CN1231760C - 用于生物材料标记的稀土纳米粒子、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于标记生物材料的稀土纳米粒子。该粒子的粒径在3nm-400nm之间，它能与所说的生物材料相连接，而且在激发时能够发出荧光。该粒子的成分是选自下列各复合物质中的一种或数种：SrAl₂O₄:Eu²⁺；SrAl₂O₄:Eu²⁺+Dy³⁺；Y₂O₃:Eu³⁺；CaS:Eu³⁺；CaS:Eu³⁺+X，其中X＝Tm³⁺、Y³⁺或Al³⁺；ZnS:Y，其中Y＝Eu²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Ag⁺和/或Au⁺；Gd₂O₃:Eu³⁺；La₂O₃:Eu³⁺；MgB₅O₁₀:Ce³⁺+Gd³⁺；SrB₄O₇:Sm²⁺和/或Gd₃(PO₄)₂:Eu³⁺。为防止稀土纳米粒子的水解，在其表面可被包被上一层聚合物膜或无机物膜。包被后的粒子的粒径优选在5—100nm之间。

Description

用于生物材料标记的稀土纳米粒子、其制备方法及用途

本发明涉及一种可用于生物材料标记的稀土纳米粒子材料、其制备方法及用途。具体地讲，本发明涉及一种可用于生物材料标记的、被聚合物包被的稀土纳米粒子材料、其制备方法及用途。

生物材料如DNA、多肽、蛋白质、细胞及组织等本身缺少可以用来进行检测的性质。在生命科学研究或临床诊断中常需要对这些材料进行标记，以使其具有放射性、荧光或化学发光等性质。荧光标记法是目前普遍采用的一种方法。目前，常用的荧光材料主要是有机染料，如异硫氰基荧光素(FITC)、四乙基罗丹明(RB 200)等。有机染料荧光光谱的缺点是激发峰比较窄，斯托克斯位移小，发光时间短，易于光漂白，这使得有机荧光标记技术的应用受到很大限制。

目前，有许多报道利用荧光微球作为抗体(抗原)分子的荧光标记物。例如，用二萘嵌苯微球(0.8-1μm)作为荧光标记物，与抗体相连后溶于水溶液中，可以定量检测抗原的浓度。而量子点纳米微球由于其量子限制效应，具有光谱激发峰宽、发射峰窄、发光时间不易被光漂白等特点，适合作为一种理想的荧光标记材料。Chan和Marcel报道了分别将不同的量子点纳米微球用于生物分子的标记。但是，由于制备量子点纳米微球的条件很苛刻，且成本昂贵，使它的应用程度也受到了很大的限制。

美国专利US5,990,479中提出了用一种纳米晶半导体来作为荧光探针。其所采用的半导体为MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe和HgTe等。

众所周知，稀土类固体材料荧光强度高，荧光寿命长(很多材料的寿命可达到毫秒到分钟数量级)，斯托克斯位移大，且品种繁多，合成方法简便，成本低廉，是一类使用范围极广的荧光材料。但是，目前稀土材料通常是由高温合成的，多为块状材料。其中某些成分溶于水，如其硼酸盐、铝酸盐等，在水溶液中应用时会导致这些磷光体部分溶解于水而失去发出荧光的特性，因此不宜直接作为生物材料的荧光标记物。同时，还存在无机的稀土材料与生物材料连接强度问题，以及连接后如何保持生物材料的活性问题。

与US5,990,479半导体纳米荧光探针不同，本发明提出一种稀土或掺杂稀土的纳米粒子作为生物材料的荧光探针。其发光机理与稀土的f层电子的形变有关。

本发明的目的就是提供一种可应用于水溶液中的、与生物材料连接较好的标记生物材料的稀土纳米粒子。

本发明的另一目的是提供一种制备上述稀土纳米粒子的方法。

本发明还有一个目的是将上述的稀土纳米粒子应用于生物材料的检测。

在本发明中，可用作类荧光探针的稀土纳米粒子可以是一种稀土或者几种稀土组成的混合物，也可以是稀土掺杂于其它非稀土元素中所形成的混合物，如掺杂于硫化物、磷酸盐、铝酸盐、硼酸盐等物质中。具体地说，本发明的稀土纳米粒子的成分可以选自下列各复合物质中的一种或数种：SrAl₂O₄:Eu²⁺；SrAl₂O₄:Eu²⁺+Dy³⁺；Y₂O₃:Eu³⁺；CaS:Eu³⁺；CaS:Eu³⁺+X，其中X＝Tm³⁺、Y³⁺或Al³⁺；ZnS:Y，其中Y＝Eu³⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Ag⁺和/或Au⁺；Gd₂O₃:Eu³⁺；La₂O₃:Eu³⁺；MgB₅O₁₀:Ce³⁺+Gd³⁺；SrB₄O₇:Sm²⁺和/或Gd₃(PO₄)₂:Eu³⁺。在上述各表达式中，Mⁿ⁺表示掺杂的稀土。

