CN1238807A - 稳定的瞬时基因表达 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于提高真核细胞中的瞬时表达的方法和试剂。还提供了在实体瘤中用于延长瞬时表达的模型***，不需饲养细胞或与基层结合的胞外基质即可用于培养肝细胞的方法以及控制细胞代谢以减少细胞的葡萄糖消耗的方法。

Description

稳定的瞬时基因表达
本申请是美国专利申请08/833,747(申请日1997年4月11日)的部分后续申请，后者是美国临时申请60/030,109(申请日1996年11月1日)的部分后续申请。
发明领域
本发明涉及提高已导入培养真核细胞中之外源基因的瞬时表达的方法和试剂。
发明背景
将外源DNA导入真核宿主细胞有许多目的。例如，该技术可提供一种用于鉴定具体基因的遗传互补的方法，例如表达对于代谢途径至关重要的酶的基因可利用其在该途径中拯救缺陷细胞的能力而得到鉴定。另外，可导入外源基因以达到使受体细胞暴露于高剂量蛋白质的目的，所述蛋白质对于所述细胞是非正常天然的，例如将一种细胞毒性蛋白质导入恶性细胞中以达到杀死所述恶性细胞的目的。或者，可将外源基因导入宿主细胞以得到外源基因足够大量的蛋白质产物，从而可回收所述蛋白质以用于进一步研究或用作药物。此外，外源基因的导入是体基因治疗的一种有前途的方法。基因治疗的目的是通过给患者提供有效拷贝的丢失或缺陷基因来治愈天生遗传缺陷，或者为了达到治疗目的，暂时提供外源基因产物。一种体基因治疗方法是离体方法，其中从体内取出细胞，将转基因DNA***所述细胞，然后将所述细胞移回体内。在另一种方法中，通过被直接导入患者体内的外源DNA来靶向体内细胞。
通过各种方法可将外源基因导入活的真核细胞内。这些方法包括例如利用其中已连接了外源基因的病毒载体。通常，病毒载体仅靶向活跃***的细胞(例如造血干细胞)。用于导入外源DNA的另一种有用的方法是电穿孔，其中在存在DNA溶液的条件下，细胞对施用于其上的瞬时高压电脉冲作出反应而摄入DNA。将外源DNA导入细胞的其它常用方法包括脂转染，其中将DNA与脂质体相结合，所述脂质体是通过聚集形成膜结构的脂分子所形成的液体填充囊。DNA分子可以被包被在脂质体中或与脂质体膜相连。脂质体与受体细胞融合，从而成为将外源基因导入细胞的一条途径。尽管被广泛使用，但是脂染的一个缺陷是脂质体对活真核细胞有点毒性。其它常用的方法中，可以在应用于细胞前，将DNA与磷酸钙共沉淀，或者可以通过DEAE-葡聚糖将外源DNA导入，所述DEAE-葡聚糖这种聚合物与DNA形成静电复合物，该复合物通过胞吞作用进入细胞内部(Kormis and wu,SeminarsLiv.Dis.,15:257-267(1995))。可列举的转染方法很多(参见例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning,2d ed.,(1989)，该文献引入本文作为参考；Gorman,C.,向哺乳动物细胞高效转移基因(“High EfficiencyGene Transfer into Mammalian Cells”),Chap.6,pp.143-190，来自《(DNA克隆Ⅱ-实用方法》，IRL Press,Oxford(1985),Ed.Glover,D.M.；Wynshaw-Boris et al.,生物技术(BioTechniques),4:104-119(1986)；Chang,P.L.(Ed)，体细胞基因治疗(Somatic Gene Therapy)，CRC Press,1995；和《真核细胞的阳离子脂试剂转染指南》(Guide toEukaryotic Transfection with Cationic Lipid Reagents),LifeTechnologies(Gibco-BRL))。
“转染”是一个泛泛的术语，常用于描述将外源基因(“转基因”)导入活宿主细胞的方法。该方法的另一术语是“转导”，当指病毒载体介导的基因转移时，更常用后一术语。表达或掺入外源DNA的宿主细胞被称为“转化细胞”，将其变为转化状态的方法被称为“转化”或“转导”。不同类型的细胞对转化的敏感性不同，而且通过调整各种参数如pH，培养基类型，DNA量，二氧化碳浓度或导入DNA的方法可优化用于导入外源DNA的方法(参见例如Chen and Okayama，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.),7:2745-2752(1987))。
当用磷酸钙或DEAE-葡聚糖法将外源DNA导入细胞时，已观察到大部分细胞开始摄入DNA，但在所述DNA被导入后前几天内，只有部分细胞表达所述DNA(参见，例如Gorman(1985))。转染DNA的早期表达通常是短寿的，并被称为“瞬时表达”。仍有小部分受体细胞(0.1-0.001％)通过将转染的DNA共价连入宿主基因组内而稳定地掺入所述DNA(参见，例如Wynshaw-Boris et al.,(1986))。当转染的外源DNA以支持所述外源基因表达的方式共价***宿主DNA中后，所得的细胞就是所谓“稳定转化的”。共价整合水平低的一个可能的原因是只有在活性DNA的合成时方可进行外源DNA整合。因此，人们认为只有在细胞周期的S期，细胞才对稳定转化敏感。
在稳定转化的细胞中，每次细胞***时，外源基因都会被复制，由所述外源基因编码的蛋白质会通过与转录内源细胞染色体基因相同的酶促机制得到表达。但是，在开始的瞬时表达之后，转染培养物中只有小部分细胞通常含有完整拷贝的转染基因。因此，在这种培养物中表达的外源基因的量是很小的，甚至可能检测不出。因此，稳定的转化方法通常依赖于转染后的筛选步骤以便给在加入外源DNA后产生的少数稳定转化细胞提供选择生长优势。
可在各种试验条件下选择性分离稳定转化细胞的纯培养物以便得到整合了外源基因并继续表达所述外源基因的细胞系。为了达到这一目的，在导入编码所需蛋白质的DNA的同时，必须将一选择性基因导入宿主细胞，所述选择性基因通常是赋予药物抗性或编码产色蛋白质的基因。适用于该目的的报道基因的实例包括细菌氯霉素乙酰转移酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、细菌β-半乳糖苷酶等基因(参见例如Alam and Cook，分析生物化学，188:245-254(1990))。如果使用药物抗性标记，必须通过长期暴露于相关药物来筛选药物抗性细胞，以便使稳定转化的细胞在培养物中占大部分。或者，通过它们表达能够将产色底物转变成有色物质的共转染基因可以鉴定含整合DNA的细胞，所述有色物质使得可鉴定并人工克隆单个稳定转化的细胞。在某些情况下，所需基因本身可赋予稳定转化的细胞以选择性性状，但这种情况很少见。在任何情况下，稳定转化细胞系的产生和分离都要花一至三个月的时间才能完成(Wynshaw-Boris et al.,(1986))。
与稳定转化相比，转染DNA的瞬时表达不依赖于外源DNA整合至宿主细胞染色体中。尽管人们认为加至细胞中的大部分DNA被迅速运输到核内，但在一些***中，在不存在任何可检测整合的情况下，可在转染后达80小时内检测到表达(参见例如Gorman(1985)；Wynshaw-Boris et al.,(1986))。在检测瞬时表达前不需要筛选步骤。但是，通常摄入外源DNA中仅有约1-10％的细胞从被转染的外源基因转录mRNA(参见，例如Gorman等，核酸研究(Nucl.Ac.Res.),11:7631-7648(1983))。尽管在瞬时转染的细胞中，大量转染的DNA未被掺入到宿主DNA中，但在约0.001-1％的细胞中确实掺入了所述DNA(Alamand Cook(1990))。在转染后即进行观察的外源基因表达图中，据信这小部分稳定转染的细胞没有起显著或有用的作用。
没有筛选步骤，外源基因的表达迅速从转染细胞的培养物中消失。通常，在培养细胞中的瞬时表达在约48小时时达到峰值，而且只在24-80小时内可检测到(Gorman(1985)；Wynshaw-Boris etal.,(1986))。大家普遍认为由转染细胞摄入的大部分DNA迅速被核酸酶分解或通过细胞***而被稀释(参见，例如Gorman(1985)；用阳离子试剂的真核细胞转染指南，Life Technologies)。
由于瞬时表达不需要靶细胞正在进行活性***，因此，可在没有正常***的最终分化的细胞中进行瞬时表达，尽管这些细胞的转染敏感性有显著差异。例如裸DNA在被直接注射至小鼠骨骼肌后，可以得到表达(Wolff等，科学，247，1465-1468(1990))。在其它研究中，裸DNA被用作疫苗(Cohen,J.,科学，259,1691-1692(1993))。
许多研究都集中于在体内用脂质体将外源DNA传递至肝细胞(参见，例如Wu and Wu，生物化学杂志，263:14621-14624(1988)；Chow etal.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,248:506-13(1989)；Wu et al.,生物化学杂志，264:16985-16987(1989)；Kaneda et al.,生物化学杂志，264:12126-12129(1989a)；Kaneda et al.,科学，243:375-378(1989b)；Wilson et al.,生物化学杂志，267:963-967(1992)；Wilson et al.,生物化学杂志，267:11483-11489(1992b)；Chowdhury et al.,生物化学杂志，268:11265-11271(1993)；Perales et al.,美国国家科学院院报，91:4086-4090(1994)；Kormis and Wu(1995))。一种将外源DNA导向体内特定组织的方法是受体介导的脂质体传递(见Kormis and Wu的综述(1995))。在将该方法应用于肝时，Wu和他的同事们利用了肝细胞表面存在的脱唾液酸糖蛋白受体而将注射的脂质体导向肝。一系列的出版物中描述了该传递***(Wu and Wu(1988)；Wu et al.,(1989)；Wilsonet al.,(1992a)；Wilson et al.(1992b)；Chowdhury et al.(1993)；Peraleset al.(1994))。将脱唾液酸糖蛋白与DNA一起包装到脂质体中，所述DNA已与多赖氨酸形成静电复合物。当最初的努力成功后，该小组试图通过在受体大鼠中进行部分肝切除来使外源DNA的稳定整合最大化。因为再生的肝细胞中，S期细胞的比例比正常肝中要高，因此推测这种趋性会增加可整合外源DNA的肝细胞的比例。部分肝切除后，在转染后长达11周的时间内，在血液中均可检测到转基因蛋白质(Wu etal.(1989))。起初，这些研究人员相信注射的DNA已经被整合，但以后的试验表明未检测到整合的DNA，这说明保留的外源DNA存在于质膜/内体部分(Wilson等(1992b)；Chowdhury等(1993))。这一惊人的观察结果表明部分肝切除通过与DNA合成本身无关的一种机制而使得转基因DNA得以保持。
另一小组也使用直接将DNA注射至肝的导向策略(Kaneda等(1989a)；Kaneda等(1989b))。该小组将转基因DNA与在核中正常发现的蛋白质即非组蛋白染色体蛋白质一起包装至脂质体中。他们观察到，注射的小泡被运输至肝细胞核中，在注射后，达7或8天检测到转基因表达。但是，该DNA未整合到肝细胞染色体中。其他人已报道了将磷酸钙-DNA沉淀直接注射至肝、脾或腹膜中后，成功地在体内表达了外源DNA(参见Kaneda等(1989a))。
已经表明许多试剂均可提高体外稳定转化效率。一个研究小组报道，在磷酸钙介导的转染过程中，通过控制培养基的pH，稳定转化效率可高达50％(Chen and Okayama(1987))。
