CN1253469C - 人的肿瘤－睾丸抗原hca587的抗原决定簇多肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人的肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽，该多肽及其衍生物能与人类HLA分子结合，并能通过杀伤性T淋巴细胞导致靶细胞裂解。本发明进一步公开了这些抗原肽及其衍生物在肝癌及其它肿瘤的治疗、诊断和预防中的应用。

Description

人的肿瘤-睾丸抗原HCA587的抗原决定簇多肽及其用途

技术领域

本发明涉及一类抗原决定簇多肽，尤其涉及人的肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽，并进一步涉及这些抗原肽及其衍生物在肝癌及其它肿瘤的治疗、诊断和预防中的应用。

背景技术

肿瘤的发生是一个多阶段、多步骤的过程，这一过程中伴随着机体许多的细胞学、遗传学的改变，出现多种基因表达异常，包括癌基因的激活和/或抑癌基因灭活，激发异常的信号传导通路，导致细胞周期及细胞凋亡异常，从而使得细胞恶性转化，并随着各种分子异常的累积，肿瘤出现进展、转移。因此，了解这些在肿瘤发生过程中、在肿瘤组织中特异表达的基因对于肿瘤发生发展机制的阐明、临床的诊断和治疗都具有重要意义。

原发性肝细胞癌是人类原发性肝癌中最常见的一种类型，也是全世界最常发生的恶性肿瘤之一，尤其在东南亚及非洲，它的发病率更高。除了极高的发病率外，肝细胞癌还以高恶性度和高死亡率著称，如果不进行治疗，从诊断到死亡的预期寿命约是6个月，5年存活率小于3％；若单纯行手术治疗，小肝癌的五年存活率为62.7％，大肝癌的仅为37.1％。就中国而言，每年约有110,000人死于肝癌，占全世界每年肝癌死亡人数的四分之一。这种高死亡率，主要是由于早期肝癌缺乏特异临床症状，导致大部分患者就诊迟，而又缺乏有效治疗手段及术后易复发所致。发病率高、恶性度高、诊断迟、治疗方法少、预后差，是肝癌的几大特点。尽管国内外科研人员都对肝癌进行了多方面的研究，但目前肝癌发生发展的分子机理还不太清楚，对肝癌的治疗也主要是采取手术治疗及局部或全身化疗，但术后生存期仍不尽人意。因此，寻求针对肝癌及其它肿瘤的新的免疫治疗手段已成为科研工作者义不容辞的责任。

要进行肿瘤的免疫治疗，首先需要得到肿瘤抗原。在二十世纪的最后十年，随着免疫学理论方法和分子生物学方法的飞速发展，克隆肿瘤抗原已成为肿瘤免疫研究及治疗的重要方面。大量可以诱导机体免疫应答的肿瘤抗原的发现，为肿瘤的免疫治疗开辟了新的纪元。

迄今为止，为了寻找肿瘤特异性或相关性抗原用于肿瘤的免疫治疗，人们已经建立了多种方法来分离肿瘤抗原。利用CTL筛选cDNA文库转染的细胞，人们从黑色素瘤中鉴定了第一个肿瘤抗原MZ2-E(由MAGE-A1基因编码)(van der Bruggen P，et al.Science.1991 Dec13；254(5038)：1643-7)。十多年来，CTL方法虽然有了许多改进，但其烦琐的步骤及较长筛选周期，制约了它的广泛使用。

