CN1244259A - 用于血红蛋白和细胞分析的无氰化物裂解试剂组合物与方法 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了一种用于测定血样中总血红蛋白浓度、计数白细胞、区别计数三种白细胞亚群(包括淋巴细胞、单核细胞和粒细胞)的无氰化物的裂解试剂组合物以及方法。所说的无氰化物裂解试剂组合物包含选自季铵盐、吡啶鎓盐、有机磷酸酯和烷基磺酸的溶血性表面活性剂以溶解红细胞并释放血红蛋白,该组合物还包含选自由***及其衍生物、四唑及其衍生物、4,6-二羟基-1,3,5-三嗪-2-羧酸、蜜胺、苯胺-2-磺酸、喹哪啶酸、2-氨基-1,3,4-噻二唑、三嗪及其衍生物、尿唑、DL-2-哌啶酸、异烟酰胺、邻氨基苯甲腈、6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶、腺嘌呤、3-(2-噻吩基)丙烯酸、苯甲酸和苯甲酸的碱金属和铵盐、吡嗪及其衍生物的有机配体以与血红蛋白形成稳定的色原。另外,可以将有机配体添加至适合的血液稀释剂中以用于血红蛋白和白细胞的分析。
Description
发明背景
发明所属技术领域
本发明涉及用于测定血样中总血红蛋白浓度(人工或自动)及用于同时进行白细胞计数或白细胞亚群的区别计数的裂解试剂组合物、稀释剂以及方法。
现有技术的讨论
总血红蛋白的测定是全血携氧容量的指示。对有临床症状的患者的检查和对临床正常群体的电泳研究发现了300种以上的异常血红蛋白。许多这样的异常导致了血红蛋白水平改变或血红蛋白结合氧的能力改变的临床病理。这些疾病是镰状细胞性贫血、α和β-地中海贫血和血红蛋白M等。
测定血样中血红蛋白(Hgb)的能力是诊断分析的十分重要的部分,对监控对影响血红蛋白的疾病的疗法的反应以及对其它疾病但可能对血红蛋白水平产生不利影响的疗法的反应也是重要的。
正常人外周血液中的白细胞是由五种类型组成的,即,淋巴细胞、单核细胞、中性白细胞、嗜曙红细胞和嗜碱细胞。后三种类型的白细胞被一起称作粒细胞。不同类型的白细胞具有不同的生物功能。计数和区别在血样中的不同类型的白细胞为临床诊断提供了有价值的信息。例如,在患有感染病的患者的恢复期间或在如单核细胞白血病这样的疾病期间,单核细胞的数量增加。
白细胞的分类和计数通常通过区别计数法(即手工方法)进行。自动血液分析仪也常用于计数白细胞,该仪器使用了溶血试剂以裂解红细胞并制备仅包含白细胞的样品。然后样品混合物通过阻抗方法分析。现已开发了一种更先进的装置,该装置计数包括单核细胞、淋巴细胞和粒细胞的不同类型的白细胞(区别计数)。理想地,人们希望能在单个自动步骤中完成若干诊断分析,如血红蛋白测定和计数白细胞或区别计数白细胞亚群。
在许多用于血红蛋白测定的著名方法中,氰化物血红蛋白方法被国际血液学标准化委员会推荐为标准方法。Matsubara和Okuzono对该方法的改良导致其在临床实验室中广泛的应用。按照该方法,在红细胞的所有血红蛋白形式的血红素基的铁离子由铁***氧化成高铁血红蛋白。然后高铁血红蛋白和氰阴离子(其对血红素铁离子具有十分高的亲和性)结合,形成氰化正铁血红蛋白色原。这种极端稳定的色原在540nm具有最大吸光度,这可以通过紫外光谱测定法人工测定。
尽管通过标准的氰化正铁血红蛋白方法及其改良的自动方法形成的色原稳定,然而,由于使用***,试剂废物引起了巨大的环境关注。在过去十年中,人们付出了巨大的努力以开发不使用氰化物的自动血红蛋白分析方法。
Oshiro等(临床生物化学(Clin.Biochem.),1583(1982))说明了用于血红蛋白分析所使用的试剂,该试剂包含十二烷基硫酸钠(SLS)和中性pH(7.2)的Triton X-100(非离子型表面活性剂)。SLS用于裂解红细胞,并被认为进一步产生SLS-血红蛋白复合物,它在539nm处具有最大吸光度并在572nm处有肩峰。反应在5-10分钟内完成,总血红蛋白测定是定量的。然而,如后来在美国专利号5,242,832(属Sakata)中所解释的,使用Oshiro方法不可能在进行血红蛋白测定的同时分析白细胞。
美国专利号5,242,832(属Sakata)公开了用于对血样白细胞计数并测定血红蛋白浓度的无氰化物裂解试剂。该裂解试剂包含至少一种第一表面活性剂(季铵盐)、至少一种第二表面活性剂(包括阳离子表面活性剂和兼性表面活性剂)以及至少一种选自下列化合物的血红蛋白稳定剂:Tiron、8-羟喹啉、联吡啶、1-10-菲咯啉、酚类化合物、双酚、吡唑及其衍生物、2-苯基5-吡唑啉酮及其衍生物、苯基3-吡唑啉酮以及咪唑及其衍生物。Sakata说明了白细胞分级分离成两个或三个组(包括淋巴细胞的聚集体,单核细胞、嗜曙红细胞和嗜碱细胞的聚集体以及中性白细胞的聚集体)只有通过使用至少两种适合的表面活性剂和严格控制表面活性剂浓度才能完成。Sakata也说明了裂解试剂优选的pH值是5.0-8.0。如果pH值是3.0或更小,对白细胞的破坏增加,这样使白细胞的测定困难,如果pH值是9.0或更大,血红蛋白的稳定性随时间变坏。