另一种据报道可提高转染DNA表达的试剂是丁酸或其钠盐(Gorman等(1983))。由于其改变染色质结构的已知能力，Gorman等(1983)试验了丁酸对通过转染而导入细胞之外源基因的表达的影响。在这些研究中，先转染细胞，然后将细胞与丁酸钠接触12小时。在接下来的5天监测瞬时表达，他们观察到表达转染基因的受体细胞百分比增加了2-4倍。他们还注意到，当转染构建体包含一SV40增强子元件时，外源基因的表达水平增加了25-100倍。对丁酸盐存在的条件下转染的其它培养物筛选稳定转化体时，他们观察到产生稳定转化体的转染细胞百分比比对照细胞有显著增加。但是，Palermo等(生物技术杂志，19:35-48(1991))发现，无论在转染步骤中是否存在丁酸盐，丁酸盐均可稳定转化体中转基因的表达增加。事实上，许多报道都记载了丁酸盐体外诱导特定蛋白质合成或提高细胞分化的能力。(Boffa等，生物化学杂志，256:9612-9621(1981)；Kruh，分子细胞生物化学42:65-82(1982)；Chabanas等，分子生物学杂志183:141-151(1985)；Parker，生物化学杂志，261:2786-2790(1986)；Kooistra等，Biochem.J.,247:605-612(1987)；Kaneko等，癌症研究(Canc.Res.)50:3101-3105(1990)；Nathan等，实验细胞研究，190:76-84(1990)；Palermo，生物技术杂志，19:35-48(1991)；Kosaka等，实验细胞研究，192:46-51(1991)和Oh等，生物技术生物工程(Biotechnol.Bioeng.),42:601-610(1993))。用于基因诱导的丁酸盐的最佳浓度随细胞类型的不同而不同，而且使细胞毒作用最小的适宜浓度范围必须根据每种靶细胞的种类依经验来确定(参见例如Gorman(1985)；Parker等(1986)；Oh等(1993))。
丁酸(或丁酸盐)在活细胞中的作用不限于修饰染色体蛋白质。这种化合物的一个最显著的特性是其可逆性地抑制培养细胞生长的能力(参见例如Boffa等(1981)，据报道与丁酸盐接触的大部分细胞停滞在G1/S期交界处)。此外，丁酸盐可提高干扰素的抗肿瘤作用(Kruh(1982))。这种抗肿瘤活性是特别令人感兴趣的，因为通过将0.5ml 50mM丁酸盐溶液直接注射到活小鼠中就可产生这种活性。
对于外源基因的表达来说，利用瞬时表达比稳定转化有许多优点。首先，利用瞬时表达，可以迅速地分析相对大量的构建体。另外，它也可成为传递治疗蛋白质的选用方法，只在疾病过程中需要在体内存在所述蛋白质。此外，瞬时表达避免了因外源DNA***一重要细胞基因中而可能引起的诱变或细胞死亡危险。另外，可以在未无限增殖化的原代细胞系中完成瞬时表达，而稳定转化体只能从在培养中长期存活并***的细胞建立。但是，肝切除模型是个例外，目前已知的瞬时表达法的主要缺陷一直是外源基因的表达相对短寿，并且转染试剂(包括纯化DNA本身)对活细胞可能有毒性。对于大部分实用目的来说，肝切除或其它外科切除法是非常剧烈的方法。因此，稳定瞬时表达的其它方法可扩大该技术的潜在应用范围。
本发明综述
本发明提供了可显著提高导入到宿主真核细胞中之外源DNA的表达的方法和试剂。本文所述试剂增加了瞬时表达的数量和持续时间。已证实含这些试剂的化学物质对于正在生长的细胞和非***细胞的静止培养物均是有效的。这种情况表明用这些化合物所观察到的转基因表达的增加并不涉及外源DNA整合至受体宿主细胞的基因组中。
此外，还表明本发明化合物降低了培养细胞对培养基中葡萄糖的消耗，因此，使细胞依赖于其它碳源例如类脂或蛋白质来获得能量。这些细胞的氨产量增加，因此表明蛋白质被用作为一种能源。其对葡萄糖消耗的影响提示这些化合物的主要作用位点是线粒体。这一观察结果意味着在体外和体内，线粒体在非整合外源DNA的持续表达中起重要作用。另外，存在这些化合物的条件下生长的细胞被诱导表达和分泌内源性的碱性磷酸酶活性。
本发明还提供了经各种传递***导入靶细胞的外源基因的长期瞬时表达，所述传递***包括但不限于阳离子类脂(即脂质体)和各种合成聚合物如树状聚合物(dendrimer)(也称为“starburst”聚合物)。许多本发明的化合物都在外源DNA被导入细胞后影响外源基因的表达，因此其作用与导入DNA的方法无关。其中一些化合物在外源DNA导入后的前4天对于提高表达程度特别有效，因此可能可提高摄入细胞的初始DNA量或提高表达DNA之细胞的比例，或者两者均得到提高。
本发明化合物有疏水部分和酸性部分，后者可以是盐或酯的形式。此外，它们是生物相容性的，即当以适当浓度用于细胞时，50％以上的细胞仍能存活。
本发明方法包括将化合物分成“A型”制剂和“B型”制剂，前者主要在将外源DNA加至细胞后的前4天提高瞬时表达程度，后者主要在外源DNA进入细胞后稳定瞬时表达。因此，名称“A型”和“B型”反映了所述化合物加至培养物中的时间。通过在转染步骤前、过程中和/或之后(瞬时表达第一期)用A型化合物处理细胞，然后在导入外源DNA后数小时或数天(例如12-60小时)内再加入B型化合物，使其与细胞接触(瞬时表达第二期)，即可得到最佳表达。最好在瞬时表达的两个期间内培养基中均含有A型化合物。本发明还提供了用于确定单个化合物和两种或多种化合物的制剂在瞬时表达两期间之用途效力的检测方法。
本发明化合物使活细胞产生显著的代谢变化，从而使其能够将外源DNA的瞬时表达保持比以前观察到的长很多的时间。此外，在加入这些化学物质后，培养的细胞明显减少了葡萄糖消耗，同时提高了其对不同能源如蛋白质、可能还有类脂的利用。
在其它实施方案中，本发明提供了在不存在饲养细胞并且不需要用蛋白质性的或其它促粘附分子预包被细胞培养基层的条件下培养肝细胞的方法。
附图描述
在参考下列详细描述并考虑附图后，本发明的前述方面和许多伴随优点将更容易认识和理解，其中：
图1表明与本发明的数种不同化合物接触的细胞的细胞生长曲线。图1图示说明了在实施例4和表7中描述的一部分平板的细胞生长量。图1中***框的数对应于表7所列的平板数；
图2图示说明一些化合物的细胞毒性，其试验结果列于表7。图2中***框的数对应于表7所列的平板数；和
图3图示说明实施例6的试验结果。这些试验涉及存在可延长瞬时表达时间的各种化合物的条件下，在类似肝细胞的分化的猪PICM-193BT细胞中的瞬时表达。
图4图示说明在实施例8中所述的试验过程中每天收获的样品中测量的β-半乳糖苷酶的量，并说明存在稳定瞬时表达的化合物条件下，在生物反应器装置中培养的转染细胞内转基因表达的长期稳定性(即32天)。
图5A-5C图示说明在实施例8所描述的试验过程内，每天取样的培养基中的氨、葡萄糖和乳酸盐浓度。图5A说明每种样品中测量的氨浓度；图5B说明每种样品中测量的葡萄糖浓度；图5C说明每种样品中测量的乳酸盐浓度。
优选实施方案的详述定义：
转染：为了达到下列公开目的，“转染”指将外源DNA导入受体细胞中的任何方法，包括脂质体介导的方法，病毒载体，磷酸钙-DNA共沉淀，DEAE-葡聚糖，裸DNA，存在starburst聚合物条件下与蛋白质复合的DNA转染，或其它将DNA导入受体细胞的方法。
外源DNA/转基因DNA：为在受体真核细胞中表达而被适当修饰的遗传物质，通常但并非必须源自受体细胞以外的生物体。转基因DNA通常含有生物活性蛋白或蛋白质结构域的编码区。“适当修饰”指转基因DNA与确保外源基因在宿主细胞中有效转录的真核启动子和任何其它调节序列有效相连。所述DNA通常是环状，并含有多肽编码区，该编码区与转录及所得mRNA的随后翻译所需之调节信号有效相连。这种信号包括结合RNA聚合酶的启动子、增强子、转录终止信号、核糖体结合位点、翻译起始和终止信号，poly(A)加入信号等。所述增强子可以是组织特异性的。
β-半乳糖苷酶(β-gal)：一种能够将无色底物转变成容易检测的有色产物的细菌酶。在下列实施例中，将该基因用作一种代表性外源基因以说明本发明的效率。
本发明提供了用于提高外源基因在真核细胞中之表达的方法和试剂。已表明该方法在人结肠癌细胞、小鼠黑素瘤细胞、猪原代肝细胞和在类似于分化的肝细胞的猪细胞系中是有效的。该方法首先包括将编码蛋白质的外源DNA分子以能够在细胞中表达的形式导入细胞中。
通过任何适宜的方法可将外源DNA导入细胞，所述方法包括但不限于脂染，电穿孔，与磷酸钙-DNA共沉淀物温育，与DEAE-葡聚糖保温，将DNA与病毒载体相连等。衍生于反转录病毒或腺病毒的载体可用于将外源DNA导入真核宿主细胞。如果需要，含外源DNA的质粒或病毒可提供位于启动子和***位点之间的核苷酸序列，或者位于***位点后的核苷酸序列，以便由载体提供的核苷酸序列编码的一个或多个氨基酸与由所述外源DNA编码的蛋白质融合。这种融合序列可提供指导所需翻译后修饰的肽，例如用于分泌的信号肽，或者用于连接碳水化合物部分的位点。
本发明提供用于提高外源基因在细胞中瞬时表达的方法和试剂。在将外源DNA导入细胞前、过程中或者之后，将细胞与下述一种或多种化合物接触，这样，外源DNA的表达与不存在这些化合物时转染的细胞相比有相当的提高。“提高瞬时表达”在本文中指当使用所述方法时，在转染后的前几天内，与对照相比，转基因表达量得到提高，或者与对照相比瞬时表达持续时间延长，或这两种效果兼而有之。在本发明方法中，将导入外源DNA的细胞与可提高初始DNA摄入或表达效率或者可在外源DNA进入细胞后延长其有效半衰期的化学试剂接触。单个化合物有可能提高初始表达效率，并且也可能延长瞬时表达的持续时间。在时间意义上，本文所用术语“外源DNA的有效半衰期”指由外源DNA编码的蛋白质在细胞中可检测到的时间长度。当使用常规转染方法，即不使用公开方法的下列所述化合物而进行转染时，瞬时表达通常在外源DNA被导入细胞后的3-4天内降至不可检测的水平。但是，用本发明方法，通常在转染后14天、而且已在转染后32天观察到易检测水平的表达。在用本发明方法处理的转染细胞中，转染后32天还检测到与被转染的外源DNA同源的DNA和RNA。用本发明方法，通常瞬时表达在约2-3天内达到峰值，然后跌至约初始水平的三分之一，此后仍能稳定数天至数星期。
可用于本发明方法的试剂包括下文全面描述的大量化合物。“试剂”可由一种化合物组成，或者是两种或多种化合物的组合。此外，所述试剂可包括在转染过程早期加入的一种或多种化合物，以及在外源DNA进入细胞后加入的一种或多种其它化合物。这些瞬时表达增强剂可在外源DNA导入前、过程中和之后加入。当在导入DNA后才将试剂加入细胞时，通常该试剂与细胞维持接触至少24小时或更长。
通常，可在本发明中用作试剂的化合物包括至少一个疏水部分和至少一个酸部分。酸部分也可以是疏水的和有机的。对于某些这种特定化合物而言，已将酸部分修饰为盐或酯。在一实施方案中，所述化合物是由通式R1-C(=O)-OR2表示的羧酸衍生物，在另一实施方案中，所述化合物是由通式R7-SO2-OR8表示的磺酸衍生物。
适宜的羧酸衍生物(即R1-C(=O)-OR2)包括天然氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸)，其非天然光学异构体，和某些氨基酸衍生物(例如3-甲基-L-组氨酸、α-酮戊二酸、β-丙氨酸、肌肽、瓜氨酸、肌酸、叶酸、谷胱甘肽、马尿酸、高丝氨酸、N-氨甲酰天冬氨酸、N-甲酰-L-甲硫氨酸和鸟氨酸)。
就氨基酸的一般羧酸衍生物分子式R1-C(=O)-OR2而言，R1是CHNH2R3，其中R3是天然氨基酸的侧链。可用于本发明方法的其它氨基酸衍生物包括还含有烷基取代基和带其它官能团的烷基取代基的氨基酸。这些氨基酸由上述羧酸衍生物分子式表示，其中R1是-CHNH2(CH2)nR5，其中n=1-7,R5选自CH3、OH、CONH2、C6H4OH和CONHNH2。或者R1是-(CH2)nCHNH2CO2H(其中n=1-8)，或-CH(CO2H)NHCONH2或R1是-C5H4N(即烟酸和衍生物)。
除氨基酸外，可用于本发明方法的羧酸衍生物包括烷基、芳香基及取代的烷基和芳香基羧酸衍生物。优选的烷基和取代烷基的羧酸衍生物由上述通式表示，其中R1是-(CH2)nR6，其中n=1-9,R6选自吲哚基、NCH3C(=NH)NH2、SCH3、NH2、CH3、CO2H、CONH2和NHC(=NH)NH2。优选的芳香基羧酸衍生物包括苯甲酸和其衍生物。苯甲酸衍生物由上述分子式表示，其中R1是-C6H4R4，其中R4选自H、CH3、(CH2)nCH3、NH2、COCH3、CO(CH2)nCH3、C(CH3)3、CH(CH3)2、(CH2)nCH(CH3)2、(CH2)nCOCH3、OCH3和O(CH2)nCH3，其中n=1-3。已发现支链常常比直链更有效。
在本发明中有用的羧酸衍生物包括羧酸(即R2是H)；羧酸酯(如R2是CH3和(CH2)nCH3，其中n=1-8)，所述羧酸酯包括带有其它官能团如醚和酮基的酯(例如R2是(CH2)xO(CH2)yCH3和(CH2)xCO(CH2)yCH3，其中x+y=2-7)；羧酸盐包括金属盐(例如锂、钠、钾、钙和镁)和相对低分子量的阳离子(例如铵)。
由通式R7-SO2-OR8表示的适宜磺酸衍生物包括烷基、芳香基、或取代的烷基或芳香基磺酸衍生物(即R7是烷基、芳香基、或者取代烷基或芳香基)。优选地，磺酸衍生物是低级烷基(即直链或支链C1-C5烷基)磺酸酯，更优选地氨基取代的低级烷基磺酸酯，例如牛磺酸。优选芳香基磺酸衍生物是苯磺酸衍生物，更优选氨基取代的苯磺酸，例如3-氨基苯磺酸。可用于本发明的磺酸衍生物包括磺酸(即R8是H)和磺酸盐，所述磺酸盐包括金属盐(例如R8是锂、钠、钾、钙或镁)和相对低分子量的有机阳离子(如R8是铵离子)。
