CN1233189A - 用TNFR-Ig治疗哮喘 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用含有效量的包含p55TNF受体的可溶部分和人IgG1或IgG3的除了重链恒定区的第一结构域之外的所有结构域的嵌合TNFα结合蛋白的组合物抵抗哮喘的方法,和涉及该嵌合的TNFα结合蛋白用于制备治疗哮喘的药物的应用。

Description

用TNFR-Ig治疗哮喘
哮喘是呼吸道的一种慢性发炎性疾病，其特征在于因接触特异性过敏原(IgE介导的反应)，锻炼，冷空气或紧张而复发加重。与哮喘病相关的发炎特点是存在激活的嗜酸细胞，呼吸道对非特异性刺激的敏感性增加(呼吸道过敏反应：AHR)，水肿，粘液分泌过多和咳嗽。相信该发炎过程部分地由分泌各种细胞因子的Th2型淋巴细胞的产生和激活介导。细胞因子TNFα是涉及引起哮喘症状的一种细胞因子。
复合治疗剂用于治疗哮喘，使用吸入β2的***(缓解急性支气管痉挛)和作为选择试剂的类固醇(抗发炎)。然而，据认为没有一种治疗方案是足够有效的，但是该疾病的死亡率在逐渐增加。最迫切的医学需要之一是需要一种可迅速逆转在急性/严重哮喘中所见的严重发作的肺炎的试剂。另外，没有一种治疗剂可归入疾病缓解剂。必然需要一种可迅速逆转急性/严重哮喘中所见的发炎反应的药物以及作为真正的疾病缓解剂的试剂。TNFα的作用是启动哮喘症状，而申请人确定抑制TNFα的作用提供了缓解这些症状的途径。
现在申请人发现了一种在患有哮喘症状的病人中抵抗哮喘的方法，包括给所述的病人施用含有由一种或多种嵌合的TNFα结合蛋白组成的制品的组合物，所述的制品中的各蛋白质由融合到IgG上的p55TNF受体蛋白的可溶部分组成，其中所述的融合的IgG含有除了IgG重链恒定区的第一IgG结构域之外的所有IgG结构域，所述的组合物含有治疗上的惰性载体，且所述组合物施用给所述病人以便给病人提供有效量的所述嵌合蛋白制品以抵抗所述的哮喘症状。
该组合物可以有效地施用给患有哮喘病的病人，其中嵌合蛋白制品以足以缓解所述的疾病的影响的量来施用。该组合物也可以在哮喘病发作前以有效防止或延缓所述的疾病发作的量施用给哮喘病人。
本发明涉及通过给病人施用含有由一种或多种嵌合的TNFα结合蛋白组成的制品的组合物在患有哮喘症状的病人中抵抗哮喘的方法。该制品中的蛋白质由融合到IgG(免疫球蛋白G)上的p55 TNF受体蛋白的可溶部分组成(TNFR-Ig)，其中该IgG含有除了IgG重链恒定区的第一结构域之外的所有结构域。该组合物还含有治疗上的惰性载体。将该组合物施用给所述的病人以便给病人提供有效量的嵌合蛋白制品以抵抗所述的哮喘症状。
由融合到IgG上的p55 TNF受体蛋白的可溶部分组成的嵌合TNFα结合蛋白用于制备治疗哮喘的药物是本发明的另一目的，其中所述的融合IgG含有除了IgG重链恒定区的第一IgG结构域之外的所有IgG结构域。
该组合物以足以缓解哮喘发作的影响的蛋白质制品的量有效施用给处于哮喘病发作期间的病人。该组合物也可以在哮喘病发作前以有效防止或延缓该疾病发作的蛋白质制品的量施用给哮喘病人。
任何TNFR-Ig，即由融合到IgG上的p55 TNF受体蛋白的可溶部分组成的嵌合TNFα结合蛋白可用于本发明的制品以便在具有上面段落所述哮喘症状的病人中抵抗哮喘，其中所述的融合IgG含有除了IgG重链恒定区的第一IgG结构域之外的所有IgG结构域。IgG可以是人IgG1或IgG3，在本发明中优选IgG1。
该TNFR-Ig的例子包括在EP417 563；美国专利号5,447,851和5,395,760；Lesslauer等，欧洲免疫学杂志,21(11):2883,1991；Loetscher等，生物学化学杂志，266(27):18324,1991；Ashkenazi等，美国国家科学院院报，88:10535,1991中公开的蛋白质，它们也可用在这些文献中公开的方法获得。
优选的本发明的TNFR-Ig分子的制品用IgG1制备并包含具有以一个或多个唾液酸残基终止的复合寡糖并具有暴露的N-乙酰葡糖胺的蛋白质，制品中唾液酸残基的摩尔比为每摩尔蛋白质大约4至大约7摩尔唾液酸，尤其是大约5至大约6，制品中暴露的N-乙酰葡糖胺的摩尔比是每摩尔蛋白质从大约1至大约2摩尔N-乙酰葡糖胺，制品中唾液酸残基与N-乙酰葡糖胺残基的摩尔比是从大约0.35至大约0.5，尤其是大约0.4至大约0.45。制品的等电点(pI)是从大约5.5至大约7.5，可用层析聚焦测定并对神经氨酸酶处理敏感。
本发明的TNFR-Ig可用重组技术或蛋白质合成的常规方法获得。编码p55 TNF受体的DNA，编码除了第一IgG1或IgG3重链恒定区之外的所有结构域的DNA，且将这些序列连接在一起用于在合适的载体中表达对技术人员而言是已知的且在文献中进行了描述。合适的克隆载体和宿主细胞是熟知的且可由技术人员进行选择，而且已测定了合适的培养条件(见动物细胞培养：实践探索，第2版，Rickwood和Hames编辑，牛津大学出版社，NY 1992)。
然后可使用已知的蛋白质回收和纯化方法纯化TNFR-Ig。TNFR-Ig尽管也可以从宿主细胞裂解产物中回收，但优选从培养基中作为分泌的多肽回收。可离心细胞培养基或裂解产物以去掉颗粒状的细胞碎片。随后从有杂质的可溶性蛋白质和多肽中纯化TNFR-Ig，下面的程序作为合适的纯化程序的例子：在免疫亲和或离子交换柱上分离；乙醇沉淀；反向HPLC；在二氧化硅或诸如DEAE的阳离子交换树脂上层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如，Sephadex G-75，和蛋白A琼脂糖柱凝胶过滤以去掉诸如IgG的污染物。诸如苯甲基磺酰氟(PMSF)的蛋白酶抑制剂也可用于抑制纯化期间的蛋白水解的降解。本领域的技术人员可预料到适合于目的多肽的纯化方法需要根据在重组细胞培养物中表达的多肽的特征的变化进行修改。
具有特定pI及唾液酸和N-乙酰葡糖胺比率的本发明的TNFR-Ig可通过使用重组哺乳动物细胞表达TNFR-Ig并按例如WO 96/39488所述控制哺乳动物细胞产生TNFR-Ig的培养条件获得。选择的宿主细胞应能够将N-和O-连接的包括唾液酸的糖类连接到它们表达的蛋白质上。一个这种宿主细胞的例子是CHO细胞。合适的培养条件是熟知的且依赖于所选的宿主细胞。在糖蛋白生产期间增加细胞特定产量导致成熟蛋白质唾液酸含量降低，反之亦然。影响细胞特定产量的因素在本领域是熟知的，且包括但不限于，影响DNA/RNA拷贝数的因素，影响RNA的因素，如稳定RNA的因素，培养基营养成分和其它补充物，转录增强子浓度，培养物环境的重量摩尔渗透压浓度，细胞培养物的温度和pH值等。这些因素可用熟知的方法进行调节以获得诸如唾液酸的糖蛋白的优选含量。通过向细胞培养物中以大约0.1mM至大约20mM，或5至20mM的浓度加入链烷酸，如丁酸钠或其盐，并保证细胞培养物的重量摩尔渗透压浓度在大约250至600mOsm之间，最好在过渡期间互相组合改变细胞培养物生产期的细胞特定产量来生产具有不同唾液酸量的蛋白质。大约6.0mM丁酸钠的浓度和350-400mOsm的条件提供本发明的高度唾液酸化的TNFR-Ig，而大约12mM丁酸钠的浓度提供本发明的较低唾液酸化的TNFR-Ig。后一浓度可与450-550mOsm的条件组合。