寻找肿瘤特异组织特异表达的肿瘤-睾丸抗原(cancer-testis antigen，CT)进行肿瘤的免疫治疗已成为肿瘤免疫学的研究热点。近年来由Pfreundschuh和他的同事们创建的一种新的筛选策略称为SEREX(Serological Identification of Recombinant Expression Cloing)(Sahin U，etal.Natl Acad Sci USA.1995 Dec 5；92(25)：11810-3)。利用它可以直接鉴定在肿瘤病人体内诱导产生IgG抗体应答的肿瘤抗原。SEREX方法已经在一系列组织类型肿瘤中得到应用，包括：乳腺癌、黑色素瘤、肾细胞癌、星形细胞瘤、食管癌、小细胞肺癌、结肠癌、恶性间皮瘤、胃癌、胰腺癌和淋巴瘤(Minenkova O，et al.Int J Cancer.2003，106(4)：534-44；Koroleva EP，et al.Russ J Immunol.2002，7(3)：229-38；Jager D，et al.Cancer Immun.2002，28：2-5；Diesinger I，et al.Int J Cancer.2002，102(4)：372-8；Line A，et al.Cancer Immunol Immunother.2002，51(10)：574-82)。通过SEREX方法已鉴定了一些非常有价值的抗原如MAGE-1、HOM-MEL-40、NY-ESO-1、SSX2、SCP-1、CT7、NY-ESO-1和SCP-1。利用NY-ESO-1多肽疫苗进行的晚期黑色素癌病人的临床治疗实验证实了以上理论。在接受治疗的12位病人中，7位为NY-ESO-1血清抗体阴性，5位为阳性；前者经疫苗免疫后，4/7的病人发生了NY-ES0-1多肽疫苗特异性的CTL和CD4+的DTH应答，后者虽未检测到NY-ESO-1特异性T细胞应答的变化，但3/5例病人的病情得到了控制。这些临床实验的初步结果，为肿瘤多肽疫苗的免疫治疗提供了希望。

发明内容

本发明的目的在于提供来源于肿瘤-睾丸抗原HCA587的、能与人类HLA分子结合的、并能通过杀伤性T淋巴细胞导致靶细胞裂解的抗原决定簇多肽及其应用。

本发明进一步提供了编码上述多肽序列的DNA片段及其应用。

本发明的目的是这样实现的：

本发明提供的一种人的肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽，该多肽能与人类HLA分子结合，并能通过杀伤性T淋巴细胞导致靶细胞裂解。

所述的人肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽，优选为下述九肽序列：FLAKLNNTV、TLDEKVAEL、VIWEVLNAV、KVLEFLAKL、VMASESLSV、LLIIILSVI；

本发明的人肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽，优选为包含一段或几段下述九肽序列的多肽，该九肽序列为FLAKLNNTV、TLDEKVAEL、VIWEVLNAV、KVLEFLAKL、VMASESLSV、LLIIILSVI；该抗原决定簇多肽是9以上的氨基酸序列，它含有上述6种九肽序列的一种或几种。

本发明还提供了编码人肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽的DNA序列。

所述的编码多肽的DNA序列优选为编码下列多肽序列：FLAKLNNTV、TLDEKVAEL、VIWEVLNAV、KVLEFLAKL、VMASESLSV、LLIIILSVI；

还优选该编码多肽的DNA序列，所编码的多肽包含一段或一段以上的选自下列的氨基酸序列：FLAKLNNTV、TLDEKVAEL、VIWEVLNAV、KVLEFLAKL、VMASESLSV、LLIIILSVI。

本发明还进一步提供了所述的抗原决定簇多肽的应用。

上述任何一种或多种多肽和佐剂联合后制成的多肽疫苗能在肿瘤，如肝癌、黑色素瘤等患者临床治疗中使用。

包含上述任何一种多肽能制备成肿瘤的诊断和预防试剂。该多肽与人类HLA分子的聚合物、化合物或复合物(如二聚体、四聚体及八聚体等)聚合，制备成HLA-多肽复合物试剂，能用于检测肿瘤病人体内针对肿瘤细胞的特异性应答T细胞，从而评估肿瘤患者的免疫功能状态、判断肿瘤患者的预后及肿瘤高危人群中的预防。

本发明更进一步提供了编码上述抗原决定簇多肽序列的DNA的应用。

作为本发明的另一部分，即编码这些多肽的核苷酸序列(亦被称“mini-genes”)，它们可构建在适当的表达载体中，在启动子的作用下进行表达，从而可制备成特异性的基因疫苗，用于肿瘤患者的基因治疗。需要指出的是，这些表达序列不仅可包含同一编码多肽序列的多拷贝重复，亦可是不同多肽编码序列的组合。其它任何包含这些编码多肽序列的重组载体形式、或重组细胞形式(如真核或原核细胞)都可作为基因疫苗产品的组成部分，因此都是本发明需要保护的内容。