在另一实施方案中，在本发明方法中可用作试剂的化合物包括磺化的氨基多糖。优选所述多糖是磺化的N-乙酰化氨基多糖。适宜的多糖通常含有约4-200个糖残基。
优选的磺化的N-乙酰化氨基多糖包括软骨素-6-硫酸和磺化瓜尔聚糖(guarans)。瓜尔聚糖是从瓜尔豆种子的胚乳中分离的，是含有与甘露聚糖骨架相连的α-1,6-连接的D-半乳糖残基的高分子量β-1,4 D-半乳甘露聚糖(例如高达约1,200,000道尔顿)。适宜的瓜尔聚糖包括通常称为羟丙基瓜尔聚糖的2-羟丙基醚衍生物。
可用于本发明方法的其它化合物包括肾上腺素、辅酶B12和甲基钴胺素。
迄今为止认为特别有效的磺化氨基多糖的例子是软骨素-6-硫酸(C型硫酸软骨素)，多阴离子粘多糖。硫酸软骨素是在全身的软骨和软***中发现的天然粘多糖。C型硫酸软骨素是在分子量、重复二糖的N-乙酰半乳糖胺残基的磺化程度以及硫酸化与未硫酸化重复单位的相对分布方面有变化的聚合分子。分子量约4000道尔顿的软骨素-6-硫酸特别有效。商业上的C型软骨素-6-硫酸制品通常含有比例不同的A型硫酸软骨素，即软骨素-4-硫酸。主要含C型硫酸软骨素的制品对于稳定瞬时表达是非常有效的，但主要含这种聚合物A型形式的制品是无效的。因此，在给定聚合物制品中，占据重复二糖的N-乙酰半乳糖胺残基的4-硫酸酯与6-硫酸酯取代位点的相对量对于本发明方法中聚合物的活性是非常重要的，因为只有6-硫酸酯形式在提高瞬时表达方面显示有活性。
在提高瞬时表达方面有效的化合物有下列所需的共同特征：
1．当以对提高瞬时表达有效的浓度范围加至培养物中的细胞时，几乎或没有细胞毒性。对于磺化的氨基多糖，该范围为约0.01-0.5mM。对于在提高瞬时表达方面有效的其余化合物，该范围在约1-15mM之间。这些最佳量不包括已经作为细胞培养基组分存在的这些物质(如特定氨基酸)的量。根据该检测，本文将没有细胞毒性的化合物定义为“生物相容性的”。为了达到本发明的目的，可将细胞毒性物质定义为在给定的浓度，与所述物质连续接触，SW480细胞的8天静止培养物在转染后4天内活细胞数减少＞50％，其中在8天的时间结束时，没有细胞的净增加。但是，应理解不同类型的细胞对不同化合物的敏感性不同。因此，虽然可以用SW480细胞作为确定化合物生物相容性浓度的便利工具，但必须要靠经验来调整用SW480细胞确定的浓度以便使与其它类型细胞的生物相容性达到最佳。在实施例4中将更详细地描述测定细胞毒性的实验。
2．酸性官能团总是存在(如羧酸、磺酸等)并可对其进行修饰以降低细胞毒性。优选的修饰是形成酯和盐(包括以有机阳离子为基础形成的盐)，因为在化合物进入靶细胞后，盐和酯键很容易被代谢过程裂解。在优选的实施方案中，化合物水溶液的pH为4.5-9.0。
3．酸基团与相对疏水的有机基团相连。对于磺化多糖以外的化合物，所述分子的该部分优选是非极性和疏水的。同样，磺化多糖通过存在相对疏水的官能团(例如在2-取代位置上的软骨素-6-硫酸的N-乙酰基)而使其天然亲水特征得到修饰。已证实对本发明有效的许多化合物均含有有机和疏水性的酸基团。
4．一些最有效的试剂(例如苯甲酸和苯甲酸钠的50/50混合物(苯甲酸盐缓冲液)，和软骨素-6-硫酸)具有抗氧化和自由基清除特性(例如参见Merck目录)。
为了方便，下文将除磺化氨基多糖以外的化合物称为“Ⅰ类”制剂，将磺化氨基多糖称为“Ⅱ类”制剂。在本发明的优选实施方案中，在外源DNA导入细胞前和过程中，将细胞与选自Ⅰ类的化合物接触，然后在外源DNA导入细胞后，再将细胞与选自Ⅱ类的化合物接触。无论是在转染步骤前、过程中还是之后加入本发明化合物，它们均是有效的。
本发明提供了可用于延长培养细胞中的瞬时表达的方法，所述细胞包括原代培养物，已建立的细胞系，分化细胞的稳定培养物，与生长因子接触而维持的正常细胞系，以及转化细胞，如从各种肿瘤建立的培养物，包括杂交瘤细胞和SW480P3人结肠癌细胞系(ATCC#CCL228；下文称为“SW480细胞”)。
本发明方法还可用于将外源DNA导入体内细胞。可通过各种便利的方法施用所述化合物，这些方法包括口服、局部施用，通过灌注或通过注射施用。如果需使宿主与化合物的接触限制在欲接受外源DNA的组织内，则可通过定位注射如直接注射至实体瘤，或者通过将蛋白质掺入脂质体(所述蛋白质将使脂质体导向特异性组织)中来导入所述化合物。注射化合物或化合物组合的同时或之后接着在相同位点注射用于传递外源DNA的载体。或者，用可以使得在靶位点缓慢释放化合物的载体来施用所述化合物，例如通过惰性固体载体的溶解。
本发明方法包括在存在上述化合物的条件下，回收由导入细胞中的转基因DNA表达的蛋白质。可用任何便利方法如提取转染的细胞或者通过提取细胞生长的培养基来收集蛋白质。如果需要，可利用提供信号肽的载体来表达转基因蛋白质，所述信号肽指导转基因蛋白质分泌至培养基中。还可在数天的过程中检测分泌的蛋白质以确定所产生蛋白质的相对量或绝对量，由此提供评价转染方法中各变量的有效性的方法。可检测粗细胞提取物以分析收集的蛋白质的酶促或其它生物活性，或者在完成蛋白质活性的功能检测前，用标准方法进一步纯化所述蛋白质。如果在体内表达转基因，则可从宿主的体液如奶或者其它身体组织中收集所述蛋白质。用于特定蛋白质的纯化方法取决于所述蛋白质的物理特性，如其大小、形状、疏水性、稳定性等。另外，还可用物理方法如凝胶电泳、等电聚焦或通过色谱方法如高压液相色谱等检测或定量测定收集的蛋白质。
本发明方法可在培养的真核细胞或瞬时表达的哺乳动物宿主中迅速生产被表达的转染基因的毫克量蛋白质产物。在转染真核细胞中生产蛋白质比细菌表达***优越，原因是真核细胞中的表达可支持对于许多蛋白质的生物活性必需的翻译后修饰。此外，用真核宿主细胞代替原核宿主细胞，可避免不得不从转基因蛋白质的最终制品中除去可能有毒的细菌蛋白。
本发明方法提供了利用真核宿主细胞得到商业有用量的生物活性蛋白质(如生长因子、激素、抗生素等)的方法，而不需要建立含稳定整合之外源DNA的永久细胞系，可用这些方法迅速得到用于检测其药物特性的生物物质。
将细胞与选自本发明Ⅱ类的化合物接触可提高细胞粘附和细胞-细胞接触和联系，因此，这些化合物的施用提供了一条提高这些细胞-细胞相互作用的途径。因此，本发明包括在存在已加至培养基中的磺化氨基多糖的条件下培养细胞来提高细胞与培养基层的粘附，由此促进培养物中细胞的寿命的方法。例如在具有分化肝细胞之特征的细胞系培养物中，软骨素-6-硫酸对于促进其长期生长是有效的。正常地讲，除非提供饲养细胞或首先用促进肝细胞粘附的物质涂覆培养基层，否则肝细胞将不能在培养物中存活(参见，例如Sidhu and Omiecinski，药物遗传学(Pharmacogenetics),5:24-36(1995))。
当将本发明试剂与培养细胞接触时，细胞表现出改变的代谢过程，包括葡萄糖消耗和乳酸生产减少，以及氨生产增加。因此，本发明可用于控制细胞代谢以便所述细胞利用其它碳源如蛋白质或类脂。另外，这些试剂诱导细胞表达升高水平的内源性碱性磷酸酶活性。Ⅰ类和Ⅱ类化合物均可用于此目的。特别适用于控制细胞的能源利用的试剂是苯甲酸，4-乙基苯甲酸，软骨素-6-硫酸和苯甲酸盐缓冲液的混合物，其中苯甲酸盐缓冲液是苯甲酸和苯甲酸钠的等摩尔混合物。本发明方法可用于体外或体内控制细胞代谢，例如治疗哺乳动物肥胖症。
由于其疏水性，所述方法的化合物能够跨过高度疏水的线粒体外膜。由于这些试剂可影响与线粒体有关的代谢过程，即葡萄糖代谢，因此，观察到的表达水平提高可能是因线粒体内的外源DNA转录而引起的。由于外源DNA是环状的，因此，它甚至可以通过常用于复制环状线粒体DNA的机制来复制，由此提高可用于表达转基因的模板量。
本发明提供了这些化合物作为提高体外和体内瞬时表达的试剂的用途。当在体外或体内使用时，最好在外源DNA导入前、过程中和之后使用所述化合物。从细胞培养基中除去这些化合物后，它们对长期表达的影响逐渐消失，并恢复细胞以前的行为。当在体内使用时，可将化合物作为引发剂注射至受体组织或者与转基因DNA溶液静脉内混合，然后在通过注射导入外源基因后施用，或者可作为食物添加剂施用。例如，可通过直接注射化合物，然后晚些注射DNA，再晚些通过口服补充相同或不同的化合物而引发肿瘤。
在其它实施方案中，本发明提供了在细胞培养物***中使外源基因的瞬时表达稳定的方法，所述细胞培养物***在刺激实体瘤的半固体基质中维持细胞，即在生物反应器中生长的细胞。可以用由该模型肿瘤***发展的方法将表达抗肿瘤化合物(如IL-2)的基因直接转染到实体瘤中。
本发明试剂提高转基因表达的机制尚不确定。它们可能是直接稳定转染DNA或其转录物，或者甚至可能是使表达的蛋白质稳定，尽管后一种可能性很小。另外，Ⅰ类和Ⅱ类化合物似乎是通过不同机制起作用而提高瞬时表达，因为两类化合物同时使用往往比单独使用更有效(参见例如实施例6)。在本发明优选的实施方案中，在转染前、过程中和之后，将细胞与一种或多种Ⅰ类化合物接触，然后在转染步骤后与一种Ⅱ类化合物即磺化多糖接触。
已定义了下列参数以便于表征可用作延长瞬时表达时间之试剂的化合物。这些参数被称为“X”因子、“G”因子和“K”因子。
1．X因子： X = 100 - ( A × 100 ) C , 其中“A”是在选定的时间内在对照转染细胞中表达的蛋白质量，“C”是加入化合物的细胞中生产的蛋白质量。
该因子反映了加至转染细胞中的化合物在转染后前4天提高稳定化瞬时表达的程度。对于在稳定瞬时表达中有活性的化合物，X值将＞1。例如，如果在存在化合物的条件下双倍表达，则X=50。优选化合物X＞10，最佳化合物的X＞25。该因子为比较转染后前4天内培养基中存在本发明化合物中观察到的外源基因表达量及无该化合物的对照培养物中观察到的表达量提供了一条途径。因此，X因子与存在和不存在所述化合物条件下观察到的表达量之间的比例有关。当所用试剂是一种以上化合物的混合物时，按类似方法计算X。
通过将培养细胞等分液中每天的测量值加和，可测量累积蛋白质表达，即“A”和“C”的值。
2．G因子。G因子仅在计算时间上不同于X因子。为了计算G因子，从第4-7天或第4-17天测量表达的蛋白质量，其中第0天是将外源DNA加至细胞中的那天。下标表示哪段时间是测量基础。因此，“G7”表明在第4-7天进行测量，“G14”表示在第4-14天进行测量。如X因子，其中“A”和“C”与就X因子进行的定义相同。
用X和G因子二者表征化合物是非常有用的，因为有些有低或负X值的化合物可能有高或正G因子值。G7或G14值高的化合物对于在DNA进入细胞后，即在瞬时表达第二期向培养基加入一种或多种化合物的瞬时表达特别有用。优选地化合物的G＞0。更优选地，G＞10，最佳G＞25。
3．K因子。K因子是对照转染细胞和与本发明化合物接触的细胞中外源DNA表达下降的速率常数比例。根据下列等式确定K：
Figure A9718018600282
其中“k(DNA)”是作为时间函数而表达蛋白质的转基因DNA表达下降的一级速率常数，即： - d ( DNA ) dt = k ( DNA ) 。其等价于 log ( DNA ) = kt 2.303 + log ( DNA ) 。为了方便，使用术语“d(DNA)”，它反映了转染DNA有效浓度的变化，尽管所观察到的表达变化也可能是其它参数而非仅是细胞中外源DNA浓度的函数。因此，可将对照转染培养物的一级反应速率表示为k(DNA)=d(DNA)/dt=或log(DNA)=kt/2.303+log(DNA)0。因此，当log(DNA)对时间作图时，Y轴上的截距或log(DNA)0反映了被表达的转染DNA的初始浓度。此外，该线所斜率等于-k(DNA)/2.303。
k(DNA)值可通过计算机程序得到，该程序将外源蛋白质浓度的log值对时间作图。该程序确定了所得曲线对应于蛋白质生产减少期间的那部分的斜率。通常，蛋白质合成的最佳量发生在转染后48小时期间内。此后，表达速率以一定的速度下降，通过在转染前、过程中和/或之后将细胞与本发明各种化合物接触而控制这一速度。因此，在该下降期计算所述斜率得到k(DNA)和K值，可达到比较不同化合物效力的目的。特别有效的本发明化合物制剂在表达速率开始下降后有一个速率升高。
因此，K因子反映了外源基因进入细胞内后化合物对该外源基因表达之稳定性的影响，而不是反映这些化合物对初始DNA摄入的影响。K因子非常重要，因为与改善瞬时表达的其它已知方法相比，本发明的优点主要源于提供了用于在转染步骤后稳定瞬时表达的方法，而传统方法是努力提高DNA摄入效率。然而，本发明的一些化合物在转染后最初4天内有最大效率，因此表明它们可能是通过诱导细胞吸收更大量的转染DNA来发挥作用。在外源DNA进行细胞内后，这种化合物可能还可以很好地延长基因表达的有效半衰期。正的K值表明一种化合物或化合物组合物可有效稳定转染后的外源DNA表达，因此，本发明优选的化合物和制剂的K值＞0。