PCT/US95/02897(Kim)公开了用于测定全血样中的血红蛋白的无氰化物方法与试剂。该试剂包括配体(选自下列化合物:咪唑及其衍生物、N-羟乙酰胺、H-羟胺、吡啶、噁唑、噻唑、吡唑、嘧啶、嘌呤、喹啉和异喹啉)以及一种强红细胞溶解能力的表面活性剂(选自十二烷基二甲基胺氧化物和辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)。该分析方法快速,不到10秒。然而,该试剂仅在极端碱性(pH值11-14)条件下操作。此外,Kim没有说明计数白细胞或区别白细胞亚群的能力。
上述的无氰化物血红蛋白测定方法中,没有一种可以在血红蛋白测定的同时提供单核细胞和整个粒细胞的数量;然而,这两个参数都是用于各种疾病临床诊断的有价值的工具。这就需要更多用途的无氰化物血红蛋白测定方法和多功能试剂以在单个自动步骤中可以完成若干诊断分析。
发明概述
考虑到前面的讨论,本发明的目的是提供用于测定存在于血样中的总血红蛋白浓度的无氰化物裂解试剂组合物。
该无氰化物裂解试剂组合物包含至少一种足以溶解红细胞并释放血红蛋白量的、选自季铵盐、吡啶鎓盐、烷基磺酸、或烷基磺酸的碱金属盐、有机磷酸酯或有机磷酸酯的碱金属盐的表面活性剂;和足以与血红蛋白形成稳定的色原量的、选自***及其衍生物、四唑及其衍生物、4,6-二羟基-1,3,5-三嗪-2-羧酸的碱金属盐、蜜胺、苯胺-2-磺酸、喹哪啶酸、2-氨基-1,3,4-噻二唑、三嗪及其衍生物、尿唑、DL-2-哌啶酸、异烟酰胺、邻氨基苯甲腈、6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶、腺嘌呤、3-(2-噻吩基)丙烯酸、苯甲酸以及苯甲酸的碱金属盐和铵盐、吡嗪及其衍生物的有机配体的水溶液。该裂解试剂组合物具有大约1-大约13的pH值。
在优选的方式中,一种或几种季铵盐与所公开的有机配体的组合可用于通过DC阻抗测定方法提供血样中总血红蛋白浓度的测定和白细胞的计数。
在更优选的方式中,一种或几种季铵盐和与白细胞差别分析相容的有机配体的组合用于同时提供总血红蛋白浓度的测定、白细胞的计数和血样中白细胞亚群的区别计数,其中所说的白细胞被区分成包括淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的三个亚群。
由随后对优选实施方案的详细描述中将更好地认识到,本发明与现有技术相比特别有利,它提供了用于在大范围pH值下血红蛋白测定的无氰化物裂解试剂。
本发明的另一个目的是提供一种使用该裂解试剂组合物和适当的血液稀释剂用于测定血液中的血红蛋白浓度或同时与白细胞计数或白细胞亚群的区别计数结合的方法。
一方面,该方法包括用适合的血液稀释剂稀释血样、将足量的裂解试剂组合物与稀释的样品混合、在预定的用于血红蛋白浓度测定的波长下用光度测定该样品、同时在装备有DC阻抗测定装置的血液分析仪上计数白细胞或区别计数白细胞亚群。
另外,当与裂解试剂结合使用时,公开的有机配体也可以添加进适合的血液稀释剂以形成稳定的血红蛋白色原。另一方面,本发明提供了一种血液稀释剂以及使用该血液稀释剂用于血红蛋白测定以及白细胞计数和白细胞亚群区别计数的方法。本发明的另一个重要优点是它给设计者提供了在裂解试剂或稀释剂中使用血红蛋白配体(根据特定的产品需要)的灵活性。
从随后的参考附图的优选实施方案的描述中可以更好地了解本发明及其各种优点。
附图的简要描述
图1a和1b是按照在实施例1中描述的方法使用本发明实施例1的裂解试剂组合物处理的全血样品的吸收光谱(配方1b和1c)。
图2显示了按照实施例1的方法使用配方1a的裂解试剂组合物处理的血样的一系列吸收光谱。在一个小时间隔的十二小时内总共获得了十二种图谱。
图3a和3b显示了按照在实施例2中所描述的方法使用实施例2的裂解试剂组合物以及标准的磷酸缓冲盐水和商业血液稀释剂COULTERISOTON作为稀释剂处理的全血样图谱。
图4a、4b、4c和4d显示了通过在商业的血液分析仪COULTERCOUNTERS-Plus IV型上使用本发明实施例4的裂解试剂组合物获得的四种全血样品的白细胞亚群分布直方图。
图5a和5b显示了在自动商业血液分析仪COULTERSTKS上使用常用的裂解试剂COULTERLYSE SIII diff获得的血红蛋白浓度和白细胞数量与在相同仪器上使用本发明实施例3的裂解试剂组合物(配方3a)获得的结果之间的相关性。
图6a和6b显示了在自动商业血液分析仪COULTERSTKS上使用COULTERLYSE SIII diff裂解试剂获得的血红蛋白浓度和白细胞数量与在相同仪器上使用本发明实施例3的裂解试剂组合物(配方3b)获得的结果之间的相关性。