附图说明

图1为HCA587蛋白序列

图2为肝癌患者TIL细胞对负载HCA587抗原多肽T2细胞的杀伤

其中1：No.1号肽；2：No.2号肽；3：No.3号肽；4：No.4号肽；5：No.5号肽；6：No.6号肽；7：单纯T2细胞对照

图3肝癌患者TIL细胞对肿瘤细胞系细胞的杀伤

其中1：SK-MEL37细胞系；2：NA8-MEL；3：单纯SK-MEL37细胞对照；4：单纯NA8-MEL细胞对照；5：单纯TIL细胞对照

具体实施方式

实施例1.CT抗原HCA587的基因发现过程

为了筛选原发性肝细胞癌中异常表达的CT抗原，我们利用Stratagene公司的cDNA synthesis Kit、Uni-ZAP XR载体和Gigapack IIIGOLD packaging extract试剂盒，选取了肝细胞癌患者的组织标示进行SEREX方法的筛选。

首先按TRIzol试剂盒(Gibco公司)的操作说明提取肝癌及癌旁组织总RNA，步骤共包括：组织匀浆、抽提、RNA沉淀、洗涤和溶解，提取好的RNA以适量的DEPC处理过的超纯水溶解沉淀。紫外分光光度计测定样品的OD260和OD280值，甲醛变性凝胶电泳检测RNA质量(28S和18S rRNA的比例)。

采用Promega公司PolyATract mRNA分离试剂盒(Promega，Madison，WI)分离mRNA，其基本原理是用带有亲和素的磁珠在磁场的作用下贴壁于管壁的同时，可与生物素化的oligo(dT)结合，通过oligo(dT)与mRNA3’端的PolyA尾互补杂交使mRNA得到分离纯化。操作流程主要包括探针退火、洗涤链亲和素结合的磁珠、Oligo(dT)-mRNA杂交体的捕获、洗涤及mRNA的洗脱，最后用紫外分光光度检测mRNA的浓度和纯度。

肝癌组织cDNA表达文库的构建使用ZAP-cDNA Gigapack III Gold克隆试剂盒。简言之，模板mRNA为5ug，以GAGA序列+XhoI识别位点序列(CTCGAG)+Poly(dT)₁₈为引物，在MMLV逆转录酶的作用下合成第一条cDNA链。再以第一条cDNA链为模板，以经RNaseH酶切的RNA片段为引物，在DNA聚合酶I的作用下合成第二条cDNA链。双链cDNA在pfu DNA聚合酶的作用下末端补平，经T4连接酶平端连接EcoR I接头、再经Xho I酶切，使双链cDNA的两端分别形成XhoI和EcoR I的互补序列。经SizeSep400 Spun Columns分子筛层析，将酶切的小片段(小于400bp)除去后，将cDNA定向连接在Uni-ZAP XR噬菌体载体上。带有***片段的连接载体经包装抽提物包装成为噬菌体颗粒，最后转化宿主菌XL1-Blue MRF’细胞，形成初级文库。

包装形成的初级文库经滴度和重组效率测定后，以约5×10⁴集落/板的密度接种噬菌体于宿主菌XL1-Blue MRF’，经37℃6-8小时生长后，加适量的SM缓冲液4℃孵育过夜，最后收获形成的噬菌体即为扩增的cDNA文库。