在不存在本发明化合物的条件下，转基因DNA表达的下降即k(DNA)是一级反应。将本发明化合物加到培养物中后，与对照培养物相比，外源DNA表达动力学显著改变。存在这些化合物的情况下，随外源蛋白质生产的长时间持续进行，k(DNA)变得更大。对于一些最优选制剂(即K值大于40的那些制剂)，这种改变非常显著，以致常规一级动力学不能适当地表示结果。因此，似乎优选化合物/制剂将动力学变成假一级反应或二级反应。该结果用常规理论是无法预测的。
在实施例中讨论了可用于本发明方法的许多化合物和制剂，并将它们列在表1、8、9和10中，其中列出了X、G和K值。
本发明还提供了以SW480细胞系为基础用于筛选化学试剂以确定它们是否能够稳定瞬时表达的方法。对于该方法，用于筛选的候选化合物是生物相容的，并含有至少一个疏水部分和至少一个酸部分。在第0天导入外源DNA前、过程中和/或之后，将试验化合物或化合物组加到SW480细胞培养物中，所述外源DNA如果在细胞中表达，则编码一种能够被检测的蛋白质。在转染步骤后一段时间里，收集培养物样品并确定其中外源蛋白质的量。培养物中积累表达的蛋白质量通过每天样品中测量数量的加和来确定，将这些总和在试验培养物(即与试验化合物接触的那些培养物，和不与试验化合物接触的平行对照培养物)之间进行比较。在第0-4天或者第4-7天或第4-14天之间，每天收集用于蛋白质测量的样品，利用测得的蛋白质量分别按上述公式确定X、G7或G14值。如果由此确定的X、G7或G14值＞0，可以得出结论：所述试剂能够提高瞬时表达。优选X、G7或G14值＞10，最佳是＞25。可将这样鉴定的化合物用于上述方法中以提高外源基因的瞬时表达。在此筛选试验中，可用其它细胞系代替SW480细胞。
优选的产物制剂选自有最高(或最大正值)X、G和K因子值的那些化合物和化合物组合。此外，本发明的各种化合物可一起使用以便使转基因表达的提高达到最大程度。例如，在该方法过程中，可用不同的化合物在不同时间处理同一培养物。不同制剂需要不同的特性组合。两种完全不同类型的优选制剂是：
A型制剂：这些是有高X值的化合物。这些化合物在转染步骤即后，立即有较高活性，因此可能通过增加DNA摄入效率而在瞬时表达的第一期发挥作用。因此，A型化合物或制剂的上述半log图的log(DNA)0或Y截距大于不含这些化合物的对照培养物的值。推测这种化合物会影响DNA摄入效率，因为Y截距是外源DNA导入细胞后即刻细胞内活性外源DNA浓度的大致量度。试验的许多化合物的X因子均有正值(参见表1)。因此，本发明不仅提供了用于稳定转染DNA的化合物，还提供了似乎可提高细胞初始DNA摄入的化合物。许多处理的化合物有高G7或G14或K值以及高X值，因此，在瞬时表达的两个期间内都是有效的(例如参见表1、3、8和9)。
B型制剂：这一类中有用的化合物需要具备高G和K因子值。高X值是理想的，但不是必需的。K值大于零是能够稳定转染DNA之化合物的特征。高度优选的B型稳定剂的K＞1，更优选K＞10，并且G7或G14＞25。此外，在确认特定试剂是A型或B型制剂中的高度优选化合物前，需要进行重复试验并且重复试验中的X和/或G因子＞25。
对于体外和体内应用来说，通过A型和B型制剂的利用可使瞬时表达达到最佳。例如，优选的方法首先涉及在转染前，通过将细胞与X＞25的一种或多种A型化合物接触而引发细胞。转染期间，并且最好是在整个瞬时表达期间，A型化合物仍旧存在。转染步骤后，在瞬时表达的剩余期间，将细胞与G7或G14＞25的一种或多种B型化合物接触。在优选的实施方案中，A型化合物是苯甲酸盐缓冲液，B型化合物是软骨素-6-硫酸。在另一优选的实施方案中，A型化合物是苯甲酸和4-乙基苯甲酸，B型化合物是苯甲酸盐缓冲液和软骨素-6-硫酸。在另一优选的实施方案中，A型化合物是苯甲酸盐缓冲液和谷氨酸，B型化合物是软骨素-6-硫酸。
对于体外应用，在转染步骤前，将细胞在存在A型制剂条件下培养数小时如约20-24小时可达到最佳结果。应注意，以食物(或口服应用)形式用A型制剂引发是一种现实的体内方案。已知可有效提高瞬时感染的许多化合物都是无毒的(见下文表1)。转染后，最好将培养细胞在A型制剂的存在下保持至少48小时。如果需要，可以在约＞90％的细胞摄入外源DNA后，即将DNA加至培养物中数天后，除去A型制剂，或者在瞬时表达的第二期间，所述制剂仍与细胞接触。B型制剂最好是在转基因表达高峰时(这通常是在转染后24-48小时发生)加入细胞中。最好在试验过程中，定期用含B型制剂的培养基重复喂养细胞。
显然，本发明方法可在体内使用(即动物研究和临床操作中)。具体地讲，在与实体瘤有关的基因治疗中，可将A型制剂与DNA传递载体同时施用，其中在施用该DNA前，通过注射A型制剂来“致敏”受体组织。然后再施用B型制剂。
各化合物的有益浓度范围可能不同，而且有益浓度范围的上限可能受细胞毒性作用的限制。将DNA/A型制剂直接注射至肿瘤中可以只涉及常规方法，因为各种药物载体是本领域熟知的。直接注射可避免使非靶组织与转染试剂接触。可将胆碱、脂质体制剂或控释制剂与B型制剂联用以延长对转染的肿瘤细胞的定位作用。另外，可将B型制剂作为食物补充剂(或添加剂)长时间提供给患者服用。可根据因子如毒性等，同时使用注射和食物供给方法以达到最佳效力。该方法的优点是可将高剂量细胞毒性蛋白质传递至肿瘤而不会损伤其它身体组织。用这种策略，可诱导肿瘤细胞本身在数天内连续生产该细胞毒性蛋白，由此提供了比简单地将一定剂量蛋白质本身注射至肿瘤中远为有效的传递方法。如果目的蛋白质外部施用时不易跨过质膜，或者治疗蛋白在进入靶细胞内后半衰期短，则这种方法可能会特别有用。
在本发明的其它说明中，可将选自Ⅰ类的化合物与选自Ⅱ类的化合物如软骨素-6-硫酸共价或非共价相连。
实施例1瞬时表达提高的筛选方法对照转染的方法
用下列方法提供瞬时表达：
将SW480P3(ATCC#CCL228)人结肠癌细胞(通常1×106个细胞)铺在6孔组织培养平板的孔中。所铺孔的号数反映了转染后试验将进行的天数。每孔含1ml来自30ml储备液的完全培养基，所述储备液含有：26.4ml RPMI组织培养基，4mM L-谷氨酰胺，3.0ml胎牛血清和10μg/ml庆大霉素。铺板后，在含10％二氧化碳的二氧化碳培养箱中，于37℃将细胞培养24小时，在此过程中细胞附着于平板上。
预培养24小时后，除去RPMI，然后加入900μL OPTI-MEM(Gibco)培养基来完成转染步骤，所述培养基中含2μg在巨细胞病毒启动子控制下表达β-半乳糖苷酶基因的VR1412 DNA(Vical,Inc.,SanDiego,CA)和8μg阳离子类脂(1,2-二肉豆蔻基氧丙基-3-二甲基-羟乙基铵溴化物(例如“DMRIE/DOPE”)与二油基磷脂酰基乙醇胺等摩尔比例混合)的混合物，类脂：DNA摩尔比为0.99∶1。应注意常规的瞬时转染法使用10微克DNA/106细胞，但本文所述方法使用较少的DNA以便减少对细胞的毒性。然后将平板在37℃保温4小时。
保温4小时后，将100微升失活的胎牛血清(以停止转染)和12.0微升50mg/ml庆大霉素加至各孔中。将外源DNA加至孔中后24小时，对每个孔中的所有细胞进行胰蛋白酶消化并计数，然后将每孔中的2×104个细胞裂解并在液氮中贮存直至以后用于确定β-半乳糖苷酶浓度。此时，向每个未收集的孔中加入1ml前述OPTI-MEM培养基(不加L-谷氨酰胺)。为了进行剩余的试验，以24小时的间隔收集一个孔，而每隔48小时向未收集的孔加入1ml OPTI-MEM(不含L-谷氨酰胺，但含有试验化合物)。检测化合物的方法：
为了检测各种化合物在提高瞬时表达方面的效力，通过将候选化合物加至培养基中来使上述用于对照培养物的方法得到改进。剩下的操作仍与用于对照培养物的方法相同。
保留来自2×104个细胞的裂解样品以进行β-半乳糖苷酶检测，每天都杀死每孔的剩余细胞。将溶解产物冷冻并保持在液氮中直到可进行β-半乳糖苷酶检测。用氯酚红为基础的氯酚红方法检测融解样品的β-半乳糖苷酶，其中用紫外/可见光分光光度计在580nm定量分析有色产物。
许多化合物的该检测结果列于下文表1。表1中给出了在试验中确定的X值，其中用实施例中所述的方法培养培养的SW480人结肠癌细胞，并用细菌β-半乳糖苷酶基因进行转染。
为了进行比较，表1包括在测定中测量为负值的化合物和测量为正值的大量化合物。表1中的pH值是在水溶液中确定的，所述水溶液是通过用去离子水稀释用培养基制备的储备液而制备的。观察到pH为约3(黑色素)-10(肾上腺素)的化合物对于延长瞬时表达持续时间是有效的。优选的pH范围是约pH4.5-9.0。
如果X、G或K的计算值大于0，则认为试验结果为正。
                          表1
 Ⅰ类
化合物 mM pH(H2O) X因子 G14因子 K因子
3-[双(2-羟乙基氨基)]-2-羟基-1-丙烷磺酸 1 6.81 -55 -10
 3-氨基苯磺酸 1 3.8 -19 32
3-甲基-L-组氨酸 4 7.39 -15 55
 4-氨基苯甲酸 1 7.67 52,52 96*,-12 1,1
4-丁基苯甲酸 1 5.94 -26 65 9
4-乙基苯甲酸 1 6 42,46 43,63 1,2
4-己基苯甲酸 1 6.13 -68 -26
4-辛基苯甲酸 1 7.45 -2314 -665
4-戊基苯甲酸 1 1 -96 -88
α-氨基正丁酸 4 7.58 -.19 35 1
α酮戊二酸 1 3.75 7.28 53
肾上腺素 1 10.29 49 68
天冬氨酸 4 5.75 40,-13 -45,-17*
β-丙氨酸 4 8.38 .2 33 1
α-丙氨酸 4 7.27 31 35
苯甲酸盐/肝素 2.5,0.1 5.51 -3 22
苯甲酸盐缓冲液(等摩尔苯甲酸/苯甲酸钠) 4 4.74 29,17,3,2,-16,30 41*,58,27,38,44,41* 2,2,1,1,1,3*
苯甲酸 1 4.21 -3.1 28 1
 Ⅰ类
化合物 mM pH(H2O) X因子 G14因子 K因子
苯甲酸和4-乙基苯甲酸 1,1 5.82 41 80 2
BES 1 6.64 77,57 32,-24 1,1
丁酸缓冲液 2.5 6.12 -169,-275 81*,69* -9,8
肌肽 4 8.32 -8 35
瓜氨酸 1 7.71 39 46 1
辅酶B12 N/A N/A -17 51
肌酸 4 7.54 .34 28
半胱氨酸 4 7.24 -35 -50
二碘酪氨酸 4 7.23 -48 -8*
4-乙酰基苯甲酸乙酯 1 7.59 49 42 1
 4-乙酰基丁酸乙酯 1 5.98 51 58 1
叶酸 1 6 -1.4 24
谷氨酸 1 4.2 -17,8 -14*,31* 2
谷氨酸与苯甲酸盐缓冲液 1 4.91 44,45,3,44,42,53,44 69,65,27,69,76,10,69* 1,1,1,2,6*
戊二酸 1 3.85 22 -77
谷胱甘肽 2 3.58 2 34 1
甘氨酸 4 7.27 -.34 40 2
马尿酸 2 6.46 2 33 1
组氨酸 4 6.75 26,-30 54*,6 1,1
高丝氨酸 1 7.4 77 39
异亮氨酸 4 6.99 -119 30
 Ⅰ类
化合物 mM pH(H2O) X因子 G14因子 K因子
L-精氨酸 4 8.66 15,54 11*,57
 L-谷氨酰胺 4 7.14 -13 23
 L-苏氨酸 4 8.14 28 40 1
亮氨酸 4 7.88 -13 32
L-赖氨酸 4 8.34 -39,18 -10,9*
黑色素 0.1 3.45 -155,0 -453,-173
甲基钴胺素 N/A N/A 1 25
甲硫氨酸 1 7.41 2 36 0
 N-(4-氨基苄基)-L-谷氨酸二乙酯 1 6.44 -35 8
 N-氨甲酰基-DI-天冬氨酸 4 4.19 26 115
 N-甲酰基-L-甲硫氨酸 1 4.34 26 63
烟酸 1 6.91 12 87 1
鸟氨酸 1 7.37 16 28
苯丙氨酸 4 6.97 -12 53 3
脯氨酸 4 7.71 -22 21
S-氨甲酰基-L-半胱氨酸 1 6.52 -76 -74
丝氨酸 1 7.4 43 104 1
苯甲酸钠 1 8.14 -15 -6 1
牛磺酸 4 7.88 -20 34 2
色氨酸 4 6.25 55 67 2
酪氨酸 4 7.88 36 52 2
 Ⅰ类
化合物 mM pH(H2O) X因子 G14因子 K因子，r
缬氨酸 4 8.12 -18 40 2
*用星号表示的G值表示是G7值，而不带星号的G值是G14值。