技术人员将认识到培养基的重量摩尔渗透压浓度依赖于培养液中的渗透的活性颗粒浓度，和配制哺乳动物复合细胞培养基的许多变量会影响重量摩尔渗透压浓度。培养基的组成决定培养基的起始重量摩尔渗透压浓度。使用渗透压计，例如Fisher Scientific,Pittsburgh,Pennsylvania以商标名OSMETTE销售的渗透压计(或可从精密***公司，NatickMA获得的Osmette 2007型)测量重量摩尔渗透压浓度。为了获得所需范围的重量摩尔渗透压浓度，可调节培养基中各组成成分的浓度。可在培养基中加入溶质以增加其重量摩尔渗透压浓度，该溶质包括蛋白质，肽，氨基酸，诸如蛋白胨的水解动物蛋白质，非代谢多聚体，维生素，离子，盐，糖类(特别是葡萄糖)，代谢产物，有机酸，脂类等。在一个实施方案中，通过在补料分批培养程序期间向细胞培养物中加入蛋白胨以及其它培养基成分控制重量摩尔渗透压浓度。
可使用细胞培养的三个时期，生长期：其中选定的哺乳动物宿主细胞的细胞生长最快；接着是过渡期，其中选择并应用如上所述的为得到成熟糖蛋白所需唾液酸含量的细胞培养参数；随后是生产期，其中保持过渡期选择的参数，生产并收获糖蛋白产物。关于在本发明说明书中优选的纯化，可以是选择来用于本发明的糖类的纯化技术和方法。可通过例如，离子交换软凝胶色谱或使用阳离子或阴离子交换树脂的HPLC，针对含唾液酸的分子富集本发明的所需糖形式，其中收集酸性更强的馏分。
本发明优选的TNFR-Ig在纯化组合物中具有一个或多个下列特征：TNFR-Ig组合物的pI范围在大约5.5至大约7.5之间，唾液酸与蛋白质的摩尔比为大约4至大约7，尤其是大约5至大约6，具有每摩尔蛋白质大约1至大约2摩尔的暴露的N-乙酰葡糖胺残基，具有大约0.35至大约0.5且更优选的是大约0.4至大约0.45的唾液酸与N-乙酰葡糖胺的摩尔比。获得该优选的TNFR-Ig的最合适的条件是采用的丁酸钠浓度为大约0.1mM至大约6mM，重量摩尔渗透压浓度维持在大约300至450mOsm之间，温度在大约30℃和37℃之间的培养条件。
技术人员使用熟知的技术可测定TNFR-Ig的上述特征。例如，如果需要，用本发明方法生产的糖蛋白的复合糖类部分容易用糖类分析的常规技术分析。因此，例如，在本领域熟知的技术，如凝集素印迹揭示了末端甘露糖或诸如半乳糖的其它糖类的比率。通过使用脱水酰肼或酶学方法从蛋白质释放糖并经离子交换或大小排阻层析或其它本领域熟知的方法分离寡聚糖可证实单-，双-，三-，四-支寡聚糖由唾液酸的终止。也可在用神经氨酸酶处理去掉唾液酸之前和之后测定糖蛋白的pI。神经氨酸酶处理后pI增加表明在糖蛋白上存在唾液酸。
本发明的糖类结构出现在表达为N-连接的或O-连接的糖类的蛋白质上。N-连接的和O-连接的糖类主要区别在其核心结构上。N-连接的糖基化指通过GlcNAc将糖部分连接到肽链的天冬酰胺残基上。N-连接的糖类也含有共同的核心结构Man1-6(Man1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-R。因此，在所述的核心结构中，R代表生产蛋白的天冬酰胺残基。生产的蛋白质的肽序列会含有天冬酰胺-X-丝氨酸，天冬酰胺-X-苏氨酸，和天冬酰胺-X-半胱氨酸，其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸。相反，O-连接的糖类其特征在于一个共同的核心结构，它是附着于苏氨酸或丝氨酸羟基上的GalNAc。在N-连接的和O-连接的糖类中，最重要的是N-和O-连接的复合糖类。该复合糖类含有一些分支结构。单-，双-，三-和四-外侧结构对于增加末端唾液酸是重要的。这样的外侧链结构提供了特异性糖的附加位点和包含本发明的糖类的键。
以包括本文所述的那些方法的本领域已知的任何方法可分析所得的糖类。用于糖基化分析的一些方法在本领域是已知的并在本发明的内容中是有用的。该方法提供了关于连接于肽上的寡聚糖的相同性和组成的信息。在本发明中有用的糖类分析方法包括但不限于凝集素层析；使用高pH值阴离子交换色谱的HPAEC-PAD以电荷为基础分离寡聚糖；NMR；质谱分析法；HPLC；GPC；单糖组成分析；顺序酶消化。
另外，释放寡聚糖的方法是已知的。这些方法包括1)酶，通常使用肽-N-糖苷酶F/内切-β-半乳糖苷酶进行；2)使用强碱性环境以释放主要的O-连接结构消除法；和3)使用脱水酰肼以释放N-和O-连接的寡聚糖的化学方法。
可使用下列步骤进行分析：
1．用去离子水透析样品以去掉所有的缓冲盐，随后冻干。
2．用脱水酰肼释放完整的寡聚糖链。
3．用无水的含甲醇的HCl处理完整的寡聚糖链以O-甲基衍生物释放单个的单糖。
4．任意第一氨基的N-乙酰化。
5．衍生化以提供高-O-三甲基硅烷基甲基糖苷。
6．通过在CP-SIL8柱上毛细GLC(气-液色谱)分离这些衍生物。
7．用从GLC的滞留时间和质谱分析与已知标准相比来鉴定单个的糖苷衍生物。
8．用内部标准(13-O-甲基-D-葡萄糖)以FID定量单个衍生物。
以高效阴离子交换色谱结合脉冲安培计检测(HPAE-PAD糖类***，Dionex公司)可测定中性和氨基糖。例如，通过在20％(v/v)三氟乙酸中100℃水解6小时可释放糖类。然后通过冻干或用Speed-Vac(Savant Instruments)干燥水解产物。然后将残留物溶于1％三水乙酸钠溶液中并按Anumula等(生化年鉴195:269-280(1991)〕所述在HPLC-AS6柱上分析。
可在一式三份样品中用Yao等(生化年鉴，179:332-335(1989)〕的直接比色方法分别测定唾液酸。在优选的实施方案中，使用Warren,L.生物化学杂志238:(8)(1959)的硫代巴比妥酸(TBA)。
作为选择，可进行免疫印迹糖类分析。根据该方法，使用根据Haselbeck和Hosel[Hasebeck等，糖偶联物杂志，7:63(1990)]所述的氧化免疫印迹方法的商用聚糖检测***(Boehringer)检测蛋白质结合的糖类。按照厂家推荐的染色方案，除了蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上代替硝酸纤维素膜之外，封闭缓冲液在10mM Tris缓冲液(pH7.4)和0.9％氯化钠中包含了5％牛血清白蛋白。检测用在tris缓冲盐水中1∶1000稀释的与碱性磷酸连接物(Boehringer)连接的抗洋地黄毒苷抗体进行，使用在含100mM氯化钠和50mM氯化镁的100mM Tris缓冲盐水(pH9.5)中的磷酸酶底物，0.03％(w/v)4-氮蓝四唑氯，和0.03％(w/v)5-溴-4氯-3-吲哚-磷酸。通常在大约10至15分钟内观察含糖的蛋白质带。
也可通过用肽-N-糖苷酶F消化分析糖类。根据该方法，残留物悬浮于14μl含0.18％SDS,18mMβ-巯基乙醇，90mM磷酸盐，3.6mMEDTA,pH8.6的缓冲液中，在100℃加热3分钟。冷却到室温后，样品分成两份相等的部分。一个等分样品不作进一步处理并用作对照。第二部分调节到含有大约1％NP-40去污剂，接着加入0.2单位的肽-N-糖苷酶F(Boehringer)。两份样品在37℃保温2小时，然后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