扩增的文库加氯仿至终浓度为0.3％(v/v)可于4℃短期储存；加DMSO至终浓度为7％(v/v)可于-70℃长期保存。

筛选肝癌组织cDNA表达文库采用的抗体筛选法。同体或异体肝癌病人的血清作为自然抗体的来源。将文库以SM进行稀释后与宿主菌XL1-Blue MRF’细胞混匀铺板，约10⁴/133cm平板。42℃孵育3.5小时后，盖上经IPTG浸泡后晾干的NC膜，37℃孵育5小时。作好标记后将膜取出，TNT漂洗，在封闭液中过夜。加1∶15000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG(H+L)二抗，室温摇动1小时，TNT洗三次，TBS洗两次，加入BCIP/NBT显色液显色。此时显色的克隆为二抗阳性克隆，用细针头在阳性位置扎孔作为标记。在此过程中保持NC膜的湿润。标记好的NC膜用大量TBS室温洗三次，每次15分钟。加入1∶500稀释的病人血清，室温摇动1小时，TNT洗三遍；再加入1∶15000稀释的二抗，室温摇动1小时，TNT洗三次，TBS洗两次，加入BCIP/NBT显色液显色。没有针孔标记的阳性噬斑为对病人血清反应的阳性克隆。根据NC膜的定位标记挑取琼脂板上相应位置的噬菌斑，加入1ml SM/氯仿噬菌体保存液中。

第一轮挑取的阳性克隆按一定稀释度稀释后重新与宿主菌混合铺板，重复上述方法进行第二轮筛选。一般经过3-4轮筛选，可得到分离良好的单克隆阳性噬菌斑。

取适量的保存在SM缓冲液中的阳性克隆与宿主菌XL1-BlueMRF’及辅助剪切噬菌体混合，加入3ml LB液，37℃孵育2.5～3小时，65～70℃孵育20分钟，离心后所得上清含有切割后形成的pBluescript噬菌粒。取适量此上清加入到新鲜制备的SOLR菌中，接种LB/AMP板，37℃过夜培养后，取单一菌落，用QIAprep Miniprep试剂盒提取质粒，经EcoR I和Xho I酶切，确定***片段的大小。有相同酶切图谱的克隆判定为同一基因，不同大小***片段的克隆由赛百盛公司和上海基康公司用T3、T7或M13引物，在ABI Prism全自动序列测定仪(PerkinElmer)上进行核酸序列测定。结果发现，通过数据库相似性搜索，HCA587在核苷酸水平上没有相似性较高的基因(全序列对比＜85％)，因此它们是一种新的抗原编码基因。通过RACE方法获得全长后，经Sequenin软件向DDBJ/EMBL/GenBank申请登录全长新的cDNA序列，获取的查询号为AF151378。

实施例2.HCA587重组蛋白的表达及在肿瘤组织中的分布

(1)重组pQE30-HCA587蛋白的表达

根据HCA587的核苷酸序列设计特异性引物，在上下游引物的5’端分别合成BamHI、HindIII酶切位点，P1：5’ATC GGATCCCCTCCCGTTCCAGGCGT 3’，P2：5’ACT AAGCTTTCACTCAGAAAAGGAGAC3’，以正常睾丸组织的cDNA为模板，PCR扩增出HCA587全长ORF，PCR产物和pGEM-Teasy载体连结后，转化DH5a，挑取含正确***HCA587的阳性克隆，分别用BamHI和HindIII双酶切HCA587-pGEMT-easy质粒和pQE-30载体，电泳后凝胶回收HCA587和pQE-30片段，T4连结酶过夜连结后，转化XL-Blue感受态细胞，提取重组质粒(pQE-30/HCA-587)，酶切鉴定重组载体。取构建正确的重组载体转化M15感受态细胞，氨苄青霉素和卡那霉素抗性筛选为阳性的克隆接种于5ml LB液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和25μg/mL卡那霉素)，37℃过夜培养，然后以1∶100稀释于200mL LB培养基中，于37℃振荡培养至OD＝0.6时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续于37℃振荡培养4.5h，离心收集细菌。用细菌裂解缓冲液悬浮离心收集的细菌，加入溶菌酶至终浓度0.1mg/ml，室温放置30min后，超声破碎，13000rpm离心30min(4℃)，分别收集上清和沉淀。参照Qiagen公司说明书，利用自该公司购买的镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)进行亲和层析。

纯化蛋白经SDS-PAGE电泳的纯化蛋白按上述方法电转移至经甲醇浸泡后的PVDF膜上，考马斯亮蓝染色后，50％甲醇脱色至满意为止，在PE/ABI491测序仪上进行重组蛋白的氨基酸序列测定(HCA587蛋白序列见图1)。结果证明，我们已成功获取重组的HCA587蛋白。Western实验进一步证实，该重组蛋白能与抗体阳性患者的血清反应，说明其具有与天然蛋白相似的结构。