图7a、7b、7c、7d和7e显示了在COULTER COUNTERS-Plus IV上所获得的白细胞数量、白细胞差别计数和血红蛋白浓度与在相同仪器上使用本发明实施例4的裂解试剂组合物(配方4a和稀释剂)获得的结果的相关性。
图8a和8b是按照在实施例5中描述的方法使用本发明实施例5的裂解试剂和稀释剂组合物(配方5a和5b)处理的两种全血样品的吸收光谱。
图9a和9b显示按照在实施例6中所描述的方法使用实施例6的裂解试剂和稀释剂组合物处理的全血样的图谱和白细胞亚群分布直方图。
优选实施方案的详细描述
一般来说,要用光度测定法测定血样中的总血红蛋白浓度,必须使用溶血试剂裂解红细胞并释放血红蛋白,然后把血红蛋白转化成稳定的色原,这种色原可以在预定的波长由紫外光谱发现和测定。对于定量和精确的测定,所形成的色原需要是稳定的,至少在测定的时间范围内稳定。红细胞的裂解可以通过酸裂解、渗透裂解和使用各种天然以及合成的表面活性剂完成。释放的血红蛋白包含各种形式,如氧合血红蛋白、脱氧血红蛋白、高铁血红蛋白、碳氧血红蛋白等。
大多数把血红蛋白转化成稳定色原的有效方法是提供配体,该配体对血红素铁具有高亲和性以形成稳定的血红蛋白复合物。这已用氰化正铁血红蛋白方法成功地证明,其中氰阴离子对血红素铁具有极高的亲和性。术语血红蛋白复合物和血红蛋白色原在本发明上下文中可以互换使用。通常,在缺少高亲和性配体的情况下,所形成的血红蛋白色原不十分稳定。其吸光度有变化,并且在大多数情况下随时间衰减。在这种情况下,分析方法不可靠(即使很好地监控并校正降解反应的动力学),因为色原可能对环境(如温度和样品制备条件等)十分敏感。当提供了适合的血红蛋白配体时,血红蛋白转变可以是定量的,形成的血红蛋白复合物的稳定性确保分析方法的可靠性。
配体的选择取决于要完成的分析,例如,仅用于血红蛋白测定,或用于多个诊断分析(如血红蛋白测定同时结合白细胞计数或白细胞亚群区别计数。如果配体不与其它分析相容,对于血红蛋白测定来说极好的配体可能不适合于后者的应用。Sakata说明的例子(在U.S.5,242,832中)中用于裂解红细胞并形成HSb-SLS色原的SLS不能用于白细胞测定。
本发明涉及一种无氰化物的裂解试剂组合物,该组合物用于测定血样中总血红蛋白浓度,或同时进行白细胞计数或三种白细胞亚群的区别计数。无氰化物裂解试剂组合物包含以下物质的水溶液:
(I)至少一种足以溶解红细胞并释放量血红蛋白的量的表面活性剂,该表面活性剂选自由下列物质组成的组:
季铵盐,由下列分子结构表示:
其中R1是有10-18个碳原子的烷基、烯基或炔基;R2、R3和R4是有1-4个碳原子的烷基,X-是氯和溴阴离子;
其中n是7-12的整数,X-是阴离子基团;
烷基磺酸、或烷基磺酸的碱金属盐;
有机磷酸酯,或有机磷酸酯的碱金属盐;
(II)足以与血红蛋白形成稳定的色原的量的有机配体,该有机配体选自由下列物质组成的组:
(a)***如1,2,3-***和1,2,4-***,及***衍生物如1,2,4-***-3-硫醇、1,2,4-***钠盐衍生物、***二羧酸和***的杂环衍生物;
(b)四唑及其衍生物如5-氨基四唑;
(c)4,6-二羟基-1,3,5-三嗪-2-羧酸的碱金属盐其中M是碱金属阳离子;(d)蜜胺(e)苯胺-2-磺酸(f)喹哪啶酸(g)2-氨基-1,3,4-噻二唑(h)三嗪及其衍生物其中R1、R2和R3是-H、-OH、-SH、-COOH以及三嗪的杂环衍生物;(i)尿唑(j)DL-2-哌啶酸(k)异烟酰胺(l)邻氨基苯甲腈(m)6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶(n)腺嘌呤(o)3-(2-噻吩基)丙烯酸(p)苯甲酸或苯甲酸的碱金属和铵盐其中R是-H、NH4 +和碱金属阳离子;(q)吡嗪及其衍生物其中R1、R2 R3和R4是-H、-CN、-OH、-SH、-COOH、-CONH2。裂解试剂组合物的pH是1-13。
在溶血性表面活性剂中,季铵盐是更优选的。在裂解试剂组合物中的表面活性剂的浓度需要足以裂解红细胞并释放血红蛋白、而同时保存白细胞核。为了对白细胞计数,不需要使白细胞膜保持完整。一般来说,使用上述的本发明裂解试剂组合物中的溶血性表面活性剂时,当红细胞完全裂解和破坏时,白细胞膜部***解。白细胞留下的核使得可以使用DC阻抗方法计数白细胞并将白细胞亚群区别成淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。在裂解试剂组合物中的表面活性剂浓度是大约2g/L至大约250g/L,优选地是大约4g/L至大约80g/L。
