CN1246534A - 人甲硫氨酸亚砜还原酶编码序列、其编码的多肽及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种新的人甲硫氨酸亚砜还原酶msrA。本发明提供了该新的甲硫氨酸亚砜还原酶的cDNA编码序列、该序列编码的多肽,以及利用重组技术生产所述的新的人甲硫氨酸亚砜还原酶的方法。本发明还提供了这种新的人甲硫氨酸亚砜还原酶的应用。

Description

人甲硫氨酸亚砜还原酶编码序列、其编码的多肽及制备方法

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及人甲硫氨酸亚砜还原酶(msrA)的cDNA序列。本发明还涉及所述多核苷酸序列和所述多肽的生产方法，以及这些多核苷酸和所述多肽的生产方法。

甲硫氨酸亚砜还原酶在维持生物体内蛋白质活性方面有重要的作用，它能够将蛋白质中被氧化的甲硫氨酸残基还原修复，从而避免由于甲硫氨酸被氧化而造成的蛋白质失活。已知蛋白质中由于甲硫氨酸氧化而引起的失活与多种疾病相关，这些疾病包括呼吸窘迫症、肺气肿、白内障和风湿性关节炎等(J.Clin.Invest.1983，71，754-761；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1980，79，2041-2045；Biochim.Biophys.Acta.1977，492，43-52；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1980，77.1274-1277；Biochem.Biophys.Res.Commun.1980，96，1449-1454)。Rahman MA等于1992年首先对大肠杆菌的甲硫氨酸亚砜还原酶(msrA)基因进行了克隆，测序和表达(Ragman MA，etc，J Biol Chem 1992 Aug5；267(22)：15549-15551)，并在1994年完成了该基因的物理图定位(Rahman MA，etc，JBacteriol 1994 Mar；176(5)：1548-15490)。1995年Brot N等也做了该基因的克隆，高表达和提纯的实验(Brot N，etc，Methods Enzymol 1995；251：462470)。1996年Moskovitz J等从牛肝中提纯了大肠杆菌msrA蛋白的同源物，克隆和表达了编码该蛋白的基因，并用Northern分析法检测了在鼠的组织浸出液中编码msrA蛋白的mRNA的分布(Moskovitz J，etc，Proc Natl Acad Sci U S A 1996 Mar 5；93(5)：2095-2099)，同年，他们用免疫化学印迹法进行了该基因在鼠组织中的差别表达实验，并将该基因定位于小鼠第14号染色体(Moskovitz J，etc，Proc Natl Acad Sci U S A 1996 Apr 16；93(8)：3205-3208)。然而在本发明之前，没有公开过本申请中涉及的人类msrA家族的新成员。

本发明的一个目的是提供一个新的多核苷酸，该多核苷酸编码甲硫氨酸亚砜还原酶家族的一个新成员，本发明的甲硫氨酸亚砜还原酶家族的同系物命名为msrA。

本发明的另一个目的是提供一种新的甲硫氨酸亚砜还原酶家族的新成员。

本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的甲硫氨酸亚砜还原酶家族的成员的方法。

本发明还涉及这种新的甲硫氨酸亚砜还原酶基因序列和多肽的应用。

在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括：编码具有人msrA蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸61-768位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸61-768位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸61-768位的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种分离的msrA蛋白多肽，它包括：具有SEQID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。

在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。

在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。

在本发明的另一方面，提供了一种产生具有msrA蛋白活性的多肽的方法，该方法包括：

(a)将编码具有msrA蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成msrA蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸61-768位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成msrA蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达msrA蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有msrA蛋白活性的多肽。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为853个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于61-768位核苷酸。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“msrA蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有msrA蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中61-768位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框61-768位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中61-768位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸61-768位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸61-768位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与人msrA相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、***和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。

在本发明中，术语“msrA蛋白多肽”指具有msrA蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。该术语还包括具有与人甲硫氨酸亚砜还原酶相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括msrA蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与msrA DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗msrA多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含msrA多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了msrA多肽的可溶性片段。通常，该片段具有msrA多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供msrA蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然msrA多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明还包括msrA多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内msrA的表达。

本发明还包括一种探针分子，该分子通常具有msrA多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码msrA的核酸分子。

本发明还包括检测msrA核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于msrA多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

另一方面，本发明还包括对msrA DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体或单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于msrA基因产物或片段。较佳地，指那些能与msrA基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制msrA蛋白的分子，也包括那些并不影响msrA蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的msrA基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利NO.P,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的msrA基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达msrA或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，InMonoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断msrA功能的抗体以及不影响msrA功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用msrA基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与msrA基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