(2)HCA587在肿瘤组织中的分布

HCA587重组蛋白100ug和福氏完全佐剂混匀后，皮内多点免疫家兔，共进行四次免疫(1次/2周)后，取血后分离免疫血清进行抗体滴度测定，ELISA结果显示，抗体滴度达1∶25600，经Poly A柱纯化IgG后，用免疫组化的方法分析HCA587蛋白在各种正常和肿瘤组织中的蛋白分布。

收集正常组织标本和各种肿瘤组织的石蜡和冰冻切片，使用1∶4000稀释抗体用ABC方法进行组化染色，后经DAB显色，苏木素复染后观察HCA587在组织中的表达情况，结果可见，HCA587在正常组织中除睾丸和小脑的Pukenji细胞有表达外，其它组织均为阴性；而在肿瘤组织中HCA587呈不同组织的、不同比例的异源性表达，见表1。

   表1.HCA587在肿瘤组织中的表达

组织类型	组化染色(阳性数/总数)
		黑色素瘤肺癌乳腺癌胰腺癌淋巴瘤头颈部癌	3/62/111/52/112/101/4

卵巢癌***癌***癌肾细胞癌脂肪肉瘤结肠癌尿道膀胱癌血管瘤

1/21/20/100/30/30/30/30/1

由该表可以看出，HCA587在不同的肿瘤组织中的表达比例不同，这对HCA587多肽免疫应用具有一定的指导作用。

实施例3.T2结合试验

分析HCA587要诱发机体产生免疫应答，首先要求该蛋白被APC细胞处理后，相应多肽和其HLA分子结合，提呈到细胞表面。因此，我们首先用Dr.Kenneth Parker发明的模型(Parker，K.C.，et al.1994.J.Immunol.152：163)预测HCA587蛋白序列中能和HLA-A2结合的多肽(网址：http：//www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla bind/)，结合其它HLA-A2预测结合多肽软件筛选出9个较为可能的HCA587和HLA-A2结合的抗原多肽，体外用多肽合成仪合成所有的预测多肽(见表2)，用HPLC进行纯化，纯度达99％，然合用细胞系CEMX721.174.T2(简称T2)进行HLA-A2结合试验。因为，T2细胞只表达HLA-A2分子，而不能将内源性多肽提呈到细胞表面，因此其是一个理想的细胞免疫应答研究的细胞系。1×10⁶T2细胞经无血清1640培养基37℃培养36小时后，加入2μgβ₂-微球蛋白5μg，同时加入各种合成的能和预测HLA-A2结合的HCA587九肽50μg，其中设立来源于流感病毒已知和HLA-A2结合的九肽(序列编号：NO.10)(见表2)为阳性对照和不加多肽的阴性对照，37℃培养18小时后，用BSS-2％NCS的缓冲液洗涤2遍后，加入B77.2单抗100μl，冰上染色40分钟后，用BSS-2％NCS的缓冲液再洗2遍后，加入FITC标记的二抗进行间接染色，冰上40分钟后，BSS-2％NCS的缓冲液洗涤后，加入FACS保存液保存，流式分析结果。

表2.HCA587抗原编码肽的T2结合试验

编号	位置	序列	荧光指数#
				12345678910	317140248313356229228361190Flu 68	FLAKLNNTVTLDEKVAELVIWEVLNAVKVLEFLAKLVMASESLSVLLIIILSVISLLIIILSVSLSVMSSNVELLFGLALIGILGFVFTL	3.365.623.012.972.472.761.401.531.342.96

#：荧光指数：(肽结合管平均荧光指数-二抗对照管平均荧光指数)/

             (空白管平均荧光指数-二抗对照管平均荧光指数)

