CN1248324A - 鉴别在g蛋白偶联体系中起作用的植物蛋白的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鉴别作为或作用方式类似于G蛋白偶联受体,或作为植物G蛋白亚基的植物蛋白的方法,该方法利用掺入了该植物蛋白的生物分析***。在本发明的其他方面,提供了编码待鉴别的植物蛋白的表达载体和转化的酵母细胞,以及它们的使用方法。

Description

鉴别在G蛋白偶联体系中起作用的植物蛋白的方法和组合物

发明领域

本发明涉及生物分析技术，该技术利用在宿主细胞***中表达的植物蛋白来鉴别它们在植物G蛋白偶联***中的功能，本发明特别适用于鉴别植物G蛋白亚基以及作用方式类似于这些G蛋白亚基和G蛋白偶联受体的植物蛋白。本发明的其他实例涉及表达这些植物蛋白(尤其是植物G蛋白亚基)的宿主细胞，用于制备这类细胞的载体，以及它们的制法和用途。

发明背景

在动物体系中，许多胞外信号的作用(例如神经递质、激素、有味物质和光)是由具有7个跨膜结构域的受体(G蛋白偶联受体)和异三聚体的鸟嘌呤核苷酸结合调节蛋白(G蛋白)所介导的。G蛋白由3个亚基构成：脒基核苷酸(guanyl-nucleotide)结合α亚基、β亚基和γ亚基[综述可参见Conklin，B.R.和Bourne，H.R.(1993)细胞(Cell)73，631-641]。G蛋白在两种形式之间循环，这取决于结合于α亚基的是GDP还是GTP。当GDP结合时，G蛋白以异三聚体即Gαβγ复合物形式存在。当GTP结合时，α亚基解离，留下Gβγ复合物。重要的是，当Gαβγ复合物可操作地与细胞膜上的活化G蛋白偶联受体缔合时，则GTP交换结合的GDP的速度就增加，因此结合的Gα亚基从Gβγ复合物上解离的速度就上升。游离的Gα亚基和Gβγ复合物能够将信号传递给各种不同信号传导途径中的下游元件。这一基本事件构成许多不同细胞的信号传导现象的基础。对于其他信息，可参见H.G.Dohlman，J.Thorner，M.Caron和R.J.Lefkowitz，生物化学年报(Ann.Rev.Biochem.)，60，653-688(1991)。

在植物中，有证据表明大量的植物信号传导途径，其中包括红光和蓝光信号(Warpeha等人，1991；romero和Lam，1993；Neuhaus等人，1993)、对气孔开启的K⁺通道调控(Fairley-Grenot和Assmann，1991；Li和Assmann，1993；Armstrong和Blatt，1995)、以及生长素信号传导(Zaina等人，1990)，都是通过G蛋白中介进行调节的。更具体地，在某些这类研究中，在显微注射GTP类似物GTPγS或霍乱毒素(这两种物质都导致G蛋白被组成型激活)后，测量番茄突变株aureus中红光依赖型的反应，结果发现产生了与显微注射植物光敏色素或将植物暴露于红光时相同的效果。显微注射抑制剂GDPβS或百日咳毒素，可有效地阻断红光依赖型反应。

此外，根据用GTPγS、GDPγS和毒素进行的电生理学研究，已提示抑制性G蛋白可调节蓝光依赖型K⁺通道的开启。在另一些实验中，已表明蓝光可激活豌豆质膜中的GTP结合蛋白。在水稻中，生长素可增进体外GTPγS与小泡(vesicle)的结合，同时GTPγS的结合降低了生长素的结合。这种结合关系提示生长素对G蛋白的激活作用刺激了细胞伸长。此外，有证据表明G蛋白介导植物的防御反应(Legendre等人，1992，Vera-Estralla等人，1994；Beffa等人，1995)。

在大量植物物种中已检测到Gα样蛋白(具有与动物Gα亚基相似的分子量而且被抗动物Gα亚基的抗体所识别)(综述可参见Ma，1994和Kaufman，1994)，而且已鉴别出编码G蛋白α亚基的3个基因。第一个基因是根据动物G蛋白α亚基的保守序列，用PCR引物从拟南芥(Arabidopis thaliana)中克隆出的(Ma等人，1990)。预测的蛋白质具有GTP结合蛋白所特有的鸟嘌呤核苷酸结合与水解的所有保守序列，并且与大鼠Gi(1-3)和牛转导素有36％相同性。将拟南芥基因用作探针，鉴别出了番茄(Ma等人，1990)和大豆(Kim等人，1995)中的基因。拟南芥、番茄和大豆的基因之间有80％以上的相同性，这暗示植物G蛋白α亚基可能是高度保守的。根据Southern印迹分析，拟南芥和番茄DNA似乎是单基因，而在大豆中可能存在多基因。编码G蛋白β亚基的单基因也已从玉米和拟南芥中克隆出(Weiss等人，1994)。预测的蛋白质序列相互有76％相同性，而且与哺乳动物G蛋白β亚基有41％相同性。

尽管植物Gα亚基的序列相对于哺乳动物Gα亚基是保守的，但是没有已出版数据表明植物蛋白的功能也是保守的。尽管根据对霍乱或百日咳毒素的反应敏感度或根据特异性刺激会增进GTP与膜的结合，生理学研究暗示G蛋白介导大量途径，但是这类证据是间接的。在本文详细描述的工作之前，现有技术无法提供直接证据来表明这些效应是通过与其他***中的相同机制而产生的。事实上，最近一位植物G蛋白分子生物学领域的领先学者报道，即“…植物Gα的功能不可能与任一非植物Gα的功能相似”…(出处同上，Hong Ma 1994)。

蛋白质介导的信号***存在于诸如酵母、植物和人之类的各种生物体中。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)被用作真核生物模型。因为人们可方便地操纵酿酒酵母的遗传组成，因此研究者已能详细地了解许多复杂的生物途径。在很多***中已表明，蛋白质结构的演化保守使得许多异源蛋白能够替代它们的酵母等价物。例如，哺乳动物Gα蛋白可以与酵母Gβγ蛋白形成异三聚体形式的复合物(Kang，Y.-S.，Kane，J.，Kurjan，J.，Stadel，J.M.，和Tipper，D.J.(1990)分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)10，2582-2590)。用已遗传修饰过以容许功能性地表达植物G蛋白的酵母株所进行的筛选分析，在涉及鉴别植物蛋白(该植物蛋白在胞内信号***例如G蛋白偶联***中发挥功能)的研究中具有明显的优点。

发明概述

本发明的第一方面涉及鉴别在胞内信号***(例如G蛋白偶联细胞信号***)中发挥功能的植物蛋白的方法。这是这样实现的：提供含有编码待鉴别的植物蛋白的核苷酸序列的宿主细胞，该蛋白可以被怀疑是G蛋白亚基或作用方式与G蛋白亚基相似，或者被怀疑是G蛋白偶联受体或作用方式与G蛋白偶联受体相似，其中该G蛋白偶联受体在哺乳动物、昆虫等的胞内信号***中起作用(例如哺乳动物G蛋白偶联***或昆虫G蛋白偶联***)。在一些优选例子中，G蛋白偶联的细胞信号途径的内源的必然组份，例如Gα蛋白亚基，在宿主细胞中是没有活性的。用编码待鉴别和分析的植物蛋白的核苷酸序列来转化宿主细胞，然后让转化的宿主细胞在合适条件下生长。测量生长与否(以及有时测量生长的程度)，作为在没有内源对应物的情况下，待鉴别的植物蛋白能够恢复宿主细胞生长的标志。根据这种信息，可以确定研究中的靶蛋白在G蛋白偶联的细胞信号***中发挥作用。在某些情况下，取决于所研究的靶蛋白，蛋白可能以类似于G蛋白亚基的方式，尤其是Gα亚基方式发挥作用。可以使除了Gα之外的G蛋白组份没有活性，以鉴别和分析G蛋白偶联***中的各种其他组份、或者起G蛋白偶联***作用的胞内***。例如，靶蛋白的作用可能是作为其他G蛋白组份例如Gβ或γ组份，或Gβγ复合物。在本发明方法的另一些优选例子中，待鉴别的植物蛋白被怀疑是G蛋白偶联受体，或者被怀疑其作用方式类似于G蛋白偶联受体。在这些例子中，使内源的受体或受体样蛋白质无活性，或者完全除去。引入感兴趣的蛋白质，因此在任一情况下，宿主细胞都用编码“G蛋白偶联受体样”蛋白质的核苷酸进行转化。