在裂解试剂组合物中的有机配体的浓度需要足以形成稳定的血红蛋白色原。该浓度随配体类型变化而变化,取决于配体对血红蛋白的亲和性。一般来说,如果在裂解试剂组合物中的配体的量不足,所形成的血红蛋白色原不稳定。发现在本发明的裂解试剂组合物中的有机配体的浓度在大约1g/L至大约30g/L、优选地大约2g/L至大约15g/L的大范围中有效。
在裂解试剂组合物中的化学成分的浓度就是在采用常用的血液分析仪使用适合的血液稀释剂进行血红蛋白及白细胞测定的条件下的浓度。然而,化学成分的浓度可以依赖于裂解试剂组合物和稀释剂的体积比而改变。
此外,如果仪器使用单一裂解试剂组合物(没有血液稀释剂的预稀释),人们可以降低裂解试剂组合物的化学成分的浓度,并调整裂解试剂组合物的导电率使其用于阻抗测定方法。导电率可以通过添加适量的碱金属盐调整。在这类单一试剂方法中,裂解试剂组合物的化学成分的浓度应该与本发明包含稀释剂和裂解试剂组合物的最终样品混合物中所包含的浓度相同。
可有可无的添加剂也可以包含在裂解试剂组合物中,浓度使其存在与裂解试剂组合物的主要功能组分相容即可。这些添加剂有防腐剂,它具有抗氧化性质(以增加组合物的货架寿命)以及抗微生物性质。
本发明也涉及使用上述无氰化物裂解试剂组合物测定血样中的总血红蛋白浓度、或同时对白细胞计数或对白细胞亚群的区别计数的方法。
将抗凝结的血样通过适合的血液稀释剂稀释,然后将足量的上述裂解试剂组合物与所稀释的样品手工混合或机械混合。血液的稀释比是大约125∶1至大约500∶1(总试剂量相对于血液)。然后在添加裂解试剂组合物后8-60秒在紫外分光计上或在装备有紫外检测器的自动血液分析仪上、在预定的用于总血红蛋白测定的吸光波长下用光度法测定样品混合物。也可以将样品混合物引入装备有紫外检测器和DC阻抗测定装置的血液分析仪中,以测定血样的血红蛋白浓度和对白细胞计数,或基于所获得的群体分布直方图进一步区别白细胞亚群。在后一种情况下,白细胞分成三个亚群,包括淋巴细胞,单核细胞和粒细胞。
利用装备有DC阻抗测定装置的血液分析仪对白细胞计数的检测方法在美国专利号2,656,508(属Wallace H.Coulter)中有综合描述,其内容整个引入本文作为参考。使用DC阻抗测定法区别白细胞亚群的方法在美国专利号4,485,175和4,528,274中有描述。
以上所述的有机配体(如***和蜜胺)不仅可以与血红蛋白形成稳定的色原,而且使白细胞在处理的样品混合物中稳定。该白细胞稳定效果阻止了白细胞裂解和核收缩,有利于基于其核体积分离白细胞亚群,并使在大范围pH值内将白细胞分成三个亚群成为可能。实施例4说明了在本发明的裂解试剂组合物中使用白细胞稳定化配体的成功例子。
另一方面,上述的一些有机配体(如苯胺-2-磺酸和喹哪啶酸)表现出对白细胞亚群的核大小的中等到强的冲击。当这些配体用于血红蛋白测定时,白细胞亚群破裂成一或两个组,使白细胞的区别变得困难。然而,即使有这些配体,白细胞核大小远保持在裂解试剂组合物处理样品后的细胞碎片之上,并在常用的DC阻抗测定装置的检测限之上,这样,如在实施例3中的应用所说明的,白细胞的精确计数可以方便地在商业血液分析仪上完成。
一般来说,包含上述有机配体和表面活性剂的本发明裂解试剂组合物可以在非常大范围的pH值内测定血样的总血红蛋白浓度。优选地,一种或几种季铵盐与任何有机配体的结合用于提供通过DC阻抗测定方法测定血样中的总血红蛋白浓度和白细胞计数。更优选地,一种或几种季铵盐与和白细胞差别分析相容的有机配体的结合用于提供血样的总血红蛋白浓度的测定、白细胞计数和白细胞亚群的区别计数。在最优选的方式中,白细胞被分成三个亚群,包括淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。
无氰化物裂解试剂组合物和使用该组合物的方法与现有技术的血红蛋白测定方法相比具有几个优点。本发明使得可以在无氰化物的条件下精确测定血样中的血红蛋白浓度并确定白细胞数量或将白细胞亚群区别成淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。裂解试剂组合物将存在于血样中的血红蛋白在大约8秒-60秒(取决于所使用的有机配体与稀释剂)迅速转化成稳定的色原,使得可以进行快速自动分析。血红蛋白色原一旦形成,在测定时期是稳定的。
图2显示了按照实施例1的方法使用配方1a的裂解试剂组合物(包含四唑作为血红蛋白配体、COULTERISOTONII(商业血液稀释剂)作为稀释剂)处理的血样的一系列吸收光谱。图2说明了在添加裂解试剂组合物后从12秒至12小时(以一个小时的间隔)获得的十二种图谱。Hgb-四唑色原的图谱十分稳定,在十二小时的数据收集期间没有表现出任何变化或衰减。
特异性血红蛋白色原的性质取决于用于裂解试剂组合物的有机配体。通过使用以上所述的有机配体用本发明的裂解试剂组合物处理血样形成的大多数色原在大约510nm至大约560nm具有最大吸光度。因此,色原可以通过大部分商业的血液分析仪结合特异性色原的吸光系数测定。