由T2结合试验可以看出，其中能和T2结合的HCA587九肽为序列编号：No.1-No.6，我们知道，抗原肽引起机体免疫应答的前提是其首先能和机体的HLA分子形成复合体，而上述6种多肽能和T2细胞表面表达的HLA分子呈现一定的亲和结合能力，说明其可能是HCA587蛋白中能引起特异性免疫应答的抗原决定簇。而其余合成肽不能与T2的HLA-A2分子结合，说明其可能很难诱导特异性的细胞免疫应答。

实施例4  HCA587多肽在正常人中免疫应答的分析

能和T2的HLA-A2分子结合的多肽不一定都能引起机体产生特异性的细胞免疫应答，下面这一试验将用ELISPOT分析能引起特异性γ-干扰素产生的CTL的细胞免疫应答。

取HLA-A2阳性的正常人PBMCs的单核细胞在含GM-CSF1000u/ml，IL-4 500u/ml及10％FCS的RPMI-1640培养基中培养8天，第8天收获悬浮的树突状细胞(DC)，DC用10μg/ml的T2结合试验阳性的HCA587合成九肽及2.5μg/mlβ2微球蛋白在无血清RPMI-1640中进行加载，37℃，5％CO₂2小时，经⁶⁰Coγ射线3000Gy照射，洗去多余的抗原肽后，DC以1×10⁵/孔，加入和阳性磁珠分离的CD8⁺T细胞孔，混匀后，在含IL-2 10u/ml和500U/ml IL-6的10％AB血清1640进行培养，每隔2天换液，一周后，用同样的方法培养DC后，加载抗原肽，反复刺激CD8⁺T细胞，经4次刺激后，收获CD8⁺T细胞进行ELIPOT试验。

ELISPOT方法检测CD8⁺T细胞被HCA587抗原肽刺激后分泌IFNγ的能力。简述如下，96孔平底硝酸纤维素板(Millititer，Millipore)用抗人IFNγ单抗(1-D1k；2μg/ml于PH 9.6碳酸盐缓冲液中；MABTECH，德国)包被，4℃过夜；第二天经0.05％Tween PBS洗涤后，该板用10％AB血清的1640培养液室温避光封闭1小时，经0.05％Tween PBS洗涤后，每孔加入5×10⁴经7天诱导的效应细胞(Effector Cells，E)并分为两组，即效应细胞与T2细胞组(E+T2)、效应细胞与T2细胞加载抗原肽组(E+T2(肽))，每组各做两复孔；单纯T2细胞和T2细胞在含10μg/ml抗原肽的无血清RPMI-1640中，37℃，5％CO2孵育2小时，经1000Gy照射，洗去多余的抗原肽后作为刺激细胞，以1×10⁵/孔加入各效应细胞孔；该反应体系在不含细胞因子及血清的1640培养液中，37℃，5％CO2孵育18-20小时后，用0.05％Tween PBS充分冲洗培养板以去除残留细胞；随后加入生物素标记的抗人IFN-γ二抗(0.2μg/ml，7-B6-1-biotin；MABTECH)，在37℃孵育2小时后，洗板，再加入碱性磷酸酶标记的链霉亲和素(1μg/ml；MABTECH)在室温避光孵育1小时；洗板后，加入底物BCIP-NBT显色液(NCBI，Sigma产品)避光显色5分钟，用自来水冲洗，终止反应；待反应板晾干后，于解剖显微镜下计数每孔呈黑紫色的斑点数；每组斑点数均由两复孔的平均值得出；抗原特异的CD8⁺T细胞频数＝(E+T2(肽))组斑点数-(E+T2)组斑点数。

结果在2×10⁴CD8⁺细胞中，产生IFN-γ的细胞数分别为：序列编No.1：73、序列编No.2：45、序列编No.3：53、序列编No.4：66、序列编No.5：32、序列编No.6：27。