在本发明中，msrA的cDNA核苷酸序列是如此获得的：以人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A1：5′-CTGCGGCTCCGCTGCCGGTAG-3′(SEQ ID NO：1)为正向引物，寡核苷酸B1：5′-CCACGATTGTGAGTCACACAAGC-3′(SEQ ID NO：2)为反向引物，进行PCR，分别获得853的目的片段。鉴定测序后得到SEQ ID NO：3的全长cDNA序列。

过同源检索发现，上述序列与牛的msrA基因在核酸和蛋白水平上都有高度同源性。

众所周知，蛋白肽链中的甲硫氨酸可被非酶因素催化为甲硫氨酸亚砜，这些非酶因素包括有氧代谢的副产物——过氧化物、羟基、次氯酸盐等(Brot，N.，and H.Weissbach.1988.Methionine sulfoxide：chemistry and biochemistry，p.851-872.In S.Patai and Z.Rappoport(ed.)，The chemistry of sulphones and sulphoxides.John Wiley& Sons，Inc.，New York.)。甲硫氨酸的氧化可导致蛋白生物活性的丧失(Brot，N.，and Weissbach，H.1991，Biofactors 3，91-96；Brot，N.，and Weissbach，H.1983，Arch.Biochem.Biophys.223，271-283)，从而导致多种疾病的发生，所以生物体内必然存在能修复这些被氧化的甲硫氨酸残基的酶类。甲硫氨酸亚砜还原酶(msrA)正是这样一类酶。体内外实验结果均表明msrA可以将游离的或肽链中的甲硫氨酸亚砜还原为甲硫氨酸，所以msrA在挽救蛋白所受的氧化危害中扮演着重要的角色，可以认为是一种蛋白质的翻译后调控手段。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

msrA的cDNA序列的克隆和测定

1.引物扩增

以人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A1：5′-CTGCGGCTCCGCTGCCGGTAG-3′(SEQ ID NO：1)为正向引物，寡核苷酸B1：5′-CCACGATTGTGAGTCACACAAGC-3′(SEQ ID NO：2)为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、68℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到长度为为853bp的目的片段。

2.PCR产物的测序

将这段PCR扩增产物A1/B1与pGEM-T^载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JMl03，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(pHarmacia)对***片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCEL^TM DNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共853bp，详细序列见SEQ ID NO：3，其中开放读框位于61-768位核苷酸。

根据得到的全长cDNA序列推导出msrA的氨基酸序列，共235个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO：4。

实施例2

同源比较

用msrA的全长cDNA序列及其编码蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中用BLAST进行核酸和蛋白同源检索。结果发现它们与牛的msrA基因及其编码蛋白具有极高同源性，在核酸和蛋白水平上的同一性和相似性都超过了85％。同时，牛msrA与酵母和大肠杆菌中的msrA又有着较大同源性，因此它们被认为构成一个家族，根据结构相似功能相似的原则，可以从这些基因或蛋白的功能来推测msrA的功能。

众所周知，蛋白肽链中的甲硫氨酸可被非酶因素催化为甲硫氨酸亚砜，这些非酶因素包括有氧代谢的副产物——过氧化物、羟基、酸盐等。甲硫氨酸的氧化可导致蛋白生物活性的丧失(Brot，N.，and Weissbach，H.Biofactors.1991，3，91-96；Brot，N.and Weissbach，H.Arch.Biochem.Biophys.1983，223，271-283)，所以生物体内必然存在能修复这些被氧化的甲硫氨酸残基的酶类。甲硫氨酸亚砜还原酶(msrA)正是这样一类酶。体内外实验结果均表明msrA可以将游离的或肽链中的甲硫氨酸亚砜还原为甲硫氨酸，所以msrA在挽救蛋白所受的氧化危害中扮演着重要的角色，可以认为是一种蛋白质的翻译后调控手段。