在上述各例子中，宜使内源G蛋白信号***的一部分或全部失去活性，并用对应的植物蛋白(例如Gα亚基、Gβ亚基等，或者含有与衍生自植物的片段相融合的衍生自宿主细胞的一部分亚基的嵌合构建物)加以替换。

本发明的第二方面涉及表达载体和用上述待鉴别的植物靶蛋白转化的宿主细胞。在某些优选例中，宿主细胞含有第一异源核苷酸序列，该序列编码感兴趣的蛋白，而该蛋白被怀疑是在胞内***(例如G蛋白偶联的胞内信号***)中起作用的蛋白质组份。这类核苷酸序列可编码G蛋白偶联受体蛋白、G蛋白亚基、或作用方式可能类似于G蛋白偶联受体或G蛋白亚基的植物蛋白。在某些优选例中，核苷酸序列编码全部或部分的G蛋白(例如α、β或γ亚基)，其中该G亚基衍生自植物(至少部分衍生自植物)。各种嵌合的或三聚体型的杂合G蛋白构建物在本发明构思之中。例如，在某些例子中，将编码异源植物G蛋白α亚基的全部或部分核苷酸序列融合于酵母G蛋白或哺乳动物G蛋白α亚基的核苷酸序列。在此处所述的表达载体和宿主细胞构思范围内，还包括如上所述用第一异源核苷酸序列(所编码的蛋白质怀疑是G蛋白偶联受体样蛋白)和第二异源核苷酸序列(编码全部或部分的植物衍生G蛋白亚基)转化的种类。在最佳例子中，表达***是酵母，而且表达载体和转化的细胞通常含有第三异源核苷酸序列，该第三序列包括信息素应答型(pheromone-responsive)启动子，以及位于信息素应答型启动子下游并与其操作性相连的指示基因。

利用优选酵母表达***的细胞和载体，还可含有数个突变，这些突变可有效地将内源酵母宿主细胞的信息素应答型信号传导途径与宿主细胞的天然细胞循环抑制途径(arrest pathway)断开，或否则增加细胞对激活作用的反应敏感性。在某些优选例中，其中酵母细胞是宿主细胞，这些突变包括：(1)酵母SCG1/GPA1基因的突变，该突变使酵母Gα蛋白失活，从而有利于异源植物蛋白与G蛋白之间的相互作用；(2)酵母基因的突变，该突变使该基因失去功能并使酵母细胞尽管在信息素应答信号传导途径被激活的情况下也能继续生长，优选的例子是FAR1和/或FUS3基因的突变；和(3)酵母基因的突变，该突变的效应是大大提高细胞对信息素应答信号传导途径的受体依赖型激活作用的反应灵敏度，在这方面的优选基因是SST2、STE50、SGV1、STE2、STE3、PIK1、AFR1、MSG5和SIG1基因。

本发明的第三方面是嵌合表达构建物和用其转化的宿主细胞，它含有编码怀疑在G蛋白偶联的细胞信号途径中起作用的植物蛋白的第一核苷酸序列，还含有与其操作性相连的、编码宿主细胞的内源非植物蛋白或功能性异源等价物(必然是G蛋白组份)的第二核苷酸序列。这样的构建物和细胞还可含有第三异源核苷酸序列，该第三序列包括信息素应答型启动子，以及位于信息素应答型启动子下游并与其操作性相连的指示基因。当宿主细胞是酵母细胞时，构建物和细胞还可含有上述的突变。

通过将转化的异源蛋白与宿主细胞的信号传导途径偶联，在生物分析中检测所产生的信号。

本发明的第四方面是一种分析化合物的方法，它通过测量对细胞生长的影响来确定配体结合于异源植物受体时所产生的效果。在某些优选例中，宿主细胞在合适的生长培养基中培养以表达异源植物蛋白，这些植物蛋白被分散于液体介质中或包埋于固体介质(如琼脂)中，然后暴露于施涂在小泡表面的物质或含有该物质的平板。对细胞生长的效应，预计将围绕着以能激活异源植物蛋白和信号传导途径的物质。对于作为激动剂的物质，可观察到生长增加；而对于作为拮抗剂的物质，可观察到生长下降。

如本文所用，术语“G蛋白偶联的细胞信号***”指发挥胞内信号传导功能的胞内信号***，它与发明的背景技术章节中所述的众所周知的哺乳动物G蛋白偶联的受体***相类似，并且具有这类***的某些结构标志。术语“Gα样、Gβ样。Gγ样和Gγβ样复合物”特别包括了它们的突变体和类似物，并且包括在G蛋白偶联的细胞信号***或等价的胞内信号***中，以与已充分研究的哺乳动物***相似的方式发挥作用的蛋白。

如本文所用，术语“嵌合的”通常指重组核苷酸序列所表达的蛋白，该核苷酸序列是通过将来自一种以上生物体或物种，或来自同一生物体或物质的一种以上基因的各自的核苷酸序列片段连接在一起而形成的。该术语可与融合蛋白或融合构建物，杂合蛋白或构建物等互换使用，并且并不用于将这些嵌合体局限于纯粹通过重组方法而产生的嵌合体。应理解，有其他方式可构建相同的嵌合体。“三聚体(型)的”指含有3个这类独立的蛋白质组份的构建物。

如本文所用，术语“异源”，对于宿主细胞和核苷酸序列表达构建物和技术而言，指核苷酸序列、蛋白质或其他物质来源于除该特定宿主细胞之外的其他生物体。因此，哺乳动物、鸟类、两栖动物、昆虫、植物和酵母都应被认为相互是异源的。

如本文所用，术语“哺乳动物”指任何哺乳动物物种(如人、小鼠、大鼠和猴)。

术语“核苷酸序列”意指所有形式的含有核苷酸碱基的线性聚合物，而不受任何限制，合适情况下包括DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、合成的寡核苷酸等。

如本文所用，术语“受体”或“受体样”可互换使用，并且包括鉴别为受体的蛋白或起受体作用的蛋白，而且还包括蛋白的亚型，以及其突变体和类似物，还包括编码它们的核苷酸序列。本领域的技术人员会知道，在某些情况下，不必要表达全长受体就可以实现所需目的。因此，术语“受体”包括给定受体的截断形式或其他各种变异形式，而不受任何限制。

如本文所用，术语“上游”和“下游”指转录和翻译的方向，当一个序列比另一序列先转录和翻译，那么它就位于后者的“上游”。

在本发明的方法和构建物中，用编码待鉴别、定性和/或分析的植物靶蛋白的核苷酸序列转化宿主细胞。任何可疑的在G蛋白偶联的细胞信号***或类似***中起作用的植物蛋白(例如G蛋白偶联受体)、作用方式类似于在胞内信号传导中G蛋白偶联受体的蛋白、或其片段、以及植物G蛋白亚基本身或怀疑是这类亚基或类似组份的蛋白质，都可用本发明的鉴别方法和构建物加以鉴别和分析。

在本发明方法的某些例子中，需要使宿主细胞的内源G蛋白偶联的细胞信号途径的一部分或全部失去作用。这可以通过各种方式实现，例如通过内源基因的缺失(该基因可能是这类信号途径中的整体组份)、通过***外源序列而破坏该内源基因、以及表达反义的G蛋白基因，这仅仅列举了少数技术。在某些例子中，被失活的内源G蛋白偶联途径的组份，可以用相应的植物G蛋白偶联途径的组份、或者用含有全部或部分宿主细胞内源组份或来自异源***的功能性等价序列且融合于植物蛋白的杂合构建物加以替换。编码植物G亚基的任何DNA序列都可用于制备本发明的构建物，甚至可能起植物G蛋白亚基作用的蛋白也行。这类蛋白质的例子包括(但并不限于)：拟南芥G蛋白α亚基、拟南芥G蛋白β亚基、番茄G蛋白α亚基、大豆G蛋白α亚基、玉米G蛋白β亚基，在所附的文献目录中列出的Ma等人(17-19)和Kim等人(13)的出版物中有进一步的论述。

从此处所给出的讲授内容中，本领域的技术人员会理解到，用于本发明构建物和酵母细胞中的G蛋白可含有植物Gα亚基、或嵌合的植物/哺乳动物Gα亚基、酵母/植物Gα亚基、三聚体的酵母/哺乳动物/植物形式的亚基。只需按此处所讲授的那样构建载体、转化宿主细胞并测定是否存在持续生长，人们便可以确定哪种结构最适合与细胞信号***发生足够的偶联。取决于所用的分析指示***，宿主细胞的持续生长通常表明G蛋白构建物在该宿主细胞中起作用，并取代了功能性的内源G蛋白偶联的细胞信号***。在某些优选例中，G蛋白α亚基是所选的植物亚基，尤其是衍生自拟南芥的亚基。