本发明稀土粒子具有很强的荧光强度，其形状可以是球形、棒状、立方体、长方体或者前几种的任意组合形状。粒径大小可在3纳米到400纳米之间，适宜的粒径大小在5-100纳米之间。最佳的范围是经下面包被处理后，粒子的大小在5-100纳米之间。荧光纳米粒子粒径分布比较窄，粒径分布在±20％内，最好在±15％之内。

本发明中，为使稀土纳米粒子荧光材料不被所应用体系中的溶液腐蚀或溶解，从而导致荧光强度下降，应当对稀土纳米粒子材料进行包被。即在所说的稀土纳米粒子的表面被包被上一层聚合物膜或无机物膜，以保护稀土纳米粒子。

包被的方法基本上有三种：有机单体聚合法、有机硅烷水解法以及吸附法。

利用有机单体聚合法所得的聚合物膜的表面需经功能化处理，使不同的功能基团如氨基、羧基、羟基、醛基和/或环氧基等连接于粒子的表面，从而使包覆后的稀土纳米粒子可以与生物材料进行有效地连接。

有机单体聚合法的包被层是由下列各种单体中的一种或多种组分组成的总的有机单体通过悬浮聚合而得：

1.包覆单体：分子中仅含有一个可以进行自由基聚合的碳-碳双键；

2.交联剂：分子中含有2个或2个以上的可以进行自由基聚合的碳-碳双键。加入交联剂的目的是使得表面包被层中含有网状结构，但该单体的加入是任选的；

3.功能化试剂：分子中同时含可以进行自由基聚合的碳-碳双键以及功能化基团。这些功能化基团可以是：氨基、羧基、羟基、醛基或环氧基等。通过这些功能基团，稀土纳米荧光探针可以方便地与生物材料连接；

4.偶联剂：一端含有强极性的磷酰氧基团，跟稀土具有强的络合作用，而另一端含有长链及可以与其它单体共聚的双键。由于稀土纳米粒子的表面极性强，而聚合物的极性较弱，为了使聚合物能够完全包覆于稀土纳米粒子的表面，还可以加入上述偶联剂。这样，前面所述的聚合单体如包覆单体、交联剂、功能化试剂等可以先吸附于微粒表面，再进行聚合，结果是可以得到分布均匀的聚合物包覆层。而纯的聚合单体则很少形成新的聚合物颗粒。

在本发明中，包覆单体通常选自下列组中的一种或多种：丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸-2-羟乙酯、丙烯酸-2-羟乙酯、乙二醇单环氧丙烯酸酯、乙二醇单丙烯酸酯、三乙二醇二丙烯酸酯、乙二醇二丙烯酸酯和苯乙烯等。

本发明的交联剂通常选自下列组中的一种或多种：二乙烯苯、乙二醇二丙烯酸酯、二乙二醇二丙烯酸酯、三乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、季戊四醇二丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯等。

本发明的功能化试剂通常选自下列组中的一种或多种：丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯醛、丙烯酰胺、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-醛基丙基三乙氧基硅烷、3-胺基丙基三乙氧基硅烷、3-巯基丙基三乙氧基硅烷、甲基丙烯酸-2-羟乙酯、丙烯酸-2-羟乙酯、甲基丙烯酸-2-胺乙酯、乙二醇双还氧单丙烯酸酯、3-环氧基丙基三乙基硅烷等。

本发明所选的偶联剂可以是磷酸双-(三羟甲基丙烷二丙烯酸酯)、磷酸双-(甲基丙烯酸-2-羟乙酯)和/或磷酸双-(季戊四醇三丙烯酸酯)等。

除了上述采用聚合方法在稀土纳米粒子上包被聚合物层外，另一种在稀土纳米粒子上进行包被的方法是有机硅烷水解法。该方法首先用硅酸烷基酯在稀土纳米粒子上经水解形成二氧化硅层，然后再用有机硅烷如三乙氧基-3-氨基丙基硅烷、三乙氧基-3-醛基丙基硅烷、三乙氧基-3-巯基丙基硅烷和/或四乙氧基硅烷等进行功能化处理，以便包被后的稀土纳米粒子与生物材料继续更好地连接。

