CN1235978A - 参与活化腈水合酶的蛋白以及编码它的基因 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种参与活化来自嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)JCM3095的腈水合酶的蛋白以及编码它的基因。另外,本发明提供含有该基因的重组质粒、含有该基因和腈水合酶基因的重组质粒、通过用重组质粒转化获得的转化菌株以及使用培养物溶液从腈化合物制备相应酰胺化合物的方法和通过培养转化菌株获得的细胞以及经处理的细胞产物。

Description

参与活化腈水合酶的蛋 白以及编码它的基因

本发明涉及一种参与活化来自嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardiathermophila)JCM3095(下文简单地称为“嗜热假诺卡氏菌”)的腈水合酶的蛋白以及编码它的基因。另外，本发明涉及含有该基因的重组质粒、含有该基因和腈水合酶基因的重组质粒、通过用重组质粒转化而获得的转化菌株以及使用转化菌株从腈化合物制备相应的酰胺化合物的方法和通过培养转化菌株获得的培养物溶液以及其经处理的产物。

最近一些年来，公开了腈水合酶以及大量产生这种酶的微生物菌株，其中腈水合酶为一种具有通过水合作用将各种化合物的腈基转化成酰胺基的腈水合活性的酶。

为了使用腈水合酶从腈化合物工业化生产酰胺化合物，降低占据酰胺化合物生产成本的酶的生产成本是非常重要的。具体地说，不得不增加占微生物单位重量的酶的含量。在这方面，已研究了一种克隆该酶基因的方法来通过使用该酶基因的遗传工程的方法大量表达此酶。

本发明人发现嗜热假诺卡氏菌是一种具有腈水合酶活性的微生物(JP-A-8-56684)。发明人进一步从相同菌株中分离了腈水合酶，并鉴定该酶由一个α-亚基和一个β-亚基组成。另外，他们从相同菌株中分离了腈水合酶基因，阐明了其氨基酸序列和基因序列，成功地制备了能在大肠杆菌(Escherichia coli)中大量表达基因的重组质粒和通过用相同质粒转化获得的转化的大肠杆菌菌株(欧洲专利申请公开号079310)。另外，对于嗜热假诺卡氏菌，该菌株以JCM3095保藏在Rikagaku Kenkyusho,Biseibutsu Keito Hozon Shisetsu(2-1,Hirosawa,Wako-shi,Saitama-Ken)，并且免费地分送给需要的任何人。

本发明提供参与活化在欧洲专利申请公开号0790310中描述的来自嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的蛋白、编码它的基因、含有该基因的重组质粒、通过用重组质粒转化获得的转化菌株以及使用转化菌株从腈化合物制备相应的酰胺化合物的方法和通过培养转化菌株获得的培养物溶液以及其经处理的产物，其中通过详细分析能在大肠杆菌大量表达该酶的重组质粒(pPT-DB1)对该蛋白进行了阐明。

发明人详细分析了转导在JP-A-9-275978描述的MT-10822菌株的重组质粒pPT-DB1中的来自嗜热假诺卡氏菌的DNA片段的碱基序列。结果他们获得了下面五个发现。第一，发现不同于腈水合酶结构基因(α-和β-亚基结构基因)的第三个开放阅读框(下文称为“ORF3’)存在于pPT-DB1的DNA片段中，并且ORF3编码具有分子量为约15,900的蛋白。第二，它们制备了质粒pPT-D1，其中仅克隆了α-亚基的开放阅读框(下文称为“ORF2”)和β-亚基的开放阅读框(下文称为“ORF1”)以及pPT-DB1中的ORF3，并已鉴定用该质粒转化所获得的转化的大肠杆菌具有腈水合酶活性。第三，他们构建了仅具有来自pPT-DB1的ORF1和ORF2的重组质粒pPT-F1。作为测定用该质粒转化所获得的转化的大肠杆菌的腈水合酶活性结果，没有从该大肠杆菌中检测出腈水合酶活性。同时，在细胞中观察到对应于α-和β-亚基的多肽链的存在。第四，从pPT-DB1制备了其中仅ORF3区被克隆的质粒pPT-G1，并已鉴定在通过用该质粒转化所获得的转化的大肠杆菌中未观察到腈水合酶活性。第五，从pPT-F1制备了其中具有lacZ启动子、ORF1和ORF2的区通过PCR被扩增以及产生的扩增的DNA片段被重新克隆至pPT-G1的ORF3的3’一末端下游的质粒pPT-H1。测定了用该质粒转化所获得的转化的大肠杆菌的腈水合酶活性，从而，在该大肠杆菌中测定了腈水合酶活性。

从这些发现中，发明人总结出为了让在其中转导了来自嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的大肠杆菌显示相同的活性，ORF3区的存在是必不可少的，另外在对第二、第三和第五个发现的研究中发现ORF3的翻译产物的存在也是必不可少的。并且从这一事实中，即相同的酶由α-亚基和β-亚基组成(欧洲专利申请公开号079310)，以及甚至当具有三个开放阅读框ORF1至ORF3的最小DNA片段被转导在大肠杆菌时，重组大肠杆菌显示出腈水合酶活性(第二个发现)，总结出ORF3的翻译产物参与腈水合酶的活化。即，总结出ORF3是一个编码参与活化来自嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的蛋白的基因座。从而完成了本发明。

也就是说，本发明提供一种参与活化来自嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardiathermophila)的腈水合酶的蛋白以及编码它的基因。另外，本发明提供含有该基因的重组质粒、含有该基因和腈水合酶基因的质粒、通过用重组质粒转化获得的转化菌株以及使用转化菌株从腈化合物制备相应酰胺化合物的方法和通过培养转化菌株获得的培养物溶液以及其经处理的产物。

图1为pPT-DB1的限制性内切酶裂解位点图。图2为pPT-D1的限制性内切酶裂解位点图。图3为质粒pPT-E1的限制性内切酶裂解位点图。图4为质粒pPT-F1的限制性内切酶裂解位点图。图5为质粒pPT-G1的限制性内切酶裂解位点图。图6为质粒pPT-H1的限制性内切酶裂解位点图。符号的说明：bla：编码β-内酰胺酶的基因ColE1-Ori:ColE1型的复制起始位点LacZ：来自pUC18的乳糖操纵子的启动子和操纵子区NHα：编码来自嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的α-亚基的基因NHβ：编码来自嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的β-亚基的基因P16：编码参与来自嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶活化的蛋白的基因P16(部分)：编码参与来自嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶活化的蛋白的基因的部分区域