本发明的TNFR-Ig包含PEG化的TNFR-Ig，它是指共价连接到诸如聚(亚烷基)二醇(取代的或未取代的)，特别是聚乙二醇的多聚体上的TNFR-Ig分子。连接可以是直接的，但优选借助于本领域已知的各种偶联剂来实现，例如在EP510346，EP593838，美国专利号4,766,106,4,917,888,4,902,502,4,847,325,4,179,337,5,832,657,Veronese等，应用生物化学和生物技术，11:141(1985)和Monfardini等，生物偶联化学6:62(1995)中所公开的那些偶联剂。PEG化的TNFR-Ig可以正如对TNFR-Ig所述的，用于哮喘治疗和预防。
本发明的TNFR-Ig制品对于在哮喘病人中抵抗哮喘有用。在治疗具有哮喘病的病人时，这些制品可减轻疾病影响，如逆转已经发生的炎症，防止出现进一步的炎症。当以预防的方式提供时，这些制品可延缓或防止哮喘病的发作，或当疾病发生时，保证疾病的严重性降低。
根据本发明，该制品可按任何常规方式施用给病人用于治疗或预防。因此本发明的制品可在常规药用组合物中施用，该组合物包括任何常规治疗上的惰性载体。该药用组合物可含有惰性的和药物动力学上有活性的添加剂。液体组合物可采用例如，与水混合的无菌溶液的形式。另外，也可有常规用作保护，稳定，保湿和乳化剂的物质以及改变渗透压的物质，如盐，改变pH值的物质，如缓冲液和其它添加剂。如果需要，在药用组合物中可包括诸如生育酚，N-甲基-γ-生育胺，丁基化羟基苯甲醚或丁基化羟基甲苯的抗氧化剂。用于组合物的药学上可接受的赋形剂或载体包括盐水，缓冲盐溶液，葡萄糖或水。组合物也可包括特定的稳定剂，例如糖，包括甘露糖和甘露醇，以及用于适合组合物(indictable composition)的局部麻醉剂，包括，例如，利度卡因盐酸盐。前面提到的载体物质和稀释剂可以是有机或无机物质，例如，水，明胶，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，滑石粉，***胶，聚(亚烷基)二醇等。前提是用于生产药用组合物的所有佐剂和物质是无毒的。
本发明的制品可经胃肠外(例如，通过皮下，静脉内，肌肉内，眼眶内，囊内的，脊柱内，胸骨内的注射)或喷雾吸入施用。可使用用于肠胃外或喷雾吸入用药的任何常规药用制品。合适的药用组合物的例子是输注或注射溶液。优选的用药方式是通过静脉内注射。另一优选的用药方式是用气溶胶。
可使用任意有效量的抗哮喘的本发明的制品以减轻或逆转疾病的影响或以防止或延缓疾病的发作。用于治疗，防止或逆转哮喘的本发明的用于肠胃外(注射)用药的TNFR-Ig组合物的优选剂量是每病人每千克体重大约0.1到大约5.0mg的TNFR-Ig制品(mg/kg)。特别优选的剂量是从大约1.0到大约3.0mg/kg。用于相同目的且在喷雾用药中的TNFR-Ig组合物的优选剂量是占TNFR-Ig制品重量的0.03％至5.0％。在任一用药方式中，治疗剂量可在每个治疗日中用药一次，或分成更小的剂量在大约24小时期间内用药以达到总的所给剂量。
为了经肠胃外用药快速治疗哮喘病，可提供每病人每天0.1至5.0，特别是1.0-3.0mg/kg的单次剂量。为了经肠胃外用药预防哮喘，根据病人和状态的不同从每天的间隔，但优选以从每周两次到每周一次到每月一次或其它间隔期间优选提供0.1至5.0，特别是1.0-3.0mg/kg的这种剂量。同样，对于经喷雾用药快速治疗哮喘病，可每天吸入单次剂量。对于预防，根据病人和状态的不同以每天的间隔，但优选以从每周两次到每周一次到每月一次或以其它间隔期间吸入这一剂量。施用组合物的精确剂量可根据使用的类型，使用的方式和病人的要求按技术人员的测定而变化。用于病人的精确剂量可由技术人员考虑症状的严重性，所用的具体配方和可能包含的其它药物作具体修改。
本发明的喷雾组合物可以是液体和粉末。它们可以通过鼻或通过口(鼻内或口腔)用药。喷雾组合物的一个例子是可针对鼻和口的喷雾剂，它由通过对TNFR-Ig制品的水或盐溶液的机械作用从喷雾器产生。另一个例子是雾化喷雾剂，其中雾状物从该溶液产生，然后可有效地被病人吸入(不是直接喷射进鼻和口腔)。如果TNFR-Ig是粉末状的，颗粒应足够大以便保存在呼吸道中而不会吸入后被病人呼出。根据用于快速治疗或预防的医疗方案，该喷雾剂可按对病人介绍的每天吸入一次或多次或更少的频率。对于喷雾用药，可通过吸入对治疗或防止如上所述的哮喘有效量的本发明的TNFR-Ig来给病人用药。对于哮喘，以这种方式使呼吸道受影响的部分(鼻腔，气管，低级气体通道或细支气管)接受合适量的TNFR-Ig。
本发明的喷雾剂配方优选地按重量比提供从制品的大约0.03％到5.0％，更优选大约0.03到0.5％，特别是大约0.1到0.3％。优选的喷雾配制品是气溶胶配制品，一般来说，对于喷雾剂，优选较低剂量范围，例如雾化配制品，对于气溶胶，优选更高的剂量范围。在本发明中可使用任何常规气溶胶配制品以提供有效量的TNFR-IG制品，优选提供上述制品量。通过当病人呼吸时在病人口腔释放测定剂量的气溶胶雾状物，将雾状物吸入口腔并通过呼吸道进入肺来最有效地施用该制品。如上所述，有效量可一次或几次以更小的剂量在一天内经口腔或鼻内用药，对于快速治疗以每天的剂量用药，对于预防以每周至每月的间隔用药。
合适的气溶胶配制品包括适当剂量的药用活性化合物(例如，TNFR-Ig制品)和有效量的任何常规气溶胶推进剂。也可包括任何常规表面活性剂。TNFR-Ig可与作为溶液中的液体或作为粉末(例如，以熟知的方法冻干)的推进剂组合。推进剂可以是适当液化的。
在推进剂中的可溶的或可分散的那些表面活性剂是更有效的。在推进剂中可溶性更大的表面活性剂是最有效的。另外较重要的是，表面活性剂应是非刺激性的且无毒性。
可使用液化的或非液化的技术人员已知的用于药用组合物的可接受的任何常规推进剂。根据TNFR-Ig是粉末形式还是液体形式，推进剂可以是适合于与粉末一起使用的推进剂或是适合于与液体活性成分一起使用的推进剂。采用的液化推进剂可以是在室温(65°F)和大气压(760mm汞柱)下为气体的推进剂，即，在大气压下它可具有低于65°F的沸点且无毒性。可采用的合适的液化推进剂包括含有多达5个碳原子的低级链烷，如丁烷和戊烷。液化推进剂的例子是氟化的和氟氯化的低级链烷，如以商标“Freon”销售的推进剂。可适当采用上述推进剂的混合物。
现在已对本发明进行了一般性的描述，通过参考下面的实施例将更容易理解本发明，这些实施例以例证的方式提供并不是打算来限制本发明，除非另有说明。
实施例
实施例1：用于生产TNFR-Ig的编码TNFR-Ig的质粒
A．细胞系
用作哺乳动物宿主细胞系的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系来源于CHO-K1(ATCC号：CCL61 CHO-K1)。然后使用命名为CHO-K1DUX-B11(DHFR-)的CHO-K1突变型二氢叶酸还原酶(DHFR-)缺陷型细胞系(获自哥伦比亚大学L.Chasin博士；Simonsen,C.C和Levinson,A.D.,(1983)美国国家科学院院报80:2495-2499；UrlaubG.,和Chasin,L.,(1980)美国国家科学院院报77:4216-4220)通过用含胰岛素原前体cDNA的载体(Sures等；(1980)科学，208:57-59〕转染获得胰岛素需求减少的细胞系。命名为dp12.CHO的选择克隆生长需要甘氨酸，次黄嘌呤和胸苷，从而证实它们为DHFR-基因型。
B．可溶性1型TNFR-IgG1嵌合体的构建
