H-胸腺嘧啶核苷掺入情况，Wahl等，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)8：5016-5025(1988)。

结果：将软骨细胞培养物暴露于1μg/ml Zcyto7中，可见对原代软骨细胞增殖有3.5-9倍的刺激作用。在该蛋白质的多种制品中观察到了Zcyto7对软骨细胞的刺激作用并跨越了种界。与此形成对照，用BSA做的对照实验对软骨细胞不产生刺激作用。

实施例8

利用Zcyto7处理的软骨细胞生产糖胺聚糖

制备软骨细胞的20％铺满培养物，加入Zcyto7至浓度为1μg/ml。在第二个实验里，除Zcyto7外，还向细胞培养物中加入IL-1β。在对照组中，将BSA加入软骨细胞培养物中。然后用1，9-二甲基亚甲兰染料结合检验，确定由软骨细胞培养物所产生的糖胺聚糖(GAG)水平，Fardale等，生物化学与生物物理学学报(Biochem.Biophys.Acta)888：173-177(1987)。

结果：与Zcyto7一起培养的软骨细胞显示，在软骨细胞培养物中稳定状态存在的GAG有50％的增长。此外，当软骨细胞与Zcyto7和白介素-1β(IL-1)共培养时，与软骨细胞分别单独与Zcyto7或白介素-1β培养时相比，软骨细胞的GAG产量提高了2.5倍。而加入BSA的培养细胞则显示GAG产量没有增加。

实施例9

Zcyto7对成骨细胞的刺激作用

CCC4细胞系是一种来自p53敲除小鼠的成骨细胞样细胞系。用含有引发荧光素酶表达的可诱导型血清效应元件(SRE)的质粒转染CCC4细胞系。SRE的刺激作用及因此而产生的荧光素酶的表达表明该化学本体可能刺激成骨细胞。

在有1μg Zcyto7/ml培养基条件下培养CCC4细胞。将作为对照的BSA、成纤维细胞生长因子(FGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)分别加入CCC4细胞的不同培养物中。BSA是阴性对照，FGF和PDGF由于已知可促进成骨细胞增殖而作为阳性对照。通过加入40μl Promega荧光素酶底物，利用Labsystes LUMINOSKAN^上2秒钟内的综合读数来检测荧光素酶活性。

结果

Zcyto7以及FGF和PDGF在检验中刺激荧光素酶的表达，这表明它们都刺激成骨细胞。在此检验中BSA载体对照是阴性的。

实施例10

Zcyto7在成纤维细胞生长的作用

用Zcyto7接种人皮肤、肺和胎儿肺成纤维细胞的铺满培养物，以测定Zcyto7对成纤维细胞生长的作用。FGF用作阳性对照而BSA则作为阴性对照载体。

结果：Zcyto7对成纤维细胞生长无影响。

实施例11

Zcyto7对BaF3细胞生长的作用

BaF3细胞是一种依赖于IL-3而增殖的鼠前B细胞系，用基本培养基将其洗几次，然后铺于96孔板上，每孔约含5500个细胞。用1μg/mlZcyto7或1-2pg/ml IL3或Zcyto7和IL-3的混合物处理细胞。同样，在另一实验中以0.1-10ng/ml的TGFβ代替Zcyto7加入孔中。检验平板在37℃和5％二氧化碳中保温3-6天后，每孔加入20μl ALAMAR兰，并将平板于37℃保温15-24小时。平板随后用荧光计读数，其中激发波长为544nm，发射波长为590nm。该检定也用肉眼估计在ALAMAR兰加入前细胞增殖的刺激或抑制情况。此基本培养基中含RPMI1640+10％HIA-FBS+L-谷氨酰胺+丙酮酸钠。

结果：Zcyto7和TGFβ有效抑制了IL-3引起的BaF3细胞的增殖。然而，与Zcyto7一起加入抗TGFβ的中和抗体时，Zcyto7对BaF3细胞增殖的抑制作用就消除了。