本发明的裂解试剂组合物可以与许多适合的血液稀释剂一起使用。图3显示了使用包含四唑的裂解试剂组合物(实施例2)、并使用标准的磷酸缓冲盐水和商业血液稀释剂COULTERISOTONIII由上述方法处理的全血样的图谱。用这两种稀释剂,基本上形成了相同的血红蛋白色原,可以在540nm下测定。
不同于以前的试剂,本发明的裂解试剂组合物具有宽范围的pH值(1-13)。这加宽了可以用作血红蛋白配体的化学药品的范围。例如,4,6-二羟基-1,3,5-三嗪-2-羧酸的钾盐与血红蛋白形成稳定的色原,在538nm具有强吸光度。然而,4,6-二羟基-1,3,5-三嗪-2-羧酸的钾盐仅在低pH值(小于pH3)下易溶于水中。以前的中性和碱性试剂不可能使用这种化学物质用于血红蛋白的测定。Sakata在美国专利号5,242,832中说明:如果pH值是3.0或更低,对白细胞的破坏增加,这样使白细胞的测定变得困难。图4显示了按照本发明的方法使用实施例4的裂解试剂组合物(含有0.5%的4,6-二羟基-1,3,5-三嗪-2-羧酸钾盐,并具有2.3的pH值)和COULTERISOTONIII(作为稀释剂)所获得的白细胞亚群分布直方图。如图4c和4d所说明的,白细胞清楚地分成淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。图6b显示了在商业的自动血液分析仪COULTERSTKS上获得的白细胞数量与在相同的仪器上使用实施例3的裂解试剂组合物之一(配方3b)获得的结果之间具有极好的线性相关性,其中裂解试剂组合物的pH值仅为1.67。
本发明的裂解试剂组合物和使用该组合物的方法提供了精确的血红蛋白测定、精确的白细胞计数以及白细胞亚群的区别计数。图5a和6a显示了在COULTERSTKS上使用常用的裂解试剂获得的血红蛋白浓度和使用实施例3的裂解试剂组合物(配方3a和3b)获得的血红蛋白浓度之间具有极好的线性相关性。图5b和6b说明了在COULTERSTKS上获得的白细胞数量和在相同的仪器上使用配方3a和3b所获得的结果之间具有极好的相关性。
本发明的裂解试剂组合物提供了在普通的干扰材料存在下精确的血红蛋白测定。总共72种全血样品在COULTERSTKS上使用实施例3的配方3a分析。样品的70%是各种疾病(如镰状细胞危象和丙型肝炎)的临床样品。已知这些异常的血液含有异常血红蛋白和血红蛋白测定的干扰材料。然而,使用本发明的裂解试剂组合物和方法的测定结果与常用的氰化物-Hgb方法相关性极好(如由图5和6所示),这表明了各种临床样品的总血红蛋白浓度都可以通过使用本发明的裂解试剂组合物测定。
另一种使用有机配体稳定血红蛋白的功能的方式是,将有机配体添加到血液稀释剂而非裂解试剂组合物中。按照以上所述的方法,血样在与裂解试剂混合之前使用血液稀释剂预先稀释。当稀释剂含有以上所述的有机配体时,在通过裂解试剂从红细胞释放之后的样品混合物中的血红蛋白分子立即与有机配体接触以形成稳定的血红蛋白色原。因此,替代的方式用于血样中血红蛋白测定的相同目的。然而,它使试剂设计者基于其特定需要(例如,有机配体对裂解试剂或稀释剂需要进行的血红蛋白测定以外的其它检测的相容性,或有机配体对裂解试剂或稀释剂中的其它化学成分的相容性)可以选择最适合的方式。实施例5说明了有机配体在血液稀释剂中这种应用以形成稳定的血红蛋白色原,其中的裂解试剂仅含有溶血性表面活性剂。图9a显示了按照实施例6的方法使用包含***作为血红蛋白配体的稀释剂处理的血样的图谱。色原的特征与使用在图1a中显示的包含相同配体的裂解试剂组合物所获得的色原的特征相同。图9b显示了通过使用实施例6的稀释剂在COULTER COUNTERS-Plus IV上获得的血样的白细胞分布直方图,其中裂解试剂仅含有表面活性剂。该例子显示了当以这种替代方式使用时,有机配体与白细胞差别分析的相容性。
下列实施例是对本发明的说明,决不能解释为限制如在权利要求书中所定义的本发明的范围。可以理解:按照以上公开的发明,可以使用各种其它成分与比例。
实施例1
制备了下列组成的试剂。配方1a四唑 5.0g十四烷基三甲基溴化铵 15.0g蒸馏水调整至1升pH 2.77配方1b*** 10.0g十二烷基三甲基氯化铵(50%溶液) 35.0ml十四烷基三甲基溴化铵 3.5g蒸馏水调整至1升pH 6.19配方1c喹哪啶酸 5.0g十二烷基三甲基氯化铵(50%溶液) 50.0ml蒸馏水调整至1升pH 2.55配方1d蜜胺 5.0g十四烷基三甲基溴化铵 5.0g十二烷基三甲基氯化铵(50%溶液) 36.0ml蒸馏水调整至1升pH 4.55配方1e四唑 5.0gChemfac NB-104(由Chemax公司制造的复合磷酸酯) 30.0g蒸馏水调整至1升pH 7.11