本试验说明，正常人在序列编号No.1-No.6的HCA587多肽的反复刺激下，能在体外成功诱导针对HCA587多肽的特异性细胞免疫免疫。

实施例5  HCA587多肽在肝癌患者外周血中免疫应答的分析

在本实验中，我们将进一步证实，在肝癌病人体内存在针对HCA587多肽的特异性免疫应答细胞。

收集HCA587蛋白表达阳性、血清抗体阳性的肝癌患者外周血PBMC，经贴壁分离培养DC后，用HCA587合成多肽加载后，刺激经阳性磁珠分离的CD8⁺T细胞，实验步骤同实施例4，唯一不同的是，正常人一般需4轮刺激，而肝癌病人我们只刺激1-2次，目的是扩增已对HCA587蛋白产生特异应答的CTL细胞。结果可见，在肝癌患者体内确实存在针对HCA587蛋白的特异性CTL细胞。

实施例6  肝癌患者TIL细胞对HCA587多肽负载的T2细胞的杀伤试验

本实验分离肝癌患者***或肿瘤组织浸润的淋巴细胞(TIL)，用⁵¹Cr杀伤试验证实天然存在于患者体内的针对HCA587多肽的TIL细胞。

在无菌条件下将切除新鲜瘤体组织去除坏死部分与***，用RPMI1640培养液冲洗干净，移至无菌平皿内用手术剪将肿瘤组织剪碎至1-2mm 3小块，置于3600u DNA酶、50ug胶原酶和125u透明酶的RPMI1640培养液40ml中，混匀并移至有磁棒的无菌三角瓶内，于37℃恒温的磁力搅拌器上搅拌1-2小时。用200目孔径的不锈钢滤网将酶消化后的细胞悬液过滤，以除去未消化好的肿瘤组织块。经1500r/min收集单个细胞，用RPMI 1640培养液洗细胞2次，将细胞再悬起，用梯度离心分离TIL细胞。于无菌管内分层放入100％及75％的淋巴细胞分离液，其上再沿管壁轻轻加入细胞悬液，经2000r/min离心20min，收集100％分离界面上的细胞为富含TIL细胞的悬液，再用RPMI 1640培养液将TIL细胞洗2次，以除去分离液。TIL细胞在含0.24mM Asn，0.55mM Arg，1.5mM Gln，10％pooled human AB serum，100U/ml IL-2，and 10ng/ml ofIL-7的Iscove′s Dulbecco培养基中生长2-3周。

用标准方法对T2细胞进行⁵¹Cr标记，洗涤3遍后，加入10μg/mlHCA587抗原肽及2.5μg/mlβ₂微球蛋白的无血清1640，室温培养1小时后，加入效应细胞TIL，效∶靶比为30∶1，在37℃5％CO₂培养箱中孵育4小时。然后200g离心5分钟，收获上清测定放射活性，结果见图2。

结果发现，序列编号：No.1-No.6是较好的HLA-A2限制性的HCA587特异性TIL的刺激剂。

实施例7  肿瘤细胞系的杀伤试验

在本实验中，用⁵¹Cr杀伤试验证实TIL细胞(见实施例6)对于表达或不表达HCA587蛋白的HLA-A2肿瘤细胞系的杀伤能力。

细胞系NA8-MEL(HLA-A2+，HCA87-)，SK-MEL37(HLA-A2+，HCA587+)被分别用⁵¹Cr标记，具体步骤参见实施例6。结果见图3。显示，SK-MEL37细胞系能被TIL细胞特异性杀伤，而NA8-MEL却不能被杀伤。这说明TIL细胞不仅能杀伤外源加载于T2细胞上的抗原肽，而且能杀伤肿瘤细胞内源提呈的HCA587抗原肽。