实施例12

Zcyto7对TF-1细胞生长的作用

TF-1细胞是一种GM-CSF或IL-1β依赖型的人白血病细胞系，将其用基本培养基洗多次，然后铺于96孔板上，7000个细胞/孔。将细胞与1μg/ml Zcyto7和100-200pg/ml IL-1β共培养。同样在另一实验中，以TGFβ代替Zcyto7加入孔中。检验平板在37℃和5％二氧化碳中保温3-6天后，将20μl ALAMAR兰加入每孔中，并将平板于37℃保温15-24小时。平板随后用荧光计读数，其中激发波长为544nm，发射波长为590nm。在加入ALAMAR兰之前，此检定也用肉眼估计细胞增殖的刺激作用或抑制作用。此基本培养基中含RPMI1640+10％HIA-FBS+L-谷氨酰胺+丙酮酸钠。

结果：Zcyto7和TGF-β均可抑制TF-1细胞的IL-1β刺激作用。Zcyto7浓度大于200ng/ml时产生增殖抑制；而TGF-β浓度约为50pg/ml对产生增殖抑制。序列表(1)基本信息(i)申请人：ZymoGenetics，Inc.

1201 Eastlake Avenue East

Seattle，

WA

USA

98102(ii)发明名称：哺乳动物细胞因子样因子7(iii)序列数目：43(iv)联系地址：

(A)收件人：ZymoGenetics，Inc.

(B)街道：1201 Eastlake Avenue East

(C)城市：Seattle

(D)州名：WA

(E)国家：USA

(F)邮政编码：98102(v)计算机可读形式

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM兼容机

(C)操作***：DOS

(D)软件：FastSEQ，Windows版本2.0(vi)目前申请资料：

(A)申请号：

(B)递交日：

(C)分类：(vii)在先申请资料：

(A)申请号：

(B)递交日：(viii)代理人/代理信息：

(A)姓名：Lunn，Paul G

(B)登记号：32，743

(C)参考/文档号：97-15PC(ix)电信信息：

(A)电话：206-442-6627

(B)传真：206-442-6678

(C)电传：(2)关于SEQ ID NO：1的信息(i)序列特征

(A)长度：736个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：

(A)名称/关键词：编码序列

(B)位置：57...596

(D)其它信息：(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：GAATTCGGCA CGAGGAGGCG GGCAGCAGCT GCAGGCTGAC CTTGCAGCTT GGCGGA ATG 59

Met

1GAC TGG CCT CAC AAC CTG CTG TTT CTT CTT ACC ATT TCC ATC TTC CTG 107Asp Trp Pro His Asn Leu Leu Phe Leu Leu Thr Ile Ser Ile Phe Leu

5 10 15GGG CTG GGC CAG CCC AGG AGC CCC AAA AGC AAG AGG AAG GGG CAA GGG 155Gly Leu Gly Gln Pro Arg Ser Pro Lys Ser Lys Arg Lys Gly Gln Gly

20 25 30CGG CCT GGG CCC CTG GCC CCT GGC CCT CAC CAG GTG CCA CTG GAC CTG 203Arg Pro Gly Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Gln Val Pro Leu Asp Leu

35 40 45GTG TCA CGG ATG AAA CCG TAT GCC CGC ATG GAG GAG TAT GAG AGG AAC 251Val Ser Arg Met Lys Pro Tyr Ala Arg Met Glu Glu Tyr Glu Arg Asn50 55 60 65ATC GAG GAG ATG GTG GCC CAG CTG AGG AAC AGC TCA GAG CTG GCC CAG 299Ile Glu Glu Met Val Ala Gln Leu Arg Asn Ser Ser Glu Leu Ala Gln

70 75 80AGA AAG TGT GAG GTC AAC TTG CAG CTG TGG ATG TCC AAC AAG AGG AGC 347Arg Lys Cys Glu Val Asn Leu Gln Leu Trp Met Ser Asn Lys Arg Ser