进行本发明的方式

下面详细描述本发明。

如解决问题的方法以及后面将描述的实施例中所述的，本发明中参与来自嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶活化的蛋白(下文简单地称为“腈水合酶活化蛋白”)是一种其表达直接影响来自嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的活化的蛋白。

作为本发明中的腈水合酶活化蛋白的具体的实例，可提及来自嗜热假诺卡氏菌的蛋白。近些年来的分子生物学以及遗传工程的发展已使得有可能并相对容易通过直接涉及该腈水合酶活化蛋白的分子生物学特性和氨基酸序列，从与嗜热假诺卡氏菌大不相同的微生物菌株获得具有与来自嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶活化蛋白相同活性的蛋白。根据这些技术标准，来自非嗜热假诺卡氏菌的微生物菌株但参与来自嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的活化的蛋白被包括在本发明中。这样的微生物菌株的优选实例包括属于下列属的菌株：诺卡氏菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属、嗜热芽孢杆菌、假诺卡氏菌、微球菌属、红球菌属、典型的种为紫红红球菌、不动杆菌属、黄色杆菌属、链霉菌属、根瘤菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、气单胞菌属、柠檬酸杆菌属、无色杆菌属、土壤杆菌属或非嗜热假诺卡氏菌JCM3095菌株的假诺卡氏菌。

作为本发明的腈水合酶活化蛋白的具体实例，可提及由序列表中的序列号1所示的氨基酸序列组成的蛋白。而且，甚至当使用相同的碱基序列基因作为模板进行转录和翻译时，有时通过在翻译后，用取决于基因被转导，培养中所使用营养培养基的各组分或组成，以及保温温度或pH的宿主类型的宿主中的酶进行修饰来制备部分变异体蛋白，其中虽然保持预测的功能，但该蛋白在序列表中的N末端附近的一个或多个氨基酸缺失或一个或多个氨基酸被重新加到N-末端。而且，重组DNA技术的发展使得有可能相对容易地将构成蛋白的一个或多个氨基酸用其它氨基酸置换、缺失、删除或***而基本不改变蛋白的功能。根据这一技术标准，本发明涉及的腈水合酶活化蛋白不仅包括具有如序列表的序列号1所示的氨基酸序列的蛋白，而且还包括具有其中一个或多个氨基酸被其它氨基酸置换、缺失、删除或***的氨基酸序列并参与来自嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的活化的部分变异体蛋白。

也就是说，本发明蛋白的典型实例为由序列表的序列号1中所示的144个氨基酸序列组成的腈水合酶活化蛋白。此外，在本发明中，只要其参与来自嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的活化，如序列表的序列号1所示的通过置换、缺失、删除或***部分氨基酸序列获得的部分变异体蛋白被包括在本发明中。

对于本发明中的腈水合酶活化蛋白，来自嗜热假诺卡氏菌并由系列表中的序列号1所示的氨基酸序列组成的蛋白可提出作为一个典型的实例。而且，近些年来遗传工程的发展使得有可能并相对容易通过直接针对来自嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶活化蛋白的氨基酸序列而获得具有与该蛋白相同的功能而来自与嗜热假诺卡氏菌极不相同的微生物菌株的蛋白。根据这一技术标准，来自非嗜热假诺卡氏菌的微生物菌株并具有序列表中的序列号1所示的氨基酸序列的蛋白，或具有其中一个或多个氨基酸被其它氨基酸置换、缺失、删除或***的氨基酸序列并参与来自嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的活化的蛋白被包括在本发明中。这样的微生物菌株的优选实例包括属于下面属的菌株：诺卡氏菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属、嗜热芽孢杆菌、假诺卡氏菌、微球菌属、红球菌属、典型种为紫红红球菌、不动杆菌属、黄色杆菌属、链霉菌属、根瘤菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、气单胞菌属、柠檬酸杆菌属、无色杆菌属、土壤杆菌属或非嗜热假诺卡氏菌JCM3095菌株的假诺卡氏菌。

本发明包括编码腈水合酶活化蛋白的基因序列。只要它是编码本发明的腈水合酶活化蛋白的基因，对于编码本发明腈水合酶活化蛋白的基因没有特别的限制。

在本发明中，编码序列表中的序列号1中所示的144个氨基酸的序列的碱基序列被包括在编码本发明腈水合酶活化蛋白的基因的范围内。而且，在本发明中，当通过置换、缺失、删除或***序列表中的序列号1所示的部分氨基酸序列获得的部分变异体蛋白参与来自嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的活化时，编码部分变异体蛋白的氨基酸序列的碱基序列也被包括在本发明编码腈水合酶活化蛋白的基因的范围内。

对于编码本发明腈水合酶活化蛋白的基因来讲，序列表中的序列号2所示的第1328-1762号碱基的碱基序列可提出作为典型实例。而且，重组DNA技术的发展使得有可能相对容易地用其它碱基序列置换在翻译中作为模板的DNA碱基序列而基本不改变蛋白的氨基酸序列。

另一方面，有可能通过置换、缺失、删除或***翻译中作为模板的DNA碱基序列，将组成蛋白的一个或多个氨基酸用其它氨基酸置换、缺失、删除或***而基本不改变蛋白的功能。根据这一技术标准，编码本发明的腈水合酶活化蛋白的基因当然具有序列表中的序列号2所示的第1328-1762位碱基的碱基序列。只要它起着参与来自嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶活化的蛋白的模板的作用，那么其中DNA碱基序列的一个或多个碱基被其它碱基置换、缺失、删除或***的部分变异体的序列也包括在本发明中。

也就是说，本发明包括编码腈水合酶活化蛋白并由序列表中的序列号2所示的第1328-1762位碱基组成的基因。而且，只要由前面基因编码的蛋白参与来自嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的活化，则具有通过置换、缺失、删除或***序列表中的序列号2所示的第1328-1762号碱基的碱基序列的一部分而获得的碱基序列的基因被包括在编码本发明的腈水合酶活化蛋白的基因中。