通过将人1型TNFR的细胞外结构域与IgG1重链铰链区和CH2及CH3结构域的基因融合(下文称为TNFR1-IgG1)来构建可溶性1型TNFR-IgG1嵌合体。作为选择，也可使用IgG3重链的铰链区和CH2及CH3结构域。
编码人1型TNFR的DNA序列(见Loetscher等，出处同上)从质粒pRF-TNFR[Schall等，细胞，61,361(1990)]获得。为构建该起始质粒，将2.1kb胎盘cDNA克隆(Schall等，出处同上)***哺乳动物表达载体pRK5中，其构建在EP公开号307,247中描述。该cDNA开始于Loetscher等所报道的序列的64位核苷酸处，起始甲硫氨酸位于下游118bp处。
IgG1编码序列的来源是CD4-IgG表达质粒pRKCD42Fc1[Capon,D.J等，自然，337,525(1989)；Byrn等，自然，344,667(1990)]，该质粒含有编码与人IgG1序列融合的成熟人CD4蛋白质1-180残基(2个N-末端CD4可变结构域)所组成的杂交多肽的cDNA序列，该IgG1序列在216位天冬氨酸起始(将114位氨基酸作为重链恒定区的第1个残基)[Kabat等，免疫学感兴趣的蛋白质序列，第4版(1987)]，即在涉及重-轻链结合的半胱氨酸残基后的IgG1铰链的第1个残基)并于441位残基终止以包括IgG1的CH2和CH3 Fc结构域。也见EP227110。作为选择，可使用pCD4-Hγ3载体(DSM5523，EP394,827)。通过SstⅠ酶切去掉CD4 cDNA以获得所需的IgG3序列。
通过产生质粒pRK-TNFR和pRKCD42Fc1的限制性片断并连接它们，使用缺失诱变使成熟TNFR’s的171位苏氨酸残基与IgG1重链的216位天冬氨酸残基并列[Kabat等，出处同上]来构建TNFR1-IgG1。所得的质粒pRKTNFR-IgG含有TNFR1-IgG1编码序列的全部长度。然后可通过诸如磷酸钙沉淀的常规方法将该质粒转染进诸如CHO细胞的宿主细胞中。可用常规方法培养所得的细胞以表达TNFR-IgG，然后以常规方法分离之。
实施例2：具有大约：每蛋白质5-6M.唾液酸，每蛋白质0.4-0.45MN-乙酰葡糖胺，5.5-7.5的pI的TNFR-Ig的生产
细胞培养
通过转染将实施例1中编码可溶性1型TNFR-IgG1的基因导入dp12.CHO细胞中。使用将DNA导入哺乳动物细胞中的磷酸钙技术来完成转染。转染2天后，用胰蛋白酶消化细胞并重新涂布到选择培养基(加了2％的透析血清的无甘氨酸-次黄嘌呤和胸苷的Ham’s F-12 DMEM,1∶1v/v)上。随后，筛选出分泌TNFR1-IgG1的分离株。在氨甲喋呤中扩增的表达TNFR1-IgG1的克隆在产生高表达克隆的，随后调适到无血清中培养基。这些细胞处于连续选择压力下直到转移至非选择性培养基进行接种物的生长和扩增。
为了提供产生TNFR1-IgG1的细胞培养物，上述细胞种群通过在不断增大体积的容器中进行系列传代培养从含氨甲喋呤的培养基扩增至不含氨甲喋呤的生长培养基。对于该方法的这些步骤，非选择性生长培养基是以DMEM/HAMF-12为基础的配制品(例如，见美国专利5,122,469)，其中一些成分的浓度有所改变，如，葡萄糖，氨基酸，盐，糖，维生素，甘氨酸，次黄嘌呤，和胸苷；重组人胰岛素，水解蛋白胨(Primatone HS或Primatone RL)，细胞保护剂如Pluronic F86(多聚醇)或同等物；庆大霉素；脂类和微量元素。
通过使用CO2气体(酸)和/或Na2CO3(碱)将培养物控制在pH7.2+/-0.4。细胞生长期间温度控制在37℃左右。通过直接喷入空气和/或氧气使溶解氧维持在空气饱和度的5％以上。接种物扩增期间渗透压维持在大约250mOsm和350mOsm之间。
每次培养的生长期后是第二期或过渡期，其中培养参数从最适生长改变为生产条件。在该过渡期期间培养***的温度一般降低到约30和35℃之间。加入丁酸盐，从而保证一定的重量摩尔渗透压浓度范围。分析在该生产期期间积累的产物的唾液酸含量。
在典型的生产程序中，从选择期的接种物扩增产生大约1.2×106个细胞，其中在生长期生长的起始重量摩尔渗透压浓度为300-450mOsm，优选大约300。生长培养基补加微量元素，重组人胰岛素和水解蛋白胨。细胞在此条件下生长两天。第3天开始时降低细胞培养物的温度。温度改变的同时或之后，向细胞培养物中加入大约1至6mmol丁酸钠，优选6mmol且通过加入各种培养基成分保证生产所需的重量摩尔渗透压浓度。在这些条件下培养细胞生长9-10天。当需要时提供细胞各种培养基成分。
高唾液酸化组合物的pI比低唾液酸化组合物的pI低。对组合物进行等电聚焦。等电聚焦凝胶使用不同pH的两性电解质产生的pH梯度根据其等电点pI将组合物的糖蛋白分离。使用10至4的pH梯度进行组合物分析。
由层析聚焦测定上述组合物显示的等电点范围为大约5.5至大约7.5，其中pI对神经氨酸酶处理敏感。
TNFR-IgG的回收
如Capon等自然，337:525,1989所述，可通过离心细胞培养物并将所得的培养物上清通过蛋白A柱来纯化IgG融合蛋白。因此，离心上述获得的细胞培养物并将上清过蛋白A柱。这种亲和层析法通过如由Capon等，出处同上所述的在固定化金黄色葡萄球菌蛋白A上的TNFR1-Ig制品可纯化达到超过95％的同质性。
糖类分析
A.唾液酸含量可用Warren,L.(1959)，生物化学杂志234:1971-1975的方法进行分析。
B．完整的中性和氨基糖的释放可通过高pH阴离子交换层析结合脉冲安培计检测来测定。使用如下的步骤进行分析：
1．用TNFR1-IgG1(大约50μg/ml)和合适的参照样进行缓冲液交换，以使最终样品包含于1％乙酸中。
2．将大约90μg TNFR1-IgG1及参照样品冷冻于干冰和乙醇浴中，冷冻样品冻干过夜。
3．冻干样品在500μl三氟乙酸中重新配制并在120℃温育1小时。
4．酸水解后冷却TNFR1-IgG1和参照样品并蒸发干燥。
5．样品用水重新配制至终浓度大约为0.6mg/ml。
6．通过使用Dionex CarboPac Pal(4×250mm)柱(Dionex公司，美国，加州，圣尼维尔)以脉冲安培计检测的高pH阴离子交换层析在室温下进行单糖的分离。
7．通过与参照单糖进行比较确定每份单糖的量。
实施例3．TNFR-Ig的制备
1．使用磷酸钙共沉淀法用质粒pSV16B.TNFR-IgG(编码TNFR1-IgG1)和pFD11(编码DHFR)转染CHO细胞系DP12(EP307,247)。
2．转染获得的细胞克隆用含2％渗滤牛血清和100nmol/L氨甲喋呤的选择培养基扩增至9升悬浮培养物。用无氨甲喋呤的无血清培养基将两个9升培养物接种至100升发酵罐中。用1000倍的生产培养基洗涤以减少残留的血清成份后，在将细胞接种到1000升生产培养容器之前，将100升培养物用无血清培养基接种进400升培养物中。生产培养基为以DMEM/HAM F-12为基础的配制品，补充有葡萄糖，氨基酸，甘氨酸，次黄嘌呤，胸苷，水解蛋白胨，pluronic F68，庆大霉素，脂类和微量元素。
3．生产培养物用CO2气体和/或Na2CO3维持在pH7.2+或-0.2条件下13天。在细胞浓度达到5×106细胞/ml后，培养温度从37℃改变到30℃。在第2天和第4天通过加入培养基成份将培养物的重量摩尔渗透压浓度调节至大约450mOsm/kg。加入丁酸钠至最终浓度为12mM。通过向培养物喷入空气和或氧气使溶解氧浓度维持在60％气体饱和度。
