CN1237890C - 分级大豆蛋白及其生产方法 - Google Patents

Abstract

提供一种有效的、工业规模的将大豆蛋白分离成高纯度的7S球蛋白和11S球蛋白的方法，所述方法包括在弱酸性条件下加热含有大豆蛋白的溶液，然后在pH5.6至6.6时分离出可溶部分和不溶部分。如果需要，还可以在生产过程中使用肌醇六磷酸酶进行处理以分离出7S球蛋白和11S球蛋白。

Description

分级大豆蛋白及其生产方法

技术领域

本发明涉及从含有大豆蛋白的溶液中生产富含7S球蛋白的部分和富含11S球蛋白的部分的方法。

背景技术

大豆的沉淀蛋白在pH接近4.5时沉淀下来，且可以容易地分成蛋白组分和非蛋白组分。这种沉淀蛋白是指大豆分离出的蛋白质，它是在食品工业中使用时的一种普通的形式。根据超速离心法的沉降系数，蛋白质分成包括2S，7S，11S和15S的不同的球蛋白。在这些球蛋白中，7S和11S球蛋白是球蛋白部分的主要成分(术语7S和11S球蛋白是根据沉降方法标定的，实质上与免疫学定义的β-联合球蛋白(β-conglycinin)和球蛋白相关)，它们的粘性、凝结性和表面活性等等彼此不同。因此，通过将大豆蛋白分离成富含7S球蛋白的部分和富含11S球蛋白的部分，就能够开始应用两种蛋白质的性质，借此可扩大蛋白质的工业应用。

每个7S球蛋白和11S球蛋白都含有几个亚基，前者含有被称为α、α′、β的三个亚基，后者含有几种类型的由一对酸性多肽(A)和一条碱性多肽(B)组成的亚基。关于这两种蛋白的比例，当典型地使用光密度分析法确定SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳谱带的面积比来说明两种球蛋白的比例时，7S球蛋白：11S球蛋白的比例约为1∶2。关于7S球蛋白和11S球蛋白的性质，这两种的分子量和静态条件非常接近。特别是因为两种球蛋白的不同是由于其亚基组成不同，因此它们的性质在一定程度上是不同的，并且又是相互重叠的。因此，完成无任何相互混杂的有效分离是非常困难的。

有几种已知的分离方法，例如，利用等电点不同的分离方法，这种方法是在pH接近11S球蛋白的等电点时进行提取，这样就专门提取了7S球蛋白(JP-A-55-124457)；利用与钙的反应活性不同进行的分离方法，其中加入少量的钙盐后进行提取，这样就可以提取到富含7S球蛋白的部分(JP-A-48-56843)；利用在某一pH值或离子强度下的溶解度不同的分离方法，包括在pH为1.2到4.0的氯化钠或氯化钾中除去不溶的蛋白质生产7S球蛋白的方法(JP-A-49-31843)和将等电点沉降物的pH调节到5.0至5.6，并且将氯化钠调到0.01到0.2M来分离富含7S球蛋白的部分和富含11S球蛋白的部分的方法(JP-A-58-36345)；利用低温沉淀和还原剂等等方法，其中在低温下减小11S球蛋白的溶解度(称作低温沉淀)，并在pH为6.5或更高的存在亚硫酸盐化合物、谷胱甘肽和半胱氨酸的水体系中处理大豆蛋白源，然后在20℃或更低的温度下调节pH到5.5至7.0，这样就分离出富含7S球蛋白的可溶部分和富含11S球蛋白的不溶部分(JP-A-61-187755)。

这些已知的分离方法都包含了对7S球蛋白和11S球蛋白在一定的pH和离子强度、在一定的盐存在下、在一定的温度等等条件下溶解度不同的有效利用，虽然其实现了一定程度的分离，但其仅为一种实验室方法，而不是工业方法，并且仍然存在涉及实用性的问题。例如，JP-A-61-187755中公开的方法含有涉及实用性的缺点，例如由于低温沉淀极大地依赖于温度，因此需要冷却到5℃的低温，并且为了使用工业用的低离心力完成分离，还需要添加大量的亚硫酸盐化合物，还包含涉及分离精确性的缺点，例如11S球蛋白不可避免地迁移到可溶的部分中。

为了获得富含7S球蛋白的蛋白质，尝试了分离出利用遗传学生产的11S球蛋白缺损的大豆，即富含7S球蛋白的种子(Breeding Science，46，11，1996)，还可以找到这种种子的应用(Breeding Science，50，101，2000)和专利(US6,171,640 B1)。

如上所述，已经研究和开发了一种分离富含7S球蛋白的部分和富含11S球蛋白的部分的方法，使用此方法减少了可溶部分和不溶部分之间的相互迁移，还方便和有效地完成了工业规模的生产。

另外一方面，Samoto等人报道了在大豆得到的蛋白质中，有一类作为细胞质膜、蛋白体或油体膜(油体结合蛋白)成分与极性的脂类有高的亲和力的蛋白质，从工业生产分离出的大豆蛋白中得到了约高达35％的这种蛋白质(Biosci.Biotechnol.Biochem.，62(5)，935-940(1998))。油体结合蛋白是主要包括膜蛋白的蛋白质的通用术语，特别是用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的分子量为34kDa，24kD和18kD的，且含有大约10到12％重量的极性脂类的膜蛋白，其极性脂可用氯仿∶甲醇以2∶1混合的极性溶剂混合物提取。