85 90 95CTG TCT CCC TGG GGC TAC AGC ATC AAC CAC GAC CCC AGC CGT ATC CCC 395Leu Ser Pro Trp Gly Tyr Ser Ile Asn His Asp Pro Ser Arg Ile Pro

100 105 110GTG GAC CTG CCG GAG GCA CGG TGC CTG TGT CTG GGC TGT GTG AAC CCC 443Val Asp Leu Pro Glu Ala Arg Cys Leu Cys Leu Gly Cys Val Asn Pro

115 120 125TTC ACC ATG CAG GAG GAC CGC AGC ATG GTG AGC GTG CCG GTG TTC AGC 491Phe Thr Met Gln Glu Asp Arg Ser Met Val Ser Val Pro Val Phe Ser130 135 140 145CAG GTT CCT GTG CGC CGC CGC CTC TGC CCG CCA CCG CCC CGC ACA GGG 539Gln Val Pro Val Arg Arg Arg Leu Cys Pro Pro Pro Pro Arg Thr Gly

150 155 160CCT TGC CGC CAG CGC GCA GTC ATG GAG ACC ATC GCT GTG GGC TGC ACC 587Pro Cys Arg Gln Arg Ala Val Met Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys Thr

165 170 175TGC ATC TTC TGAATCACCT GGCCCAGAAG CCAGGCCAGC AGCCCGAGAC CATCCTCCT 645Cys Ile Phe

180TGCACCTTTG TGCCAAGAAA GGCCTATGAA AAGTAAACAC TGACTTTTGA AAGCCAGAAA 705AAAAAAAAAA AAAAAAAATT CCTGCGGCCG C 736(2)关于SEQ ID NO：2的信息(i)序列特征

(A)长度：180个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(v)片段类型：内部的(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Asp Trp Pro His Asn Leu Leu Phe Leu Leu Thr Ile Ser Ile Phe1 5 10 15Leu Gly Leu Gly Gln Pro Arg Ser Pro Lys Ser Lys Arg Lys Gly Gln

20 25 30Gly Arg Pro Gly Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Gln Val Pro Leu Asp

35 40 45Leu Val Ser Arg Met Lys Pro Tyr Ala Arg Met Glu Glu Tyr Glu Arg

50 55 60Asn Ile Glu Glu Met Val Ala Gln Leu Arg Asn Ser Ser Glu Leu Ala65 70 75 80Gln Arg Lys Cys Glu Val Asn Leu Gln Leu Trp Met Ser Asn Lys Arg

85 90 95Ser Leu Ser Pro Trp Gly Tyr Ser Ile Asn His Asp Pro Ser Arg Ile

100 105 110Pro Val Asp Leu Pro Glu Ala Arg Cys Leu Cys Leu Gly Cys Val Asn

115 120 125Pro Phe Thr Met Gln Glu Asp Arg Ser Met Val Ser Val Pro Val Phe

130 135 140Ser Gln Val Pro Val Arg Arg Arg Leu Cys Pro Pro Pro Pro Arg Thr145 150 155 160Gly Pro Cys Arg Gln Arg Ala Val Met Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys

165 170 175Thr Cys Ile Phe

180(2)关于SEQ ID NO：3的信息(i)序列特征

(A)长度：397个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：其它(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：AGGCGGGCAN AGCTGCAGGC TGACCTTGCA GCTTGGCGGA ATGGACTGGC CTCACAACCT 60GCTGTTTCTT CTTACCATTT CCATCTTCCT GGGGCTGGGC AGCCAGGAGC CCCAAAAGCA 120AGAGGAAGGG GCAAGGGCGG CCTGGGCCCN TGGCCTGGCC TCACCAGGTG CCACTGGACC 180TGGTGTCACG GATGAAACCG TATGCCCGCA TGGAGGAGTA TGAGAGGAAC ATCGAGGAGA 240TGGTGGCCCA GCTGAGGAAC AGCTCANAAG CTGGCCCAGA GAAAGTGTGA GGTCAACTTG 300CAGCTGTGGA TGTCCAACAA GAAGGAGCCT GTCTCCCTTG GGGCTACAAG CATCAACCAC 360CGACCCCAGC CGTATCCCCG TGGGACCTTG CCGGGAC 397(2)关于SEQ ID NO：4的信息(i)序列特征