本发明包括其中***了编码腈水合酶活化蛋白的基因的重组质粒的构建物。具体地说，它为一种其中编码腈水合酶活化蛋白的基因被***到具有基因表达所需控制区以及自我复制所需区的质粒载体中的质粒。

表达所需的控制区指启动子序列(包括控制转录的操纵子序列)、核糖体结合序列(SD序列)以及转录终止序列。启动子序列的具体实例包括色氨酸操纵子的trp启动子、来自大肠杆菌的乳糖操纵子的lac启动子、来自λ噬菌体的P_L启动子和P_R启动子以及葡糖酸合成酶启动子(gnt)、碱性蛋白酶启动子(apr)、中性蛋白酶启动子(npr)以及来自枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶启动子(amy)。另外，还可使用被各自修饰和设计的序列，如tac启动子。作为核糖体结合序列，可提及本发明中的假诺卡氏菌的固有序列或来自大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的序列。其没有特别限制，只要它是在所需宿主，如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中发挥功能的序列。例如，作为与16S核糖体RNA的3’-末端区互补的序列，其中至少4个碱基连续在一起的共有序列可通过DNA合成来制备并使用。转录终止序列不是必需的。可使用非ρ因子依赖序列，例如，脂蛋白终止子或trp操纵子终止子。对于重组质粒中的控制区的序列顺序，可建议从5’-末端上游以此顺序排列，即启动子序列、核糖体结合序列、编码腈水合酶活化蛋白的基因以及转录终止序列。

质粒载体的具体实例包括具有在大肠杆菌中能自动复制的区的pBR322、pUC18、Bluescript Ⅱ SK(+)、pKK223-3和pSC101以及具有在枯草芽孢杆菌中自我复制的区的pUB110、pTZ4、PC194、ρ11、φ1和φ105。另一方面，能在两种或多种宿主中自我复制的质粒包括pHV14、TRp7、YEp7和pBS7。

本发明包括重组质粒构建物，其中编码腈水合酶活化蛋白的基因和腈水合酶基因被同时***。即，它是通过将两种基因***到含有表达两种基因所需的控制区和自我复制所需区的质粒载体中而获得的重组质粒。它是一种当被导入任何宿主中时，允许该酶的产生和活化的重组质粒。具体地，可选择上述含有表达所需的控制区和自我复制所需的区的质粒载体。而且，编码腈水合酶活化蛋白的基因以及腈水合酶的α-亚基基因和β-亚基基因可以具有该控制区的独立的顺反子或具有共同控制区的多顺反子的形式表达。

作为本发明腈水合酶基因的典型实例，可提及来自嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶基因。具体地说，提到的是由序列表中的序列号2所示的第714-1331位碱基的碱基序列代表的编码α亚基的基因以及由序列表中的序列号2所示的第16-717位碱基的碱基序列代表的编码β亚基的基因。即，它为其中α亚基由618个碱基的碱基序列组成以及β亚基由702个碱基的碱基序列组成的碱性腈水合酶。重组DNA技术的发展使得有可能相对容易地用其它碱基序列置换在翻译中作为模板的DNA碱基序列而基本不改变酶的氨基酸序列，或通过置换、缺失、删除或***作为翻译模板的DNA碱基序列，将组成该酶的一个或多个氨基酸用其它氨基酸置换，缺失、删除或***而基本不改变酶的活性。根据这一技术标准，本发明涉及的来自嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶基因不仅包括具有由序列表中的序列号2所示的第714-1331位碱基的碱基序列代表的α亚基和由序列表中的序列号2所示的第16-717位碱基的碱基序列代表的β亚基的基因，而且包括其部分变异体序列的基因，只要它可起具有腈水合酶活性的蛋白的模板的作用，其中DNA碱基序列的一个或多个碱基被用其它碱基置换、缺失、删除或***。

具体地，如欧洲专利申请公开号0790310中所述，可提及具有α-亚基基因作为其组成成分的腈水合酶基因，其中α-亚基基因通过用其它碱基序列置换碱基序列第729-731位碱基、第768-770位碱基、第825-827位碱基、第942-944位碱基、第981-983位碱基、第1017-1019位碱基、第1029-1031位碱基、第1089-1091位碱基、第1101-1103位碱基、第1137-1139位碱基、第1149-1151位碱基、第1271-1274位碱基、第1293-1295位碱基以及第1320-1322位碱基的碱基序列中的一个或多个碱基所获得的碱基序列代表。

即，本发明包括编码具有通过用其它氨基酸置换第6、19、38、77、90、102、106、126、130、142、146、187、194以及203位氨基酸中的一个或几个而获得的α-亚基作为其一个组成成分的腈水合酶的基因。

同样，可提及具有β亚基基因作为其一个组成成分的腈水合酶基因，其中β亚基基因通过用其它碱基序列置换如序列表中的序列号2所示的碱基序列第73-75位碱基、第76-78位碱基、第337-339位碱基、第613-615位碱基以及第649-651位碱基的碱基序列的-个或多个而获得的碱基序列代表。

即，本发明包括编码腈水合酶并具有通过用其它氨基酸置换β亚基的第20、21、108、200以及212位氨基酸中的一个或多个而获得的β-亚基作为其一个组成成分的基因。

本发明的腈水合酶基因不具体局限于来自嗜热假诺卡氏菌的基因，它还包括来自其它微生物菌株的腈水合酶基因，只要它们用本发明的腈水合酶活化蛋白活化。这样的微生物菌株的优选实例包括属于下面属的菌株：诺卡氏菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属、嗜热芽孢杆菌、假诺卡氏菌、微球菌属、红球菌属、典型种紫红红球菌、不动杆菌属、黄色杆菌属、链霉菌属、根瘤菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、气单胞菌属、柠檬酸杆菌属、无色杆菌属、土壤杆菌属或非嗜热假诺卡氏菌JCM3095菌株的假诺卡氏菌。