                       SEQUENCE LISTING

<110>北京大学

<120>人的肿瘤-睾丸抗原HCA587的抗原决定簇多肽及其用途

<130>FPI03161

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>373

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>1

Met Pro Pro Val Pro Gly Val Pro Phe Arg Asn Val Asp Asn Asp Ser

1               5                   10                  15

Pro Thr Ser Val Glu Leu Glu Asp Trp Val Asp Ala Gln His Pro Thr

            20                  25                  30

Asp Glu Glu Glu Glu Glu Ala Ser Ser Ala Ser Ser Thr Leu Tyr Leu

        35                  40                  45

Val Phe Ser Pro Ser Ser Phe Ser Thr Ser Ser Ser Leu Ile Leu Gly

    50                  55                  60

Gly Pro Glu Glu Glu Glu Val Pro Ser Gly Val Ile Pro Asn Leu Thr

65                  70                  75                  80

Glu Ser Ile Pro Ser Ser Pro Pro Gln Gly Pro Pro Gln Gly Pro Ser

                85                  90                  95

Gln Ser Pro Leu Ser Ser Cys Cys Ser Ser Phe Ser Trp Ser Ser Phe

            100                 105                 110

Ser Glu Glu Ser Ser Ser Gln Lys Gly Glu Asp Thr Gly Thr Cys Gln

       115                  120                 125

Gly Leu Pro Asp Ser Glu Ser Ser Phe Thr Tyr Thr Leu Asp Glu Lys

    130                 135                 140

Val Ala Glu Leu Val Glu Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Glu Ala Glu Glu

145                 150                 155                 160

Pro Val Thr Glu Ala Glu Met Leu Met Ile Val Ile Lys Tyr Lys Asp

                165                 170                 175

Tyr Phe Pro Val Ile Leu Lys Arg Ala Arg Glu Phe Met Glu Leu Leu

            180                 185                 190

Phe Gly Leu Ala Leu Ile Glu Val Gly Pro Asp His Phe Cys Val Phe

        195                 200                 205

Ala Asn Thr Val Gly Leu Thr Asp Glu Gly Ser Asp Asp Glu Gly Met

    210                 215                 220

Pro Glu Asn Ser Leu Leu Ile Ile Ile Leu Ser Val Ile Phe Ile Lys

225                 230                 235                 240

Gly Asn Cys Ala Ser Glu Glu Val Ile Trp Glu Val Leu Asn Ala Val

                245                 250                 255

Gly Val Tyr Ala Gly Arg Glu His Phe Val Tyr Gly Glu Pro Arg Glu

            260                 265                 270

Leu Leu Thr Lys Val Trp Val Gln Gly His Tyr Leu Glu Tyr Arg Glu

        275                 280                 285

Val Pro His Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg

    290                 295                 300

Ala His Ser Glu Ser Ile Lys Lys Lys Val Leu Glu Phe Leu Ala Lys

305                 310                 315                 320

Leu Asn Asn Thr Val Pro Ser Ser Phe Pro Ser Trp Tyr Lys Asp Ala

                325                 330                 335

Leu Lys Asp Val Glu Glu Arg Val Gln Ala Thr Ile Asp Thr Ala Asp

            340                 345                 350

Asp Ala Thr Val Met Ala Ser Glu Ser Leu Ser Val Met Ser Ser Asn

        355                 360                 365

Val Ser Phe Ser Glu

    370

<210>2

<211>9

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Phe Leu Ala Lys Leu Asn Asn Thr Val

1               5

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>3

Thr Leu Asp Glu Lys Val Ala Glu Leu

1               5

<210>4

<211>9

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>4

Val Ile Trp Glu Val Leu Asn Ala Val

1               5

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>5

Lys Val Leu Glu Phe Leu Ala Lys Leu

1               5

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>6

Val Met Ala Ser Glu Ser Leu Ser Val

1               5

<210>7

<211>9

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>7

Leu Leu Ile Ile Ile Leu Ser Val Ile

1               5

Claims (5)

1.一种人的肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽，该多肽能与人类HLA分子结合，并能通过杀伤性T淋巴细胞导致靶细胞裂解；所述的多肽选自下列氨基酸序列：

FLAKLNNTV；

TLDEKVAEL；

VIWEVLNAV；

KVLEFLAKL；

VMASESLSV；

LLIIILSVI。

2.一种编码权利要求1所述多肽的DNA序列，所述的多肽选自下列氨基酸序列：

FLAKLNNTV；

TLDEKVAEL；

VIWEVLNAV；

KVLEFLAKL；

VMASESLSV；

LLIIILSVI。

3.一种权利要求1所述的多肽在制备***的多肽疫苗中的应用。

4.一种权利要求1所述的多肽在制备肿瘤的诊断和预防试剂中的应用。

5.一种权利要求2所述的DNA序列在制备***的基因疫苗中的应用。