甲硫氨酸的氧化与多种疾病有关。

已知血清α1蛋白酶体阻遏物(alpha 1-proteinase inhibitor，alpha 1-PI)的氧化失活就是由于两个关键的甲硫氨酸残基被氧化所致(J.Biol.Chem.1979，254，4022-4026)。实验发现成年人呼吸窘迫综合征很可能就是由于支气管肺泡黏液中(bronchoalveolar lavage)alpha 1-PI活性位点的甲硫氨酸被氧化所致，而血清α1蛋白酶体阻遏物的氧化失活与成年人呼吸窘迫综合征有密切联系(J.Clin.Invest.1983，71，754-761)。alpha 1-PI甲硫氨酸的氧化还与吸烟者的肺气肿有关。alpha 1-PI的失活被认为与肺气肿的发病有密切联系，研究发现吸烟者支气管肺泡黏液中的alpha 1-PI的活性显著降低，而在失活的alpha 1-PI中存在大量被氧化的甲硫氨酸(4mol/mol失活的alpha 1-PI)(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1980，79，2041-2045)。

晶状体蛋白的甲硫氨酸残基被氧化与白内障的发病机理也有关。研究发现白内障的形成过程中伴随着甲硫氨酸和半胱氨酸的氧化。在严重的白内障患者中，60％或更多的晶状体膜连组分的甲硫氨酸发生了氧化，与之相反正常人中则不存在这一现象(Biochim.Biophys.Acta.1977，492，43-52；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1980，77，1274-1277)。

另外，风湿性关节炎也与甲硫氨酸残基的氧化有关(Biochem.Biophys.Res.Commun.1980，96，1449-1454)。

值得注意的是，体外实验证实E.coli.msrA可使氧化失活的血清α1蛋白酶体阻遏物恢复活性(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1981，78，7483-7486；J.Clin.Invest.1983，71，754-761)。因此，利用MsrA能够还原蛋白质中被氧化的甲硫氨酸残基从而恢复蛋白质活性的这一性质，为治疗上述疾病以及其它相关病症提供了一种可能的方法。

实施例3

msrA在大肠杆菌中的表达

编码msrA的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板进行扩增，以合成***片段。

5′寡核苷酸引物序列为：

5′-TTGGGATCCATGCTCTCGGCCACCCGGAG-3′(SEQ ID NO.5)

该引物含有BamH1限制性限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的msrA编码序列的20个核苷酸；

3′端引物序列为：

5’-AACAAGCTTTTATTTTTTAATACCCACTG-3’(SEQ ID NO.6)

该引物含有HindIII限制性限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和msrA的编码序列。

限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。

用BamHI和HindIII消化pQE-9载体以及***片段，随后将***片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kan^r)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，测序验证msrA的cDNA片段已正确***了载体。

在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD₆₀₀)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的msrA。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱msrA。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出纯化蛋白。纯化后的蛋白质被结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。

用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为26kDa。

此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO：4的序列一致。

实施例4

msrA在真核细胞(CHO细胞株)中的表达

编码msrA的cDNA序列(GenBank Accession No.AF064257)用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板进行扩增，以合成***片段。

5′寡核苷酸引物序列为：

5′-TTGGGATCCATGCTCTCGGCCACCCGG-3′(SEQ ID NO.5)

该引物含有BamHI限制性限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的msrA编码序列的20个核苷酸；

3′端引物序列为：

5’-AACGGATCCTTATTTTTTAATACCCACTG-3’(SEQ ID NO.7)

该引物含有BamHI限制性限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和msrA的编码序列。

限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r和Neo^r)、一个噬菌体复制起点(f1ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序、。

用BamHI消化pcDNA3载体以及***片段，随后将***片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，用SacI酶切鉴定***片段大小及方向，并测序验证msrA的cDNA片段已正确***了载体。

质粒转染CHO细胞是采用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mM Tris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。

用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小，测得msrA的分子量大小约为26kDa。

此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO：4的序列一致。

实施例5

制备抗体

将实施例3或4中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀msrA基因翻译产物的能力加以评估。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                          序列表(2)SEQ ID NO：1的信息(i)序列特征

(A)长度：21碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：CTGCGGCTCC GCTGCCGGTA G21(2)SEQ ID NO：2的信息(i)序列特征

(A)长度：23碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：2CCACGATTGT GAGTCACACA AGC(2)SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征：