传统的分离仅集中在7S和11S上，而没有注意到能污染每一部分的油体结合蛋白，原因是使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析时，油体结合蛋白不象7S和11S一样可以绝对地确定并且常常被忽视。换言之，仅用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的纯度常常较真实的纯度高，为了获得真正高纯度的7S或11S蛋白，应该考虑到油体结合蛋白的作用。这样，传统的7S/11S部分的分离仅仅以7S与11S蛋白之间的比例作为每部分的纯度进行处理。而每部分都与油体结合蛋白有关，而且在许多情况下，实际的情况是纯度稍低的相对粗的部分，其蛋白组分的特点是含有大量的油体结合蛋白。

本发明的目的之一是提供一种特别在工业规模中高精度和高效率地分离7S球蛋白和11S球蛋白的新方法。本发明的另一个目的是得到一种蛋白部分，其特征是混入的油体结合蛋白含量降低，且7S球蛋白和11S球蛋白的纯度高。

发明内容

本发明是一种生产分级大豆蛋白的方法，其包括在弱酸性条件下加热含大豆蛋白的溶液，然后在pH5.6至6.6的条件下分离可溶部分和不溶部分。上述的弱酸条件优选pH为3.8到6.8，且优选在30到75℃下加热。这样，就可得到含少量的油体结合蛋白的富含7S球蛋白的可溶部分。虽然这种方法使富含11S球蛋白的不溶部分所含油体结合蛋白的量增加了，但11S球蛋白可以专门在接近中性的水性溶液中提取，因为这种条件下11S球蛋白溶解了而油体结合蛋白仍然是不溶的，这样就得到了含少量的油体结合蛋白的富含11S球蛋白部分。

本发明还提供了一种高纯度的7S球蛋白大豆蛋白或高纯度的11S球蛋白大豆蛋白，并通过生产过程中使用肌醇六磷酸酶分解肌醇六磷酸降低了肌醇六磷酸的含量，这在分离过程中也改进了分离的精度。

上述生产方法得到的可溶部分的7S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)的比值是0.4或更高，通过选择适当的条件，其可以达到0.8或更高，0.85或更高，或0.9或更高，这样就很容易地得到了高纯度的蛋白质。该可溶部分也是一种大豆蛋白，除了含有7 S球蛋白外，还含有仅少量的11S球蛋白或其它蛋白质，特别是其中含有含量低至蛋白固体总量的10％或更少的油体结合蛋白，这样就提供了严格意义上的高纯度的7S球蛋白。另一部分，即不溶部分的11S球蛋白/(11S球蛋白+7S球蛋白)的比值是0.7或更高，通过选择适当的条件，其可以达到0.8或更高，0.85或更高，或0.9或更高，这样就很容易地得到了高纯度的蛋白质。

这里所述的7S球蛋白或11S球蛋白的相对含量是指用光密度分析法测定SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳带的谱图的面积比(下述的校正纯度除外)。

当使用硫酸钠从几乎未改性的酸沉淀球蛋白中精确地获得油体结合蛋白时，其在酸沉淀球蛋白中的浓度为30％到35％(Biosci.Biotechnol.Biochem.，62(5)，935-940(1998)，op.cit.)，这种酸沉淀球蛋白固体含有3到4％重量的可用氯仿∶甲醇(2∶1，v/v)提取的极性脂类，这种脂类还以10到12％的含量存在于油体结合蛋白中，这说明上述的极性脂类(此后有时称作“氯仿·甲醇可提的油份”)主要存在于酸沉淀球蛋白的油体结合蛋白中，并且油体结合蛋白的量可以通过氯仿·甲醇可提的油重量份的10倍计算得到。这种计算还可用于如用己烷将油体结合蛋白脱脂的物质，可以用于用己烷脱脂后未用己烷提取的物质。根据本发明，上述富含7S球蛋白的可溶部分中氯仿·甲醇可提的油份的含量为1％或更少，其对应的油体结合蛋白的含量在10％的水平或更少。

另一部分，即不溶的部分，11S球蛋白/(11S球蛋白+7S球蛋白)的比值是0.7或更高，不溶部分中所含的11S球蛋白可以专门在接近中性(pH6.5至8.5)的水溶液中提取，因为这种条件下11S球蛋白溶解了而油体结合蛋白仍然是不溶的，这样就提供了富含11S球蛋白及含量降低的油体结合蛋白的大豆蛋白质部分(其11S球蛋白/(11S球蛋白+7S球蛋白)的比值是0.7或更高)，其中含有油体结合蛋白为20％/总蛋白或更少，即，含有的可用氯仿∶甲醇(2∶1)提取的极性脂类为2％或更少。

上述两部分均可以使用肌醇六磷酸酶分解肌醇六磷酸，以提供一种肌醇六磷酸的含量降低了的蛋白部分，其肌醇六磷酸的含量降低至所得蛋白质的1.2％或更少。如果进行肌醇六磷酸酶处理的目的是为了提高分离效率时，优选在分离之前的任意时间进行酶处理。

附图简要说明

图1是通过在60℃和pH4.8的条件下加热得到的可溶部分和不溶部分的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱；

图2是从可溶部分得到的富含7S球蛋白的蛋白质的溶解图；和

图3是从不溶部分得到的富含11S球蛋白的蛋白质的溶解图。

优选实施方案的详细描述

本发明使用的分析方法说明如下。

*总蛋白；基于Kjeldahl方法，测定氮含量并乘以系数6.25转换为总蛋白。

*SDS-聚丙烯酰胺电泳；基于Laemmli的方法(Nature，227，680(1970))，使用浓度为10到20％的梯度凝胶进行分析。样品的量为10μg。

*肌醇六磷酸；使用Alii Mohamed(Cereal Chemistry 63，475-478，1986)的方法。

*可用氯仿-甲醇提取的油部分；将干燥的样品与大约50倍体积的氯仿和甲醇的混合物(2∶1，v/v)共混，回流提取的固体的重量比确定为氯仿·甲醇可提的油份。

*纯度(SPE标准)；上述SDS-聚丙烯酰胺电泳得到的谱带通过光密度计测定，纯度用相应带面积与总面积的％面积表示(基于SPE)。所述的7S球蛋白的含量是指α、α′、β亚基的总量，而11S球蛋白的含量是指酸性多肽(A)和碱性多肽(B)的总量。