应注意，表1化合物中X＞1的那些是在转染后前数天能够增加瞬时表达程度的化合物。这种化合物与其它化合物相比，可使每细胞摄入更大数量的DNA，或者有更高比例的转染细胞表达外源DNA。这些化合物还可能提高早期转录或表达。以前未报道这些化合物对转染有这种效果。令人惊奇的是，黑色素显著抑制瞬时表达。
除表1中所列的化合物外，还检测了其它一些化合物，发现能够延长瞬时表达的化合物包括叔丁基苯甲酸、乙氧基苯甲酸、异丙基苯甲酸、甲氧基苯甲酸、异丁基苯甲酸、软骨素-6-硫酸(C型)和瓜尔聚糖，特别是羟丙基瓜尔聚糖。实施例2一些化合物能提高瞬时表达并减少糖消耗
完成其它试验以便进一步表征有所改进的瞬时表达方法。为了进行这些试验，用实施例1中所述的瞬时表达方法检测表2中所述的5种培养条件。使用6-孔平板，用SW480细胞接种足够量的孔以便能够按如下所述收集来自每个孔的细胞。表2
平板号 化合物 浓度 培养基类型
1A 含庆大霉素的对照 -- 见上文
1B 不含庆大霉素的对照 见上文 见上文
2 苯甲酸盐缓冲液L-谷氨酰胺 2.5mM4mM 预转染转染转染后添加
3 硫酸软骨素(C型)苯甲酸盐缓冲液L-谷氨酰胺 0.1mM2.5mM4 mM 预转染转染转染后添加
4 谷氨酸苯甲酸盐缓冲液L-谷氨酰胺 4 mM2.5mM4mM 预转染转染转染后添加
每天收集一孔细胞以便计数，将从每孔收集的2×104个细胞裂解，保留裂解产物以进行β-半乳糖苷酶试验。将来自这些孔的上清液冷冻并以后用于评估pH，葡萄糖消耗，乳酸和氨产量。如下文表3所示，平板2、3和4中所用化合物的各种组合在增加和保持基因表达方面有差异。在该试验中，平板4总的表现最好，其X和G因子值高。该试验中只有平板3含有Ⅱ类化合物，清楚地显示转染效力降低(即X因子小)，但对于维持表达很有前途(即G因子相对较高)。
                          表3
                         平板号
    1A     1B    2     3     4
参数 庆大霉素   无庆大霉素
因子 未测     9    30     -26     44
因子 未测     32    41     51     69
所耗时间     ％X-gal(蓝色)
24小时 60-70   85-90  80-90   85-95   95-100
48小时 40-50     60  50-60     70     80
72小时 40-50     60  60-70     60   70-75
96小时 10-20     30  50-60   55-60     30
120小时 10-20   20-30  30-40   20-30     30
144小时 10-15   10-20    20     25   20-30
168小时 10-15    2-5    10     10     2-5
细胞培养试验通常有20％的标准偏差。由于这一原因，如果X和G因子小于25，就不认为比对照有显著的提高。
在上述试验方案中包括了对照试验(平板1A和1B，表3)以确定在培养基中存在庆大霉素(一种抗生素)是否影响上述试验的结果。从对照平板1A和1B的结果比较中可以看出，庆大霉素对蛋白质的生产显然有些抑制作用。在含庆大霉素的对照即平板1A中，X和G因子值比不含庆大霉素的对照平板1B的值稍低，就说明了这一点。此外，来自β-半乳糖苷酶试验的结果也支持这一结论。
分析了这些细胞样品中的葡萄糖消耗和乳酸产量以及氨产量。根据Kodak提供的并在临床实验室中常规用于测量血清葡萄糖和乳酸水平的标准方法，用Kodak Ektachem DT60Ⅱ分析仪测量葡萄糖和乳酸。通过将10微升每种试验样品加至塑料载玻片上用薄膜覆盖的孔中来完成分析(Ektachem DT载玻片(GLU)或Ektachem DT载玻片)，所述孔中含测量葡萄糖或乳酸所需的所有试剂。为了测量葡萄糖，该分析依据的是葡萄糖氧化酶催化的葡萄糖与分子氧反应，以及产生强度与该样品中葡萄糖量成正比的红染料的第二反应。用于测量乳酸的载玻片同样提供了能够产生红染料的酶和底物，所产生的红染料量与载玻片上乳酸的量成正比。将载玻片放在Ektachem DT60Ⅱ分析仪中，在该分析仪中通过反射光分光光度计读出红色值。按类似的方法，用Ektachem DT载玻片(NH3)，依据NH3与溴酚蓝反应产生可用相同仪器检测的蓝色染料的反应完成氨分析。
在表4中列出了作为时间函数的葡萄糖和乳酸浓度的测量结果。表4令人惊奇地表明含庆大霉素的对照(平板1A)比同样含有庆大霉素的任一试验样品消耗了更多的葡萄糖并产生了更多的乳酸(注意表4中未包括不含庆大霉素的对照，即平板1B)。表4的数据清楚地表明，相对于对照而言，接受了表2所述化合物的细胞在代谢方面有复杂的变化，表现在外源基因的表达水平显著提高。
除表4中的数据以外，还观察到苯甲酸与4-乙基苯甲酸的组合也可以减少葡萄糖消耗。在此完成一试验，其中在转染步骤前和过程中，将A型制剂首先施用于SW480细胞，然后在将DNA导入细胞后一天，加入B型制剂。A型制剂由含有1mM苯甲酸，1mM4-乙基苯甲酸盐和4mM L-谷氨酰胺的OPTI-MEM组成，而B型制剂除含这些组分外，还含有0.1mM C型软骨素-6-硫酸。庆大霉素存在于整个试验过程中。在该试验中，6-孔平板中培养的细胞在转染后14天内，或者反应器中培养的细胞在转染后32天内，基本上未观察到葡萄糖消耗，而此期间，细胞继续从转染的DNA表达蛋白质。
                   表4
平板号 天数  葡萄糖浓度(mg/dL) 乳酸盐浓度(mmo/L)
1A．   0     218     1.5
  2     180     6.0
  4     141     9.6
  6     38     ＞12.0
 2．   0     209     1.8
  2     188     5.0
  4     175     6.5
  6     ---     ---
 3．   0     213     1.6
  2     195     4.3
  4     185     6.1
  6     ---     ---
 4．   0     209     1.6
  2     199     3.8
  4     181     5.7
  6     140     9.5
以前已报道Ⅰ类化合物中的丁酸加至培养的肝细胞中时可补偿葡萄糖饥饿对翻译后糖基化作用的影响，这很有可能是通过增加细胞内葡萄糖池而达到的(Morrow等，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)112:115-125(1983))。但是，Morrow等人未检测在其培养物中的葡萄糖消耗，因此，没有观察到本发明注意到的在存在Ⅰ类化合物条件下发生的代谢变化。所观察到的葡萄糖代谢变化是本发明的一个很显著的特征。该特征不仅和提高与基因治疗方法有关的化合物效力有关(由本实施例可明显看出)，而且表明，这些化合物选择性和无毒地重指导细胞代谢过程的能力可能有广泛的治疗应用，包括例如在肥胖症的治疗中调节脂肪/脂类代谢。实施例3反应器中的瞬时表达提高
在Genespan原型保温箱内的高效中空纤维灌注原型生物反应器(下文称为“HPBr”装置)中完成4个基于脂染的基因转染试验。该装置主要包括无菌室，在该室中有两组中空纤维通过。培养基在一组纤维内连续循环，而细胞生长所需的气体(如氧气和二氧化碳)通过第二组纤维。所述纤维由多孔材料组成，气体和营养物质可以一个方向通过该纤维，而由室内生长细胞所产生的废物分子以另一方向通过。在该装置中生长的细胞可以是悬浮状态，或者可附着于这两组中孔纤维的外表面。
HPBr装置的一个有用特征是可以通过旋转管在其中穿过的室来搅拌细胞。当所述室以一个方向绕纵轴旋转120度，然后以另一方向旋转120度时，即构成一个旋转“循环”。或者，可以不用旋转而在“静止”条件下培养培养物。
采用HPBr装置，使用SW480细胞完成一系列试验。每个试验都含一个平行对照，其中细胞铺在常规6-孔平板上，并放在常规10％二氧化碳培养箱中。用上述实施例1用于对照平板的方法培养和转染所述对照6-孔平板，而将下列试验方法用于反应器装置。HPBr装置试验
在HPBr装置中，用类似于实施例1中用于6-孔平板的方法，完成4个β-半乳糖苷酶报道基因转染试验，但要成比例地调整各种试剂的体积以适应反应器中细胞的大体积和大数量。由于细胞培养的灌注模式(即连续给料，这是HPBr的特征)，因此不需要手工定期补料。
生物反应器实验的过程在下列方面与实施例1所述的过程有所不同。用磷酸缓冲盐溶液预溶涨足够的Cytodex1微载体(即由交联的葡聚糖组成的微球，所述葡聚糖在表面带有带正电荷的季铵官能团以便细胞粘附；Sigma,St.Louis,MO)，然后导入HPBr的侧区。每10个细胞约使用1个微载体珠。在试验开始时，将1×107个活SW480细胞和1×106个珠一起注射到装置中。当细胞接种至装置中时，使用的是表5中所述的培养基。表5注明了在该研究中所用的旋转参数(“cpm”指每分钟的转数)。将839ml培养基加到每个生物反应器中。在2、3和4号(“号”指不同的试验)的OPTI-MEM转染培养基中含有0.1mM的C型硫酸软骨素。转染步骤后，换掉再循环的OPTI-MEM培养基(即管内的培养基)，但含细胞的室(即毛细管外空间)中的培养基不用替换。替换培养基中包含了表5所列的化合物。在将细胞接种至生物反应器中后24小时，将含外源DNA的脂质体加至毛细管外空间。该空间与试管内体积(839ml)相比体积较小(17ml)。
表5
号 类型 条件 培养基组成
1 平板 二氧化碳保温箱(对照) OPTI-MEM(见实施例1)
2 HPBr 30 cpm OPTI-MEM；10％胎牛血清；4mM L-谷氨酰胺；10g/ml庆大霉素；2.5mM苯甲酸盐缓冲液；0.1mM硫酸软骨素(C型)(也存在于OPTI-MEM转染培养基中)
3 HPBr 静止 与第2号相同
4 HPBr 前48小时为30cpm；然后静止 与第2号相同
5 HPBr 静止(对照) OPTI-MEM
每天从每个生物反应器的细胞室中取细胞和上清液样品(约1.5ml)，然后补充相同体积的新鲜培养基。确定细胞计数和存活力，将2×104个活细胞裂解，然后保存起来以用于用实施例1所述的分光光度法确定β-半乳糖苷酶。
表6含有将4个灌注装置试验(第2-5号)与平板对照(第1号)进行比较所得的数据。在表6中，标有“曲线下面积”的栏指每天收集的细胞等份中产生的β-半乳糖苷酶的量作为时间函数在2星期的试验期间绘制的曲线下的面积。因此，“曲线下面积”栏中的值用绝对单位即cm2表示，反映了在试验过程中，以每个细胞为基础而产生的β-半乳糖苷酶的总量。表6中的最后一栏，表示每一号即每个平板或生物反应器，在第13天剩余的所有活细胞中β-半乳糖苷酶的总量。
显然，可以用灌注生物反应器进行大规模基因转染并收集转染的细胞，这对于治疗应用(例如产生稳定或瞬时表达外源基因的大量T淋巴细胞和造血干细胞以用于诸如体细胞治疗中)是有用的。该***还可用作人工器官以便简单并真实地研究外源基因的长期表达；用这种方法，等于在完整的体内器官中进行活检。
                  表6
在平板和HPBr装置中2周的β-半乳糖苷酶生产号    实验      总细胞数   存活率    曲线下面    每2×104细   在13天，   在13天，
  条件      (13天)       ％      积(cm2)   胞表达的β-     ng/ml    以活细胞
                                            半乳糖苷酶   β-Gal/2×  为基础的
                                            占对照的％    104细胞    总表达1   平板对照   6.5×106   97％       70                      0.084        332    30cpm     1×107     86％       84         20％         0.120        653    静止      2.3×107   42％       105        50％         0.602        3644 30cpm/48hr   7.3×107   77％       180        157％        0.357        1254