本发明包括通过将重组质粒导入任选的微生物宿主中所获得的转化体。同时，可使用编码腈水合酶活化蛋白的基因以及腈水合酶的α亚基基因和β亚基基因存在于相同质粒载体中的重组质粒，或可同时转导其中各个基因存在于独立的质粒载体中的多个重组质粒。另一方面，作为这里所涉及的任选的宿主，大肠杆菌被提及作为典型的实例。然而，它不具体局限于大肠杆菌，还包括属于杆菌属的菌株，如枯草芽孢杆菌以及其它微生物菌株，如酵母和actinomycetes。例如，MT-10822(根据日本细则，该菌株于1996年2月7日保藏在the National Institute of Bioscience and Human-Technology of theAgency of Industrial Science and Technology of the Ministry ofInternation Trade and Industry，保藏号为FERM P-15426，接着根据布达佩斯条约，于1997年1月10日被转到国际保藏机构，在该保藏机构指定号为No.FERM BP-5785；保藏机构的地址为1-3,Higashi 1 chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,Japan)。

对于通过将编码本发明的腈水合酶活化蛋白的基因和/或来自嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶基因***到含有表达外源基因所需区的质粒载体中来构建本发明重组质粒的方法，可根据如“分子克隆，第二版”(T.Maniatis等；冷泉港实验室出版，1989)中描述的遗传工程领域中已知的一般方法，将重组质粒转化到所需宿主中。

本发明包括从腈化合物制备相应的酰胺化合物的方法，它包括将编码腈水合酶活化蛋白的基因以及腈水合酶基因同时导入任何宿主中，在一般营养基中培养产生的转化子以产生该酶，制备产生该酶的转化菌株，转化菌株的培养物溶液，从转化菌株的培养物溶液中获得转化细胞以及转化细胞的处理产物，并将这些与腈化合物的水溶液接触。可通过使用分子生物学，生物工程和遗传工程领域的已知的一般方法制备转化菌株。例如，可提议将转化菌株接种在普通液体培养基中，如LB培养基和M9培养基(优选在该培养基组分中，Fe离子和Co离子以0.1μg/ml或更高的量存在)，并在适宜的培养温度下生长(通常为20-50℃之间。另外，还可使用培养物溶液本身，通过离心从培养物溶液中分离和回收所获得的转化细胞以及转化细胞的处理产物。这里所涉及的处理产物指通过分离和纯化提取物或研磨产物的腈水合酶活性级分而获得的分离后的产物，或通过固定转化细胞或提取物而获得的固定化产物，研磨产物或使用适宜载体的转化细胞的分离后产物。只要本发明的腈水合酶可起底物的作用，对于产生相应酰胺化合物的腈化合物没有特别限制。其优选的典型实例包括腈化合物，如乙腈、丙腈、丙烯腈、甲基丙烯腈、正丁腈、异丁腈、丁烯腈、α-羟基异丁烯腈、3-羟基丙腈、富马腈、丙二腈、苄腈、扁桃腈、氰基吡嗪和3-氰基吡啶。对腈化合物的水溶液的浓度没有特别的限制。对反应温度也没有特别的限制。优选在不使腈水合酶失活的温度范围下，较优选0-50℃之间。

实施例

通过参考下面的实施例将更具体地说明本发明。然而，本发明不限于此。

在实施例和比较实施例的HPLC分析中，由Nippon Bunko提供的Finepak SILC18-5(250×4.6mm(直径))被用作柱，10mM含有4％乙腈(体积计)的磷酸盐水溶液被用作洗脱液。此外，在210nm处检测丙烯酰胺、丙烯腈和丙烯酸的吸光度。实施例1

MT-10822株的***片段的分析(1)

将100uL具有下面组成的培养基加入到500uL装有挡板的三颈烧瓶中，121℃下高压灭菌20分钟。将氨苄青霉素加入到培养基中以使最终浓度达到100ug/ml，在其中接种一满勺MT-10822菌种(FERMBP-5785)，37℃下，以130rpm培养16小时。以15,000G离心15分钟，仅将细胞从培养物溶液中分离。然后，将细胞重新悬浮在50ml生理盐水中，接着再离心获得湿细胞。培养基组成：酵母提取物               5.0g/l聚胨                     10.0g/lNaCl                     5.0g/l氯化钴.6水合物           10.0mg/l硫酸亚铁.7水合物         40.0mg/lpH7.5

通过碱性SDS提取法从湿细胞中制备pPT-DB1的质粒DNA(图1)。通过引物延伸法，使用测序盒和由ABI提供的自动测序仪373 A测定***片段的全部碱基序列。结果，从5’末端侧以这种顺序在***片段中观察到具有705个碱基对，621个碱基对和435个碱基对的碱基序列的开放阅读框(分别称为ORF1、ORF2和ORF3)。而且，这些开放阅读框的转录方向完全一致。包括翻译终止密码子的位于离ORF1 3’-末端最近端的四个碱基被位于离ORF2 5’-末端最近端的四个碱基重叠。同样，包括翻译终止密码子的位于离ORF2 3’-末端最近端的四个碱基被位于离ORF3 5’-末端最近端的四个碱基重叠。如JP-A-9-275978中已经描述的，ORF1是腈水合酶的β-亚基基因，ORF2为其α-亚基基因。