用2500μl的ISOTONII稀释11.6μl的全血样品,然后将403μl的上述裂解试剂组合物之一与预先稀释的样品手工混合。立即在Beekman DU 7500分光光度计上测定样品的吸收光谱。图1a和1b显示了按照上述方法使配方1b和1c处理的血样的图谱。图2显示了从按照上述方法使用配方1a处理的血样获得的总共十二种图谱。在添加裂解试剂组合物之后以一小时的间隔获得从12秒-12小时的图谱。
实施例2
制备了下列组成的试剂。四唑 5.0g十二烷基三甲基氯化铵(50%溶液) 36.0ml十四烷基溴化铵 3.6g蒸馏水 1升pH 2.73
用2500μl的血液稀释剂稀释11.6μl的全血样品,然后将403μl的上述裂解试剂组合物与预先稀释的样品手工混合。立即在BeekmanDU 7500分光光度计上测定样品的吸收光谱。使用了五种商业的血液稀释剂用于血红蛋白测定,即COULTERISOTONIII、COULTERISOTONII、Technicon HTM***RBC DIL(Technicon仪器公司的商品)、标准磷酸缓冲盐水和标准氯化钠盐水。所形成的色原在大约540nm具有最大吸收峰,在大约565nm具有肩峰。当不同的稀释剂用于血红蛋白测定时,色原的最大吸收仅有轻微不同,即用ISOTONIII在540nm,ISOTONII、Technicon HTM***RBC DIL以及标准的磷酸缓冲盐水在539nm,标准的氯化钠盐水在538nm。在添加上述裂解试剂组合物之后,色原在8秒-大约35秒(取决于使用的血液稀释剂)后立即形成。图3显示了按照上述方法使用标准的磷酸缓冲盐水与ISOTONIII(作为稀释剂)获得的图谱。
实施例3
制备了下列组成的试剂。配方3a四唑 5.0g十四烷基三甲基溴化铵 15.0g蒸馏水调整至1升pH 12.06配方3b苯胺-2-磺酸 5.0g十四烷基三甲基溴化铵 10.0g十六烷基三甲基溴化铵 4.0g蒸馏水 1升pH 1.67配方3c喹哪啶酸 5.0g十二烷基三甲基氯化铵(50%溶液) 40.0ml蒸馏水 1升pH 2.58
将大约70个血样(其血红蛋白浓度为6-17g/dL,白细胞数目为1,000/μL-40,000/μL)在校准的COULTERSTKS仪器上在标准仪器设置下(除裂解试剂外,LYSE SIII diff由上述制剂代替)分析。对于每一种配方,大约一半样品是各种疾病的临床样品。在配方3a的情况下,70%样品是临床样品。图5显示了通过使用参考试剂(LYSE SIII diff)获得的血红蛋白浓度和白细胞数量(表示为以103/μL为单位的WBC)与在相同的仪器上使用配方3a获得的结果之间的相关性。图6显示了通过使用LYSE SIII diff获得的血红蛋白浓度和白细胞数量与在相同的仪器上使用配方3b获得的结果之间的相关性。
图5和6说明了在血红蛋白浓度和WBC测定上本发明的裂解试剂组合物和常用的含氰化物裂解试剂之间极好的线性相关性。
实施例4
制备了下列组成的试剂。
裂解试剂配方4a*** 10.0g十二烷基三甲基氯化铵(50%溶液) 35.0ml十四烷基三甲基溴化铵 3.5g蒸馏水调整至1升pH 6.39配方4b4,6-二羟基-1,3,5-三嗪-2-羧酸 5.0g钾盐十二烷基三甲基氯化铵(50%溶 35.0ml液)十四烷基三甲基溴化铵 3.5g蒸馏水调整至1升用HCl将pH调整至2.3稀释剂硫酸钠 9.7g氯化钠 4.0g蒸馏水调整至1升用1%NaOH将pH调整至7.14
将85个血样(其血红蛋白浓度为6-17g/dL,白细胞数目为1,000/μL-45,000/μL)在校准的COULTER COULTERS-Plus IV上在标准仪器设置下使用参考试剂LYSE SIII diff和ISOTONIII分析。然后在相同的仪器上再次分析相同的样品,只是裂解试剂LYSE SIIIdiff由上述裂解试剂组合物代替,ISOTONIII由上述稀释剂代替。图4显示了在COULTER COULTERS-Plus上获得的四个血样的白细胞亚群分布直方图。图4a和4b使用配方4a和上述稀释剂获得,其中图4a显示了正常血液的直方图,图4b显示了具有高单核细胞的血样的直方图。图4c和4d使用配方4b和ISOTONIII获得,其中图4c显示了正常血液的直方图,图4d显示了具有大于90%粒细胞的临床样品的直方图。图7a-7e显示了使用参考试剂获得的白细胞数量(以103/μL为单位的WBC,图7a)、淋巴细胞%(图7b)、单核细胞%(图7c)、粒细胞%(图7d)和血红蛋白浓度(图7e)与使用配方4a和上述稀释剂获得的结果之间的相关性。回归曲线的相关系数、斜率和截距说明了血红蛋白浓度、WBC、淋巴细胞%和粒细胞%极好的线性相关性,以及对单核细胞%的良好相关性。
实施例5