4．13天后收集培养物，通过切向流动过滤细胞从上清液中分离出来。该收获的细胞培养液(HCCF)用10KD的Maxisette膜浓缩约20倍。通过加入固体NaCl至1.0M，随后通过0.22微米Durapore滤器过滤来澄清残留物并控制其条件以进行蛋白A层析。
5．过滤后，将调耗条件的HCCF通过固定的蛋白A。上样物质在洗脱前洗涤几次。TNFR-IgG用0.05M柠檬酸钠/20％(w/v)甘油，pH3.0逐步洗脱。通过加入1M柠檬酸钠将洗脱合并液调节为pH5.0。
6．调节pH后，稀释蛋白A合并液并上样到S-Sepharose Fast Flow上。样品经冲洗后用0.05M MOPS/0.05M NaCl pH7.2分步洗脱。
7．分步洗脱后，稀释S-Sepharose Fast Flow合并液，然后上样到Q-Sepharose Fast Flow柱上。使用在0.125M MOPS(pH7.2)中的从0.0125M NaCl至0.125M NaCl的线性梯度洗脱该柱。
8．线性梯度洗脱后，通过加入1体积的0.1乙酸钠/4.0M尿素/2.0M硫酸铵(pH5.0来调节Q-Sepharose Fast Flow合并液，然后上样到用0.05M乙酸钠/2.0M尿素/1.0M硫酸铵(pH5.0)平衡过的苯基Toyopearl650M柱上。在这些条件下TNFR-IgG流过此柱。样品随后用平衡缓冲液冲洗，合并流出液和冲洗液，组成苯基Toyopearl合并液。
9．合并两个苯基toyophearl合并液并用10KD Filtron Centrassette膜浓缩。浓缩液通过用0.01M柠檬酸钠/0.023M甘氨酸/0.023M甘露醇(pH6.0)中平衡过的G-25柱以产生TNFR-Ig组合物。
下述实施例4-10所描述的体内实验证明，本发明的TNFIg缓解哮喘发作效应。TNF受体融合蛋白可TNFR-Ig明显减轻，甚至在某些情况下消除过敏性肺炎动物模型中抗原激发引起的反应。TNFR-Ig抑制作用的程度可比得上用广谱消炎药***获得的程度。
缩写：TNFα，肿瘤坏死因子-α；TNFR-Ig，重组的可溶性的TNF受体IgG1融合蛋白；BAL，气管肺泡灌洗液；OA，卵清蛋白；RL，肺阻力；HBSS,Hanks平衡盐溶液；物质P，一种用于诱导急性支气管痉挛的神经肽，通常在文献中称为物质P〔例如见Selig和Tocker，欧洲药物学杂志213(3):331-336(1992)〕。
数据分析：每次实验所有数值均计算平均+/-SEM值。统计学差异通过两种方法重复测量分析分级数据的方差，随后通过使用学生Newman-Keuls t-检验或通过学生t-检验的多重比较检验来测定。P＜0.05认为在统计学上显著。计算用在PC机上运行的微软EXCEL5.0(softmart,Exton,PA,USA)和Sigma Stat(Jandel Scientific,SanRafael,CA,USA)软件包进行。
药物：所有药物均以1mg/kg的剂量用药。TNFR-Ig按实施例3所述生产和纯化，贮液在柠檬酸钠(10mM)，甘氨酸(23mM)和甘露醇(230mM)(pH6缓冲液中制备。贮液的等分样品使用前在-20℃贮存并在无菌盐水中进行稀释。下列物品从Sigma化学公司(St.Louis,MO,USA)购买并在无菌盐水中配制：卵清蛋白，氢氧化铝，乌拉坦，物质P乙酸酯，(+/-)盐酸***，***21-磷酸酯和伊文斯兰。
实施例4：用TNFR-Ig缓解豚鼠哮喘症状(气管过敏反应)
本实施例使用对OA产生过敏的豚鼠，使得随后接触OA将诱导气管过敏反应的哮喘症状。该症状可被TNFR-Ig缓解，其作用也与***，一种已知缓解哮喘的类固醇，进行了比较。
雄性豚鼠在0天(10μg+1mg Al(OH)3于0.5ml盐水中)的OA，皮下注射)敏化，在第14天后接受同样剂量的OA作为加强注射。在第21天动物用0.1％OA气溶胶激发30分钟。此敏化作用引起豚鼠哮喘样症状，包括对物质P的气管过敏。为了测定TNFR-Ig对此症状的影响，在激发前施用TNFR-Ig，将其症状与未激发的动物进行比较且显示为减轻。使用***(30mg/kg，腹腔注射，激发前1小时和后4小时)对气管过敏得到类似的效果。***是一种已知的哮喘治疗剂。
通过敏化，激发和治疗处理的豚鼠用于如下实验。
敏化：重250-300克的雄性Hartley品系豚鼠(Charles River,kingston,NY,USA)在第0天和第14天用单剂皮下注射(10μgOA+1mg氢氧化铝于0.5ml无菌盐水中)积极地对OA敏化，在第21天和28天之间用于实验。
激发：抗原激发方案以前已有描述(O’Donnell等，1994)。敏化的动物放在有机玻璃箱中，用0.1％(w/v无菌盐水)OA气溶胶激发30分钟。气溶胶用De Vilbiss Ultra-Neb 100超声喷雾器(呼吸服务中心，Ephrata,PA,USA)以内置风扇驱动的30L/分钟的气流速度传递。为了使过敏性反应引起的死亡数降至最小，在最初的5分钟给药时，喷雾器进行间隔60秒的开关循环，在这些条件下动物死亡率大约为5％。
药物治疗：在OA喷雾前18和1小时，动物组或接受载体(见药物)，或接受TNFR-Ig(1或3mg/kg，腹腔注射)。对于用***进行的实验，在OA喷雾前1小时或之后4小时动物组分别接受载体(盐水)或***(30mg/kg，腹膜内)。根据初步的观察结果确定TNFR-Ig和***的最佳剂量参数。
本实施例的结果表明经接触OA对OA过敏的豚鼠在OA激发后6小时表现出对物质P(1-10ug/kg静脉注射)的气管反应增强。对物质P的增强反应是哮喘样敏化的特性，表明豚鼠具有由上述实验条件诱导的过敏反应的哮喘症状。过敏反应受TNFR-Ig(3mg/kg，腹膜内，激发前18和1小时)抑制。
使用方法如下：气管对物质P的反应根据前述方法(Selig和Tocker,1992)在接触OA气溶胶后6小时的敏化的未激发的和激发的豚鼠中测定。动物用乌拉坦(2g/kg，腹膜内)麻醉，用PE-50导管做颈动脉(血压)和颈静脉(药物注射)插管。气管用15号针头插管，动物放入整体体积描记器(Modular Instruments,Malvern,PA,USA)中。用琥珀酰氯化胆碱(1.2mg/kg，静脉注射)抑制自发呼吸，使用1ml/100g体重的潮气量和60次呼吸/分钟的频率给动物机械通气(Harvard ApparatusModel 683；South Natick,MA,USA)。体积描记器总体积为2L，动物和呼吸装置间通气管路的体积是10ml。体积描记器装配有与Validyne分压传导器(DP45-14)相连的Fleisch呼吸速度描记器(Model#0000)用于测量气流。通过连接在气管插管侧臂和插在第5和第6肋骨间的16号胸膜内针头之间的第二Validyne传导器(DP45-28)测定跨肺压。用由IBM 486DX2 PC驱动的Modular Instruments(Malvern,PA,USA)M-3000数据获得***记录气流和跨肺压。计算机根据AmdurMead(1958)的方法利用常规软件(BioReport,Modular Instruments)进行肺阻力(RL)的计算。读数以平均10秒多的间隔连续进行。校正RL值作为气管的内部阻力(0.11cm水柱/ml/秒)。动物接受心得安(1mg/kg，静脉注射)并在开始施用物质P前使其稳定10分钟。