(A)长度：18个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其它(vii)直接来源：

(B)克隆：ZC13265(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：TTACCATTTC CATCTTCC 18(2)关于SEQ ID NO：5的信息(i)序列特征

(A)长度：18个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其它(vii)直接来源：

(B)克隆：ZC13266(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：CCCTTCCTCT TGCTTTTG 18(2)关于SEQ ID NO：6的信息(i)序列特征

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其它(vii)直接来源：

(B)克隆：ZC13326(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：CAAGGATCCC AGCCCAGGAG CCCCAAAAG 29(2)关于SEQ ID NO：7的信息(i)序列特征

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其它(vii)直接来源：

(B)克隆：ZC13330(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：GACCTCGAGT CAGAAGATGC AGGTGCAGCC 30(2)关于SEQ ID NO：8的信息(i)序列特征

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其它(vii)直接来源：

(B)克隆：ZC13325(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：GTCGAATTCA TGGACTGGCC TCACAACCTG 30(2)关于SEQ ID NO：9的信息(i)序列特征

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其它(vii)直接来源：

(B)克隆：ZC13327(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：GAAGGATCCG AAGATGCAGG TGCAGCC 27(2)关于SEQ ID NO：10的信息(i)序列特征

(A)长度：10个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser1 5 10(2)关于SEQ ID NO：11的信息(i)序列特征

(A)长度：692个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：

(A)名称/关键词：编码序列

(B)位置：50...589

(D)其它信息：(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：GGGGTTCCTG GCGGGTGGCA GCTGCGGGCC TGCCGCCTGA CTTGGTGGG ATG GAC TGG 58

Met Asp Trp

1CCG CAC AGC CTG CTC TTC CTC CTG GCC ATC TCC ATC TTC CTG GCG CCA 106Pro His Ser Leu Leu Phe Leu Leu Ala Ile Ser Ile Phe Leu Ala Pro

5 10 15AGC CAC CCC CGG AAC ACC AAA GGC AAA AGA AAA GGG CAA GGG AGG CCC 154Ser His Pro Arg Asn Thr Lys Gly Lys Arg Lys Gly Gln Gly Arg Pro20 25 30 35AGT CCC TTG GCC CCT GGG CCT CAT CAG GTG CCG CTG GAC CTG GTG TCT 202Ser Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Gln Val Pro Leu Asp Leu Val Ser

40 45 50CGA GTA AAG CCC TAC GCT CGA ATG GAA GAG TAT GAG CGG AAC CTT GGG 250Arg Val Lys Pro Tyr Ala Arg Met Glu Glu Tyr Glu Arg Asn Leu Gly

55 60 65GAG ATG GTG GCC GAG CTG AGG AAC AGC TCC GAG CCA GCC AAG AAG AAA 298Glu Met Val Ala Gln Leu Arg Asn Ser Ser Glu Pro Ala Lys Lys Lys

70 75 80TGT GAA GTC AAT CTA CAG CTG TGG TTG TCC AAC AAG AGG AGC CTG TCC 346Cys Glu Val Asn Leu Gln Leu Trp Leu Ser Asn Lys Arg Ser Leu Ser

85 90 95CCA TGG GGC TAC AGC ATC AAC CAC GAC CCC AGC CGC ATC CCT GCG GAC 394Pro Trp Gly Tyr Ser Ile Asn His Asp Pro Ser Arg Ile Pro Ala Asp100 105 110 115TTG CCC GAG GCG CGG TGC CTA TGT TTG GGT TGC GTG AAT CCC TTC ACC 442Leu Pro Glu Ala Arg Cys Leu Cys Leu Gly Cys Val Asn Pro Phe Thr