裂解试剂十二烷基三甲基氯化铵(50%溶液) 36.0ml十四烷基三甲基溴化铵 3.6g蒸馏水调整至1升pH 6.88稀释剂配方5a四唑 5g标准磷酸缓冲盐水 1升pH 3.86配方5b2-氨基-1,3,4-噻唑 5.0g硫酸钠 9.7g氯化钠 4.0g蒸馏水调整至1升pH 6.04
用2500μl的上述稀释剂之一稀释11.6μl的全血样品,然后将403μl的上述裂解试剂组合物与预先稀释的样品手工混合。立即在Beekman DU 7500分光光度计上测定样品的吸收光谱。图8a至8b显示了按照上述方法分别使用配方5a和5b处理的血样的图谱。
实施例6
裂解试剂十二烷基三甲基氯化铵(50%溶液) 36.0ml十四烷基三甲基溴化铵 3.6g蒸馏水调整至1升pH 6.88稀释剂*** 5.0g硫酸钠 9.7g氯化钠 4.0g蒸馏水调整1升pH 6.06
将10个血样在校准的COULTER COULTERS-Plus IV上使用上述的裂解试剂和稀释剂分析。图9a显示了在COULTER COULTERS-Plus上获得的血样的白细胞亚群分布直方图。这些样品也在分光计上按照实验5中描述的方法使用上述裂解试剂和稀释剂处理和测定。图9a显示了用于图9b的相同血样的光谱。光谱和白细胞亚群分布直方图与***用于裂解试剂组合物时获得的特征相同。
Claims (24)
1.一种无氰化物裂解试剂组合物,该组合物包含下列物质的水溶液:
(I)至少一种足以溶解红细胞并释放血红蛋白用于测定血红蛋白浓度的量的表面活性剂,该表面活性剂选自由下列物质组成的组:
其中R1是有10-18个碳原子的烷基、烯基或炔基;R2、R3和R4是有1-4个碳原子的烷基,X-是氯和溴阴离子;
其中n是7-12的整数,X-是阴离子基团;
(c)烷基磺酸、或烷基磺酸的碱金属盐;
(d)有机磷酸酯,或有机磷酸酯的碱金属盐;
(II)足以与血红蛋白形成稳定色原的量的有机配体,该有机配体选自由下列物质组成的组:
(a)***及其衍生物
(b)四唑及其衍生物
(c)4,6-二羟基-1,3,5-三嗪-2-羧酸的碱金属盐其中M是碱金属阳离子;(d)蜜胺(e)苯胺-2-磺酸(f)喹哪啶酸(g)2-氨基-1,3,4-噻二唑(h)三嗪及其衍生物其中R1、R2和R3是-H、-OH、-SH、-COOH以及三嗪的杂环衍生物;(i)尿唑(j)DL-2-哌啶酸(k)异烟酰胺(1)邻氨基苯甲腈(m)6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶(n)腺嘌呤(o)3-(2-噻吩基)丙烯酸(p)苯甲酸或苯甲酸的碱金属和铵盐其中R是-H、NH4 +和碱金属阳离子;(q)吡嗪及其衍生物
其中R1、R2 R3和R4是-H、-CN、-OH、-SH、-COOH、-CONH2;
该裂解试剂组合物的pH是1-13。
2.权利要求1的裂解试剂组合物,其中所说的表面活性剂包含具有大约2g/L至大约250g/L浓度的季铵盐。
3.权利要求1的裂解试剂组合物,其中所说的表面活性剂包含具有大约2g/L至大约130g/L浓度的吡啶鎓盐。
4.权利要求1的裂解试剂组合物,其中所说的表面活性剂包含具有大约8g/L至大约30g/L浓度的烷基磺酸或烷基磺酸的碱金属盐。
5.权利要求1的裂解试剂组合物,其中所说的表面活性剂包含具有大约15g/L至大约70g/L浓度的有机磷酸酯或机磷酸酯的碱金属盐。
6.权利要求1的裂解试剂组合物,其中所说的有机配体具有大约1g/L至大约30g/L的浓度。
8.权利要求7的裂解试剂组合物,其中所说的表面活性剂包含具有大约4g/L至大约150g/L浓度的季铵盐。
9.权利要求7的裂解试剂组合物,其中所说的表面活性剂包含具有大约2g/L至大约130g/L浓度的吡啶鎓盐。
10.权利要求7的裂解试剂组合物,其中所说的有机配体具有大约1g/L至大约30g/L的浓度。
11.权利要求7的无氰化物裂解试剂组合物,其中:
其中R1是具有10-18碳原子的烷基、烯基或炔基;R2、R3和R4是具有1-4碳原子的烷基,X-是氯和溴阴离子;所说的表面活性剂的量足以溶解红细胞并释放血红蛋白以测定血红蛋白浓度、保持白细胞亚群的核以用于白细胞的差别分析;和
(II)足量的与血红蛋白形成稳定色原的有机配体选自由下列物质组成的组:
(a)***及其衍生物
(c)4,6-二羟基-1,3,5-三嗪-2-羧酸的碱金属盐其中M是碱金属阳离子;
12.权利要求11的裂解试剂组合物,其中所说的季铵盐具有大约4g/L至大约50g/L的浓度。
13.权利要求11的裂解试剂组合物,其中所说的有机配体具有大约1g/L至大约30g/L的浓度。
14.一种使用权利要求1的无氰化物裂解试剂组合物测定血样的总血红蛋白浓度的方法,该方法包括:
(a)用血液稀释剂稀释血样;
(b)将稀释的血样与权利要求1的无氰化物裂解试剂组合物混合以裂解红细胞并形成稳定的血红蛋白色原;
(c)在预定的波长下测定形成的血红蛋白色原的吸光度;