通过以大约5-10分钟的间隔提供大剂量注射获得物质P(1,3,5和10μg/kg，静脉注射)的剂量-反应效应。获得每个剂量RL的最大变化并以施用物质P前测定的基础值的百分数来表示。ED200值定义为引起RL升高200％的物质P的剂量，通过对每个动物对数剂量-反应曲线的线性回归进行测定。
RL的基础值为大约0.30cm水柱/ml/秒，组间无显著差异(P＞0.05)。敏化的而未激发的豚鼠对物质P相当不敏感，需要30μg/kg的剂量使RL升高至少200％或更大(表1)。相反，OA激发后，气管对物质P的反应显著升高。用物质P的最大剂量获得的RL最大值升高大约5倍(表1)时，ED200值升高大约10倍(表1)。
表1：TNFR-Ig和***影响OA敏化的豚鼠对物质Pa的气管应答反应的总结。治疗b     -logED200 c  最大应答反应d   ne
                      (RL升高％)未受激发f 4.86+/-0.08    139+/-28         6TNFR-Ig载体       5.82+/-0.04    1811+/-228       71mg/kg     5.87+/-0.01    1344+/-195       63mg/kg     5.48+/-0.05*  714+/-69*       5***载体       5.87+/-0.05    935+/-91         530mg/kg    5.35+/-0.04*  596+/-66*       6
a物质P的剂量-反应效应在用0.1％OA气溶胶激发30分钟后6小时测定。检查气管对物质P的应答反应前，用心得安(1mg/kg，静脉注射)预处理动物10分钟。
b使用1ml/kg的剂量，用各自的载体，TNFR-Ig(OA激发前18和1小时)或***(OA激发前1小时和之后4小时)经腹膜内预处理动物。
c值代表肺阻力(RL)增加了基础值的200％所需的物质P剂量(以g/kg)的负对数(平均+/-S.EM.值)。
d值(平均+/-S.E.M.值)代表由物质P(10μg/kg，静脉注射)引起的基础RL的升高百分数。
e每组动物数。
f物质P的剂量-反应效果曲线在未用OA气溶胶激发的敏化动物组中测定。
*相应载体和药物处理组之间的值在统计学上有显著(P＜0.05)的差异。
给敏化动物施用TNFR-Ig(3mg/kg)显著(P＜0.05)抑制OA诱导的呼吸道对物质P的过敏反应。物质P的ED200值降低大约3倍，RL最大值减少大约60％(表1)。较小剂量的TNFR-Ig(1mg/kg)对物质的敏感性无影响(表1)。在敏化豚鼠中用***(30mg/kg)处理也以用较大剂量的TNFR-Ig所获得的相似程度(表1)显著(P＜0.05)抑制OA诱导的呼吸道过敏反应。
实施例5：用TNFR-Ig缓解的豚鼠哮喘症状(炎症细胞流入)
本实施例使用实施例4所述的对OA过敏的豚鼠以便随后接触OA时将诱导哮喘症状，即炎症细胞流入。该症状被TNFR-Ig缓解，也将其与***，一种已知缓解哮喘的类固醇，进行了比较。
如实施例4中，使雄性豚鼠对OA敏化且按所述进行激发以诱导哮喘症状，包括激发后6,24,48，和72小时定量的呼吸道炎症细胞累积。如实施例4中，为了测定TNFR-Ig对这些症状的影响，在激发前施用TNFR-Ig，与未激发的动物比较，这些症状且显示出症状减轻。也在激发前施用TNFR-Ig用于炎症，结果显示逆转炎症细胞流入。用***(30mg/kg，腹膜内，激发前1小时和之后4小时)在6和24小时获得对炎症细胞累积的相似影响。
使用方法如下：在OA激发后6和24小时根据以前所述方法(Selig和Tocker,1992)通过BAL测定呼吸道炎症细胞流入。简单地说，豚鼠用乌拉坦(2g/kg，腹膜内)麻醉，用15号插管作气管切口。用3×5ml不含Ca2+和Mg2+的无菌Hank’s平衡盐溶液(HBSS)(Gibco,GrandIsland,NY,USA)灌洗肺。样品在25℃,200g离心10分钟，用蒸馏水(1ml,30分钟)从所得的沉淀中溶开血红细胞，然后加入10mlHBSS恢复重量摩尔渗透压浓度。第二次离心(25℃下，200g,10分钟)样品，所得的沉淀重新悬浮于1ml HBSS中。用血细胞计数器从细胞悬浮液的等分样品以台盼兰(Sigma化学公司，St.Louis,MO,USA)排斥法测定总细胞数。为分类细胞计数，将细胞悬浮液的等分样品在Cytospin中离心(5分钟，1300rpm；Shandon Southern Instruments,Sewickey,PA,USA)，涂片，固定，用改良瑞氏染液(Leukostat；FisherScientific,Pittsburgh,PA,USA)染色。在光镜下分类至少300个细胞中采用标准形态学准则。数据表示为BAL细胞×106/动物。
用TNFR-Ig处理(1-3mg/kg，腹膜内，18和1小时及1小时预处理，对于BAL，在6和24小时，分别显著(P＜0.05)抑制了OA后6和24小时BAL中中性细胞和总细胞数的累积)。TNFR-Ig(3mg/kg，腹膜内)也显著(P＜0.05)减少2个时间点BAL的嗜酸性粒细胞数目，而低剂量(1mg/kg，腹膜内)无影响。本实验结果也表明过敏原诱导的炎症反应中中性粒细胞成分是由TNF介导的。最明显的是，在抗原激发后24小时，TNFR-Ig几乎消除了敏化豚鼠的BAL的中性粒细胞的流入，其中中性粒细胞数占BAL中细胞总数的大约2％。此外用TNFR-Ig而不是***处理，在激发后6小时，引起豚鼠中性粒细胞大量下降。通过TNFR-Ig或类似拮抗剂阻断TNF，可引起已知的有助于中性粒细胞回流进肺的因素的间接下降。
敏化的，未激发的豚鼠BAL的细胞组成以前已被描述(Selig和Tocker,1992)。这些动物中总的细胞计数平均为大约1×106/动物，其中大约2-3％是嗜酸性粒细胞和中性粒细胞。OA处理后6小时，在TNFR-Ig或***的载体处理的动物中含有分别含总细胞计数的至少40和20％的嗜酸性粒细胞和中性粒细胞。BAL中嗜酸性粒细胞百分数在24小时保持恒定，而中性粒细胞计数则下降至总细胞数的大约10％。炎症细胞数和总细胞数在TNFR-Ig和***的各自载体组之间无差异(P＞0.05)。
炎症细胞流入敏化的，激发的豚鼠BAL也受***(30mg/kg)的抑制，OA处理后6小时，BAL中嗜酸性粒细胞和总细胞数有显著(P＜0.05)的下降，这与TNFR-Ig所引起的情况类似。6小时时间点时对中性粒细胞数无影响。OA处理后24小时，BAL中嗜酸性粒细胞，中性粒细胞和总细胞数被***显著(P＜0.05)地抑制。与TNFR-Ig相比，***处理的动物嗜酸性粒细胞降低大约5倍(P＜0.05)。相反，尽管***处理降低了BAL中的中性粒细胞数，但是在不同细胞中这些细胞百分比保持不变(P＞0.05)，为约总细胞数的8％。
在敏化豚鼠中检查TNFR-Ig逆转活动性炎症反应的能力。使动物对OA敏化，然后如上所述进行激发。OA激发30分钟后施用TNFR-Ig(3mg/kg，腹膜内)。在激发后24,48和72小时通过BAL检测炎症。对于48和72小时时间点，TNFR-Ig每日给药。激发后用TNFR-Ig处理明显逆转敏化豚鼠BAL中炎症细胞的流入。