*校正纯度；基于上面得到的纯度(基于SPE)和混杂的油体结合蛋白，校正的纯度按以下所述的方法计算。用A％表示样品的纯度(基于SPE)，由于样品中除7S球蛋白和11S球蛋白外，还含有10倍于氯仿·甲醇可提的油重量份的油体结合蛋白，因此纯度以包括7S球蛋白、11S球蛋白和油体结合蛋白的全部蛋白质为基准计算。

校正纯度(％)＝(100(％)-氯仿·甲醇可提的油份(％)*10)*A(％)/100

本发明优选实施方案如下所述。

本发明使用的原料大豆可以是任何的商业大豆或通过育种或基因工程得到的某一部分缺损的大豆等。

含大豆蛋白的溶液可以是含水的大豆浆或从中得到的大豆乳，优选使用含水的脱脂大豆浆或从中得到的脱脂大豆乳及酸沉淀的大豆蛋白浆或分离出的大豆蛋白溶液。

根据本发明，为了分离出富含7S球蛋白的部分和富含11S球蛋白的部分，优选无变性或低变性的大豆蛋白溶液。在pH为3.8到6.8，优选pH4.0到6.6，更优选pH4.2到6.2的弱酸性条件下，在30到75℃，优选35到65℃，更优选40到60℃的温度下加热大豆蛋白溶液，然后调节pH达到pH5.6到6.6，优选pH5.6到6.4，这样就容易地分离出了富含7S球蛋白的部分和富含11S球蛋白的部分。在生产过程的任何一步中，特别是分成可溶部分和不溶部分之前，使用肌醇六磷酸酶分解与大豆蛋白共存的肌醇六磷酸，借此使富含7S球蛋白的部分和富含11S球蛋白的部分的分离更容易。肌醇六磷酸酶处理适合与加热同时进行。根据肌醇六磷酸酶的来源不同，使用条件可以不同，但肌醇六磷酸酶通常在pH 3.5到9.0，温度在20到70℃下，以0.1到100单位/重量(g)蛋白质的浓度使用5分钟到3个小时。1个单位的肌醇六磷酸酶活性对应的酶量是在反应初期的条件为pH5.5和37℃下，1分钟从肌醇六磷酸中分离出1μ摩尔的磷酸盐的酶量。

在上述的加热步骤中，加热持续时间的长短或有无还原剂与pH和温度不同，其对分离方法的实施没有严重影响，它们是不重要的。pH超出pH3.8至6.8的范围，或温度超出30℃至75℃的范围可能导致7S球蛋白和11S球蛋白的分离困难。分离使用的pH小于5.6可能导致不希望的7S球蛋白向不溶部分的迁移量的增加，pH超过6.6可能导致不希望的11S球蛋白向可溶部分迁移量的增加。

加热步骤之后，分离操作可以在相同的温度下进行，优选确保低温以控制微生物。使用已知的分离操作(如过滤和离心)完成分离，特别是使用连续离心机(如倾析器)也可以完成简单的分离。当然不排除使用非连续离心机如间歇式离心机。

本发明中作为可溶部分的7S球蛋白部分和不溶部分的11S球蛋白部分的分离情况可以依据SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳得到的谱图(纯度(基于SPE))进行验证。

然而，由于在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中油体结合蛋白的着色力差，因此基于SPE的纯度忽视了油体结合蛋白，因而认为上面的公式：(100(％)-氯仿·甲醇可提的油份(％)*10)*A(％)/100表示的校正纯度(％)更接近实际的纯度。

分离后的可溶部分可以直接用作富含7S球蛋白的部分，也可以浓缩、中和、灭菌或干燥后使用。例如可以通过改变可溶部分的pH值以接近其等电点(pH4.5至5.3，优选pH4.7至5.1)，然后回收沉淀的凝乳实现浓缩，通常之后进行中和、热灭菌，然后是干燥。热灭菌可以采用已知的HTST、OHT方法等。根据用途，使用例如蛋白酶的酶处理可以在溶液态进行。

使用接近中性的水溶液(pH6.5至8.5)从分离后的不溶部分中提取11S球蛋白组分，这样它就与不溶的油体结合蛋白(以及可能存在于不溶部分的沉淀组分)分开了。这一步中，优选使用约4000G或更高的高G离心机，更优选约5000G或更高的离心机进行11S球蛋白和油体结合蛋白的分离，这样可获得固体中的氯仿·甲醇可提油份的含量为2％或更低的蛋白质，同时11S球蛋白/(11S球蛋白+7S球蛋白)的比值保持在0.7或更高。

这样得到的含有11S球蛋白的溶液可以直接用作富含11S球蛋白的大豆蛋白，或浓缩、中和、灭菌或干燥后使用。例如可以将可溶部分进行等电点沉淀(pH4.5至5.8，优选pH4.7至5.5)，然后回收沉淀的凝乳实现浓缩，为了改善物理性质优选使用此方法，同时也可以在等电点沉淀之后进行中和、热灭菌或使用如蛋白酶进行酶处理。最普通的形式是灭菌的和干燥的形式。热灭菌可使用已知的HTST、UHT方法等等。