然后静止5 生物反应器对 29.3×107  34％       76         9％          0.040        249
照(静止)
表6中的数据表明在该装置的使用中，控制生物反应器的旋转参数为提高转染效率和保持瞬时表达提供了一种独特和方便的方法。
应注意到，C型硫酸软骨素(一种多阴离子碳水化合物)的存在可以使转染不受阻碍地进行，而且还使基因表达有实质性的提高。检测的其它一些多阴离子碳水化合物可有效地阻断转染过程。这些碳水化合物包括A型硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸肝素、肝素、羧甲基纤维素和N-羧甲基脱乙酰壳多糖N,S-硫酸(表1)。因此，细胞对C型硫酸软骨素的耐受并非通常情况下细胞对培养基中多糖耐受性的特征。
如上文所讨论的，可将微球加到所述室中以便给细胞提供附着位点。已观察到，例如，当将无限增殖的小鼠黑素瘤细胞(即ATCC#B16-F0)导入含微球的室中时，这些微球作为细胞积累大群的“种子”。还观察到，可转染这些细胞群，然后这些细胞群瞬时表达转染的DNA。通过从所述室内的培养基中取样，可很容易从这种培养物中得到样品。取样通过将注射器内的新鲜培养液注射到细胞群上来完成，从而使足够用于取样的一定量细胞悬浮在培养基中。细胞团类似实体瘤，它们为研究可有效地将治疗蛋白质传递至体内肿瘤的治疗方法提供了模型***。
用使细胞团在生物反应器内大量有效生长的相同方法，将黑素瘤细胞皮下注射到小鼠体内，使其在注射位点发展成肿瘤，然后将含β-半乳糖苷酶载体DNA的脂质体直接导入肿瘤以便瞬时表达β-半乳糖苷酶。对于表达β-半乳糖苷酶有效的方法估计对于其它蛋白质也是有效的，进行类似的试验以评估将各种蛋白质例如编码治疗蛋白质的DNA直接传递至体内实体细胞团中的效果。
本发明方法所用的生物反应器***对于产生为表达外源蛋白质而进行遗传修饰的大量细胞也是有用的。为了达到治疗目的，可将这种细胞施用给患者，此后它们可以只在治疗方案进行过程中保持活性状态。因此，本发明提供了一种独特的基因治疗形式，其中通过限制导入基因与稳定化物质的接触，即通过施用瞬时表达治疗蛋白质的细胞，然后只在所期望的转基因持续表达期间施用增强化合物，可以很容易关闭导入基因。
最后，应注意，硫酸软骨素(C型)的使用是很重要的，因为尽管有相对高的旋转速度，但它能使锚定依赖性细胞很好地附着于微载体上。该结果表明，Ⅱ类化合物可用于使培养细胞固定于固体基层。已经提出，硫酸软骨素可以作为一种化合物在装置中提供细胞附着表面，以控制细胞在表面上的生长方式(US5593814)。但是，US5593814的方法与本发明方法相比，需要硫酸软骨素与固体基层结合，而不是加至培养基中。其他人还报道了将硫酸软骨素与其它化合物结合以便促进细胞在培养物或体内的附着。(US5593814；US4458678；US4418691；US4711780；US5545722)。实施例4细胞毒性试验
按照实施例1所述的方法，用6-孔平板检测许多化合物，以确定其细胞毒性和其促进SW480细胞中外源基因摄入和表达能力之间的关系。除非另外说明，除对照外，所有平板均含4mM L-谷氨酰胺和庆大霉素以阻碍细菌生长。
按下列方法完成细胞毒性试验。在存在需检测其细胞毒性的化合物的条件下，在第0天，将SW480细胞(约1×106个细胞/孔)铺在6-孔培养皿中的1ml RPMI中。按实施例1所述，接种各孔后24小时，除去RPMI培养基，然后将含外源DNA的脂质体加至1ml OPTI-MEM培养基中的培养物中。转染培养基还含有其细胞毒性待测的化合物。也包括对照平板，对照平板与试验平板相同，只是前者在培养基中不含试验化合物。在“静止”条件，即不振荡、旋转平板，或者搅拌的条件下，培养试验和对照培养物。每天从一个试验孔和一个对照孔中收集细胞并用台盼蓝染色评估存活力，连续进行8天。在与脂质体DNA接触的对照培养物中，在转染后前4天细胞数相当稳定或者仅仅是稍微有所增加，然后在8天末每孔细胞增加至约1×107个。前4天内对照培养物的生长阻滞可能是由于脂质体DNA本身有中等程度的细胞毒性作用。如果在导入外源DNA后4天内，活细胞数减少＞50％，而且在8天末，细胞没有净增加，就认为检测的化合物在所述试验浓度有“细胞毒性”。
用该试验方法，在许多情况下，可以控制单个化合物或化合物制剂的浓度以达到SW480细胞能很好耐受又能提高这些细胞中瞬时表达水平的浓度。也检测了其它细胞类型对本发明一些化合物的耐受能力。例如检测了人黑素瘤细胞、小鼠黑素瘤细胞和COS-7细胞(ATCCCRL1651)对加至表9中6号平板的制剂的耐受能力。这些细胞对试验化合物的敏感性有些不同，但鉴定了可被所有这些细胞类型耐受的一组浓度，即在这些浓度，按照上述检测方法，这些化合物没有细胞毒性。
发现能提高瞬时表达的磺化氨基多糖都能够支持正常细胞生长，即它们的毒性不大，细胞能耐受。与表7中各种化合物和制剂接触的细胞的细胞生长和细胞毒性曲线列于图1和2，其中每个图描述的号对应于表7中的平板号。表7说明多糖肝素能够阻断瞬时表达，但C型软骨素-6-硫酸却能够提高瞬时表达。尽管在表7中没有列出，但已观察到瓜尔聚糖也可提高瞬时表达。肝素介导的基因表达抑制作用可能是由于肝素与脂质体中的阳离子类脂形成了复合物，因此，使得没有载体可将DNA传递至细胞中。就这种影响而言，软骨素-6-硫酸支持基因表达和细胞生长的能力是令人惊奇的。
表7
平板号 化合物/制剂 类别 转基因表达 细胞毒性
1 对照4mM L-谷氨酰胺 n/a 有 无
2 2.5mM苯甲酸盐缓冲液～0.1mM软骨素-6-硫酸(C型)1mM L-谷氨酰胺4.0mM L-谷氨酰胺 Ⅰ&Ⅱ 有 无
3 2.5mM苯甲酸盐缓冲液～0.1mM肝素1mM L-谷氨酰胺4.0mM L-谷氨酰胺 Ⅰ& 无 无
4 ～0.1mM肝素1mM L-谷氨酰胺4mM L-谷氨酰胺 Ⅱ 无 无
5 ～0.1mM软骨素-6-硫酸(C型)1mM L-谷氨酰胺4mM L-谷氨酰胺 Ⅱ 有 无
6 2.5mM丁酸盐缓冲液 Ⅰ 有 有
7 2.5mM丁酸盐缓冲液1mM L-谷氨酰胺4mM L-谷氨酰胺 Ⅰ 有 有
含丁酸盐缓冲液的平板表达转染的基因，但是在用于该组试验的试验条件下，该缓冲液对SW480细胞有细胞毒性。实施例5用Starburst聚合物转染
本组试验研究本发明方法表明提高瞬时表达的效力是否取决于将DNA传递至细胞中的方法。除此处是在树状聚合物的存在下而非利用脂质体送递而将DNA导入细胞外，用与实施例1类似的方法，在转染SW480细胞时使用两种不同的化合物组合(见表8)。这些树状聚合物是显微合成的聚合物球(最先由Dow Chemicals作为用于尺寸度量的“starburst”聚合物珠标准销售)，它们可被化学衍生化以起到阳离子类脂的作用。本实施例所用的树状聚合物是由旧金山(加利福尼亚州)加利福尼亚大学药物/药物化学系的F.C.Szoka,Jr.提供的。尽管不了解脂染或树状聚合物介导的方法进行基因传递的详细机制，但是依据物理化学特性如其形状和化学基团的分布，它们很可能非常不同。
本方法在下列步骤中与实施例1的不同。用397μl去离子水稀释14微克DNA，用393μl去离子水稀释56微克树状聚合物。在使用前1小时以内，将DNA溶液和树状聚合物悬浮液混合。将OPTI-MEM(733μl)和DNA/树状聚合物混合物(167μl)加至各孔中，用手转动6-孔平板以确保完全混合。保温5小时后，除去含DNA/树状聚合物的培养基，加入1.0ml培养基。其余的步骤与实施例1所述相同。
如表8所说明的，当用树状聚合物作为将外源DNA传递至细胞的方法时，试验的化合物是有效的。这些发现有力地揭示表8所列的化合物制剂可在DNA进入细胞后发挥作用，因此不管用于导入DNA的方法是什么，这种制剂都是有效的。
表8
平板号 化合物/制剂 X因子 G因子 K因子
1 对照 n/a n/a n/a
2 2.5mM苯甲酸盐缓冲液0.1mM软骨素-6-硫酸(C型)4mM L-谷氨酰胺 14 63 2
3 2.5mM苯甲酸盐缓冲液4mM谷氨酸4mM L-谷氨酰胺 42 34 -2
实施例6瞬时表达期间蛋白质的产量
下列试验说明，本发明的瞬时表达***对于用前文实施例中所述方法快速大量生产由导入至受体细胞中的外源基因表达的蛋白质产物是有用的。
完成15个平板试验，其中将表9所列化合物加至按实施例1所述在6-孔平板上转染的SW480细胞的培养基中。计算X、G14和K值，以及2×104个细胞在14天内产生的积累蛋白质量，蛋白质量列于表9最后一栏。表9中所列的数据表明，就在它们存在的情况下生产的蛋白质量而言，所有列出的组合物均优于对照。按照效力顺序，最有效的制剂是在平板6、3、13和14中所用的那些。在接受了A和B型制剂二者的平板中，观察到更好的结果，因此，这些组合对于动物试验特别有用，如用毒性蛋白质***，将激素传递至特异组织或需局部传递生物活性蛋白质的其它疾病。
表9
平板号 化合物/制剂 X因子 G14因子 K因子 总蛋白质(ng/2×104个细胞)
1 对照(含DNA但不含化合物) n/a n/a n/a 10.2
2 2.5mM苯甲酸盐缓冲液 -16 43 1 11.7
3 2.5mM苯甲酸盐缓冲液48小时后用B型制剂饲喂细胞：2.5mM苯甲酸盐缓冲液0.1mM软骨素-6-硫酸 -14 63 2 28.7
4 4mM色氨酸 55 67 2 34.2
5 1mM苯甲酸1mM 4-乙基苯甲酸 41 80 2 27.5
6 A型制剂：1mM苯甲酸1mM 4-乙基苯甲酸48小时后用B型制剂饲喂细胞：2.5mM苯甲酸盐缓冲液0.1mM软骨素-6-硫酸 20 82 42 26.2
7 1mM 4-乙基苯甲酸 47 64 2 21.9
8 1mM 4-丁基苯甲酸 -26 65 9 14.6
9 4mM L-谷氨酰胺 -12 42 … 11.7
10 4mM瓜氨酸 40 46 1 17.5
11 4mM苯甲酸盐缓冲液0.1mM软骨素-6-硫酸 54 72 2 26.1
12 2.5mM苯甲酸盐缓冲液4mM谷氨酸 42 76 6 25.1
13 A型制剂2.5mM苯甲酸盐缓冲液4mM谷氨酸48小时后用B型制剂饲喂细胞：2.5mM苯甲酸盐缓冲液0.1mM软骨素-6-硫酸 49 78 … 28.2
14 A型制剂：1mM谷胱甘肽1mM甲硫氨酸4mM甘氨酸4mMα氨基正丁酸1mM牛磺酸4mM苯丙氨酸2.5mM苯甲酸盐缓冲液4mM丙氨酸 57 77 1 29.6
15 1mM4-乙酰基丁酸乙酯 51 59 1 22.0
注：所有平板中的培养基均含有庆大霉素，并且除对照外，均还含有4mM L-谷氨酰胺；软骨素-6-硫酸是C型。
这些试验还表明了提高的瞬时表达可用于很迅速地生产毫克量蛋白质而无需先建立外源基因稳定整合的细胞系。因此，提高的瞬时表达为以足够回收的量有效表达候选生物药物并迅速筛选其药物活性提供了一种新方法。因此，本发明提供了一种加速完成药物发现过程的方法。例如平板6在14天内，每2×104个细胞生产约26ng β-半乳糖苷酶(见表9)。按比例扩大至含约2×106个细胞的常规培养物，用该制剂生产的总蛋白质将达26mg。在实施例2中所用的HPBr装置中，一般生长109这样多的细胞，因此，在这种培养物中，在数天内，将可得到数十或者甚至数百毫克的新的或所需的蛋白质。实施例7在肝细胞中的瞬时表达
从Dr.N.Talbots(U.S.D.A.,Beltsville,MA)得到衍生于猪胚胎细胞(上胚层期)的全能性(干细胞样)克隆非转化细胞系(PICM-19 3BT细胞；下文称为“PICM-19细胞”)。这些细胞的行为与肝干细胞类似，当在5％或更少的二氧化碳的条件下培养时，许多个月都有自我更新特性。在高浓度CO2下(如高达10％)，这些细胞开始分化。从分化的PICM-19细胞中已分离了至少两种不同的分化细胞表型，即成熟肝细胞和肝小管(ductile)细胞，后者产生胆汁。用已经被诱导分化的PICM-19细胞作为确定原代肝细胞之转染特征的工具，原代肝细胞与PICM-19细胞非常类似。在用原代猪肝培养物的早期试验中，所得的结果与上述SW480细胞的结果对称。因为原代肝培养物含肝细胞以外的细胞类型，故用提供肝细胞样细胞均一物的PICM-19细胞重复试验。
所用的方法与实施例1中用于转染SW480细胞的方法相同，使用1×107个细胞/孔，不同之处是将PICM-19细胞铺在经丝裂霉素C失活的STO小鼠成纤维细胞饲养细胞(CRL1503)层上，没有这层饲养细胞，PICM-19细胞通常不会生长。在制备脂质体的过程中，DNA/类脂与细胞的比例与实施例1中的相同。培养箱在这些实验过程中均维持在10％CO2浓度水平。PICM-19细胞增殖，在这些培养条件下，分化成成熟肝细胞。为了确保分化完全，在转染步骤前，将培养物在10％二氧化碳中保持3星期。