对于特定的异源受体，某些嵌合的G蛋白构建物还可提供更强的信号传导。通过将胞内信号元件的操作区域融合在一起，本领域的技术人员可制备有用的嵌合构建物。这些操作区域可根据本领域的知识进行选择。例如，Gα亚基和Gβγ亚基复合物或G蛋白偶联受体之间的相互作用位点已被描述过(可参见B.R.Conklin和H.R.Bourne，1993(3))。Gα亚基复合物和Gβγ亚基之间的相互作用位点已被定位在G蛋白α亚基的氨基端，并且可能是蛋白质的hα2(α2螺旋)和i1(***序列1)区域。G蛋白α亚基的羧基端所含有的蛋白质区域，有最有力的证据表明该区域与G蛋白偶联受体发生相互作用。含有接触点的其他区域包括氨基端和G5区(G区是在所有GTP酶中保守的肽序列)。因此，通过将含有这些Gβγ接触位点的酵母G蛋白α亚基的氨基端与植物G蛋白α亚基的羧基端相融合，可以制得与酵母G蛋白βγ复合物的作用得以增强的嵌合型G蛋白α亚基。

编码Gβ亚基或Gγ亚基或其他这类亚基、或编码与植物Gα相互作用的其他元件的任何DNA序列，都可用于实施本发明，其中包括宿主细胞的内源元件。可用于实施本发明的G蛋白和亚基包括：其亚型、突变体和类似物，以及编码它们的核苷酸序列。宿主细胞可表达内源的Gβ和/或Gγ、Gβγ复合物、或合适的植物对应亚基，宿主细胞还可任选地被工程改造以便表达异源的Gβ和/或Gγ(例如哺乳动物的、植物的、或各种组合形式)，其工程改造方式与进行工程改造以表达异源Gα相同(参见文献22)。

异源核苷酸序列通过表达“构建物”或“载体”的方式，在宿主细胞中表达。表达载体是一种可复制的核苷酸构建物，其中编码感兴趣蛋白的核苷酸序列被可操作地连于合适的调控序列，该调控序列能够在所需的宿主中实现由该核苷酸序列所编码的蛋白质或蛋白质亚基的表达。可用于获得和/或扩增编码待表达蛋白的质粒的克隆载体***，其例子包括(但并不限于)微生物，例如用重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌。用于表达待表达蛋白的宿主表达***包括：携带含有编码序列的重组酵母表达载体的酵母；用含有编码序列的重组病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞***；用重组病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV)感染的、或用重组质粒表达载体(如Ti质粒)转化的植物细胞***，其中载体含有编码序列，或用含编码序列的核酸所转化的植物细胞***；或用重组病毒表达载体(如腺病毒、痘苗病毒)感染的或含有稳定整合的核苷酸序列的动物细胞***。可用于实施本发明的载体包括：质粒、病毒(包括噬菌体)和可整合的DNA片段(即可通过遗传重组而整合到宿主基因组中的片段)。载体可以独立于宿主基因组而进行复制和发挥功能(例如质粒)，也可整合到基因组本身中(例如可整合的DNA片段)。

通常，能够影响感兴趣蛋白表达的合适调控***，可根据所用的载体/宿主***而加以选择，并且与待表达的核苷酸序列可操作地相连。真核调控序列通常包含转录启动子。然而，也可合适地提供编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及(任选的)控制转录终止的序列。当DNA区域在功能上相互联系，那么它们就是可操作地相连。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就可操作地连于该编码序列；如果核糖体结合位点被置于允许翻译的位置，那么它就可操作地连于该编码序列。通常，可操作地相连意味着邻接，而对于前导序列则意味着按阅读框相邻。

此外，在宿主细胞中可操作的启动子是可与该细胞的RNA聚合酶结合的启动子；而在宿主细胞中可操作的核糖体结合位点是可与该细胞的内源核糖体结合的核糖体结合位点。合适的载体在某些情况下可含有复制子调控序列(当载体是非整合型时)，而该复制子调控序列来自与所需的表达宿主相容的物种。

上述的这些***的表达元件，可以在强度和特异性方面有所变化。因此，取决于所用的宿主/载体***，大量合适的转录和翻译元件中任一种(包括组成型和诱导型启动子)，都可用于表达载体。例如，在细菌***中克隆时，可使用诸如噬菌体λ的pL启动子、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)之类的启动子。

在使用植物表达载体的情况下，编码序列的表达可用众多启动子中任一种进行驱动。例如，可使用病毒启动子如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子(Brisson等人，1984，自然(Nature)310：511-514)，或TMV的外壳蛋白启动子(Takamatsu等人，1987，欧洲分子生物学协会杂志(EMBO J.)6：307-311)；或者使用植物启动子如RUBISCO的小亚基(Coruzzi等人，1984，欧洲分子生物学协会杂志(EMBO J.)3：1671-1680；Broglie等人，1984，科学(Science)224：838-843)，或热激启动子如大豆hsp17.5E或hsp17.3-B(Gurley等人，1986，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)6：559-565)。通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、biolistic、微注射、电穿孔等，可将这些构建物引入植物细胞。对于这些技术，可参见例如Weissbach & Weissbach，1988，《植物分子生物学方法》(Methods forPlant Molecular Biology)，Academic Press，NY，Section VIII，pp.421-463；和Grierson& Corey，1988，《植物分子生物学》(Plant Molecular Biology)，2版，Blackie，London，Ch.7-9。

当在哺乳动物细胞***中克隆时，可使用衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)；当产生含有多拷贝DNA的细胞系时，可使用基于SV40、BPV和EBV的、有合适选择标记的载体。在腺病毒被用作表达载体的情况下，编码序列可连于腺病毒转录/翻译调控复合物(例如晚期启动子和三联前导序列)。然后，这种嵌合基因可通过体外或体内重组而***到腺病毒基因组中。***到病毒基因组的非必需区域(例如E1或E3区)可形成存活并能够在被感染的宿主中表达蛋白的重组病毒(例如，参见Logan & Shenk，1984，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81：3655-3659)。或者，可使用痘苗病毒的7.5K启动子(例如，参见Mackett等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)79：7415-7419；Mackett等人，1984，病毒学杂志(J.Virol.)49：857-864；Panicali等人，1982，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)79：4927-4931)。

另一种可用于病毒感兴趣蛋白的表达***是昆虫***。在一种这样的***中，可将苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)用作表达外源基因的载体。该病毒可在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可将编码序列克隆入病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)，并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制之下。成功地***编码序列会导致多角体蛋白基因的失活并产生未包含(non-occluded)的重组病毒(即缺乏多角体蛋白基因所编码的蛋白质包被的病毒)。然后，这些重组病毒可用于感染草地夜蛾细胞，并在该细胞中表达所***的基因。(例如，参见Smith等人，1983，病毒学杂志(J.Virol.)46：584；Smith，美国专利No.4,215,051)。

为了有效地翻译所***的编码序列，还需要具体的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。在某些情况下，编码感兴趣蛋白的全长基因(包括它自己的起始密码子和相邻序列)被***到合适的表达载体中，那么就不需要额外的翻译调控信号了。在其他情况下，可能需要对这些序列进行修饰，以优化异源基因在宿主***中的表达。然而，在仅***编码序列的一部分的情况下，必需提供包括ATG起始密码子在内的外源翻译调控信号。此外，起始密码子必须与编码序列的阅读框相符，以保证整个***片段的翻译。这些外源的翻译调控信号和起始密码子的可来自各种来源，包括天然的和合成的。通过包含合适的转录增强子元件、转录终止子等，可以提高表达效率(参见Bitter等人，1987，酶学方法(Methods in.Enzymol.)153：516-544)。

本发明的转化的宿主细胞是这样的细胞，它们被用重组DNA技术或其他合适方法构建的载体转化或转染，并且表达异源DNA序列所编码的蛋白质或蛋白质亚基。此处所公开的载体和方法适用于大范围的原核和真核生物的宿主细胞。本领域技术人员所熟知的方法，可用于构建含待表达的核苷酸序列及合适的转录/翻译调控信号的表达载体。这些方法包括：体外重组DNA技术和体内重组/遗传重组(参见Maniatis等人，1989，《分子克隆-实验手册》，Cold Spring HarborLaboratory，N.Y.)。在酵母细胞的情况下，载体的引入也可通过将细胞与携带载体的相反交配型酵母进行交配。通过使用本领域众所周知的技术并结合此处的讲授内容，本领域技术人员可以选择最佳的宿主细胞/载体表达***，来表达和鉴别所需的目标植物蛋白。此外，还可以选择能调节***序列的表达、或者能按所需的具体方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。对蛋白质产物的修饰和加工(如切割)，对于蛋白质的功能可能是至关重要的。对于蛋白质的翻译后加工和修饰，不同的宿主细胞有特有和特异的机制。可选择合适的细胞系和宿主***，以保证对表达的外源蛋白进行正确的修饰和加工。为此，可以使用真核宿主细胞，该细胞具有对一级转录物进行适当加工、糖基化和对基因产物进行磷酸化的细胞机制。这样的哺乳动物宿主细胞包括(但并不限于)：CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、W138等。