实施例6:TNFR-Ig缓解豚鼠的哮喘症状(肺水肿)
本实施例使用实施例4所述的，对OA过敏的豚鼠以便随后接触OA将诱导哮喘症状，即肺水肿。该症状被TNFR-Ig缓解，也将其与***，一种已知缓解哮喘的类固醇，进行了比较。
如实施例4中，使雄性豚鼠对OA敏化且按所述进行激发以诱导哮喘症状，包括在激发后6小时定量的水肿。如实施例4中，为了测定TNFR-Ig对这些症状的影响，激发前施用TNFR-Ig，将这些症状与未激发的动物进行比较并表明有所减轻。
使用方法如下：OA处理后6小时使用以前所述的方法(Wasserman等，***素，血栓烷，白三烯研究进展，23:271-273,1995)以伊文斯兰染色液外渗法定量作为肺水肿标志的呼吸道毛细血管渗漏。豚鼠用乌拉坦(2g/kg，腹膜内)麻醉并作颈静脉插管。然后动物接受在60秒期间内给药的伊文斯兰染色液(30mg/kg，静脉注射)。10分钟后打开胸腔并将导管(PE-240管)通过左心室***主动脉。交叉夹住心室，切开右心房并通过使用药筒泵(Masterflex；Cole-Parmer,Chicago,IL,USA)用100ml盐水以100ml/分钟的速度灌注动物来排出血液。通过在肺动脉内插管并切开左心房，再用50ml盐水灌注肺循环。整体取出肺，切下气管(末端5mm)和主支气管，在滤纸间吸干并称重。在甲酰胺中提取伊文斯兰染料(37℃,24小时)并通过用分光光度计(BeckmanInstruments Model DU-64,Somerset,NJ,USA)在620nm下测吸光率进行定量。组织染料含量由伊文斯兰染料浓度(0.5-10μg/ml)标准曲线上获得并以ng/mg组织湿重来表示。
使用伊文斯兰染料作为气管毛细血管渗透标记时，敏化的，未激发的豚鼠气管和主支气管的基础值平均为10-20ng/mg组织湿重。OA激发后6小时，气管和主支气管中伊文斯兰染料含量升高了大约5倍。用TNFR-Ig(1或3mg/kg)或***(30mg/kg)处理在激发后6小时减弱了(P＜0.05)气管和主支气管中OA诱导的呼吸道渗透。
TNFR-Ig(1或3mg/kg.腹膜内)消除了敏化豚鼠气管和主支气管中OA诱导的呼吸道水肿(以伊文斯兰染料的组织含量来定量)。
实施例7：用TNFR-Ig缓解褐色挪威大鼠哮喘症状
与实施例4中使用的豚鼠相似，在大鼠中诱导炎症细胞积累(一种哮喘症状)并用TNFR-Ig治疗。本模型与豚鼠的区别在于褐色挪威大鼠的过敏反应由IgE介导。
使用方法如下：使雄性褐色挪威大鼠在第0,1和2天对OA(1mgOA+100mgAl(OH)3溶于0.5mg盐水中，腹膜内)敏化。在第21天，用1％OA气溶胶激发动物30分钟。激发后24小时以BAL来定量炎症细胞积累。敏化，激发和BAL的方案相似于上文对豚鼠所述，但有如下例外。体重200至250g的雄性褐色挪威大鼠(Charles River,Kingston,NY)在第1,2,3天用单剂腹膜内注射(1mgOA+100mg氢氧化铝溶于1ml无菌盐水中)激活其对OA敏化用于在第21天进行实验(Elwood等，1992)。OA喷雾前1小时，各组大鼠分别接受各自的载体，TNFR-Ig(1或3mg/kg，腹膜内)或***(0.3mg/kg，腹膜内)。
实验当天，大鼠用1％OA气溶胶激发30分钟。激发后24小时，通过用2×1ml/100g的HBSS灌洗肺来进行BAL。用0.5ml蒸馏水溶解红细胞，用5ml HBSS恢复重量摩尔渗透压浓度。
用TNFR-Ig(3mg/kg，腹膜内，激发前1小时)处理上述大鼠基本上消除了BAL中中性粒细胞的积累并引起嗜酸性粒细胞数和总细胞数显著下降。用***(0.3mg/kg，腹膜内，激发前l小时)获得类似的结果。较低剂量的TNFR-Ig(1mg/kg，腹膜内)也明显降低了BAL中的中性粒细胞数，但对嗜酸性粒细胞和总细胞数无影响。
更详细地说，敏化的，未激发的褐色挪威大鼠在BAL中总细胞计数基础值为大约1×106/动物，其中按比例1-2％是嗜酸性粒细胞和中性粒细胞。OA激发后24小时，载体处理的动物BAL中细胞总数升高了大约3倍，其中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞分别占细胞总数的至少40％和25％。BAL中炎症细胞计数和总细胞数在各自载体处理组之间无差异(P＞0.05)。
用TNFR-Ig(3mg/kg，腹膜内)或***(0.3mg/kg，腹膜内)处理都以相似的程度显著(P＜0.05)降低了BAL中嗜酸性粒细胞，中性粒细胞和总细胞数的积累。用较低剂量的TNFR-Ig(1mg/kg，腹膜内)处理也显著(P＜0.05)抑制了BAL中中性粒细胞数，但对BAL中嗜酸性粒细胞或总细胞数的积累无影响。
实施例8：受伤大鼠肺中中性粒细胞的减少
Sephadex(葡聚糖凝胶)颗粒诱导的大鼠肺炎模型显示肺中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞数上升及肉芽肿形成，这与慢性哮喘中所见的近似。该模型用于显示TNFR-Ig缓解此慢性症状。
使用方法如下：通过施用Sephadex(葡聚糖凝胶)颗粒悬液(7.5mg/kg,.iv.)在雄性Sprague-Dawley大鼠中诱导炎症细胞向肺中的累积。施用Sephadex(葡聚糖凝胶)后24小时和72小时，在BAL液中白细胞总数显著升高。在24小时时，中性粒细胞数占白细胞总数的50％左右，到72小时时则下降到总数的10％左右。嗜酸性粒细胞计数维持在白细胞总数的10％左右。
用TNFR-Ig(1和3mg/kg,.ip.,激发前1小时)或***(0.1和0.3mg/kg，腹膜内)预处理在施用Sephadex(葡聚糖凝胶)后24小时抑制中性粒细胞，尽管TNFR-Ig对细胞总数无明显影响。施用Sephadex(葡聚糖凝胶)后72小时，TNFR-Ig(1和3mg/kg，腹膜内，每日)明显减少流入BAL液的中性粒细胞，但对嗜酸性粒细胞数无抑制作用。相反，***(0.1和0.3mg/kg，腹膜内，每日)基本上消除中性粒细胞和嗜酸性粒细胞向BAL液的渗入。TNFR-Ig(1和3mg/kg，腹膜内)或***(0.1和0.3mg/kg，腹膜内)在72小时时间点明显减少总细胞计数。
实施例9：灵长类特异反应性哮喘的缓解
采用对Ascaris suum抗原表现出天然呼吸道敏感的野外捕捉的弥猴建立的特异反应性哮喘灵长类模型用于证明TNFR-Ig缓解哮喘症状呼吸道过敏反应的效应。重复接触抗原诱导呼吸道的哮喘症状，尤其是增加了肺阻力(RL)。当用TNFR-Ig处理时猴子显示RL下降。
当给予重复接触A.suum抗原时，野外捕捉的野生蛔虫属敏感型弥猴显示了增强的对吸入的乙酰甲胆碱的呼吸道反应和增多了呼吸道嗜酸性粒细胞。因此使用该抗原诱导在这些猴中的过敏反应和随后产生的哮喘症状的呼吸道过敏反应性。下列方案用于检查TNFR-Ig对呼吸道过敏反应的影响。
第1天：测定一种类似物质P的气管痉挛诱导剂乙酰甲胆碱(MCh)的剂量，其产生了100％(PC100)的升高的肺阻力(RL)。
第3天：用产生至少加倍的RL的一个蛔虫属抗原吸入剂量激发猴子。
第5天和第8天：重复第3天的实验。
第10天：重复第1天的实验，测定第1天和第10天之间PC100对数值的变化。
在第1,3,5和8天施用TNFR-Ig(3mg/kg，静脉注射)减弱了呼吸道对MCh的过敏反应。
实施例10:TNFR-Ig缓解小鼠过敏性呼吸道炎症