接着，为了重新克隆ORF1至ORF3的重叠区，使用pPT-DB1质粒DNA作为模板进行PCR。

在一个体系中将包括98℃，热变性15秒，55℃退火30秒，72℃延伸反应120秒的步骤重复25个循环，其中该体系总量为100uL，含有100pmol序列表序列号3所示的引物，100pmol序列表中的序列号4所示的引物以及5U使用1μg pPT-DB1质粒DNA作为模板的Taq DNA聚合酶。通过琼脂糖凝胶电泳(使用由Sigma提供的Ⅶ型低熔点琼脂糖；琼脂糖浓度为0.8％(重量计))，使用10uL PCR反应溶液，进行扩增的DNA产物的分析。结果，证实了约1.8kbp的扩增DNA产物的存在。接着，仅将约1.8kbp的DNA片段从琼脂糖凝胶中切下。将约0.1g琼脂糖部分均匀分开，悬浮在1mL TE溶液中。将悬液保持在55℃达1小时以完全熔化琼脂糖。将熔化物用苯酚和氯仿提取并用乙醇沉淀。首先，向其中加入1mL用TE(10mM含有1mM EDTA.2Na的Tris-HCl水溶液pH8.0)饱和的苯酚溶液，轻轻搅拌混合物。通过以3,000rpm离心10分钟分离水相和有机相，单独收集水相。将这个过程重复3次。接着，向产生的水相中加入0.4mLTE饱和的苯酚溶液和0.4mL氯仿。再将混合物轻轻搅拌。然后，通过以3,000rpm离心10分钟重新分离水相和有机相，仅收集水相。向该水相中加入0.8mL氯仿。再轻轻搅拌混合物。接着，通过以3,000rpm离心10分钟重新分离水相和有机相，仅收集水相。向水相中加入80uL含有1.1M NaCl的TE溶液和1.7mL乙醇。-80℃下，将混合物静置30分钟。此后，通过4℃，以15,000rpm离心20分钟回收DNA片段的沉淀。将DNA片段空气干燥，最后溶解在10μL TE中。将约1.8kbp纯化的扩增DNA片段用限制性内切酶EcoRⅠ和SphⅠ裂解。将限制性内切酶处理的溶液进行上述用苯酚和氯仿的提取以及乙醇沉淀以再纯化DNA片段。最后，将该片段溶解在10μL TE中。同样，将载体用EcoRⅠ和SphⅠ裂解pUC18载体的唯一的限制性内切酶位点。进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma提供的Ⅶ型低熔点琼脂糖；琼脂糖的浓度为0.7％)，仅将约2.7kbp的DNA片段从琼脂糖凝胶中切下。将切下的琼脂糖部分(约0.1g)均匀分开，悬浮在1mLTE溶液中。将悬液保持在55℃达1小时以完全熔化琼脂糖。将该熔化物进行上述的苯酚和氯仿提取和乙醇沉淀以纯化DNA片段。最后，将该片段溶解在10μL TE中。使用DNA连接盒(由Takara Shuzo提供)将由此获得的扩增DNA产物与pUC18片段连接以构建质粒pPT-D1(图2)。另外，在pPT-D1的EcoRⅠ位点与SphⅠ位点之间构建的***片段的全部碱基序列示于序列表中的序列号2中。

使用由Toyobo有限公司提供的大肠杆菌HB 101感受态细胞将pPT-D1转导至HB101菌株中以获得1号转化菌株。将具有上述组成的LB液体培养基加入到500μL装有挡板的三颈烧瓶中，121℃下高压灭菌20分钟。将氨苄青霉素加入到培养基中以使最终浓度达到100μg/ml，在其中接种一满勺产生的1号转化菌株，37℃下，以130rpm培养约20小时。以5,000G离心15分钟，仅将细胞从培养物溶液中分离。然后，将细胞重新悬浮在50ml生理盐水中，接着通过再离心获得湿细胞。将100mg湿细胞悬浮在200mE 50mM磷酸钾水溶液(pH7.0)中，将10mL丙烯腈加入到该悬液中。10℃下，轻轻搅拌的同时让混合物反应1小时。在反应完成后，如实施例1通过HPLC分析反应溶液。仅丙烯酰胺存在于反应溶液中，在其中未观察到丙烯腈和丙烯酸。也就是说，转化和选择性为100％。比较实施例1MT-10822菌株***片段的分析(2)

为了重新克隆ORF1区至ORF3的上半区，使用pPT-DB1质粒DNA作为模板进行PCR。

在一个体系中将包括98℃热变性15秒，55℃退火30秒，72℃延伸反应120秒的步骤重复25个循环，其中该体系总量为100μL，含有100pmol序列表序列号3所示的引物，100pmol序列表中的序列号5所示的引物以及5U使用1μg实施例1制备的pPT-DB1质粒DNA作为模板的Taq DNA聚合酶。通过琼脂糖凝胶电泳(使用由Sigma提供的Ⅶ型低熔点琼脂糖；琼脂糖浓度为0.9％(重量计))，使用10μL PCR反应溶液进行扩增的DNA产物的分析。结果，证实了约1.6kbp的扩增DNA产物的存在。接着，仅将约1.6kbp的DNA片段从琼脂糖凝胶中切下。将约0.1g琼脂糖部分均匀分开，悬浮在1mL TE溶液中。将悬液保持在55℃达1小时以完全熔化琼脂糖。如实施例1，将该熔化物进行苯酚和氯仿提取以及乙醇沉淀以纯化扩增的DNA片段。将约1.6kbp纯化的扩增DNA片段用限制性内切酶EcoRⅠ和SphⅠ裂解。如实施例1，将限制性内切酶处理的溶液进行用苯酚和氯仿的提取以及乙醇沉淀以再纯化DNA片段，最后，将其溶解在10μL TE中。使用DNA连接盒(由Takara Shuzo提供)将产生的扩增DNA产物与实施例1制备的约2.7kbp的pUC18 EcoRⅠ-SphⅠ片段连接以构建质粒pPT-E1(图3)。

使用由Toyobo有限公司提供的大肠杆菌HB 101感受态细胞将pPT-E1转导至HB101菌株中以获得2号转化菌株。将具有与实施例1相同的组成的LB液体培养基加入到500毫升装有挡板的三颈烧瓶中，121℃下高压灭菌20分钟。将氨苄青霉素加入到培养基中以使最终浓度达到100μg/ml，在其中接种一满勺产生的转化菌株2号，37℃下，以130rpm培养约20小时。通过以5,000G离心15分钟，仅将细胞从培养物溶液中分离。然后，将细胞重新悬浮在50ml生理盐水中，接着通过再离心获得湿细胞。将100mg湿细胞悬浮在200mL 50mM磷酸钾水溶液(pH7.0)中，将10mL丙烯腈加入到该悬液中。10℃下，轻轻搅拌的同时让混合物反应1小时。在反应完成后，如实施例1通过HPLC分析反应溶液。之后，在反应溶液中未观察到丙烯酰胺，其中仅观察到未反应的丙烯腈。另外在其中未观察到丙烯酸。也就是说，转化率和选择性为0％。

同时，在从培养物溶液分离的细胞中观察到对应于嗜热假诺卡氏菌的α-和β-亚基的多肽链的存在。比较实施例2MT-10822菌株***片段的分析(3)