在引入外源DNA之后，工程改造过的细胞可在合适的生长条件下生长。例如，细胞可以经过选择性培养程序。在重组质粒中的选择标记提供耐选择条件的抗性，并允许转化的细胞生长以形成菌落或集落，这反过来可以被克隆并扩大成细胞系。测量生长情况。生长通常表示靶植物蛋白在胞内信号***中发挥功能，而不生长通常表示它不发挥功能。生长的程度也可评估并外推成靶植物蛋白作为胞内信号元件的效力，或确定其在胞内信号机制中的功能。该方法可有利地用于对表达植物蛋白以及对介导的信号传导(如G蛋白偶联的信号***)产生反应的细胞系进行改造。适用于各种宿主细胞表达***的选择性培养方案，其详细方法可在《分子生物学的当前方案》(Current Protocols in Molecular Biology)[4]中找到。

可供使用的众多选择***的例子包括(但并不限于)：单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，1977，细胞(Cell)11：223)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska & Szybalski，1962，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)48：2026)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人，1980，细胞(Cell)22：817)基因，它们可分别用于tk、hgprt或aprt细胞。此外，抗代谢物抗性可用作选择下列基因的基础：dhfr基因，它赋予抗氨甲蝶呤的抗性(Wigler等人，1980，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77：3567；O′Hare等人，1981，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)78：1527)；neo基因，它赋予抗氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin，等人，1981，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)150：1)；和hygro基因，它赋予抗潮霉素的抗性(Santerre等人，1984，《基因》(Gene)30：147)。最近，还描述了其他选择标记基因：即trpB基因，它可使细胞利用吲哚来代替色氨酸；hisD，它可使细胞利用组氨醇(histinol)来代替组氨酸(Hartman & Mulligan，1988，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85：8147)；和ODC(鸟氨酸脱羧酶)，它赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸(DFMO)的抗性(McConlogue L.，1987，Current Communications in Molecular Biology，Cold SpringHarbor Laboratory编)。

重组酵母表达***特别适用于实施本发明，因而被优选使用。各种酵母培养物以及用于转化酵母细胞的合适表达载体，是众所周知的。参见例如，美国专利No.4,745,057；美国专利No.4,797,359；美国专利No.4,615,974；美国专利No.4,880,734；美国专利No.4,711,844和美国专利No.4,865,989。在酵母中最常用的是酿酒酵母，尽管有大量其他酵母品种可供通常使用，例如。粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等。还可参见美国专利4,806,472(Kluveromyceslactis和相应的表达载体)；No.4,855,231(巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和相应的表达载体)。在某些例子中，酵母载体可含有来自内源2μ酵母质粒的复制起点、或者赋予质粒在酵母细胞中高拷贝数地复制的能力的自主复制序列(ARS)、着丝粒(CEN)序列(限制质粒使其在酵母细胞中仅低拷贝数地复制)、启动子、编码异源DNA序列的DNA、聚腺苷酸化和转录终止序列、和选择标记基因。代表性质粒以及详细的制备和使用方法在实施例部分提供。

任何能够在酵母***中起作用的启动子都可选用于本发明的优选表达构建物和宿主细胞。合适的酵母载体的启动序列包括下列物质的启动子：金属硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶(PGK)[Hitzeman等人(1980)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)255，2073]、或其他糖酵解酶[Hess等人，(1968)J.Adv.Enzyme Reg.7，149；和Holland等人(1978)生物化学(Biochemistry)17，4900]例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶。适用于酵母表达的载体和启动子在R.Hitzeman等人，EPO出版物No.73,657中有进一步描述。具有转录可受生长条件控制的额外优点的其他启动子，是下列物质的启动子：乙醇脱氢酶、1，2-异细胞色素C、酸式磷酸盐(acid phosphates)、与氮代谢有关的降解酶、上述的金属硫蛋白和甘油醛-3-磷酸脱氢酶、以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶(例如半乳糖诱导型启动子GAL1)。特别用于本发明的是PGK、GAL1、和乙醇脱氢酶(ADH)启动子。最后，在构建合适的表达质粒时，与这些基因相连的终止序列也可被连入表达载体中异源编码序列的3′端，以便使mRNA聚腺苷酸化和终止。在制备本发明的优选表达载体时，可选择翻译起始位点，以便最有效地在酵母细胞中表达给定的核酸序列[对于合适的翻译起始位点的论述，可参见Cigan，M.和T.F.Donahue 1987，基因(Gene)，Vol.59，pp.1-18]。特别优选的用于实施本发明的核苷酸表达载体含有上述的启动子序列，并且该启动子序列位于编码待表达的植物蛋白的异源核苷酸序列翻译起始位点上游。在这方面，特别优选的启动子是GAL1、PGK和ADH启动子。

众多检测手段中的任一种都可使用，以检测转导的植物蛋白对宿主细胞的G蛋白偶联的细胞信号***的作用。例如，通过常规的机械破坏技术(mechanicaldisruption technique)，可测量Gα从Gβγ解离的情况。然而，可检测的生物反应使得自身能够被测量。一种这样的反应是对信息素诱导的交配信号传导途径的激活，这是在此处的分析***中检测效应的优选方法，其机理在PCT 95/21925中有详细描述。如此处所述，在内源酵母基因中选定的突变，会导致对信息素的超敏性并且对信息素的存在不能适应。例如，将干扰功能的突变引入表达靶蛋白的酵母株中，能够开发出极其灵敏的生物分析方法，以分析靶蛋白的效应或分析与G蛋白偶联受体作用的物质的效应。其他突变(例如STE50、sgv1、ste2、ste3、pik1、msg5、sig1和afr1)具有类似的提高生物分析灵敏的效果。本领域技术人员知晓，可通过各种不同的突变形式来提高分析***的灵敏度，例如缺失一个或多个上述基因、引入破坏蛋白质活性的核苷酸取代、引入负调控表达的突变、或者在某些情况下实现基因超表达。例如在STE50构建物中，需要的是基因的超表达而不是缺失基因。因此，在交配信号传导途径中引入一群突变，可形成适合表达植物蛋白的酵母细胞，而这些植物蛋白能够在胞内信号***中进行功能性应答。

结合一种或多种上述的突变，一种检测植物蛋白对细胞信号***的作用的特别方便的方法就是利用常规的遗传指示***。因此，在某些优选例中，细胞具有额外的异源核苷酸序列，它包括信息素应答型启动子以及位于信息素应答型启动子下游并与其操作性相连的指示基因。当这样的序列位于合适位置时，就可以通过监测指示基因在细胞中的表达来进行检测。可以使用众多信息素应答型启动子中的任何一种，例如启动上述信息素应答型基因(如mFα1、mFα2、MFA1、MFA2、STE6、STE13)的启动子、BAR1基因启动子和FUS1基因启动子。同样，可以使用众多指示基因中的任一种，例子包括HIS3、G418r、URA3、LYS2、CAN1、CYH2、和LacZ基因。一种特别优选的报道基因构建物可这样利用，即将FUS1基因的转录调控元件与HIS3蛋白编码序列融合在一起，然后用该报道基因构建物替换原始的FUS1基因。从而可以将HIS3基因产物的表达置于信息素信号传导途径的控制之下。具有这一构建物的酵母株(his3)，在缺乏组氨酸的补充基本培养基中生长很差，而且对HIS3基因产物的抑制剂敏感。基因表达被激活可导致在该培养基上的生长增加。在其他优选例中，质粒携带FUS1-lacZ融合基因。通过结合信息素而导致受体激活，可刺激这些融合基因的表达。因此，通过测量由FUS1-lacZ融合基因所产生的β-半乳糖苷酶活性，或者检测表达FUS1-HIS3报道基因的酵母在基本培养基上的生长是否增加，可以定量分析信号传导情况。