下面的实施例是本发明的进一步说明。但这些实施例不是用于限制本发明的技术范围。

实施例

下面的实施例是本发明的进一步说明。但这些实施例不是用于限制本发明的技术范围。

实施例1

将大豆压扁并用正己烷提取以除去油脂，1重量份的得到的低变性脱脂大豆(氮可溶指数NSI：91)与10份用于提取的水混合，在室温下，pH7.0时提取1小时，然后离心得到脱脂大豆乳。用盐酸调脱脂大豆乳的pH到3.6至7.0以用于下一个步骤：在80℃或更低的温度下加热或者不加热。调了pH的脱脂大豆乳达到一定的温度后立刻冷却至大约30℃，调pH到5.8，然后用间歇离心机(3000G)离心以分离出含7S球蛋白的可溶部分和含11S球蛋白的不溶部分。离心过程中每种溶液的温度约为25℃。观察大豆乳的可溶部分和不溶部分在上述的pH范围和加热条件下的分离情况，结果表明：在pH为3.8到6.8，优选pH4.0到6.6，更优选pH4.2到6.2的弱酸性条件下，在30℃或更高，优选35℃或更高，更优选40℃或更高的温度下加热，实现了可溶部分和不溶部分的不连续分离。然而，离心后可溶部分和不溶部分的蛋白组合物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明：热处理在70℃进行使得7S球蛋白开始迁移到不溶部分中，而热处理在80℃进行使得几乎全部7S球蛋白都含在了不溶部分中，说明未成功分离7S和11S球蛋白。

上述结果表明在酸性条件为pH3.8到6.8，优选pH4.0到6.6，更优选pH4.2到6.2下，在30℃到75℃，优选35℃到65℃，更优选40℃到60℃的温度下加热大豆蛋白溶液，然后在pH5.8时离心，能够方便地分离出含7S球蛋白的可溶部分和含11S球蛋白的不溶部分。

图1是通过在上面指定的加热条件中，温度为60℃和pH为4.8的条件下加热得到的可溶部分和不溶部分的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。

表1中列出了经过上述分离后存在于可溶部分和不溶部分的7S球蛋白和11S球蛋白的比例(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳谱带的面积比通过光密度分析法确定，之后也类似地使用相同的方法)。

表1(在60℃和pH4.8条件下加热)

               可溶部分        不溶部分

7S∶11S        95∶5           7∶93

可溶部分和不溶部分的固体中得到的氯仿甲醇可提油份的含量分别为0.9％和3.2％，这验证了油体结合蛋白集中在不溶部分中。

实施例2

一重量份的与实施例1同样脱脂的低变性脱脂大豆与10重量份的用于提取的水混合，在室温至80℃的温度下，pH3.6到7.2时提取30分钟以得到一种浆。将这种提取的浆冷却到接近室温，然后用盐酸或氢氧化钠调节pH在5.8，再然后用间歇离心机(3000G)离心以分离出含7S球蛋白的可溶部分和含11S球蛋白的不溶部分。离心过程中每种溶液的温度约为25℃。观察浆的可溶部分和不溶部分在上述的pH范围和提取温度条件下的分离情况，结果表明：在pH为3.8到6.8，优选pH4.0到6.6，更优选pH4.2到6.2的弱酸性条件下，在30℃或更高，优选35℃或更高，更优选40℃或更高的温度下加热，实现了可溶部分和不溶部分的不连续分离。然而，离心后可溶部分和不溶部分的蛋白组合物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果验证了：热处理在70℃进行使得7S球蛋白开始迁移到不溶部分中，而热处理在80℃或更高进行使得几乎全部7S球蛋白都含在了不溶部分中，说明未成功分离7S和11S球蛋白。

上述结果表明在酸性条件为pH3.8到6.8，优选pH4.0到6.6，更优选pH4.2到6.2下，在30℃到75℃，优选35℃到65℃，更优选40℃到60℃的温度下加热大豆蛋白溶液，然后在pH5.8时离心，能够方便地分离出含7S球蛋白的可溶部分和含11S球蛋白的不溶部分。

在pH5.3和温度40℃的条件下提取后存在于可溶部分和不溶部分的7S球蛋白和11S球蛋白的比例按与实施例1相同的方法计算，并将此比例列于表2中。

表2(在pH5.3和40℃条件下提取)

                  可溶部分         不溶部分

7S∶11S           96∶4            8∶92

可溶部分和不溶部分的固体中得到的氯仿甲醇可提油份的含量分别为0.8％和3.0％，这验证了油体结合蛋白集中在不溶部分中。

由实施例1和2的结果说明：在酸性条件下加热处理的步骤使通过工业上使用的低离心力能够从含有大豆蛋白的溶液中分离出含7S球蛋白的可溶部分和含11S球蛋白的不溶部分以及油体结合蛋白。

实施例3

用盐酸调节与实施例1同样提取的脱脂大豆乳的pH到4.8，然后加热到50℃。调过pH的脱脂大豆乳达到50℃后并在50℃下保持60分钟后，立即冷却至约30℃，用氢氧化钠调节到pH5.8并使用间歇式离心机(3000G)离心。在这一过程中，除保持期外观察可溶部分和不溶部分的不连续分离。离心过程中溶液的温度约为25℃。

存在于得到的可溶部分和不溶部分中的7S球蛋白和11S球蛋白的比例按与实施例1相同的方法计算，并将此比例列于表3和4中。

表3(没有在50℃下保存)

                 可溶部分        不溶部分

7S∶11S          95∶5           7∶93

表4(保持在50℃下60分钟)