另外，还可以直接在稀土纳米粒子表面上吸附氨基葡聚糖、聚甲基丙烯酸、环氧葡聚糖和/或磷脂等，形成包被层。

采用有机单体聚合法制备用于标记生物材料的稀土纳米粒子时，主要包括如下步骤：

(1)制备粒径在3-400nm之间的稀土纳米粒子；

(2)将步骤(1)制备的稀土粒子加入到有机溶剂中；

(3)在步骤(2)所得的混合物中加入总的有机单体和聚合引发剂，进行悬浮聚合，使得稀土纳米粒子表面包覆一层聚合物膜。

本发明步骤(1)中的3-400nm之间的稀土纳米粒子可以利用多种制备纳米粒子方法制得，例如溶胶-凝胶法、沉淀法、燃烧法、水热法、高温沉淀法、微波法等。为了获得最强的荧光强度，制得的纳米粒子在较高的温度下加热使纳米粒子晶格排列整齐。为了获得较窄的粒径范围的粒子，可以对所得的微粒进行粒度分级。

本发明所涉及的聚合反应通常在有机溶剂中通过悬浮聚合完成。步骤(2)所选用的有机溶剂可以为甲苯、二甲苯和/或四氢呋喃等。

为了使步骤(1)中制得的颗粒在上述有机溶剂中充分分散，通常还要加入表面活性剂。表面活性剂可以是非离子表面活性剂和/或阴离子表面活性剂，如烷基酚聚氧乙烯醚(OP-10，OP-15)、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠等。表面活性剂在有机溶剂中的含量为0～5体积％，优选的含量为0.1～5体积％。

在上述制备过程的步骤(3)中，由于稀土纳米粒子的表面极性强，而聚合物的极性较弱，为使聚合物完全包覆于稀土微粒表面，可以加入偶联剂。所加的偶联剂可以是磷酸双-(三羟甲基丙烷二丙烯酸酯)、磷酸双-(甲基丙烯酸2-羟乙酯)和/或磷酸双-(季戊四醇三丙烯酸酯)等。

步骤(3)的包覆是通过聚合反应形成一层聚合物包被层进行的，它比较适合于含有水溶性组分的稀土纳米微粒。在该步骤中，加入合适的包覆单体以及交联剂、功能化试剂与偶联剂，使各单体分散到稀土纳米颗粒的表面。然后在搅拌下，加入引发剂并提高反应温度，使各单体在稀土纳米粒子的表面聚合形成一层亲水的薄膜。该薄膜的厚度不宜太厚，实际上越薄越好，只要能形成连续的覆盖层即可。如果包被层太厚，将导致包被后的粒子体积过大，不利于与生物材料的结合。包覆的厚度可以通过调节稀土纳米粒子与包覆单体的量来调节。反应完毕后充分洗涤微粒，除去未反应的物质和表面活性剂，将其分散在磷酸盐缓冲溶液中待用。

本发明中，纳米粒子包覆时各种试剂的用量可根据使用要求来改变。参与反应的总的有机单体(包括包覆单体、交联剂、功能化试剂、偶联剂的总和)与稀土荧光微粒的质量比为1∶300～1∶1范围内。各种组分在总有机单体中的含量为：包覆单体为5～80体积％；功能化试剂为5～40体积％；交联剂为0～80体积％；偶联剂0～10体积％。另外，还需加入1～5体积％的引发剂。优选的各组分的含量为：包覆单体：5～80体积％，功能化试剂：5～40体积％，交联剂：5～80体积％，偶联剂：1～10体积％，引发剂：1～5体积％。

适合于步骤(3)中形成聚合物包被层的单体优选是那些带有功能基团的单体，例如：丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯醛、甲基丙烯酸-2-羟乙酯、乙二醇单环氧丙烯酸酯、乙二醇二丙烯酸酯、二乙二醇单丙烯酸酯、三乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、季戊四醇二丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、苯乙烯、二乙烯苯等。这些单体可以单独使用，也可以混合使用，最好与交联剂配合使用。

实际上，对于水中不易溶解的稀土纳米粒子，这些稀土纳米粒子在水中保存时荧光不会下降。利用吸附法进行包被时，可以直接将稀土纳米粒子分散在的氨基葡聚糖(Aminodextron)、聚甲基丙烯酸或磷脂等的水溶液中，通过物理吸附使颗粒的表面能被包被上一层聚合物膜。这层膜具有非常好的亲水性，可以与生物分子通过物理吸附或化学反应连接。

按本发明方法制得的被聚合物包被的稀土纳米粒子，可以用作标记生物材料的稀土纳米荧光探针。可用来标记的生物材料包括DNA、多肽、蛋白质(酶、抗体、抗原等)、细胞等。用本发明方法制备的稀土纳米粒子作荧光探针，合成方法简便，是理想的生物材料的标记物，可广泛用于生命科学研究中的多种生物材料的标记、临床诊断中的免疫分析、DNA检测、以及生物芯片中的荧光探针。