其他有用的报道基因构建物(它们仍在信息素信号传导途径的元件控制之下，但是不同于上述的报道***)，可能与通过共表达的其他异源效应子蛋白而传导的信号有关。例如，(1)激活异源腺苷酸环化酶，可使因cdc35基因突变而缺乏自身腺苷酸环化酶的酵母株存活；(2)激活异源G蛋白偶联型钾通道，可使不能在钾浓度低的培养基中生长的酵母株存活[(trk1，trk2)，例如参见Anderson，J.A.等人(1992)(美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89，3736-3740)]；或(3)激活异源PLC-β，可使缺乏自身PLC的酵母株存活[(plc)，例如参见Payne，W.E.和Fitzgerald-Hayes，M.(1993)分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)13，4351-4363]。

编码腺苷酸环化酶的任何DNA序列都可用于实施本发明。腺苷酸环化酶的例子包括：D.Melanogaster Rutabaga基因的产物和I-VIII型哺乳动物亚基[参见，Tang，W.-J.和Gilman，A.G.(1992)细胞(Cell)70，869-872]，及其突变体和类似物，以及编码它们的DNA序列，它们可用于实施本发明。

编码G蛋白门控钾通道的任何DNA序列都可用于实施本发明。G蛋白门控钾通道的例子包括：GIRK1[Kubo，Y.Reuveny，E.，Slesinger，P.A.，Jan，Y.N.，和Jan，L.Y.(1992)自然(Nature)365，802-806]，及其亚基、突变体和类似物，以及编码它们的DNA序列，它们可用于实施本发明。

编码磷脂酶蛋白的任何DNA序列都可用于实施本发明。磷脂酶蛋白的例子包括：D.Melanogaster的norpA基因产物和PLC-β蛋白[可参见Rhee，S.G.和Choi，K.D.(1992)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)267，12392-12396]，及其亚基、突变体和类似物，以及编码它们的DNA序列，它们可用于实施本发明。

本发明转化的宿主细胞能表达由异源DNA序列所编码的蛋白质或蛋白亚基。在表达时，植物蛋白能够功能性地与胞内信号***的其他G蛋白作用。G蛋白偶联受体和某些效应子(例如腺苷酸环化酶和离子通道)是膜整合蛋白。植物蛋白可以与膜相结合(如G蛋白或效应子cGMP磷酸二酯酶那样)，或者可以是膜脂类(例如磷脂酰肌醇-磷脂酶)。细胞中的某些G蛋白会集中于内膜，其中包括内质网、高尔基体、核内体和分泌小泡(F.A.Barr等人，1992)。

使用此处所述的方法和构建物，将有助于阐述受体-配体和受体-G蛋白相互作用的结构和功能。在这种有力的遗传***的协助下，可以详细地弄清对受体和G蛋白进行修饰的植物蛋白所起的作用。重要的是，该***提供了研究植物中G蛋白偶联型传导***的组份功能和种类的通用方法，还提供了利用G蛋白偶联型信号传导***的通用筛选分析方法。一旦植物的胞内信号***被更好地认识，那么可以设计具有新作用机制的各种杀虫剂、除草剂和杀真菌剂等。本发明所提供的表达构建物和分析***，能以“表达盒”的形式适应各种不同的待鉴别的植物蛋白。待研究的植物蛋白可被简单地***到此处所提供的载体中，并在合适的宿主细胞中表达。此处所给的***还有助于鉴别植物G蛋白偶联蛋白的配体。在本发明的某些分析实施例中，可将各种物质中的任一种物质与表达靶植物蛋白的宿主细胞接触，以确定该物质对胞内信号***的效应。这类物质可包括有机化合物、金属离子、肽、蛋白质等，这取决于用户的需要。合适的分析参数(例如作用的时间长短、所用的介质和其他测试条件)可根据本领域通用技术加以确定。

提供下列实施例以进一步阐述本发明的各方面。它们并不用于限制本发明。

实施例1

为了确定与酵母和哺乳动物蛋白相比，植物G蛋白α亚基的功能是否保守，我们测试了植物G蛋白α亚基对酵母株的生长缺陷的补偿能力，其中该酵母株因为内源的酵母SCG1基因的突变而不能生长。在酿酒酵母中，交配途径的调控是通过2个“7-跨膜受体”Ste2和Ste3以及一个三聚体形式的G蛋白中介物。在没有交配信息素的情况下，G蛋白α亚基即Scg1会与βγ亚基形成复合物。这种结合阻遏了βγ亚基的活性，从而使细胞继续***。交配信息素a-因子和α-因子分别结合于STE2和STE3受体，会导致G蛋白亚基的解离、交配途径的激活和生长停止。

内源G蛋白α亚基有缺陷的单倍体酵母细胞，因为交配途径被组成型地激活而不能***。哺乳动物G蛋白α亚基Gαs(Dietzel，C.和J.Kurgen.1987细胞(Cell))、Gαi2和Gα0(Kang等人，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)1990)，通过阻遏酵母βγ亚基的活性，能够补偿scg1突变型酵母株的这种生长缺陷，并且恢复细胞的***能力。在这些研究中，在酵母细胞中表达的、编码植物G蛋白α亚基(GPα1)的cDNA，能够与酵母G蛋白βγ亚基形成有功能的复合物并恢复生长。

材料和方法

GPA1基因的克隆。该基因是根据基因的已发表序列(H.Ma等人)设计探针，从λYES拟南芥属(Arabidopsis)cDNA文库(S.Ellide等人)克隆出的。按所述方法(目前方案4)，用³²P标记的DNA片段在严紧条件下筛选文库，在300,000个噬菌斑中鉴别出总计32个阳性克隆。其中的4个被纯化。为了获得能够在酵母和大肠杆菌中复制的质粒，对噬菌体DNA进行了分离(Qiagen)并用NotI消化，从而释放出携带***的拟南芥cDNA的质粒，然后再进行连接。用这种技术回收的质粒(pAC525和pAC526)与用下列技术回收的质粒是相似的：即在λ噬菌体序列中质粒两侧的lox序列之间进行定点重组，不同点仅在于存在重复的lox重组位点。这些克隆的身份通过限制性消化和序列分析加以验证。从文库中回收得到并用于这些实验的两个全长GPA1克隆，在3′端长度上存在差异。pAC525的方向使其能够被大肠杆菌lac启动子转录，而pAC526的方向使其能够被酵母GAL1-10启动子转录。pAC527的构建是通过：用EcoRI消化pAC525而去除GPA1cDNA***片段，然后将分离的cDNA片段与pYES重新连接。对克隆进行筛选以鉴别出cDNA***片段能够从GAL1-10启动子转录的质粒，结果鉴别出pAC527。

5′端的改变以及引入不同的载体。两个GPA1 cDNA被以SalI-EcoRI片段形式克隆入pGEM3Z中，以去除拟南芥的5′端。质粒用PstI/SalI消化，然后***双链寡核苷酸以重建拟南芥编码序列，并用有利于在酵母中翻译起始的聚腺苷酸序列替换5′非编码序列。带有修饰过的5′端的GPA1 cDNA，被以EcoRI片段形式克隆入pGK和pYES中。用于该克隆程序的寡核苷酸是：

5′ GAATTCAAAAAAATGGGCTTACTCTGCAGTAGAAG3′

和5′TCGACTTCTACTGCAGAGTAAGCCCATTTTTT GAATTCCTGCA3′。第二个寡核苷酸具有PstI和SalI限制性位点的突出端。

酵母株、转化、培养基。用于这些研究中的二倍体酿酒酵母株是LY19(Matα/Mata，ade2-101，his3-Δ200，leu2-Δ1，lys2-801，trp1-Δ63，ura3-52，GPA1/gpa1Δ∷HIS)，它是YPH501的衍生株(Stratagene)。晕圈分析对照是菌株Y280(a)和Y281(α)。在GAL1-10启动子的控制下表达含拟南芥属GPA1基因的转化子(pAC1003和pAC1005)，是在补充有2％半乳糖的YEP培养基中生长以诱导基因表达；在PGK启动子控制下表达含GPA1基因的转化子(pAC572和pAC573)，是在补充有2％葡萄糖的YEP中生长。将酵母四分体接种于补充有0.1％5-氟乳清酸的SC-尿嘧啶培养基中，以便对失去表达植物GPA1基因的质粒的酵母生长情况进行选择。

酵母的转化。按“酵母遗传学”(M.Rose等人，1990)中所述的方法，用乙酸锂法转化酵母。

晕圈分析。将单个酵母菌落再悬浮于200微升无菌水中。1/10(20微升)被喷洒在YPD平板的一半上，将20微升1∶5稀释液喷洒在另一半上。在每个一半上放置3个过滤纸片，分别点上5微升水、5微升1微克/微升α-因子、或5微升2微克/微升α-因子。平板在30℃孵育过夜。