                 可溶部分        不溶部分

7S∶11S          93∶7           8∶92

根据这些结果，7S球蛋白和11S球蛋白之间的相互混杂不依赖于保持期，这说明在酸性条件下的加热时间和保持的时间不需要特别地限定。

实施例4

用盐酸调节与实施例1同样提取的脱脂大豆乳的pH到4.8，然后加热到50℃。调过pH的脱脂大豆乳达到50℃后立即冷却至约30℃，用氢氧化钠调节到pH5.7和pH6.0并使用间歇式离心机(3000G)离心。在这一过程中，观察到了可溶部分和不溶部分的不连续分离。离心过程中溶液的温度约为25℃。

存在于得到的可溶部分和不溶部分的7S球蛋白和11S球蛋白的比例按与实施例1相同的方法计算，并将此比例列于表5和6中。

表5(pH5.7时分离)

                 可溶部分        不溶部分

7S∶11S          92∶8           8∶92

表6(pH6.0时分离)

                 可溶部分        不溶部分

7S∶11S          83∶17          5∶95

根据这些结果，离心时的pH值，即含7S球蛋白的可溶部分和含11S球蛋白的不溶部分分离时的pH值，可以有某些程度的不同。

实施例5

用盐酸调节与实施例1同样提取的脱脂大豆乳的pH到4.8，然后加热到50℃。调过pH的脱脂大豆乳达到50℃后立即冷却至约30℃，用氢氧化钠调节到pH5.8并使用间歇式离心机(3000G)离心。在这一过程中，观察可溶部分和不溶部分的不连续分离。离心过程中溶液的温度约为25℃。水化(2倍重量)得到的不溶部分，用氢氧化钠中和到pH7.0，使用高G离心机(5000G，10分钟)再分离得到富含11S球蛋白的上清液。另一方面，用盐酸调节可溶部分的pH到4.9，离心(3000G，5分钟)除去乳清，这样就得到了沉淀的凝乳。水化(4倍重量)沉淀的凝乳，用氢氧化钠中和以得到富含7S球蛋白的部分。

每部分在140℃下灭菌15秒，然后喷雾干燥得到两种粉末，其为分离出的富含7S球蛋白和富含11S球蛋白的大豆蛋白。表7中列出了得到的7S球蛋白和11S球蛋白的组成。

表7

                    7S球蛋白       11S球蛋白

水                  5.0％          5.0％

总蛋白(以干重计)    97.8％         96.8％

纯度(SPE标准)       94.8％         92.2％

氯仿甲醇可提油份    0.8％          2.0％

肌醇六磷酸          2.1％          2.0％

校正纯度            87.2％         73.8％

由上述的结果表明：以脱脂大豆乳作为起始原料，从中得到了氯仿甲醇可提油份含量减少了的高纯度的7S和11S球蛋白。

实施例6

用盐酸调节与实施例1同样提取的脱脂大豆乳的pH到4.5，然后使用间歇式离心机(2000G)离心以分离出不溶部分(此后指的是酸沉淀凝乳)和可溶部分(乳清)。酸沉淀凝乳(即分离出的大豆蛋白)与水混合并充分地分散，然后加热到50℃。酸沉淀凝乳的分散体达到50℃后立即冷却至约30℃，用氢氧化钠调节到pH5.8并用间歇式离心机(3000G)离心。结果是观察到了可溶部分和不溶部分的不连续分离。离心过程中溶液的温度约为25℃。水化(2倍重量)得到的不溶部分并用氢氧化钠中和。另一方面，用盐酸调节可溶部分的pH到4.9，离心除去乳清，这样就得到了酸沉淀的凝乳。水化(4倍重量)沉淀的凝乳并用氢氧化钠中和。中和的部分都在140℃下灭菌15秒，然后喷雾干燥得到两种粉末，其为分离出的富含7S球蛋白和富含11S球蛋白的大豆蛋白。

存在于经过上述分离后得到的可溶部分和不溶部分的7S球蛋白和11S球蛋白的比例按与实施例1相同的方法计算，并将此比例列于表8中。

表8

                 可溶部分        不溶部分

7S∶11S          96∶4           10∶90

由这些结果说明：即使使用酸沉淀的凝乳(分离出的大豆蛋白)作为要分离的大豆蛋白溶液，在酸性条件下的加热处理步骤能够使富含7S球蛋白的可溶部分和富含11S球蛋白的不溶部分精确地分离。

实施例7

用盐酸调节与实施例1同样提取的脱脂大豆乳的pH到6.2并加热到40℃。将这种溶液(肌醇六磷酸含量为2.20％/重量蛋白，根据AliiMohamed的方法测定(Cereal Chemistry 63，475-478，1986))与8单位/重量蛋白质(1个单位的肌醇六磷酸酶活性对应的酶量是在反应初期的条件为pH5.5和37℃下，1分钟从肌醇六磷酸中分离出1μ摩尔的磷酸盐的酶量)的肌醇六磷酸酶(NOVO，PHYTASE NOVO L)混合并进行酶促反应30分钟。反应后(肌醇六磷酸浓度：0.05％/重量蛋白)，用盐酸调pH到4.8，通过加热升温至50℃。调过pH且肌醇六磷酸酶处理过的溶液达到50℃后立即冷却至约30℃，用氢氧化钠调节到pH6.2并用间歇式离心机(3000G)离心。结果是观察到了可溶部分和不溶部分的不连续分离。

离心过程中溶液的温度约为25℃。水化(2倍重量)得到的不溶部分并用氢氧化钠中和。另一方面，用盐酸调节可溶部分的pH到4.9，离心除去乳清，这样就得到了酸沉淀的凝乳。水化(4倍重量)沉淀的凝乳并用氢氧化钠中和。中和的部分都在140℃下灭菌15秒，然后喷雾干燥得到两种粉末，其为分离出的富含7S球蛋白和富含11S球蛋白的大豆蛋白。