120 125 130ATG CAG GAG GAC CGT AGC ATG GTG AGC GTG CCA GTG TTC AGC CAG GTG 490Met Gln Glu Asp Arg Ser Met Val Ser Val Pro Val Phe Ser Gln Val

135 140 145CCG GTG CGC CGC CGC CTC TGT CCT CAA CCT CCT CGC CCT GGG CCC TGC 538Pro Val Arg Arg Arg Leu Cys Pro Gln Pro Pro Arg Pro Gly Pro Cys

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(A)长度：180个氨基酸

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180(2)关于SEQ ID NO：13的信息(i)序列特征

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(A)长度：160个氨基酸

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(A)长度：160个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

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(A)长度：160个氨基酸

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(A)长度：160个氨基酸

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(A)长度：160个氨基酸

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(A)长度：160个氨基酸

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(A)长度：160个氨基酸

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(A)长度：160个氨基酸

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(A)长度：160个氨基酸

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130 135 140Gln Arg Ala Val Met Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys Thr Cys Ile Phe145 150 155 160(2)关于SEQ ID NO：24的信息 (i)序列特征

(A)长度：160个氨基酸

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(A)长度：160个氨基酸

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(A)长度：97个氨基酸

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(A)长度：17个氨基酸

(B)类型：氨基酸

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(A)长度：19个氨基酸

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(B)类型：氨基酸

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20 25 30Cys Glu Val Asn Leu Gln Leu Trp Met Ser Asn Lys Arg Ser Leu Ser

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(A)长度：73个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

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20 25 30Met Val Ser Val Pro Val Phe Ser Gln Val Pro Val Arg Arg Arg Leu

35 40 45Cys Pro Pro Pro Pro Arg Thr Gly Pro Cys Arg Gln Arg Ala Val Met

50 55 60Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys Thr Cys65 70(2)关于SEQ ID NO：36的信息(i)序列特征

(A)长度：158个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：36：Arg Ser Pro Lys Ser Lys Arg Lys Gly Gln Gly Arg Pro Gly Pro Leu1 5 10 15Ala Pro Gly Pro His Gln Val Pro Leu Asp Leu Val Ser Arg Met Lys

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(A)长度：154个氨基酸

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(A)长度：151个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

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(A)长度：160个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：39：His Pro Arg Asn Thr Lys Gly Lys Arg Lys Gly Gln Gly Arg Pro Ser1 5 10 15Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Gln Val Pro Leu Asp Leu Val Ser Arg

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130 135 140Gln Arg Val Val Met Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys Thr Cys Ile Phe145 150 155 160(2)关于SEQ ID NO：40的信息(i)序列特征

(A)长度：158个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：40：Arg Asn Thr Lys Gly Lys Arg Lys Gly Gln Gly Arg Pro Ser Pro Leu1 5 10 15Ala Pro Gly Pro His Gln Val Pro Leu Asp Leu Val Ser Arg Val Lys

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100 105 110Asp Arg Ser Met Val Ser Val Pro Val Phe Ser Gln Val Pro Val Arg

115 120 125Arg Arg Leu Cys Pro Gln Pro Pro Arg Pro Gly Pro Cys Arg Gln Arg

130 135 140Val Val Met Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys Thr Cys Ile Phe145 150 155(2)关于SEQ ID NO：41的信息(i)序列特征

(A)长度：153个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：41：Lys Arg Lys Gly Gln Gly Arg Pro Gly Pro Leu Ala Pro Gly Pro His1 5 10 15Gln Val Pro Leu Asp Leu Val Ser Arg Met Lys Pro Tyr Ala Arg Met

20 25 30Glu Glu Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Glu Met Val Ala Gln Leu Arg Asn