结果

补偿试验

将携带拟南芥GPA1基因的两套不同质粒引入二倍体酵母株中，以进行补偿分析。pAC526和pAC527代表2个独立的cDNA克隆，这两个克隆是从拟南芥属λYES cDNA库中以噬菌体形式分离出的，并随后被转变成质粒(参见上面的“材料和方法”)。在这套构建物中，GPA1 cDNA在酵母GAL1-10启动子的控制之下表达。这些克隆含有约200碱基对的位于翻译起始密码子上游的GPA1 5′端非编码序列，并且在聚腺苷酸化尾部的长度方面有差异。该质粒在酵母中是以单拷贝形式维持，因为存在着丝粒。为了在酵母中获得高表达水平的GPA1，将编码序列从pAC526和pAC527亚克隆至pPGK中，形成pAC572和pAC573。在这套构建物中，拟南芥GPA1基因的5′非编码区域被去除，并且在ATG起始密码子的上游添加了5个腺苷酸核苷酸以优化在酵母中的翻译起始。在高拷贝的质粒中GPA1 cDNA是在组成型PGK启动子下表达。此外，将缺乏拟南芥属5′端但含有ATG上游的腺苷酸残基的GPA1 cDNA，从pAC572和pAC573中亚克隆出，并克隆回pλYES中。在这些单拷贝的被命名为pAC1003和pAC1005的质粒中，GPA1 cDNA是在GAL1-10启动子控制下表达。

携带编码G蛋白α亚基的拟南芥属cDNA的质粒，被引入携带一个野生型和一个突变型酵母SCG1基因拷贝的二倍体酵母株中，SCG1基因编码酵母G蛋白α亚基。该二倍体菌株有野生型生长表型，因为酵母G蛋白α亚基结合于βγ亚基从而负调控交配途径。当酵母细胞减数***并形成4个单倍体孢子时，两个孢子携带野生型酵母基因，两个携带突变型拷贝的酵母基因；而所有的孢子都携带表达拟南芥G蛋白α亚基的质粒。具有野生型SCG1基因的两个孢子会形成菌落，而具有突变scg1基因的孢子只有在蛋白能够与酵母G蛋白βγ亚基形成有功能的复合物并阻遏交配途径的情况下才能生长。

当含有杂合SCG1基因的二倍体酵母株被高拷贝质粒pAC572和pAC573(它们携带在组成型PGK启动子控制下表达的拟南芥GPA1基因)转化时，回收4个孢子四分体。在每个四分体中，两个菌落的尺寸较小，这最可能是因为拟南芥属GPα1与酵母βγ亚基之间的作用弱于酵母Scg1蛋白的正常发生的作用，因而导致仅部分阻遏交配途径。因此，与哺乳动物G蛋白α亚基一样，拟南芥属Gpa1蛋白能够与酵母βγ亚基形成有功能的复合物从而阻遏它们的活性。

用质粒pAC1003和pAC1005(其中5′端被修饰过的GPA1基因被克隆入λYES质粒)转化二倍体，导致了2个、3个或4个孢子四分体的回复。这一结果与减数***过程中着丝粒质粒分离进入孢子的情况是相符的。与所述的携带质粒pAC572和pAC573的四分体相同，在每个四分体中观察到2个大菌落而且它们表达野生型的酵母Scg1蛋白。然而，生长依赖GPα1的菌落，比在去除了携带pAC572和pAC573的二倍体后所看到的相应菌落小。这种尺寸上的差异被假设是因为GPA1基因被携带在单拷贝的含着丝粒的质粒上，因此与表达携带于高拷贝质粒上的基因的那些菌落相比产生的蛋白质较少。

四分体在5-氟乳清酸上的存活力

对于假设，即在每个四分体中形成较小菌落的两个孢子是生长依赖于拟南芥GPα1蛋白的孢子，通过下列方法进行检验：测定四分体的哪些菌落能够在丢失携带拟南芥GPA1基因的质粒之后生长。在上述的补偿研究中，拟南芥GPA1基因被携带子具有野生型URA3基因的质粒上，URA3基因被用作转化缺乏有功能URA3基因的酵母细胞的标记。丢失携带URA3基因和拟南芥GPA1基因两者的质粒的细胞，可以通过将四分体的细胞膜片置于含5-氟乳清酸(5-FOA)的培养基上而加以回收。5-FOA是一种对有野生型URA3基因拷贝的酵母细胞有毒性的化合物。在5-FOA上生长的唯一细胞是这样的细胞，它们丢失了携带URA3标记基因和拟南芥GPA1基因的质粒，而且生长不依赖于拟南芥基因。在这种培养基上生长的能力预计会以2∶2分离，因为每个四分体的2个菌落携带野生型酵母SCG1基因。在一个实验中，将携带质粒pAC572和pAC573的四分体膜片置于含5-FOA和尿嘧啶的培养基，结果每个四分体仅2个膜片能够在这种培养基上生长，这表明它们携带野生型酵母SCG1基因蛋白。这些膜片对应于每个四分体中较大的两个菌落。

表达GPA1的scg1-酵母细胞的外观

在四分体中观察到的不同菌落尺寸，最可能反映了植物Gpα1蛋白和酵母βγ亚基之间的作用弱于酵母Scg1蛋白的作用。这种较弱的相互作用可能造成仅部分阻遏了交配途径，从而导致细胞的生长比野生型酵母细胞慢。对表达拟南芥Gpα1蛋白的酵母细胞的显微镜观察，提供了支持这一假说的证据。这些细胞的外观与已经暴露于交配信息素并已发生细胞循环停止的野生型酵母细胞的外观相似。在不暴露于α-因子的情况下，这些细胞有特征性的“什穆式(即小而圆)”细胞(该细胞中的交配途径已经激活)形态。然而，与暴露于α-因子的野生型细胞相比，这些细胞中有许多具有不规则的芽。这与携带Gpα1蛋白的细胞继续生长的观察是一致的。

晕圈分析

还测试了表达Gpα1的酵母细胞，以确定交配信息素是否会导致生长停止。一旦交配信息素结合于酵母受体，那么只有当有功能的受体-G蛋白α亚基之间的相互作用激活了G蛋白，生长停止才会发生。通过将细胞暴露于点样在滤纸片上的α-因子，进行晕圈分析。以两种不同密度接种细胞，并将两种不同浓度的α-因子点样于滤纸片上。将a交配型的野生型酵母细胞暴露于α-因子时，在纸片周围产生了生长抑制带，因为α-因子结合于受体并激活了G蛋白α亚基。使用α交配型酵母细胞的对照显示出在滤纸周围均匀生长，因为它们表达对a-因子而不对α-因子作出反应的受体。

在该测试中，测试了两个独立的仅表达拟南芥G蛋白α亚基的a交配型酵母转化子。在这种情况下，在点有α-因子的纸片周围的生长也是均匀的。因为生长阻遏不明显，因此拟南芥属G蛋白α亚基能够有功能地偶联于酵母受体是不可能的。表达酵母和植物G蛋白α亚基两者的a交配型酵母细胞，在纸片周围表现出生长下降的区域，这与如下假设是一致的：即酵母G蛋白α亚基因交配信息素而失活，而植物α亚基不能因交配信息素而失活。

讨论

早先对拟南芥GPA1基因的研究表明，它编码的蛋白质含有GTP结合蛋白的所有已知的共有序列，并且与早已鉴别出的其他生物(包括哺乳动物、果蝇和酵母(Ma等人))G蛋白α亚基有约33％同源性。尽管有序列相似性，然而还没有证据表明GPA1基因编码的蛋白能够作为三聚体式的G蛋白复合物的一部分。为了阐述这一问题，将GPA1基因用于酵母株的补偿研究，其中该酵母株缺乏内源的G蛋白α亚基。因为缺乏G蛋白α亚基会激活交配途径并导致生长阻遏，因此可以在这种突变菌株中表达拟南芥GPA1基因并探究该植物蛋白是否能够恢复生长。恢复生长的能力取决于GPα1蛋白能否与βγ亚基形成复合物，从而导致阻遏βγ亚基的活性。

GPA1 cDNA被转入杂合的二倍体酵母株中，而该酵母株的酵母SCG1基因有突变。四分体的分离现象揭示，仅表达拟南芥GPα1蛋白的孢子能够产生菌落。因为拟南芥GPA1基因的5′非编码区有大量小的开放阅读框，这些阅读框可能干扰蛋白质在酵母中的翻译，因此对GPA1基因的5′端加以改变以***能更有效地在酵母中翻译起始的序列。补偿分析的结果表明，与许多已经测试过的动物α亚基相似(参见Kang等人，1990)，拟南芥G蛋白α亚基能够与酵母βγ亚基形成有功能的复合物。与已在其他***中充分定性研究的G蛋白相比，植物G蛋白不仅在结构方面，而且在功能方面也是高度保守的。