表10描述了在使用这些细胞的转染研究中所用的培养基，以及用这些培养物测量的X、G7和K因子值。表10中的结果与就SW480细胞观察到的结果以及当来自成年猪肝原代分离物在类似条件下转染时得到的结果一致。
令人惊奇的是，还观察到，不含饲养细胞的平板也能支持分化的PICM-19细胞生长至少4星期。此外，如图1所说明的，这些细胞还表达转染的DNA。这一结果极令人感到意外，因为，有关肝细胞在加入细胞前没有已加至平板的饲养层或蛋白类包衣(如胶原蛋白)的培养物中生长或保持培养数天以上的报道还未有过。显然，4号平板中的细胞与含饲养细胞的平板中的细胞同样好地附着，这表明C型软骨素-6-硫酸产生了类似体内的细胞生长和保持条件。因此，这些试验首次表明了硫酸软骨素可用于在没有饲养细胞的条件下，在低成本培养基组合物中培养肝细胞，同时使肝细胞维持与体内肝细胞类似的表型。表10
平板号 化合物/制剂 X因子 G7因子 K因子
1 对照 n/a n/a n/a
2 2.5mM苯甲酸4mM L-谷氨酰胺 -17 99 1
3 2.5mM苯甲酸盐缓冲液0.1mM软骨素-6-硫酸(C型)4mM L-谷氨酰胺 -41 102 0.0
4 2.5mM苯甲酸盐缓冲液0.1mM软骨素-6-硫酸(C型)4mM L-谷氨酰胺无饲养细胞 -357 103 2
5 2.5mM苯甲酸盐缓冲液4mM谷氨酸4mM L-谷氨酰胺 -46 103 0.0
实施例8从在生物反应器中生长的转染细胞中回收转基因mRNA和DNA
在一个32天的试验中，使用实施例3中所述的高效生物反应器装置(HPBr)，其中按实施例3和表5所述转染SW480细胞并进行增殖。除下文描述的外，所用的条件和检测与实施例3中所述的相同。在试验开始时，将从组织培养瓶中新鲜收集的1×107个SW480细胞与1×106个已预溶胀的微球同时注射到HPBr装置中。然后将所述细胞在含1mM苯甲酸和1mM4-乙基苯甲酸(A型制剂)的培养基中无旋转地培养24小时。在24小时结束时，加入编码β-半乳糖苷酶的质粒DNA，然后将生物反应器以30cpm的速率旋转4小时。然后通过用含1mM苯甲酸、1mM4-乙基苯甲酸和0.1mM软骨素-6-硫酸(B型制剂)的培养基冲洗三次，从而从毛细管外空间(ECS)除去含DNA的培养基。此后，用含相同B型制剂的1升饲养培养基替换在生物反应器中循环的1升培养基。为了进行剩余的试验，每隔7天用含B型制剂的1升新鲜饲养培养基替换在生物反应器中循环的培养基。在除去DNA后不旋转装置，以使细胞可形成肿瘤样固体团。
在从生物反应器中除去DNA后24小时，每天从ECS中取细胞和培养物上清液样品，持续32天。细胞取样是通过将培养液流冲向细胞团以冲下部分细胞、然后取少量的所得细胞悬浮液来完成。通过稍微离心分离每种样品中的细胞和培养基。对每天样品中的2×104个细胞分析β-半乳糖苷酶，用每天的上清液分析其代谢标记，即其葡萄糖、乳酸和氨浓度。收集完第32天的样品后，通过胰蛋白酶消化从ECS中收集剩余的细胞，然后用收集的2.8×105个细胞提取RNA和DNA。
按实施例3所述检测每天细胞样品中的β-半乳糖苷酶，图4中说明了这些试验的结果。图4表明β-半乳糖苷酶的表达在第4天达到峰水平，而且直至约12天都基本保持不变，此后，数值有些不稳定，但仍然相当高。对应于在试验结束时通过胰蛋白酶消化收集的细胞的最后一个数据点在图4中用方形符号作了说明，其值大约对相当于峰值的60％。因此，在整个32天的过程中，培养物中均有相当高水平的β-半乳糖苷酶产生。
用实施例2所述的方法测量上清液中的葡萄糖、乳酸和氨浓度，这些测量结果列于图5A-5C。从图5A和5B显然可以看出，在整个试验过程中，葡萄糖和乳酸浓度没有显著变化(由于这些样品中乳酸量低，并且在第7天后测得的数值相对稳定，因此认为乳酸没有显著波动)。与之相比，在更换培养基之间的每个7天周期结束时，氨浓度在每次提供新鲜培养基而落回至基值前，均增加了2倍以上。在每次更换培养基后的这种氨重复积累有利地支持下列主张：与稳定转染的化合物接触可使细胞代谢从利用葡萄糖(糖酵解)变成利用蛋白质或氨基酸作为其主要碳源(三羧酸循环)。如果这一试验中的细胞利用葡萄糖作为其主要能源，估计在每个7天的时期内，是乳酸而不是氨浓度增加(注意图5B表明在第一个7天期间可能发生了一些糖酵解)。
氨是脱氨作用的副产物，脱氨作用是氨基酸代谢产物进入三羧酸循环的早期步骤。因此，培养基中氨积累的最有可能的解释是细胞利用氨基酸，或可能是肽或蛋白质作为其与用于稳定瞬时表达之化合物接触过程中的能源。这些氨基酸可能源自例如培养基中的肽。这种肽可能是在热失活培养基中的血清时由热诱导血清蛋白质的裂解而产生的。
其使细胞从利用葡萄糖作为能源变成利用氨基酸作为能源的能力对于稳定瞬时表达之化合物的用途有重要意义。例如，进行氨基酸代谢的三羧酸循环在脂肪和类脂的代谢中也很重要。因此，用诱导瞬时表达的化合物处理细胞或人也可能通过激活三羧酸循环而提高脂肪和类脂的代谢。因此，这些化合物可用作诸如控制体重的药物。这些结果也表明了在图5A-5C所见到的独特代谢标记和其中转染基因的瞬时表达被提高和稳定的生理状态之间的联系。
为了制备核酸，将在32天培养结束时收集的2.8×105个经胰蛋白酶消化的细胞离心，用5ml无钙和无镁PBS洗涤，然后与1mlTRIZOLTM(Life Technologies)试剂在室温下混合。然后，在4℃，将悬浮于TRIZOLTM中的细胞保温10分钟。此时，将样品于-70℃冻存。融解后，将样品在室温放置20分钟，再加入200μl氯仿，剧烈混合15秒，在室温保温5-20分钟。接着，以2,000xg将样品在4℃离心15分钟以便将乳液分成两相。
为了分离RNA，仔细收集上层水相而不含任何中间相部分，然后将其转移至另一试管中以沉淀RNA，将0.5ml异丙醇与该水相混合，将试管在室温保温10-20分钟，然后以12,000xg在4℃离心以收集RNA沉淀。用1ml 70％(v/v)乙醇仔细洗涤沉淀，在室温空气干燥5-10分钟，然后将其重悬在30μl无RNAse的水(Five Prime Three Prime)中。
为了分离DNA，收集上述下层相和有机层，并与300μl 100％乙醇颠倒混合，然后在室温放置2-3分钟以沉淀DNA。在4℃，以2,000xg离心5分钟收集DNA沉淀，然后，用含10％乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤两次。第二次洗涤后，再在4℃，以2,000xg离心5分钟收集DNA沉淀，然后在室温通过重悬在75％乙醇中10-20分钟进行洗涤。再离心收集沉淀，大致干燥，并重悬和溶解于8mM氢氧化钠中。
为了检测β-半乳糖苷酶序列的存在，读出260nm的吸收值而确定RNA的浓度，然后用无RNAse的水稀释RNA溶液达到100μg/ml的终浓度。然后，将50μl稀释的RNA溶液与150μl 50∶50的37％甲醛和20xSSC溶液混合。将样品加热至55-60℃20分钟以使靶核酸变性，将样品放在冰上，加入200μl无RNA的水。振荡样品并大致离心以沉淀碎片，然后，在轻真空下加至狭线印迹装置的孔中以便将RNA收集到GeneScreen PlusTM膜(New England Nuclear)上。用50μl 10×SSC洗涤各孔，然后将膜暴露于紫外光以便使RNA与膜交联，然后在约90℃将膜烤1小时以除去甲醛。除不使用真空外，用同样的方法将DNA样品狭线印迹。
通过与对应于转染质粒中β-半乳糖苷酶基因一部分的32P标记的寡核苷酸杂交，确定狭线印迹膜上的β-半乳糖苷酶DNA或mRNA的存在。该寡核苷酸的核苷酸序列是5’CTCCAACGCAGCACCATCAC3’(SEQ ID NO:1)。为了杂交，将10ml杂交缓冲液(1ml 50×Denhardts溶液，10μl 10mg/ml多腺苷酸，12.5ml 20xSSC,5ml 10％十二烷基硫酸钠和2.5ml 0.5M NaPO4(pH6.5)，终体积50ml)放在含负载的狭线印迹膜和1×106计数/ml32P-标记的探针的塑料袋中。将塑料袋密封，在52-53℃保温过夜。杂交后，在室温将所述膜用含5xSSC和0.1％十二烷基硫酸钠的缓冲液洗涤两次，每次5-10分钟。然后在52-53℃，用相同缓冲液再洗两次，每次20-30分钟，然后对X射线胶片曝光。
在放射自显影后，信号存在即表明在转染后32天收集的细胞中存在含β-半乳糖苷酶基因的转染DNA。因此，该DNA在32天的试验过程中保持了相当高的量。另外，RNA狭线印迹的放射自显影表明在与β-半乳糖苷酶探针杂交后有一惊人的强信号。许多以前的试验表明从培养基中除去化合物后诱导2-3天内，细胞的β-半乳糖苷酶产量下降并消失。因此，显然在本试验中，可检测的β-半乳糖苷酶DNA和mRNA的持续存在不是由于已整合了外源DNA的细胞的过生长而引起的。此外，mRNA的典型半衰期只有约1-3天，因此，在32天保温期结束时β-半乳糖苷酶mRNA的存在说明该mRNA是新近被转录的，因此转染的外源DNA一定是存在于32天试验的始终。
32天保温后检测β-半乳糖苷酶DNA还表明在该期间，外源DNA可能已发生复制并数量增加。由于在试验过程中细胞持续生长和***，人们可能会估计，在第0天加入的质粒DNA已变稀，因此32天后分析的细胞应只含有很少的β-半乳糖苷酶DNA。但是，存在易检测量的β-半乳糖苷酶mRNA和DNA说明在试验过程中转染的DNA可能已进行了复制，这种复制可能是在线粒体内完成的。实施例9在用瞬时表达稳定化化合物处理的细胞中诱导碱性磷酸酶
下列试验结果说明，除诱导三羧酸循环外，按实施例8所述处理的细胞的代谢特征还包括诱导正常情况下在SW480细胞中几乎检测不到的内源碱性磷酸酶活性。使细胞在塑料组织培养皿中生长，然后用与实施例8所述相同的培养基转染细胞并使其增殖。通过每隔数天加入数ml饲养培养基来饲养细胞。每天收集这些平板的培养基样品，从转染后第一天开始，共收集14天，按实施例8所述分析葡萄糖、乳酸和氨浓度。意想不到的是，当分析这些样品的内源碱性磷酸酶活性时，发现其存在量很高。与常规生长的SW480细胞相比，观察到的升高程度为约2倍至约20倍。
用于测量SEAP活性的检测方法如下。将0.5ml每种样品与2xSEAP缓冲液(1xSEAP缓冲液=1M二乙醇胺，0.50mM氯化镁，pH9.8)混合。作为对照，同时检测牛肠粘液碱性磷酸酶。用1xSEAP制备牛碱性磷酸酶。这些试验的产色底物是0.15M对硝基苯基磷酸，在用碱性磷酸酶裂解后，该底物产生了一种可在405nm检测到的产物。将底物(100μl)加至各测试管中，然后将试管在37℃放置。然后，每分钟读取对照样品的吸收值，共读10分钟，并在第1和6分钟读取各试验样品的吸收值。用下列公式计算每毫升试验样品的碱性磷酸酶单位数：
Figure A9718018600571
其中：
A405nm=在405nm的吸收值，
V=检测试管的体积，
df=稀释因子，
VE=加到检测试管中的样品体积。
对于该组试验，V=1.1ml,df=2.2,VE=0.5ml。
为了检测诱导的碱性磷酸酶活性是否是热敏感的，用与上述SEAP缓冲液相同、但含有0.01M L-高精氨酸的检测缓冲液，对相同的样品进行第二组检测。在加入底物前，将对照酶样品和培养基样品在该缓冲液中加热至65℃，保持5-10分钟。已知这种热处理可以破坏在表达碱性磷酸酶的大多数哺乳动物细胞中发现的这种酶。这一预处理确实破坏了这些样品以及对照样品中的碱性磷酸酶，因此，表明诱导的碱性磷酸酶与通常在动物细胞中最常检测到的碱性磷酸酶的类型相同，而不是已知存在于胎盘中的热耐受性种类。
尽管已经说明并描述了本发明的优选实施方案，应理解可在其中进行各种改变而不会偏离本发明的精神和范围。
序列表(1)一般资料：
(ⅰ)申请人：Goffe,Randall A.
       Goffe,Adeelia S
(ⅱ)发明题目：稳定的瞬时基因表达
(ⅲ)序列数：1
(ⅳ)联系地址：
  (A)收件人：Christensen O’Connor Johnson&Kindness
  (B)街道：1420 5th Ave.,Suite2800
  (C)城市：Seattle
  (D)州：WA
  (E)国家：美国
  (F)邮政编码：98101-2347
(ⅴ)计算机可读形式：
  (A)介质类型：软盘
  (B)计算机：IBM PC兼容机
  (C)操作***：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：PatentIn Release#1.0,Version#1.30
(ⅵ)当前申请资料：PCT
  (A)申请号：
  (B)申请日：
  (C)分类号：
(ⅷ)代理人/代理资料：
  (A)姓名：Sheiness,Diana K.