35 40 45Ser Ser Glu Leu Ala Gln Arg Lys Cys Glu Val Asn Leu Gln Leu Trp

50 55 60Met Ser Asn Lys Arg Ser Leu Ser Pro Trp Gly tyr Ser Ile Asn His65 70 75 80Asp Pro Ser Arg Ile Pro Val Asp Leu Pro Glu Ala Arg Cys Leu Cys

85 90 95Leu Gly Cys Val Asn Pro Phe Thr Met Gln Glu Asp Arg Ser Met Val

100 105 110Ser Val Pro Val Phe Ser Gln Val Pro Val Arg Arg Arg Leu Cys Pro

115 120 125Pro Pro Pro Arg Thr Gly Pro Cys Arg Gln Arg Ala Val Met Glu Thr

130 135 140Ile Ala Val Gly Cys Thr Cys Ile Phe145 150(2)关于SEQ ID NO：42的信息(i)序列特征

(A)长度：128个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质 (xi)序列描述：SEQ ID NO：42：Met Lys Pro Tyr Ala Arg Met Glu Glu Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Glu1 5 10 15Met Val Ala Gln Leu Arg Asn Ser Ser Glu Leu Ala Gln Arg Lys Cys

20 25 30Glu Val Asn Leu Gln Leu Trp Met Ser Asn Lys Arg Ser Leu Ser Pro

35 40 45Trp Gly Tyr Ser Ile Asn His Asp Pro Ser Arg Ile Pro Val Asp Leu

50 55 60Pro Glu Ala Arg Cys Leu Cys Leu Gly Cys Val Asn Pro Phe Thr Met65 70 75 80Gln Glu Asp Arg Ser Met Val Ser Val Pro Val Phe Ser Gln Val Pro

85 90 95Val Arg Arg Arg Leu Cys Pro Pro Pro Pro Arg Thr Gly Pro Cys Arg

100 105 110Gln Arg Ala Val Met Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys Thr Cys Ile Phe

115 120 125(2)关于SEQ ID NO：43的信息(i)序列特征

(A)长度：157个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：43：Arg Ser Pro Lys Ser Lys Arg Lys Gly Gln Gly Arg Pro Gly Pro Leu1 5 10 15Ala Pro Gly Pro His Gln Val Pro Leu Asp Leu Val Ser Arg Met Lys

20 25 30Pro Tyr Ala Arg Met Glu Glu Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Glu Met Val

35 40 45Ala Gln Leu Arg Asn Ser Ser Glu Leu Ala Gln Arg Lys Cys Glu Val

85 90 95Ala Arg Cys Leu Cys Leu Gly Cys Val Asn Pro Phe Thr Met Gln Glu

100 105 110Asp Arg Ser Met Val Ser Val Pro Val Phe Ser Gln Val Pro Val Arg

115 120 125Arg Arg Leu Cys Pro Pro Pro Pro Arg Thr Gly Pro Cys Arg Gln Arg

130 135 140Ala Val Met Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys Thr Cys Ile145 150 155

Claims

1.编码哺乳动物Zcyto7多肽或其变体的一种分离多核苷酸。

2.权利要求1的分离多核苷酸，其中所述多核苷酸编码选自SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14-27和SEQ ID NO：36-43的多肽。

3.权利要求2的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的多肽是由SEQ ID NO：15-25所限定的多肽，其中所述多肽的氨基端开始于氨基酸残基3，精氨酸；氨基酸残基7，丝氨酸；氨基酸残基8，赖氨酸；氨基酸残基10，赖氨酸或氨基酸残基33，甲硫氨酸。

4.权利要求2的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的多肽是SEQID NO：2，12，14-25和36-42所限定的一种多肽，其中的氨基酸序列终止于SEQ ID NO：2中第179位、SEQ ID NO：14-25中第159位氨基酸残基，异亮氨酸，它相应于SEQ ID NO：36的第157位氨基酸残基、SEQ ID NO：37的第153位氨基酸残基、SEQ ID NO：38的第150位氨基酸残基、SEQ ID NO：39的第159位氨基酸残基、SEQ IDNO：40的第157位氨基酸残基、SEQ ID NO：42的第152位氨基酸残基、SEQ ID NO：42的第127位氨基酸残基。