存在于经过上述分离后得到的可溶部分和不溶部分的7S球蛋白和11S球蛋白的比例按与实施例1相同的方法计算，并将此比例和每干燥样品重量的肌醇六磷酸含量列于表9中。

表9

                可溶部分       不溶部分

7S∶11S         95∶5          8∶92

肌醇六磷酸      0.05％         0.05％

由这些结果说明：即使使用其中的肌醇六磷酸被肌醇六磷酸酶分解的大豆蛋白溶液，在酸性条件下的加热处理步骤也能够精确地分离富含7S球蛋白的可溶部分和富含11S球蛋白的不溶部分。

实施例8

与实施例1同样提取的脱脂大豆乳分成两份样品A和B。用盐酸调样品A的pH到4.8，然后加热到50℃。调过pH的脱脂大豆乳达到50℃后立即冷却至约45℃，用氢氧化钠调节到pH5.8并使用间歇式离心机(3000G)离心。结果是观察到了可溶部分和不溶部分的不连续分离。离心过程中溶液的温度约为40℃。得到的可溶部分加热到40℃，再分为两份样品A-1和A-2，样品A-1与8单位/重量蛋白质的肌醇六磷酸酶(NOVO，“PHYTASE NOVO L”)混合并进行酶促反应30分钟。反应后，用盐酸调节样品A-1和A-2的pH到4.9，离心(3000G，5分钟)以除去乳清部分，得到沉淀的凝乳。水化(4倍重量)沉淀的凝乳，用氢氧化钠中和到pH7.0。中和过的部分都在140℃下灭菌15秒，然后喷雾干燥得到经过肌醇六磷酸酶处理的纯化过的7S球蛋白部分和未经肌醇六磷酸酶处理的纯化过的7S球蛋白部分(A-1，A-2)。

另一方面，样品B的pH调为6.4，保持在4℃下过夜，离心(5000G，4℃，10分钟)得到上清液，再调pH到4.5，离心(3000G，5分钟)得到沉淀物，回收作为低温沉淀的7S球蛋白。

低温沉淀的7S球蛋白的沉淀物与4倍体积的水混合，调pH为6.0，然后分为两份样品B-1和B-2。样品B-1与8单位/重量蛋白质的肌醇六磷酸酶(NOVO，PHYTASE NOVO L)混合并进行酶促反应30分钟。反应后，用盐酸调节样品B-1和B-2的pH到4.9，离心(3000G，5分钟)以除去乳清部分，得到沉淀的凝乳。水化沉淀的凝乳，用氢氧化钠中和到pH7.0。灭菌然后喷雾干燥得到经过肌醇六磷酸酶处理的低温沉淀的7S球蛋白部分和未经肌醇六磷酸酶处理的低温沉淀的7S球蛋白部分(B-1，B-2)。

每种样品的组成列于表10中。

表10

                      纯化过的7S球蛋白   低温沉淀的7S球蛋白

                      A-1      A-2       B-1      B-2

水                    4.8％    4.7％     4.7％    4.9％

总蛋白                98.1％   98.0％    97.2％   97.2％

纯度(SPE标准)         97.1％   97.1％    78.2％   78.3％

氯仿甲醇可提油份      0.7％    0.7％     2.8％    2.8％

肌醇六磷酸            0.06％   1.9％     0.07％   2.0％

校正纯度              90 3％   90 3％    56 3％   56 3％

总蛋白以干重计。

由这些结果说明肌醇六磷酸酶的处理对油体结合蛋白的存在没有影响。低温沉淀的7S球蛋白显示的基于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的纯度(SPE标准)高达80％，而考虑了油体结合蛋白后，其校正纯度低，大约为60％，这说明了本发明的7S球蛋白的纯度高。

实施例9

与实施例6同样制备的酸沉淀凝乳与水混合并充分地分散，用氢氧化钠调到pH5.0，然后加热到40℃。

这种酸沉淀凝乳的分散体与8单位/重量蛋白质的肌醇六磷酸酶(NOVO，“PHYTASE NOVO L”)混合并进行酶促反应30分钟。反应后立即冷却样品至约30℃，用氢氧化钠调节到pH6.0并用间歇式离心机(3000G)离心。结果是观察到了可溶部分和不溶部分的不连续分离。离心过程中溶液的温度约为25℃。水化(2倍重量)得到的不溶部分并用氢氧化钠中和。另一方面，用盐酸调节可溶部分的pH到4.9，离心除去乳清，这样就得到了酸沉淀的凝乳。水化(4倍重量)沉淀的凝乳并用氢氧化钠中和。中和的部分都在140℃下灭菌15秒，然后喷雾干燥得到两种制剂，其为分离出的进行了肌醇六磷酸酶处理的富含7S球蛋白和富含11S球蛋白的大豆蛋白。

存在于经过上述分离后得到的可溶部分和不溶部分的7S球蛋白和11S球蛋白的比例按与实施例1相同的方法计算，并将此比例和每干燥样品重量的肌醇六磷酸含量列于表11中。

表11

                  可溶部分       不溶部分

7S∶11S           94∶6          7∶93

肌醇六磷酸        0.06％         0.07％

实施例10

一重量份的与实施例1同样脱脂的低变性脱脂大豆与10重量份的用于提取的水在40℃下混合，用盐酸调pH到5.3。此溶液与8单位/重量蛋白质的肌醇六磷酸酶(NOVO，PHYTASE NOVO L)混合，然后在40℃下处理30分钟，处理包括提取蛋白质和酶促反应，这样得到酶处理过的浆状提取物。冷却酶处理过的浆状提取物至约25℃，用盐酸调节pH到6.1，再用间歇式离心机(3000G)离心。结果是观察到了可溶部分和不溶部分的不连续分离。离心过程中溶液的温度约为25℃。