进行了晕圈分析，以确定在拟南芥G蛋白α亚基和酵母α-因子受体之间是否有功能性的相互作用。将酵母细胞暴露于α-因子，当存在酵母G蛋白α亚基时导致了G蛋白被激活并且阻遏生长，但当存在拟南芥G蛋白α亚基时则不产生该现象。当两种蛋白都在同一细胞表达时，在点有α-因子的滤纸片周围明显有生长减缓的区带。这一结果，并结合对表达酵母或植物G蛋白α亚基的酵母细胞所观察到的结果，表明细胞会继续***，因为在失活了酵母G蛋白α亚基之后植物G蛋白α亚基继续与βγ亚基偶联。这一结果使如下假设具有了可信度，即α亚基和受体之间的相互作用通常存在高度的特异性。

与表达酵母蛋白的细胞相比，由拟南芥GPα1补偿的酵母细胞生长较缓慢，这很可能是因为拟南芥属蛋白对酵母βγ亚基活性的阻遏作用不完全。这得到了观察的支持：补偿的酵母的生长速度取决于质粒的拷贝数；与在高拷贝的2μ质粒上携带基因的菌落相比，在着丝粒质粒上携带GPA1基因的菌落生长得更慢。

实施例II

克隆拟南芥属G蛋白α亚基

下列实施例描述了通过酵母中的补偿作用克隆植物G蛋白α亚基。

1.将植物cDNA文库(其中cDNA在酵母启动子的控制下表达)转入二倍体酵母株，该酵母株对于内源SCG1基因突变是杂合的。该突变宜是基因遭破坏，这可通过缺失掉基因的一部分片段并在缺失后的基因中***必需的标记基因而实现。可选择众多基因(LEU2、HIS3、URA3)中一个基因，这取决于二倍体酵母株的基因型和cDNA文库质粒上所携带的标记基因。重要的标准是酵母株对于内源基因突变是杂合的，而且该基因不是在将cDNA文库引入菌株后用于选择转化子的标记基因。例如，二倍体菌株可以是his3/his3，可将野生型HIS3基因***SCG1基因，然后将cDNA文库克隆入表达URA3标记基因的质粒中。植物cDNA文库被引入该菌株，然后选择转化子。让二倍体转化子形成孢子以产生单倍体孢子，然后接种至缺乏组氨酸的培养基上。为了在这种培养基上生长，单倍体菌株必需携带野生型HIS3基因(因此破坏了内源SCG1基因拷贝)和编码功能性G蛋白α亚基的植物基因。

因为二倍体也会在这种培养基上生长，因此包含额外的标记基因是有用的，它可用于对二倍体的生长进行选择或者对生长的单倍体和二倍体进行区分。一种合适的二倍体在环己酰亚胺抗性上是杂合的。因为抗性是隐性性状，因此如果培养基含有环己酰亚胺那么二倍体将不能生长，而仅携带了抗性基因拷贝的单倍体能够生长。

2.将植物cDNA文库(其中cDNA在酵母启动子的控制下表达)转入单倍体酵母株，该酵母株的SCG1基因的基因组拷贝有突变并且携带表达野生型SCG1(在诱导型启动子控制下)的质粒。该菌株在存在诱导物的情况下维持，以便在转化之前产生酵母G蛋白α亚基。在引入植物cDNA之后，通过将细胞置于没有诱导物的培养基，选择出表达植物cDNA的文库转化子。在这种培养基上，只有表达植物G蛋白α亚基的那些细胞能够生长。

3.该实验类似于上面的#2，不同点在于：野生型酵母SCG1基因被携带于还含有URA3标记基因的质粒。在引入植物cDNA文库之后，通过将细胞置于含5-FOA的培养基，选择出表达植物G蛋白α亚基的文库转化子。因为只有那些缺失了野生型URA3基因的细胞能够在这种培养基上生长，因此选择的细胞是表达有功能的植物G蛋白α亚基且已丢失表达酵母SCG1基因的质粒的那些细胞。

实施例III

克隆G蛋白结合受体

在酵母中克隆G蛋白结合受体可如下完成：首先在酵母株中表达对酵母内源βγ亚基有高亲和力的植物G蛋白α亚基(或者植物/酵母杂合型G蛋白α亚基)。这样便将酵母反应与植物受体的激活相偶联。诸如PCT 95/21925中公开的酵母株适用于表达哺乳动物G蛋白偶联受体，较佳地该菌株携带突变的FAR1基因。因为该菌株中的突变，激活交配途径不能导致细胞生长阻遏。取而代之，FUS3启动子(该启动子在交配途径被激活时被激活)被融合于任一可选择的标记基因(如野生型HIS基因)或可见的标记基因(如lacZ)。在酵母启动子控制之下表达的植物cDNA文库被引入该菌株，然后将菌株接种于含配体(或假定配体)的培养基上，该配体可激活实验中待鉴别的受体。表达受体(该受体能与亲代菌株中表达的植物G蛋白α亚基偶联结合)的酵母细胞，或者是能够生长的细胞(如果标记基因是必需基因)，或者是存在β-gal生色底物时有颜色的细胞(例如存在X-gal时的蓝色)。生长或着色取决于培养基中是否存在配体。

                     文献目录1.  F.A.Barr.A.Leyte和W.B.Huttner(1992).三聚体型G蛋白和小泡形成

(Trimeric G proteins and vesicle formation).细胞生物学趋势(Trends in Cell

Biology)2：91-94.2.  Beffa，R.，Szell，M.Meuwly，P.，Pay，A.，Vogeli-Lange，R.，Metraux，J-P.，

Neuhaus，G.，Meins，F.和Nagy，F.(1995).霍乱毒素诱导烟草中致病相关基

因的表达并提高病原体抗性(Cholera toxin elevates pathogen resistance and

induces pathogenesis-related gene expression in tobacco).欧洲分子生物学协

会杂志(EMBO J.)14(23)：5753-5761.3.  Conklin，B.R.和Bourne，H.R.(1993)与Gβγ、受体和效应子作用的Gα亚

基的结构元件(Structural elements of Gα subunits that interact with Gβγ，

receptors，and effectors).细胞(Cell)73：631-641.4.  分子生物学当前方案(Current Protocols in Molecular Biology)(1992)ed.F.M.

Ausubel R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，J.A.Smith，K，

Struhl.5.  Blumer，K.J.，和Thorner，J.(1991)酵母中的受体-G蛋白信号传导(Receptor-

G protein signaling in yeast).生理学年报(Annu.Rev.Physiol.)53，37-57.6.  Dietzel，C.，和Kurgen，J.，(1987)酵母SCG1基因：一种涉及a-和α-因子应答

途径的Gα样蛋白(The yeast SCG1 gene：a Ga-like protein implicated in the a-

and a-factor response pathway).细胞(Cell)50，1001-1010.7.  Elledeg，S.J.，Mulligan，J.T.，Ramer，S.W.，Spottswood，M.，和Davis，R.W.

(1991)8.  λYES：一种通过酵母和大肠杆菌突变的互补作用而用于分离基因的多功能

cDNA表达载体(λYES：A multifunctional cDNA expression vector for the

 isolation of genes by complementaion of yeast and Escherichia coli mutations.)

 美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88，1731-1735.9.   Fairley-Grenot，G.K.和Assman，S.M.(1991)G蛋白调控蚕豆保卫细胞中的

 向内钾离子通道流方面的证据(Evidence for G-protein regulation of inward

 postassium ion channel current in guard cells of fava bean).植物细胞(Plant

 Cell)3；1037-1044.10   Huang，H.，Weiss，C.A.，和Ma.，H.(1994).拟南芥属G蛋白α亚基基因

 GPA1的受控表达(Regulated expression of the Arabidopsis Gprotein a subunit

 gene GPA1)国际植物科学杂志(Int.J.Plant Sci.)155，3-14.11.  Kang，Y.，Kane.J.，Kurjan.，J.，Stadel.，J.M.，和Tipper，D.J.(1990)哺乳动物

 Gα和杂合的哺乳动物-酵母Gα蛋白的表达对酵母信息素应答型信号传导途

 径的影响(Effects of expression of mammalian Ga and hybrid mammalian-yeast

 Gαproteins on the yeast pheromone response signal transduction pathway.)分子

 细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)10(6)，2582-2590.12.  Kaufman，L.S.(1994).高等植物中的GTB-结合信号蛋白(GTB-binding

 signaling proteins in higher plants)光化学-光生物学-植物生物学杂志(J.