5.编码有至少15个氨基酸残基、含SEQ ID NO：2、14-27和36-43中多肽的带表位之部分的肽或多肽的一种分离多核苷酸。

6.权利要求5的分离多核苷酸，其中的肽或多肽选自SEQ ID NO：28-35。

7.权利要求5或6的多核苷酸，其中的肽或多肽融合于一载体多肽或其它载体分子上。

8.所编码肽或多肽与权利要求1-7中多核苷酸编码的多肽有90％、95％或99％相同的一种多核苷酸。

9.含以下有效连接在一起的元件的表达载体：

转录启动子；

由权利要求1-8所限定的DNA片段；及转录终止子。

10.含以下有效连接在一起的元件的表达载体：

(a)转录启动子；

(b)编码嵌合多肽的DNA片段，其中所述的嵌合多肽基本上由通过肽键连接的第一部分和第二部分组成，所说的第一部分包括哺乳动物多肽，所述多肽具有SEQ ID NO：2、12、14-43的氨基酸序列，而所说的第二部分是第二种多肽或蛋白质。

(c)转录终止子。

11.分离的哺乳动物Zcyto7多肽或其变体。

12.权利要求11的分离Zcyto7多肽，其选自由SEQ ID NO：2、12、14-27和36-43所组成的氨基酸序列组。

13.权利要求12的多肽，其中该多肽是由SEQ ID NO：15-25所限定的多肽，所说多肽的氨基端被修饰，并开始于氨基酸残基3，精氨酸；氨基酸残基7，丝氨酸；氨基酸残基8，赖氨酸；氨基酸残基10，赖氨酸或氨基酸残基33，甲硫氨酸。

14.权利要求12的多肽，其中所述多肽是由SEQ ID NO：2、12、14-25和36-42所限定的多肽，诸氨基酸序列终止于SEQ ID NO：2的第179位、SEQ ID NO：14-25的第159位氨基酸残基，异亮氨酸，它相应于SEQ ID NO：36的第157位氨基酸残基、SEQ ID NO：37的第153位氨基酸残基、SEQ ID NO：38的第150位氨基酸残基、SEQ IDNO：39的第159位氨基酸残基、SEQ ID NO：40的第157位氨基酸残基、SEQ ID NO：42的第152位氨基酸残基、SEQ ID NO：42的第127位氨基酸残基。

15.至少有15个氨基酸残基、含Zcyto7多肽的带表位之部分的分离肽或多肽。

16.权利要求15的肽或多肽，其中所述的肽或多肽是SEQ ID NO：2、14-27和36-43中一种多肽的带表位之部分。

17.权利要求16的分离肽或多肽，其中的肽或多肽选自由SEQ IDNO：28-35所组成的氨基酸序列组。

18.与权利要求12-17的肽或多肽有90％、95％或99％相同的分离肽或多肽。

19.权利要求12-17的分离肽或多肽，其氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的添加、删除和/或取代而被修饰，并保持所述肽或多肽的生物学活性。

20.一种可与哺乳动物多肽特异性结合的抗体，所述的多肽由权利要求12-20的氨基酸序列所限定。

21.可与权利要求12-19中肽或多肽结合的抗体的制备方法，包括用所说的肽或多肽或者编码该肽或多肽的核酸接种动物，其中所说的动物产生针对该肽或多肽的抗体；并

分离该抗体。

22.权利要求21的抗体，其中所说抗体是多克隆或单克隆抗体。

23.权利要求20和21之抗体的抗体片段、单链抗体或人源化抗体。

24.权利要求21-23之抗体的抗独特型抗体。