水化(脱脂大豆量的7倍)得到的不溶部分，用氢氧化钠调节pH到7.2，提取30分钟再离心除去不溶的部分，这样得到了富含11S球蛋白的上清液。将一半上清液用高G离心机(5000G，10分钟)再分离得到更澄清的上清液。用盐酸调节富含11S球蛋白的上清液的pH到5.0，离心得到沉淀的凝乳。水化(4倍重量)沉淀的凝乳并用氢氧化钠中和。在140℃下灭菌15秒，然后喷雾干燥得到进行了肌醇六磷酸酶处理的富含11S球蛋白的大豆蛋白。

另一方面，用盐酸调节可溶部分的pH到4.9，离心得到沉淀的凝乳。用10倍体积的水洗涤沉淀的凝乳，水化(4倍重量)沉淀的凝乳并用氢氧化钠中和。在140℃下灭菌15秒，然后立即喷雾干燥得到进行了肌醇六磷酸酶处理的富含7S球蛋白的大豆蛋白。

存在于经过上述分离后得到的可溶部分和不溶部分的7S球蛋白和11S球蛋白的比例按与实施例1相同的方法计算，并将此比例和肌醇六磷酸的含量列于表12中。

表12

                  可溶部分       不溶部分

7S∶11S           94∶6          7∶93

肌醇六磷酸        0.06％         0.09％

表13中列出了富含7S球蛋白的蛋白质(表中的7S)和富含11S球蛋白的蛋白质(表中的11S)以及作为参考对照物的商品化分离蛋白(“FUJIPRO-F”，表中的SPI)三种粉末的组成。

表13

          水       总蛋白   7S/11S   肌醇六     氯仿·甲醇

                            比例     磷酸       可提取的油份

          (％)     (％)              (％)       (％)

7S        4.3      98.2     95/5     0.06       0.7

11S       5.5      94.3     4/96     0.09       2.8

(未再分离)

11S       4.8      98.2     4/96     0.09       1.8

(再分离)

SPI       5.5      90.2     30/70    1.8        3.5

总蛋白以干重计。

测定富含7S球蛋白的蛋白质的氨基酸组成，结果表明甲硫氨酸+半胱氨酸的含硫氨基酸的含量是12mg/g蛋白。而纯度差的7S球蛋白如胰蛋白酶抑制剂中含硫氨基酸的含量通常是15mg/g或更高，原因是混在蛋白质部分的杂蛋白含有大量的含硫氨基酸，不象彻底纯化的7S球蛋白其典型的含硫氨基酸的含量是5mg/g，本发明含硫氨基酸的含量低进一步证明了本发明7S球蛋白的纯度高。

实施例11

一重量份的与实施例1同样脱脂的低变性脱脂大豆与10重量份的用于提取的水在40℃下混合，用盐酸调pH到6.1。此溶液与8单位/重量蛋白质的肌醇六磷酸酶(NOVO，“PHYTASE NOVO L”)混合，然后在40℃下处理30分钟，处理包括提取蛋白质和酶促反应，这样得到酶处理过的浆状提取物。冷却酶处理过的浆状提取物至约25℃，用盐酸调节pH到6.1，再用间歇式离心机(3000G)离心。结果是观察到了可溶部分和不溶部分的不连续分离。离心过程中溶液的温度约为25℃。水化(脱脂大豆量的7倍)得到的不溶部分，用氢氧化钠调节pH到7.2，提取30分钟再离心除去不溶的部分，这样得到了富含11S球蛋白的上清液。用盐酸调节富含11S球蛋白的上清液的pH到5.0，离心得到沉淀的凝乳。水化(4倍重量)沉淀的凝乳并用氢氧化钠中和。在140℃下灭菌15秒，然后喷雾干燥得到了肌醇六磷酸酶处理过的富含11S球蛋白的大豆蛋白。另一方面，用盐酸调节可溶部分的pH到4.9，离心得到沉淀的凝乳。水化(4倍重量)沉淀的凝乳并用氢氧化钠中和。在140℃下灭菌15秒，然后喷雾干燥得到进行了肌醇六磷酸酶处理的富含7S球蛋白的大豆蛋白。

存在于经过上述分离后得到的可溶部分和不溶部分的7S球蛋白和11S球蛋白的比例按与实施例1相同的方法计算，并将此比例和固体样品中肌醇六磷酸的含量列于表14中。

表14

                 可溶部分       不溶部分

7S∶11S          89∶11         7∶93

肌醇六磷酸       0.09％         0.12％

实施例12

用盐酸调节与实施例1同样提取的脱脂大豆乳的pH到5.0，然后加热到40℃。脱脂大豆乳在40℃保持30分钟，或其与8单位/重量蛋白质的肌醇六磷酸酶(NOVO，“PHYTASE NOVO L”)混合后在40℃保持30分钟。冷却至大约30℃之后，加入氢氧化钠调未经处理的溶液的pH在5.8，调经过肌醇六磷酸酶处理的溶液pH到6.0。两种溶液每种100克用间歇式离心机(3000G)离心。结果是观察到了可溶部分和不溶部分的不连续分离。离心过程中溶液的温度约为25℃。上述离心分离的每种不溶部分的沉淀量列于表15中。