为了重新克隆ORF1至ORF2的所有区域，使用pPT-DB1质粒DNA作为模板进行PCR。

在一个体系中将包括98℃热变性15秒，55℃退火30秒，72℃延伸反应120秒的步骤重复25个循环，其中该体系总量为100μL，含有100pmol序列表序列号3所示的引物，100pmol序列表中的序列号6所示的引物以及5U使用1μg实施例1制备的pPT-DB1质粒DNA作为模板的Taq DNA聚合酶。通过琼脂糖凝胶电泳(使用由Sigma提供的Ⅶ型低熔点琼脂糖；琼脂糖浓度为0.9％(重量计))，使用10μL PCR反应溶液进行扩增的DNA产物的分析。结果，证实了约1.3kbp的扩增DNA产物的存在。接着，仅将约1.3kbp的DNA片段从琼脂糖凝胶中切下。将约0.1g琼脂糖部分均匀分开，悬浮在1mLTE溶液中。将悬液保持在55℃达1小时以完全熔化琼脂糖。如实施例1，将该熔化物进行苯酚和氯仿提取以及乙醇沉淀以纯化扩增的DNA片段。将约1.3kbp纯化的扩增DNA片段用限制性内切酶EcoRⅠ和SphⅠ裂解。如实施例1，将限制性内切酶处理的溶液进行用苯酚和氯仿的提取以及乙醇沉淀以再纯化DNA片段，最后，将其溶解在10μL TE中。使用DNA连接盒(由Takara Shuzo提供)将产生的扩增DNA产物与实施例1制备的约2.7kbp的pUC18 EcoRⅠ-SphⅠ片段连接以构建质粒pPT-F1(图4)。

使用由Toyobo有限公司提供的大肠杆菌HB 101感受态细胞将pPT-E1转导至HB101菌株中以获得3号转化菌株。将具有与实施例1相同的组成的LB液体培养基加入到500毫升装有挡板的三颈烧瓶中，121℃下高压灭菌20分钟。将氨苄青霉素加入到培养基中以使最终浓度达到100μg/ml，在其中接种一满勺产生的3号转化菌株，37℃下，以130rpm培养约20小时。通过以5,000G离心15分钟，仅将细胞从培养物溶液中分离。然后，将细胞重新悬浮在50ml生理盐水溶液中，接着通过再离心获得湿细胞。将100mg湿细胞悬浮在200mL50mM磷酸钾水溶液(pH7.0)中，将10mL丙烯腈加入到该悬液中。10℃下，轻轻搅拌的同时让混合物反应1小时。在反应完成后，如实施例1通过HPLC分析反应溶液。之后，在反应溶液中未观察到丙烯酰胺，其中仅观察到未反应的丙烯腈。另外在其中未观察到丙烯酸。也就是说，转化率和选择性为0％。

同时，在从培养物溶液分离的细胞中观察到对应于来自嗜热假诺卡氏菌的腈水含酶的α-和β-亚基的多肽链的存在。比较实施例3MT-10822菌株***片段的分析(4)

为了重新克隆ORF3的所有区域，使用pPT-DB1质粒DNA作为模板进行PCR。

在一个体系中将包括98℃热变性15秒，55℃退火30秒，72℃延伸反应120秒的步骤重复25个循环，其中该体系总量为100μL，含有100pmol序列表序列号7所示的引物，100pmol序列表中的序列号4所示的引物以及5U使用1μg实施例1制备的pPT-DB1质粒DNA作为模板的Taq DNA聚合酶。通过琼脂糖凝胶电泳(使用由Sigma提供的Ⅶ型低熔点琼脂糖；琼脂糖浓度为0.9％(重量计))，使用10μL PCR反应溶液进行扩增的DNA产物的分析。结果，证实了约450bp的扩增DNA产物的存在。接着，仅将纯化的约450bp的DNA片段从琼脂糖凝胶中切下。将约0.1g琼脂糖部分均匀分开，悬浮在1mL TE溶液中。将悬液保持在55℃达1小时以完全熔化琼脂糖。如实施例1，将该熔化物进行苯酚和氯仿提取以及乙醇沉淀以纯化扩增的DNA片段。将约450bp扩增DNA片段用限制性内切酶EcoRⅠ和SphⅠ裂解。如实施例1，将限制性内切酶处理的溶液进行用苯酚和氯仿的提取以及乙醇沉淀以再纯化DNA片段，最后，将其溶解在10μL TE中。使用DNA连接盒(由Takara Shuzo提供)将产生的扩增DNA产物与实施例1制备的约2.7kbp的pUC18 EeoRⅠ-SphⅠ片段连接以构建质粒pPT-F1(图5)。

使用由Toyobo有限公司提供的大肠杆菌HB 101感受态细胞将pPT-G1转导至HB101菌株中以获得转化菌株4号。将具有与实施例1相同的组成的LB液体培养基加入到500毫升装有挡板的三颈烧瓶中，121℃下高压灭菌20分钟。将氨苄青霉素加入到培养基中以使最终浓度达到100μg/ml，在其中接种一满勺产生的转化菌株4号，37℃下，以130rpm培养约20小时。通过以5,000G离心15分钟，仅将细胞从培养物溶液中分离。然后，将细胞重新悬浮在50ml生理盐水中，接着通过再离心获得湿细胞。将100mg湿细胞悬浮在200mL 50mM磷酸钾水溶液(pH7.0)中，将10mL丙烯腈加入到该悬液中。10℃下，轻轻搅拌的同时让混合物反应1小时。在反应完成后，如实施例1通过HPLC分析反应溶液。之后，在反应溶液中未观察到丙烯酰胺，其中仅观察到未反应的丙烯腈。另外在其中未观察到丙烯酸。也就是说，转化率和选择性为0％。实施例2MT-10822菌株***片段的分析(5)