(d)从所测定的血红蛋白色原的吸光度确定所述血样的血红蛋白浓度;
(e)报告所述血样的总血红蛋白浓度。
15.权利要求14的方法,其中所说血样的吸光度在大约510nm至大约560nm测定。
17.权利要求14的方法,其中:(I)表面活性剂是季铵盐,由下列分子结构表示:
其中R1是具有10-18碳原子的烷基、烯基或炔基;R2、R3和R4是具有1-4碳原子的烷基,X-是氯和溴阴离子;所说的表面活性剂的量足以溶解红细胞并释放血红蛋白以测定血红蛋白浓度、保持白细胞亚群的核以用于白细胞的差别分析;(II)足以与血红蛋白形成稳定的色原量的有机配体选自由下列物质组成的组:(a)***及其衍生物(b)蜜胺(c)4,6-二羟基-1,3,5-三嗪-2-羧酸的碱金属盐其中M是碱金属阳离子;(d)2-氨基-1,3,4-噻二唑(e)三嗪及其衍生物其中R1、R2和R3是-H、-OH、-SH、-COOH以及三嗪的杂环衍生物;(f)尿唑(g)DL-2-哌啶酸(h)异烟酰胺(i)吡嗪及其衍生物其中R1、R2、R3和R4是-H、-CN、-OH、-SH、-COOH、-CONH2;裂解试剂组合物的pH值是2-10,该方法还包括以下步骤:在自动血液分析仪中使用DC阻抗测定法对白细胞计数;按照群体分布直方图区别白细胞亚群;报告白细胞和白细胞亚群的数量。
18.一种用于血红蛋白测定和白细胞计数的血液稀释剂,它包含下列物质的水溶液:
(I)足以与血红蛋白形成色原并保持白细胞核的量的有机配体,该有机配体选自由下列物质组成的组:
(a)***及其衍生物
(b)四唑及其衍生物
(c)4,6-二羟基-1,3,5-三嗪-2-羧酸的碱金属盐其中M是碱金属阳离子;(d)蜜胺(e)苯胺-2-磺酸(f)喹哪啶酸(g)2-氨基-1,3,4-噻二唑(h)三嗪及其衍生物其中R1、R2和R3是-H、-OH、-SH、-COOH以及三嗪的杂环衍生物;(i)尿唑(j)DL-2-哌啶酸(k)异烟酰胺(l)邻氨基苯甲腈(m)6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶(n)腺嘌呤(o)3-(2-噻吩基)丙烯酸(p)苯甲酸或苯甲酸的碱金属和铵盐其中R是-H、NH4 +和碱金属阳离子;(q)吡嗪及其衍生物
其中R1、R2 R3和R4是-H、-CN、-OH、-SH、-COOH、-CONH2;和
(II)一种或几种调节重量渗克分子浓度至250-400mOsm的盐。
19.权利要求18的稀释剂,其中所说的有机配体具有大约0.5g/L至大约20g/L的浓度。
20.一种分析血液以确定血样中血红蛋白浓度的方法,该方法包括以下步骤:
(a)用权利要求18的血液稀释剂稀释血样;
(b)将稀释的血样与裂解试剂混合以裂解红细胞并形成稳定的血红蛋白色原;
(c)在预定的波长测定形成的血红蛋白色原的吸光度;
(d)从所测定的血红蛋白色原的吸光度确定所述血样的血红蛋白浓度;
(e)报告所述血样的总血红蛋白浓度。
21.一种分析血液以确定血样中白细胞数量的方法,该方法包括以下步骤:
(a)用权利要求18的血液稀释剂稀释血样;
(b)将所稀释的血样与裂解试剂混合以裂解红细胞并保持白细胞的核体积;
(c)使用DC阻抗测定法在自动血液分析仪中对白细胞计数;
(d)报告所说的血样中的白细胞的数量。
22.一种用于血红蛋白测定和区别计数白细胞亚群的方法,该方法包括以下步骤:
(1)用血液稀释剂组合物稀释血样,该血液稀释剂组合物包含下列物质的水溶液:
(I)足以与血红蛋白形成稳定色原的有机配体,该有机配体选自由下列物质组成的组:
(a)***及其衍生物(b)蜜胺(c)2-氨基-1,3,4-噻二唑(d)三嗪及其衍生物其中R1、R2和R3是-H、-OH、-SH、-COOH以及三嗪的杂环衍生物;(e)DL-2-哌啶酸(f)异烟酰胺(g)吡嗪及其衍生物
其中R1、R2 R3和R4是-H、-CN、-OH、-SH、-COOH、-CONH2;和
(II)一种或几种将重量渗克分子浓度调节至250-400mOsm的盐;
(2)将预先稀释的血样与裂解试剂混合以裂解红细胞并形成稳定的血红蛋白色原,并保持白细胞亚群的核体积;
(3)使用DC阻抗测定法在自动血液分析仪上对白细胞计数,并在形成的血红蛋白色原的预定波长下测定样品混合物的吸光度;
(4)从所测定的吸光度计算所述样品中的总血红蛋白浓度;
(5)按照群体分布直方图区别白细胞亚群;
(6)报告白细胞的数量以及白细胞亚群的数量。
23.权利要求22的方法,其中所说的白细胞被区别成包括淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的三个亚群。
24.权利要求22的方法,其中所说的有机配体具有大约0.5g/L至大约20g/L的浓度。
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