表15

              未经肌醇六磷酸酶    经过肌醇六磷酸酶

                    处理               处理

沉淀量(g)           12.2               10.6

固体(g)             27.0               31.1

回收固体(g)         3.3                3.3

实施例13

与实施例6同样制备的酸沉淀凝乳与水混合并充分地分散，用氢氧化钠调pH到5.0，然后加热到40℃。酸沉淀凝乳在40℃保持30分钟，或其与8单位/重量蛋白质的肌醇六磷酸酶(NOVO，“PHYTASE NOVOL”)混合后在40℃保持30分钟。冷却至大约30℃之后，加入氢氧化钠调未经处理的溶液的pH在5.8，调经过肌醇六磷酸酶处理的溶液pH到6.0。每种凝乳浆的浓度调为5％，并用间歇式离心机(3000G)离心。结果是观察到了可溶部分和不溶部分的不连续分离。离心过程中溶液的温度约为25℃。

上述离心分离的每种不溶部分的沉淀量列于表16中。

表16

               未经肌醇六磷酸     经过肌醇六磷酸

                   酶处理             酶处理

沉淀量(g)           15.5               13.5

固体(g)             26.5               30.4

回收固体(g)         4.1                4.1

由实施例12和13的结果表明使用肌醇六磷酸酶分解肌醇六磷酸在分离含7S球蛋白的可溶部分和含11S球蛋白的不溶部分时提高了不溶部分的脱水速度，这样分离操作更加简单。

对比例1

与实施例1同样提取的脱脂大豆乳在沸水浴沸腾10分钟。用水冷却后，用盐酸调节样品的pH到4.8，然后加热到50℃。调过pH的脱脂大豆乳达到50℃后立即冷却至约30℃，pH调到5.8并使用间歇式离心机(3000G)离心，但未观察到可溶部分和不溶部分的不连续分离。因此使用8000G的间歇式离心机离心样品以得到不溶部分和可溶部分。然而，得到的可溶部分的蛋白回收％低，仅为30.3％，并且由SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳确定的可溶部分的组成表明几乎不含7S球蛋白。

通过这些结果发现：在酸性条件下加热之前进行加热明显对分离有不利影响。

(分离的大豆蛋白的溶解图)

比较测定实施例6中得到的肌醇六磷酸未分解的7S和11S球蛋白以及实施例9中得到的肌醇六磷酸被分解的7S和11S球蛋白这四种分离的大豆蛋白的溶解图。

溶解图的评价是根据用盐酸调为pH1的分离大豆蛋白溶液(1％)中通过9000G离心得到的可溶部分中含有的蛋白质占蛋白总量的比例。制备1％的溶液，调节pH和离心均在25℃下进行。

图2和3分别表示7S球蛋白和11S球蛋白的溶解图。

由这些结果说明：分解肌醇六磷酸使7S球蛋白的溶解度在pH为4或更低时大大地增加，而pH为6.5或更高时11S球蛋白的溶解度减小。

工业应用

如上所述，本发明包括在弱酸性条件下加热含有大豆蛋白的溶液，然后在pH 5.6至6.6时分离出可溶部分和不溶部分，其能以工业规模有效地实现。

Claims (15)

1、一种生产分级大豆蛋白的方法，其包括在pH3.8至6.8的弱酸性条件、在30至75℃的温度下加热含有大豆蛋白的溶液，然后在pH5.6至6.6时分离出富含7S球蛋白的可溶部分和富含11S球蛋白的不溶部分。

2、根据权利要求1的方法，其中，含有大豆蛋白的溶液是含水的大豆浆，从含水大豆蛋白浆得到的大豆乳，含水的脱脂大豆浆，由含水的脱脂大豆浆得到的脱脂大豆乳，及酸沉淀的大豆蛋白浆或分离出的大豆蛋白溶液。

3、根据权利要求1的方法，其中，在分离成可溶部分和不溶部分之前，通过向含有大豆蛋白的溶液中添加肌醇六磷酸酶切割与大豆蛋白共存的肌醇六磷酸。

4、根据权利要求1的方法，其中可溶部分的7S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)的比值是0.4或更高。

5、根据权利要求1的方法，其中可用2∶1的氯仿∶甲醇混合物提取的极性脂类在可溶部分的固体组分中总计1％或更少。

6、根据权利要求3的方法，其中肌醇六磷酸在可溶部分的固体组分中总计1.2％或更少。

7、根据权利要求1的方法，其中不溶部分的11S球蛋白/(11S球蛋白+7S球蛋白)的比值是0.7或更高。

8、根据权利要求3的方法，其中肌醇六磷酸在不溶部分的固体组分中总计1.2％或更少。

9、根据权利要求1的方法，其中不溶部分的11S球蛋白使用接近中性的水溶液提取，然后离心得到提取部分。

10、根据权利要求9的方法，其中，所述的离心在4000G或更高的条件下进行以获得提取部分，所述的提取组分中可用2∶1的氯仿∶甲醇混合物提取的极性脂类的含量为所述提取部分中固体组分的2％或更少。

11、根据权利要求9的方法，其中与大豆蛋白共存的肌醇六磷酸被附加的肌醇六磷酸酶切割，肌醇六磷酸在提取部分的固体组分中总计1.2％或更少。

12、由权利要求1的方法获得的高纯度7S球蛋白，其7S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)的比值是0.4或更高并且其中可用2∶1的氯仿∶甲醇混合物提取的极性脂类在固体组分中总计1％或更少。

13、根据权利要求12的高纯度7S球蛋白，其中肌醇六磷酸在固体组分中总计1.2％或更少。

14、由权利要求10的方法获得的高纯度11S球蛋白，其中11S球蛋白/(11S球蛋白+7S球蛋白)的比值是0.7或更高并且其中可用2∶1的氯仿∶甲醇混合物提取的极性脂类在固体组分中总计2％或更少。

15、根据权利要求14的高纯度11S球蛋白，其中肌醇六磷酸在固体组分中总计1.2％或更少。

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