将含有lacZ启动子、比较实施例2中制备的pPT-F1中的β亚基的ORF2和α-亚基的ORF1的区克隆在pPT-G1质粒的ORF3区的3’-末端一侧。

在一个体系中将包括98℃热变性15秒，55℃退火30秒和72℃延伸反应120秒的步骤重复25个循环，其中该体系总量为100μL，含有100pmol序列表序列号8所示的引物，100pmol序列表中的序列号9所示的引物以及5U使用1μg比较实施例1制备的pPT-F1质粒DNA作为模板的Taq DNA聚合酶。通过琼脂糖电泳(使用由Sigma提供的Ⅶ型低熔点琼脂糖；琼脂糖浓度为0.8％(重量计))，使用10μL PCR反应溶液进行扩增的DNA产物的分析。结果，证实了约2.0kbp的扩增DNA产物的存在。接着，仅将约2.0kbp的DNA片段从琼脂糖凝胶中切下。将约0.1g琼脂糖部分均匀分开，悬浮在1mL TE溶液中。将悬液保持在55℃达1小时以完全熔化琼脂糖。如实施例1，将该熔化物进行苯酚和氯仿提取以及乙醇沉淀以纯化扩增的DNA片段。将约2.0k bp扩增DNA片段用限制性内切酶SphⅠ和HindⅢ裂解。然后，如实施例1，将限制性内切酶处理的溶液进行用苯酚和氯仿的提取以及乙醇沉淀以再纯化DNA片段，最后，将其溶解在10μL TE中。同样，将相同的质粒用SphⅠ和HindⅢ裂解pPT-G1质粒唯一的限制性内切酶位点。进行琼脂糖凝胶电泳(使用由Sigma提供的Ⅶ型低熔点琼脂糖；琼脂糖浓度为0.7％)，仅将约3.1kbp的DNA片段从琼脂糖凝胶中切下。将约0.1g裂解的琼脂糖部分均匀分开，悬浮在1mL TE溶液中。然后将悬液保持在55℃达1小时以完全熔化琼脂糖。如实施例1，将该熔化物进行苯酚和氯仿提取以及乙醇沉淀以纯化DNA片段，最后将它溶解在10μL TE中。使用DNA连接盒(由Takara Shuzo提供)将产生的扩增DNA产物与pPT-G1的SphⅠ-HindⅢ片段连接以构建质粒pPT-H1(图6)。

使用由Toyobo有限公司提供的大肠杆菌HB 101感受态细胞将pPT-H1转导至HB101菌株中以获得转化菌株5号。将具有上述组成的LB液体培养基加入到500毫升装有挡板的三颈烧瓶中，121℃下高压灭菌20分钟。将氨苄青霉素加入到培养基中以使最终浓度达到100μg/ml，在其中接种一满勺产生的转化菌株5号，37℃下，以130rpm培养约20小时。通过以5,000G离心15分钟，仅将细胞从培养物溶液中分离。然后，将细胞重新悬浮在50ml生理盐水中，接着通过再离心获得湿细胞。将100mg湿细胞悬浮在200mL 50mM磷酸钾水溶液(pH7.0)中，将10mL丙烯腈加入到该悬液中。10℃下，轻轻搅拌的同时让混合物反应1小时。在反应完成后，如实施例1通过HPLC分析反应溶液。后来，仅丙烯酰胺存在于反应溶液中，在其中未观察到丙烯腈和丙烯酸。也就是说，转化率和选择性为100％。

本发明提供一种参与活化来自嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardiathermophila)JCM3095的腈水合酶的腈水含酶活化蛋白以及编码它的基因。另外，本发明提供含有该基因的重组质粒、含有该基因和腈水合酶基因的重组质粒、通过用重组质粒转化获得的转化菌株以及一种使用培养物溶液从腈化合物制备相应酰胺化合物的方法和通过培养转化菌株获得的细胞以及经处理的细胞产物。

而且，根据本发明，在使用来自嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶从腈化合物工业生产酰胺化合物中，可通过遗传工程的方法大量表达该酶，从而可降低占酰胺化合物生产成本的酶的生产成本。

                    序列表序列号1序列长度：144序列形式：氨基酸拓扑学：线性序列类型：蛋白质来源：生物名称：嗜热假诺卡氏菌(Pseudono cardia ther mophila)菌株名：JCM3095直接来源：克隆名称：pPT-DB1序列特征：确定特征的方法：E其它信息：说明参与来自嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶活化的蛋白的氨基酸序列：

Met Ser Ala Glu Ala Lys Val Arg Leu Lys His Cys Pro Thr Ala Glu

                  5                  10                  15

Asp Arg Ala Ala Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gln Leu Pro Gly Gly Asp

             20                  25                  30

Arg Ala Leu Asp Arg Gly Phe Asp Glu Pro Trp Gln Leu Arg Ala Phe

         35                  40                  45

Ala Leu Ala Val Ala Ala Cys Arg Ala Gly Arg Phe Glu Trp Lys Gln

     50                  55                  60

Leu Gln Gln Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Glu Trp Glu Arg Thr His

 65                  70                  75                  80

Asp Leu Asp Asp Pro Ser Trp Ser Tyr Tyr Glu His Phe Yal Ala Ala

                 85                  90                  95

Leu Glu Ser Val Leu Gly Glu Glu Gly Ile Yal Glu Pro Glu Ala Leu

            100                 105                 110

Asp Glu Arg Thr Ala Glu Yal Leu Ala Asn Pro Pro Asn Lys Asp His

        115                 120                 125

His Gly Pro His Leu Glu Pro Val Ala Val His Pro Ala Val Arg Ser

    130                 135                 140             144序列号2序列长度：1762序列形式：核酸链的数目；双链拓扑学：线性序列类型：基因组DNA来源：生物名称：嗜热假诺卡氏菌(Pseudono cardia·ther mophila)菌株名：JCM3095直接来源：克隆名称：pPT-DB1序列特征：确定特征的方法：E其它信息：第16-717位碱基的区域为β-亚基区第714-1331位碱基的区域为α-亚基区第1328-1762位碱基的区为编码参与来自嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶活化的蛋白的基因的一个区域。序列：