使用OA诱导小鼠过敏性肺炎的鼠类模型证明TNFR-Ig减轻炎症细胞流入的哮喘症状。反复接触OA的敏变化小鼠逐渐形成呼吸道过敏且BAL中嗜酸性粒细胞流入增加。此模型与IgE水平升高相联系且表现出典型的Th2细胞因子特征(如IL-4和IL-5水平升高)。在本模型中评价了TNFR-Ig减弱活动性过敏炎症反应的能力。
过敏性肺炎的鼠类模型与灵长类相似，为诱导呼吸道过敏反应和炎症细胞流入，需要敏化的动物多次接触过敏原。雌性C57BL/6小鼠在第0天用OA(10μg，含1mg Al(OH)3凝胶，0.1ml，腹膜内)敏化，然后，从第14-20天，每天用1％OA气溶胶激发30分钟。呼吸道对MCh的过敏反应和BAL在最后一次OA激发后24小时完成。固定一些来自敏化的，激发的肺用于组织学检查，其它被匀浆用于测定TNF水平。
在敏化的，激发的小鼠中炎症细胞累积和TNF水平在用OA气溶胶最后一次激发(第20天)后达到高峰。本实验中，在最后一次接触OA后立即施用TNFR-Ig(3mg/kg，腹膜内)。TNFR-Ig减弱了OA诱导的过敏反应，但对BAL中炎症细胞流入无影响。在激发期间每日施用TNFR-Ig对BAL细胞计数也无影响。然而施用TNFR-Ig(3mg/kg，腹膜内，第20天)明显减少了敏化的，激发的小鼠肺组织中的嗜酸性粒细胞数且清除了肺组织中的TNF水平。
实施例11：气溶胶组合物
下面是含有本发明的TNFR-Ig制品的实施例
实施例A-气溶胶
TNFR-Ig(颗粒大小范围1-5微米)    3.0％
Span85(脱水山梨醇三油酸酯)   1.0
氟利昂11(三氯单氟甲烷)       30.0
氟利昂114(二氯四氟乙烷)      41.0
氟利昂12(二氯二氟甲烷)       25.0
实施例B-气溶胶
TNFR-Ig                         0.5％
Span85                       0.5％
推进剂B1                       99.0％
1推进剂B由10％氟利昂11,50.4％氟利昂114,31.5％氟利昂12，和8.0％丁烷组成。
实施例C-气溶胶
TNFR-Ig                         1.00％
Span85                       0.25％氟利昂11                     5.0％氟利昂W1                    93.75％1氟利昂W由61.5％氟利昂114和38.5％氟利昂12组成。实施例D-气溶胶TNFR-Ig                      0.50％Span85                    0.50％推进剂(C)1                  99.0％1推进剂C由30.0％氟利昂11和70％氟利昂W组成。实施例E-气溶胶TNFR-Ig                      0.88％硫酸钠(无水)，粉末           0.88％Span85                    1.00％推进剂，由50％氟利昂12，     97.24％25％氟利昂11，和25％氟利昂114组成实施例F-气溶胶TNFR-Ig                      0.06％Span85                    0.05％氟利昂11                     20.0％氟利昂12/氟利昂114(20/80)    78.9％实施例12：注射组合物下面是含有本发明的TNFR-Ig制品的注射组合物的一个例子。
成份                       每ml含有
TNFR-IgG1                  *
无水柠檬酸，USP            1.92mg
甘氨酸，USP                1.70mg
甘露醇，无热源，USP        41.90mg
氢氧化钠                   适量，pH6.0
盐酸                       适量，pH6.0
注射水，USP                适量，至1.0ml**
*本配方中使用的TNFR-IgG1浓度可以是1.0mg/ml至20mg/ml。该配方中TNFR-IgG1的最终量以每瓶的组合物浓度和体积为基础来选择。
**通过冻干转移．
1mg药瓶     (用1.0mg/ml配方1ml)
2.5mg药瓶   (用2.5mg/ml配方1ml)
5.0mg药瓶   (用5.0mg/ml配方1ml)
10mg药瓶    (用5.0mg/ml配方2ml)
10mg药瓶    (用10.0mg/ml配方1ml)
20mg药瓶    (用8.0mg/ml配方2.5ml)
20mg药瓶    (用5.0mg/ml配方4ml)
50mg药瓶    (用20mg/ml配方2.5ml)
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Claims (11)

1．一种在患有哮喘症状的病人中抵抗哮喘的方法，包括给所述的病人施用含有由一种或多种嵌合的TNFα结合蛋白组成的制品的组合物，所述的制品中的各蛋白质由融合到IgG上的p55 TNF受体蛋白的可溶部分组成，其中所述的融合的IgG含有除了IgG重链恒定区的第一IgG结构域之外的所有IgG结构域，所述的组合物含有治疗上的惰性载体，且所述组合物施用给所述病人以便给病人提供有效量的所述嵌合蛋白制品以抵抗所述的哮喘症状。
2．权利要求1的方法，其中所述的病人患有哮喘病，并且嵌合蛋白质制品以足以减轻所述的疾病的影响的量施用。
3．权利要求1的方法，其中所述的组合物在哮喘病发作前以有效防止或延缓所述的疾病发作的量施用给哮喘病人。
4．权利要求1至3中的任意一项的方法，其中融合的IgG是人IgG1。
5．权利要求1至4中的任意一项的方法，其中在所述的蛋白质制品中的蛋白质具有以一个或多个唾液酸残基终止的复合寡糖并具有暴露的N-乙酰葡糖胺，在所述的制品中唾液酸残基的摩尔比为每摩尔蛋白质从大约4至大约7摩尔唾液酸，在所述的制品中暴露的N-乙酰葡糖胺的摩尔比是每摩尔蛋白质从大约1至大约2摩尔N-乙酰葡糖胺，在所述的制品中唾液酸残基与N-乙酰葡糖胺残基的摩尔比是从大约0.35至大约0.5，所述的制品的等电点是从大约5.5至大约7.5。
6．权利要求5的方法，其中唾液酸与N-乙酰葡糖胺的摩尔比是从大约0.4至大约0.45，且唾液酸与蛋白质的摩尔比是从大约5.0至大约6.0。
7．权利要求1至6中的任意一项的方法，其中将所述的制品以每天每病人体重每千克从0.1mg至5.0mg的剂量经注射施用给所述的病人。
8．权利要求7的方法，其中剂量是每天每体重每千克从1.0mg至3.0mg。
9．权利要求1至8中的任意一项的方法，其中所述的制品以口腔或鼻腔喷雾的方式用药。
10．权利要求9的方法，其中所述的喷雾是含有重量比从大约0.03％到5.0％的所述的制品的液体喷雾组合物。
11．由融合到IgG上的p55 TNF受体蛋白的可溶部分组成的嵌合TNFα结合蛋白在制备治疗哮喘的药物中的应用，其中所述的融合IgG含有除了IgG重链恒定区的第一IgG结构域之外的所有IgG结构域。
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