 Photochem.Photobio.B.Biol.)22：3-7.13.  Kim，W.Y.，Cheong，N.E.，Lee，D.C.，Je，D.Y.，Bahk，J.，D.，Cho，M.J.和

 Lee，S.，Y.(1995)植物生理学(Plant Physiol.)108：1315-1316.14.  King，K.，Dohlman，H.G.，Thomer，J.，Caron，M.G.，和Lefkowitz，R.J.(1990)

 通过哺乳动物β₂-肾上腺素能受体和G₅α亚基控制酵母交配信号传导

 (Control of yeast mating signal transduction by a mammalian β₂-adrenergic

 receptor and G₅α subunit.)15.  Legendre，L.，Heinstein，P.F.和Low，P.S.(1992)GTP结合蛋白在培养的大

 豆细胞中参与引发突发快速氧化方面的证据(Evidence for participation of

 GTP-binding proteins in elicitation of the rapid oxidative burst in cultures

 soybean cells.)生物化学杂志(J.B.C)267：20140-20147.16.  Li，W.和Assmann，S.M.(1993)在蚕豆叶肉细胞中G蛋白调控的向外K⁺流

 的定性研究(Characterization of G-protein regulated outward K+current in

 mesophyll cells of Vicia faba.)美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)

 90：262-266.17.  Ma.H.，Yanofsky，M.F.，和Meyerowitz，E.M.(1990).GPA1-一种拟南芥的G

 蛋白α亚基基因的分子克隆和定性研究(Molecular cloning and

 characterization of GPA1，a Gprotein α subunit gene from Arabidopsis

 thaliana.)美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87，3821-3825.18.  Ma.，H.，Yanofsky，M.F.，和Huang，H.(1991).编码番茄G蛋白α亚基的

 TGA1 cDNA的分离和序列分析(Isolation and sequence analysis of TGA1

 cDNAs encoding a tomato Gprotein α subunit.)基因(Gene)107，189-195.19.  Ma，H.(1994)植物中的GTP结合蛋白：旧家族中的新成员(GPT-binding

 proteins in plants：new members of an old family.)植物分子生物学(Plant Mol.

 Biol.)26：161-1636.20.  Neuhaus.G.，Bowler，C.Kem，R.和Chua，N.-H.(1993)钙/钙调蛋白依赖型和

 非依赖型植物光敏色素信号传导途径(Calcium/calmodulin-dependent and-

 independent phytochrome signal transduction pathways.)细胞(Cell)73：937-

 952.21.  Romero，L.C.和Lam，E.(1993)在植物光敏色素调控的基因表达的早期步

 骤中涉及鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(Guanine nucleotide binding protein

 involvement in early steps of phytochrome-regulated gene expression.)美国科

 学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：1465-1469.22.  Rose，M.，Winston，F.和Hieter，P.(1990)酵母遗传学方法(Methods in Yeast

 Genetics.)Cold Spring Harbor Laboratory Press.23.  Ryba，N.J.P.，Findlay，J.B.C.，和Reid，J.D.(1993)乌贼视觉Gq-α亚基的分子

 克隆及其在酿酒酵母中的表达(The molecular cloning of the squid(Loligo

 foresi)visual Gq-α subunit and its expression in Saccharomyces cerevisiae.)

 生物化学杂志(Biochem.J.)292，333-341.24.  Vera-Estrella，R.，Barkla，B.J.，Higgins.V.J.和Blumwald，E.(1994)植物对真

 菌病原体的防御性反应(Plant defense response to fungal pathogens.)植物生

 理学(Plant Physiol.)104：209-215.25.  Warpeha，K.M.F.，Hamm.H.E.，Rasenick，M.M.和Kaufman，L.S.(1991)在

 黄化豌豆的质膜中被蓝光激活的GTP结合蛋白(A blue-light activated GTP-

 binding protein in the plasma membranes of etiolated peas.)美国科学院院报

 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88：8925-8929.26.  Weiss，C.A.，Huang，H.，和Ma.，H.(1993).拟南芥属信号传导途径GPA1基

 因编码的G蛋白α亚基的免疫定位(Immunolocalization of the Gprotein α

 subunit encoded by the GPA1 gene in Arabidopsis)植物细胞(The Plant Cell)

 5，1513-1528.27.  Weiss，C.A.，Garnaat，C.W.，Mukai，K.，Hu，Y.和Ma，H.(1994).从玉米

 (ZGB1)和拟南芥(AGB1)中分离出的编码鸟嘌呤核苷酸结合蛋白B亚基类似

 物(Isolation of cDNAs encoding guanine nucleotide-binding protein B-subunit

 homologues from maize(ZGB1)and Arabidopsis(AGB1))美国科学院院报

 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91：9554-9558.28.  Zaina，S.，Reggiani.R.和Bertani，A.(1990)GTP-结合蛋白涉及水稻(Oryza

 savita L.)中生长素信号传导的证据(Preliminary evidence for involvement of

 GTP-binding proteins in auxin signal transduction in rice(Oryza savita L.)

 coleoptile.)植物生理学杂志(J.Plant Physiol.)136：653-658.

Claims (18)

1.一种鉴别植物蛋白的方法，该植物蛋白被怀疑是G蛋白偶联型细胞信号***中的G蛋白亚基或复合物，或者作用方式与其类似，其特征在于，它包括步骤：

(a)提供含有编码待鉴别的靶植物蛋白的核苷酸序列的宿主细胞；

(b)将存在于该宿主细胞中且怀疑必然与靶植物蛋白有关的所有和部分G蛋白亚基复合物的内源组份失活；

(c)让该宿主细胞生长；和

(d)在该宿主细胞中G蛋白偶联型细胞信号传导途径的必然内源组份的功能性表达不存在时，测量生长情况，作为待鉴别的植物蛋白是否在该宿主细胞中发挥功能的指示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该植物蛋白的全部或一部分是G蛋白亚基。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(b)的内源组份是Gα亚基，而该待鉴别的植物蛋白包括植物Gα亚基。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(b)的内源组份是Gβ或Gγ亚基或Gβγ复合物，而该待鉴别的植物蛋白包括Gβ或Gγ样蛋白或Gβγ样复合物。

5.如权利要求1-4中任一权利要求所述的方法，其特征在于，该宿主细胞是酵母细胞。

6.一种鉴别植物蛋白的方法，该植物蛋白被怀疑是细胞信号途径的G蛋白偶联受体组份，或作用方式与其类似，其特征在于，它包括步骤：

(a)提供含有编码待鉴别的植物蛋白的核苷酸序列的宿主细胞，其中该宿主细胞具有有功能的G蛋白亚基复合物；

(b)让该宿主细胞在合适的条件下生长；和

(c)测量生长情况，作为待鉴别的植物蛋白是否与该G蛋白亚基复合物作用从而在该宿主细胞的细胞信号途径中发挥功能的指示。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，该G蛋白复合物的至少一部分是衍生自植物的。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该G蛋白亚基复合物选自主要由下列物质构成的组：植物G蛋白、嵌合的哺乳动物/植物G蛋白、嵌合的酵母/植物G蛋白、和三聚体式的酵母/植物/哺乳动物G蛋白。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，该G蛋白亚基是Gα。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，该宿主细胞是酵母细胞。

11.用权利要求7方法转化的宿主细胞。

12.一种转化的宿主细胞，其特征在于，它含有编码用于植物蛋白的第一核苷酸序列和编码全部或部分G蛋白复合物的第二核苷酸序列，其中至少一部分G蛋白复合物是衍生自植物的。

13.如权利要求12所述的转化的宿主细胞，其特征在于，该第二核苷酸序列编码的Gα蛋白选自主要由下列物质构成的组：植物Gα、嵌合的哺乳动物/植物Gα、嵌合的酵母/植物Gα、和三聚体式的酵母/植物/哺乳动物Gα。

14.一种核苷酸表达载体，其特征在于，它能够将权利要求13所述的异源植物蛋白表达到宿主细胞的细胞膜中。

15.一种核苷酸表达载体，其特征在于，它能够在宿主细胞中表达权利要求1中所述的植物蛋白。

16.如权利要求14或15所述的表达载体，其特征在于，该宿主细胞是酵母细胞。

17.一种分析物质以确定配体结合于异源植物G蛋白偶联受体所产生的效应的方法，其特征在于，该方法包括步骤：

(a)提供细胞，该细胞表达异源植物G蛋白偶联受体并且还含有G蛋白复合物，其中至少一部分G蛋白复合物是衍生自植物的；

(b)将选定物质与该细胞接触，以便让该物质与表达的异源G蛋白偶联受体作用；

(c)测定该细胞的生长，作为与该物质的相互作用是否调制异源G蛋白偶联受体的指示。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，该G蛋白复合物包含植物Gα。