TGAGAGGAGC TCCGCATGAA CGGCGTGTAC GACGTCGGCG GCACCGATGG GCTGGGCCCG     60

ATCAACCGGC CCGCGGACGA ACCGGTCTTC CGCGCCGAGT GGGAGAAGGT CGCGTTCGCG    120

ATGTTCCCGG CGACGTTCCG GGCCGGCTTC ATGGGCGTGG ACGAGTTCCG GTTCGGCATC    180

GAGCAGATGA ACCCCCCCGA GTACCTCGAG TCGCCGTACT ACTGGCACTG GATCCGCACC    240

TACATCCACC ACGGCGTCCG CACCGGCAAG ATCGATCTCG AGGAGCTGGA GCGCCGCACG    300

CAGTACTACC GGGAGAACCC CGACGCCCCG CTGCCCGAGC ACGAGCAGAA GCCGGAGTTG    360

ATCGAGTTCG TCAACCAGGC CGTCTACGGC GGGCTGCCCG CAAGCCGGGA GGTCGACCGA    420

CCGCCCAAGT TCAAGGAGGG CGACGTGGTG CGGTTCTCCA CCGCGAGCCC GAAGGGCCAC    480

GCCCGGCGCG CGCGGTACGT GCGCGGCAAG ACCGGGACGG TGGTCAAGCA CCACGGCGCG    540

TACATCTACC CGGACACCGC CGGCAACGGC CTGGGCGAGT GCCCCGAGCA CCTCTACACC    600

GTCCGCTTCA CGGCCCAGGA GCTGTGGGGG CCGGAAGGGG ACCCGAACTC CAGCGTCTAC    660

TACGACTGCT GGGAGCCCTA CATCGAGCTC GTCGACACGA AGGCGGCCGC GGCATGACCG    720

AGAACATCCT GCGCAAGTCG GACGAGGAGA TCCAGAAGGA GATCACGGCG CGGGTCAAGG    780

CCCTGGAGTC GATGCTCATC GAACAGGGCA TCCTCACCAC GTCGATGATC GACCGGATGG    840

CCGAGATCTA CGAGAACGAG GTCGGCCCGC ACCTCGGCGC GAAGGTCGTC GTGAAGGCCT    900

GGACCGACCC GGAGTTCAAG AAGCGTCTGC TCGCCGACGG CACCGAGGCC TGCAAGGAGC    960

TCGGCATCGG CGGCCTGCAG GGCGAGGACA TGATGTGGGT GGAGAACACC GACGAGGTCC   1020

ACCACGTCGT CGTGTGCACG CTCTGCTCCT GCTACCCGTG GCCGGTGCTG GGGCTGCCGC   1080

CGAACTGGTT CAAGGAGCCG CAGTACCGCT CCCGCGTGGT GCGTGAGCCC CGGCAGCTGC   1140

TCAAGGAGGA GTTCGGCTTC GAGGTCCCGC CGAGCAAGGA GATCAAGGTC TGGGACTCCA   1200

GCTCCGAGAT GCGCTTCGTC GTCCTCCCGC AGCGCCCCGC GGGCACCGAC GGGTGGAGCG   1280

AGGAGGAGCT CGCCACCCTC GTCACCCGCG AGTCGATGAT CGGCGTCGAA CCGGCGAAGG   1320

CGGTCGCGTG AGCGCCGAGG CGAAGGTCCG CCTGAAGCAC TGCCCCACGG CCGAGGACCG   1380

GGCGGCGGCC GACGCGCTGC TCGCGCAGCT GCCCGGCGGC GACCGCGCGC TCGACCGCGG   1440

CTTCGACGAG CCGTGGCAGC TGCGGGCGTT CGCGCTGGCG GTCGCGGCGT GCAGGGCGGG   1500

CCGGTTCGAG TGGAAGCAGC TGCAGCAGGC GCTGATCTCC TCGATCGGGG AGTGGGAGCG   1560

CACCCACGAT CTCGACGATC CGAGCTGGTC CTACTACGAG CACTTCGTCG CCGCGCTGGA   1620

ATCCGTGCTC GGCGAGGAAG GGATCGTCGA GCCGGAGGCG CTGGACGAGC GCACCGCGGA   1680

GGTCTTGGCC AACCCGCCGA ACAAGGATCA CCATGGACCG CATCTGGAGC CCGTCGCGGT   1740

CCACCCGGCC GTGCGGTCCT GA                                            1762序列号3序列长度：29序列形式：核酸链的数目；单链拓扑学：线性序列类型：其它核酸，合成DNA序列：CGAATTCTGA GAGGAGCTCC GCATGAACG    29序列号4序列长度：28序列形式：核酸链的数目；单链拓扑学：线性序列类型：其它核酸，合成DNA序列：TGCATGCTCA GGACCGCACG GCCGGGTG     28序列号5序列长度：28序列形式：核酸链的数目；单链拓扑学：线性序列类型：其它核酸，合成DNA序列：TGCATGCTCA GATCGAGGAG ATCAGCGC     28序列号6序列长度：28序列形式：核酸链的数目；单链拓扑学：线性序列类型：其它核酸，合成DNA序列：TGCATGCTCA CGCGACCGCC TTCGCCGG     28序列号7序列长度：45序列形式：核酸链的数目；单链拓扑学：线性序列类型：其它核酸，合成DNA序列：CGAATTCTGA GAGGAGCTCC GCGTGAGCGC CGAGGCGAAG GTCCG   45序列号8序列长度：27序列形式：核酸链的数目；单链拓扑学：线性序列类型：其它核酸，合成DNA序列：TGCATGCCAT TAATGCAGCT GGCACGA    27序列号9序列长度：28序列形式：核酸链的数目；单链拓扑学：线性序列类型：其它核酸，合成DNA序列：TAAGCTTTCA GATCGAGGAG ATCAGCGC   28

Claims (12)

1．一种蛋白，特征在于参与来自嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的活化。

2．权利要求1的蛋白，其中氨基酸序列为序列表中的序列1所示的氨基酸序列。

3．权利要求1或2的蛋白，其来自嗜热假诺卡氏菌JCM3095。

4．编码权利要求1-3的蛋白的基因。

5．权利要求4的基因，由序列表中的序列号2所示的第1328-1762位碱基的碱基序列所代表。

6．一种重组质粒，特征在于含有权利要求4或5的基因。

7．权利要求6的重组质粒，其含有腈水合酶基因。

8．权利要求7的重组质粒，其中腈水合酶基因来自嗜热假诺卡氏菌JCM3095。

9．权利要求7的重组质粒，其含有由序列表中的序列号2所示的第714-1331位碱基的碱基序列所代表的编码α-亚基的基因。

10．权利要求7的重组质粒，含有由序列表中的序列号2所示的第16-717位碱基的碱基序列所代表的编码β-亚基的基因。

11．一种重组菌株，其具有权利要求6-10任一项的重组质粒。

12．一种从腈化合物制备相应酰胺化合物的方法，其包括培养具有权利要求7-10任一项所述的重组质粒的转化菌株，将转化菌株、通过培养获得的培养物溶液以及其处理产物与腈化合物接触。

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