(A)长度：853bp

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：3  1  CTGCGGCTCGCCTCCCGGTAGCGCCGTCCCCCGGGACCACCCTTCGGCTGGCGCCCTCCC61  ATGCTCTCGGCCACCCGGAGGGCTTGCCAGCTCCTCCTCCTCCACAGCCTCTTTCCCGTC121  CCGAGGATGGGCAACTCGGCCTCGAACATCGTCAGCCCCCAGGAGGCCTTGCCGGGCCGG181  AAGGAACAGACCCCTGTAGCGGCCAAACATCATGTCAATGGCAACAGAACAGTCGAACCT241  TTCCCAGAGGGAACACAGATGGCTGTATTTGGAATGGGATGTTTCTGGGGAGCTGAAAGG301  AAATTCTGGGTCTTGAAAGGAGTGTATTCAACTCAAGTTGGTTTTGCAGGAGGCTATACT361  TCAAATCCTACTTATAAAGAAGTCTGCTCAGAAAAAACTGGCCATGCAGAAGTCGTCCGA421  GTGGTGTACCAGCCAGAACACATGAGTTTTGAGAGAACTGCTCAAGGTCTTCTGGAGAAT481  CACGACCCGACCCAAGGTATGCGCCAAGGGAACGACCATGGCACTCAGTACCGCTCGGCC541  ATCTACCCGACCTCTGACAAGCAAATGCAGGCAGCCCTGAGCTCCAAAGAGAACTACCAA601  AAGGTTCTTTCAGAGCACGGCTTCGGCCCCATCACTACCGACATCCGGGAGGGACAGACT661  TTCTACTATGCGGAAGACTACCACCAGCAGTACCTGAGCAAGAACCCCAATGGCTACTGC721  GGCCTTGGGGGCACCGGCGTGTCCTGCCCAGTGGGTATTAAAAAATAATTGCTCCCCACA781  TGGTGGGCCTTTGAGGTTCCAGTAAAAATGCTTTCAACAAATTGGGCAATGCTTGTGTGA841  TTCACAATCGTGG(2)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征：

(A)长度：235个氨基酸

(B)类型：氨基酸(C)拓扑结构：线性(ii)分子类型：多肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：61 Met Leu Ser Ala Thr Arg Arg Ala Cys Gln Leu Leu Leu Leu His16 Ser Leu Phe Pro Val Pro Arg Met Gly Asn Ser Ala Ser Asn Ile31 Val Ser Pro Gln Glu Ala Leu Pro Gly Arg Lys Glu Gln Thr Pro46 Val Ala Ala Lys His His Val Asn Gly Asn Arg Thr Val Glu Pro61 Phe Pro Glu Gly Thr Gln Met Ala Val Phe Gly Met Gly Cys Phe76 Trp Gly Ala Glu Arg Lys Phe Trp Val Leu Lys Gly Val Tyr Ser91 Thr Gln Val Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Thr Ser Asn Pro Thr Tyr106 Lys Glu Val Cys Ser Glu Lys Thr Gly His Ala Glu Val Val Arg121 Val Val Tyr Gln Pro Glu His Met Ser Phe Glu Arg Thr Ala Gln136 Gly Leu Leu Glu Asn His Asp Pro Thr Gln Gly Met Arg Gln Gly151 Asn Asp His Gly Thr Gln Tyr Arg Ser Ala Ile Tyr Pro Thr Ser166 Asp Lys Gln Met Gln Ala Ala Leu Ser Ser Lys Glu Asn Tyr Gln181 Lys Val Leu Ser Glu His Gly Phe Gly Pro Ile Thr Thr Asp Ile196 Arg Glu Gly Gln Thr Phe Tyr Tyr Ala Glu Asp Tyr His Gln Gln211 Tyr Leu Ser Lys Asn Pro Asn Gly Tyr Cys Gly Leu Gly Gly Thr226 Gly Val Ser Cys Pro Val Gly Ile Lys Lys(2)SEQ ID NO：5的信息(i)序列特征

(A)长度：29碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：TTGGGATCCA TGCTCTCGGC CACCCGGAG 29(2)SEQ ID NO：6的信息(i)序列特征

(A)长度：29碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：AACAAGCTTT TATTTTTTAA TACCCACTG 29(2)SEQ ID NO：7的信息(i)序列特征  (A)长度：29碱基(B)类型：核酸(C)链性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：AACGGATCCT TATTTTTTAA TACCCACTG 29

Claims (14)

1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括：编码具有人msrA蛋白活性的多肽的核苷酸序列，

所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸61-768位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸61-768位的核苷酸序列杂交。

2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。

3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸61-768位的核苷酸序列。

4.一种分离的msrA蛋白多肽，其特征在于，它包括：具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。

7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。

9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。

10.一种产生具有msrA蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括：

(a)将编码具有msrA蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成msrA蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸61-768位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转人宿主细胞，形成msrA蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达msrA蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有msrA蛋白活性的多肽。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.3中从核苷酸61-768位。

12.一种能与权利要求4所述的msrA蛋白多肽特异性结合的抗体。

13.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。

14.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中约8-100个连续核苷酸。