  (B)登记号：35,356
  (C)文件/文档号：GSPN-1-11156
(ⅸ)通讯资料：
  (A)电话：(206)682-8100；(206)224-0735，直拨
  (B)电传：(206)224-0779(2)SEQ ID NO:1的资料：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：20个核苷酸
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：寡核苷酸
(ⅲ)假设：无
(ⅳ)反义：有
(ⅵ)来源：
  (A)生物体：大肠杆菌
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:CTCCAACGCA GCACCATCAC    20

Claims (50)

1．提高外源基因在真核细胞中的瞬时表达的方法，所述方法包括：
将编码蛋白质的外源DNA分子以能够在细胞中表达的形式导入细胞；和
在导入DNA前，过程中或之后，将所述细胞与瞬时表达提高剂接触。
2．权利要求1的方法，其中所述试剂诱导细胞利用蛋白质或氨基酸作为其主要能源。
3．权利要求1的方法，其中所述瞬时表达提高剂包括至少一种具有下式的羧酸衍生物：
Figure A9718018600021
其中R1是：
CHNH2R3，其中R3是天然氨基酸的侧链；
C6H4R4，其中R4是H、CH3,(CH2)nCH3,NH2,COCH3,CO(CH2)nCH3,C(CH3)3,CH(CH3)2,(CH2)nCH(CH3)2,(CH2)nCOCH3,OCH3，或O(CH2)nCH3，其中n=1-3；
CHNH2(CH2)nR5，其中n=1-7,R5是CH3,OH,CONH2,C6H4OH或CONHNH2；
(CH2)nR6，其中n=1-9,R6是吲哚基，NCH3C(=NH)NH2,SCH3,NH2,CH3,CO2H,CONH2或NHC(=NH)NH2；
(CH2)nCHNH2CO2H，其中n=1-8；
CH(CO2H)NHCONH2；
C5H4N；并且
其中R2选自H、CH3,(CH2)nCH3，其中n=1-8,(CH2)xO(CH2)yCH3或(CH2)xCO(CH2)yCH3，其中x+y=2-7，或者M，其中M是金属平衡离子或低分子量有机阳离子。
4．权利要求3的方法，其中所述瞬时表达提高剂包括选自下列的氨基酸衍生物：3-甲基-L-组氨酸，α-酮戊二酸，β-丙氨酸，肌肽，瓜氨酸，肌酸，叶酸，谷胱甘肽，马尿酸，高丝氨酸，N-(4-氨基苄基)-L-谷氨酸二乙酯，N-氨甲酰基天冬氨酸，N-甲酰基-L-甲硫氨酸和鸟氨酸。
5．权利要求3的方法，其中R1是非极性的和疏水的。
6．权利要求1的方法，其中所述瞬时表达提高剂包括具有下式的磺酸衍生物：R7-SO2-OR8
其中R7是低级烷基、芳基、取代的低级烷基、芳基、取代的低级烷基或取代的芳基；和
R8是氢，金属平衡离子，或低分子量的有机阳离子。
7．权利要求6的方法，其中R7是氨基取代的低级烷基或氨基取代的芳基。
8．权利要求6的方法，其中所述磺酸衍生物选自3-氨基苯磺酸、牛磺酸以及它们的盐。
9．权利要求1的方法，其中所述瞬时表达提高剂包括磺化的氨基多糖。
10．权利要求9的方法，其中所述磺化的氨基多糖包括N-乙酰化的氨基多糖。
11．权利要求10的方法，其中所述N-乙酰化的氨基多糖选自软骨素-6-硫酸和瓜尔聚糖。
12．权利要求10的方法，其中所述瓜尔聚糖是羟丙基瓜尔聚糖。
13．权利要求1的方法，其中所述瞬时表达提高剂包括选自肾上腺素，辅酶B12和甲基钴胺素的一种化合物。
14．权利要求3的方法，其中所述瞬时表达提高剂的浓度是1-15mM。
15．权利要求6的方法，其中所述瞬时表达提高剂的浓度是1-15mM。
16．权利要求9的方法，其中所述瞬时表达提高剂的浓度是0.01-0.5mM。
17．权利要求11的方法，其中所述N-乙酰化的氨基多糖是分子量为约4000道尔顿的软骨素-6-硫酸。
18．权利要求1的方法，其中所述瞬时表达提高剂包括pH为4.5-9.0的水溶液。
19．权利要求1的方法，其中在将外源DNA导入细胞之前、过程中和之后，将该细胞与第一种瞬时表达提高剂接触，其中所述试剂包括具有下式的至少一种化合物：其中R1是：
CHNH2R3，其中R3是天然氨基酸的侧链；
C6H4R4，其中R4是H、CH3,(CH2)nCH3,NH2,COCH3,CO(CH2)nCH3,C(CH3)3,CH(CH3)2,(CH2)nCH(CH3)2,(CH2)nCOCH3,OCH3，或O(CH2)nCH3，其中n=1-3；
CHNH2(CH2)nR5，其中n=1-7,R5是CH3,OH,CONH2,C6H4OH或CONHNH2；
(CH2)nR6，其中n=1-9,R6是吲哚基，NCH3C(=NH)NH2,SCH3,NH2,CH3,CO2H,CONH2或NHC(=NH)NH2；
(CH2)nCHNH2CO2H，其中n=1-8；
CH(CO2H)NHCONH2；
C5H4N；并且其中R2是H、CH3,(CH2)nCH3，其中n=1-8,(CH2)xO(CH2)yCH3或(CH2)xCO(CH2)yCH3，其中x+y=2-7，或者是M，其中M是金属平衡离子或低分子量有机阳离子；
或所述第一种瞬时表达提高剂包括具有下式的化合物：R7-SO2-OR8
其中R7是低级烷基、芳基、取代的低级烷基、芳基或取代的芳基；和
R8是氢，金属平衡离子，或低分子量有机阳离子；
在导入外源DNA后，将细胞与第二种瞬时表达提高剂接触，其中所述第二种试剂含有磺化的氨基多糖。
20．权利要求1的方法，其中在将外源DNA导入细胞前，将所述细胞与所述试剂接触。
21．权利要求1的方法，其中在将外源DNA导入细胞的过程中，将所述细胞与所述试剂接触。
22．权利要求1的方法，其中在将外源DNA导入细胞之后，将所述细胞与所述试剂持续接触。
23．权利要求1的方法，其中所述细胞是培养细胞。
24．权利要求23的方法，其中所述培养细胞是原代培养物。
25．权利要求24的方法，其中所述培养细胞选自稳定转化的细胞，肿瘤细胞系和杂交瘤细胞。
26．权利要求25的方法，其中所述培养细胞是SW480P3细胞。
27．权利要求1的方法，其中所述试剂是生物相容性的。
28．权利要求1的方法，其中收集由所述外源基因编码的蛋白质。
29．权利要求1的方法，其中所述细胞存在于活宿主中，并且通过口服或注射将瞬时表达提高剂导入该宿主内。
30．权利要求1的方法，其中通过下列方法将外源DNA导入细胞：脂染法，病毒载体，将细胞与同磷酸钙的共沉淀接触，以及存在starburst聚合物的条件下转染。
31．权利要求30的方法，其中通过病毒载体将DNA导入细胞，并且该病毒载体衍生自腺病毒。
32．权利要求27的方法，其中所述试剂含有至少一个疏水部分和至少一个酸部分，并且所述酸基团可以被修饰而形成盐或酯。
33．权利要求32的方法，其中所述酸部分是疏水的和有机的。
34．筛选含至少一种化合物的试剂以确定所述试剂是否能够提高外源基因在真核细胞中的瞬时表达的方法，其中所述试剂是生物相容性的，并含有至少一个疏水部分和至少一个酸部分，所述方法包括下述步骤：
在第0天，将编码蛋白质的外源DNA分子以能在细胞中表达的形式导入第一和第二份SW480 P3细胞；
在导入DNA之前、过程中或之后，将所述第二份细胞与所述试剂接触；
在第0-4天或第4-7天，或第4-14天之间累积性测量两份细胞中从外源DNA表达的蛋白质量，然后用这些量根据公式分别确定X、G7或G14值：X或G7或 G 14 = 100 - ( A × 100 ) C
其中“A”是在第一份细胞中表达的由外源基因编码的蛋白质量，“C”是在第二份细胞中表达的蛋白质量；和
如果X或G7或G14大于10，确定该试剂能够提高瞬时表达。
35．权利要求34的方法，其中X或G7或G14大于25。
36．提高外源基因在细胞中的瞬时表达的方法，所述方法包括：将编码蛋白质的外源DNA分子以能够在细胞中表达的形式导入细胞；和
将细胞与根据权利要求33的测定评估时X或G7或G14大于25的试剂接触。
37．控制细胞代谢以降低细胞的葡萄糖消耗的方法，所述方法包括将所述细胞与诱导细胞利用蛋白质或氨基酸作为其主要能源的试剂接触。
38．权利要求37的方法，其中所述试剂还诱导表达内源碱性磷酸酶活性。
39．权利要求37的方法，其中所述试剂能够提高外源基因在细胞中的瞬时表达，其中所述试剂包括至少一种具有下式的化合物：其中R1是：
CHNH2R3，其中R3是天然氨基酸的侧链；
C6H4R4，其中R4是H、CH3,(CH2)nCH3,NH2,COCH3,CO(CH2)nCH3,C(CH3)3,CH(CH3)2,(CH2)nCH(CH3)2,(CH2)nCOCH3,OCH3，或O(CH2)nCH3，其中n=1-3；
CHNH2(CH2)nR5，其中n=1-7,R5是CH3,OH,CONH2,C6H4OH或CONHNH2；
(CH2)nR6，其中n=1-9,R6是吲哚基，NCH3C(=NH)NH2,SCH3,NH2,CH3,CO2H,CONH2或NHC(=NH)NH2；
(CH2)nCHNH2CO2H，其中n=1-8；
CH(CO2H)NHCONH2；
C5H4N；并且其中R2是H、CH3,(CH2)nCH3，其中n=1-8,(CH2)xO(CH2)yCH3或(CH2)xCO(CH2)yCH3，其中x+y=2-7，或者是M，其中M是金属平衡离子或低分子量有机阳离子；或者
具有下式的磺酸衍生物：R7-SO2-OR8
其中R7是低级烷基、芳基、取代的低级烷基、芳基或取代的低级芳基；和
R8是氢原子，金属平衡离子，或低分子量有机阳离子；或者
磺化的氨基多糖。
40．权利要求39的方法，其中所述试剂包括选自下列的化合物：苯甲酸、4-乙基苯甲酸，苯甲酸盐缓冲液和软骨素-6-硫酸。
41．权利要求39的方法，其中所述试剂在体内施用给哺乳动物。
42．提高细胞附着于培养物基层的方法，其中将磺化的氨基多糖加至培养细胞的培养基中。
43．权利要求42的方法，其中所述细胞是通常需要饲养层以便在培养物中生长的细胞。
44．权利要求42的方法，其中所述细胞是肝细胞，所述磺化的氨基多糖是软骨素-6-硫酸。
45．权利要求1的方法，其中在将外源DNA导入细胞之前、过程中或之后，将细胞与第一种试剂接触，其中所述第一种试剂包括至少一种具有下式的化合物：其中R1是：
CHNH2R3，其中R3是天然氨基酸的侧链；
C6H4R4，其中R4是H、CH3,(CH2)nCH3,NH2,COCH3,CO(CH2)nCH3,C(CH3)3,CH(CH3)2,(CH2)nCH(CH3)2,(CH2)nCOCH3,OCH3，或O(CH2)nCH3，其中n=1-3；
CHNH2(CH2)nR5，其中n=1-7,R5是CH3,OH,CONH2,C6H4OH或CONHNH2；
(CH2)nR6，其中n=1-9,R6是吲哚基，NCH3C(=NH)NH2,SCH3,NH2,CH3,CO2H,CONH2或NHC(=NH)NH2；
(CH2)nCHNH2CO2H，其中n=1-8；
CH(CO2H)NHCONH2；
C5H4N；和其中R2是H、CH3,(CH2)nCH3，其中n=1-8,(CH2)xO(CH2)yCH3或(CH2)xCO(CH2)yCH3，其中x+y=2-7，或者是M，其中M是金属平衡离子或低分子量有机阳离子；或者
第一种试剂包含至少一种具有下式的化合物：R7-SO2-OR8
其中R7是低级烷基、芳基、取代的低级烷基或取代的低级芳基；和
R8是氢，金属平衡离子，或低分子量有机阳离子；
在导入外源DNA后，将所述细胞与第二种试剂接触，其中所述第二种试剂含有至少一种磺化的氨基多糖或其中所述第二种试剂含有至少一种具有下式的化合物：其中R1是：
CHNH2R3，其中R3是天然氨基酸的侧链；
C6H4R4，其中R4是H、CH3,(CH2)nCH3,NH2,COCH3,CO(CH2)nCH3,C(CH3)3,CH(CH3)2,(CH2)nCH(CH3)2,(CH2)nCOCH3,OCH3，或O(CH2)nCH3，其中n=1-3；
CHNH2(CH2)nR5，其中n=1-7,R5是CH3,OH,CONH2,C6H4OH或CONHNH2；
(CH2)nR6，其中n=1-9,R6是吲哚基，NCH3C(=NH)NH2,SCH3,NH2,CH3,CO2H,CONH2或NHC(=NH)NH2；
(CH2)nCHNH2CO2H，其中n=1-8；
CH(CO2H)NHCONH2；
C5H4N；并且其中R2是H、CH3,(CH2)nCH3，其中n=1-8,(CH2)xO(CH2)yCH3或(CH2)xCO(CH2)yCH3，其中x+y=2-7，或者是M，其中M是金属平衡离子或低分子量有机阳离子；
或所述第二种试剂包括具有下式的至少一种化合物：R7-SO2-OR8
其中R7是低级烷基、芳基、取代的低级烷基或取代的低级芳基；和
R8是氢原子，金属平衡离子，或低分子量有机阳离子；和
其中所述第一种试剂是用下式计算X值时，X大于25的一种试剂： X = 100 - ( A × 100 ) C
其中所述第二种试剂是G7或G14值大于25的一种试剂，其中G7或G14按下式计算：G7或 G 14 = 100 - ( A × 100 ) C
其中对于X和G7或G14，“A”是在与第一和第二种试剂接触的第一份细胞中表达的由外源基因编码的蛋白质量，“C”是在未与第一或第二种试剂接触的第二份细胞中表达的蛋白质量。
46．权利要求45的方法，其中所述第一种试剂是苯甲酸盐缓冲液，所述第二种试剂是软骨素-6-硫酸。
47．权利要求45的方法，其中所述第一种试剂包含苯甲酸和4-乙基苯甲酸，所述第二种试剂包含苯甲酸盐缓冲液和软骨素-6-硫酸。
48．权利要求45的方法，其中所述第一种试剂包含苯甲酸盐缓冲液和谷氨酸，所述第二种试剂包含软骨素-6-硫酸。
49．权利要求45的方法，其中在将外源DNA导入细胞前，将细胞与第一种试剂接触约20-24小时。
50．权利要求1的方法，其中所述试剂是：苯甲酸和4-乙基苯甲酸；或苯甲酸盐缓冲液和软骨素-6-硫酸；或苯甲酸盐缓冲液和谷氨酸；或谷胱甘肽，甲硫氨酸，甘氨酸，α-氨基正丁酸，牛磺酸，苯丙氨酸，苯甲酸盐缓冲液和丙氨酸。
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