本发明稀土纳米粒子与生物材料连接的方法是，将经包覆及功能化的稀土纳米粒子分散在磷酸盐溶液中(w/w，5％)，加入待标记的生物材料，如DNA，多肽，蛋白质、细胞和组织等。当环氧基与生物分子连接时反应液应控制在微碱性；羧基与生物分子连接时加入活化试剂1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺；醛基与生物分子连接时，反应后生成的西夫碱不够稳定，需加入硼***还原后反应生成稳定的仲胺；氨基与生物分子连接时，先加入戊二醛反应生成醛基，再与生物分子连接。所有反应缓慢搅拌数小时，离心，用磷酸盐缓冲溶液洗涤数次，得到荧光稀土纳米纳米粒子标记的生物分子。这些标记的生物分子，通过荧光分光光度计测定光的强度或用激光共聚焦扫描显微镜得到荧光图像，可用于生命科学研究、临床疾病检测、DNA芯片、蛋白质芯片等研究领域。

在本发明中，稀土纳米粒子用聚合物包覆及功能化修饰后，可较好地分散于水溶液中，不易沉淀与相互絮凝，包覆及修饰过程不会导致荧光强度的显著下降。这样处理后的稀土纳米粒子能与生物材料进行较好地连接，同时生物材料的生物活性也不会显著下降，从而可用作生物材料如蛋白质、多肽、DNA、细胞及组织等的荧光探针。

下面结合附图，用实施例来进一步说明本发明。但应当理解，这些实施例不是对本发明范围的限制，它们只是用来进行说明的。

图1是稀土纳米粒子CaS:Eu³⁺的电镜照片；

图2是稀土纳米粒子CaS:Eu³⁺的荧光光谱图；

图3是包被前后稀土纳米粒子SrAlO₄:Eu²⁺的荧光光谱图：

(A)包被前；(B)包被后；

图4是Scanner Array 4000扫描的荧光图像；

图5是稀土纳米粒子的荧光强度与待测抗原的浓度关系。

实施例1纳米粒子CaS:Eu³⁺ 的制备

制备粒度为15纳米左右的CaS:Eu³⁺粒子，制备方法如下：将1.3875gCaCl₂(0.0125mol)溶解于250ml无水乙醇中，再加入Eu(NO)₃(0.111g)和0.027g组氨酸，超声30min，得到储备液a。称取0.24g Na₂S溶解于250ml的无水乙醇中，超声30min，得到储备液b。将储备液a 50ml放入三口烧瓶中，通氮气将烧瓶口密闭后用磁力搅拌器快速搅拌溶液，用注射器将储备液b快速注入三口烧瓶中，3小时后停止反应。离心后，去掉上清液体，用去离子水洗涤固体3次，再用无水乙醇洗涤3次。将固体真空下进行干燥后，放在675℃下将样品灼烧3h，并通氮气保护。待样品冷却到室温后，就得到粒径在15纳米左右的稀土粒子，纳米粒子的扫描电镜图见附图1，荧光光谱图见图2。

实施例2纳米粒子SrAlO₄ :Eu²⁺ 的制备

制备纳米级的稀土微粒SrAlO₄:Eu²⁺，参加反应化合物的配比是，SrCO₃∶Al₂O₃∶Eu₂O₃＝1∶1∶0.005，加入适量的1mol/l硝酸使固体粉末恰好溶解，然后与1mol/l的尿素溶液混合后，直接移入已预先加热到500℃的马弗炉中。待样品燃烧后，可获得白色泡沫状长余辉纳米材料，粒径大小在10-15纳米。

实施例3纳米粒子CaS:Eu³⁺ +Sr²⁺ 的制备

制备粒度为10纳米左右的CaS:Eu³⁺+Sr²⁺粒子，制备方法如下：将0.712g CaCl₂和0.625g SrCl₂溶解于250ml无水乙醇中，再加入Eu(NO)₃(0.111g)和2.5ml巯基乙酸，超声30min，得到储备液a。称取0.25g Na₂S溶解于250ml的无水乙醇中，超声30min，得到储备液b。将储备液a 50ml放入三口烧瓶中，通氮气将烧瓶口密闭后用磁力搅拌器快速搅拌溶液，用注射器将储备液b快速注入三口烧瓶中，3小时后停止反应。离心后，去掉上清液体，用去离子水洗涤固体3次，再用无水乙醇洗涤3次。将固体真空下进行干燥后，放在675℃下将样品灼烧3h，并通氮气和氢气的混合气体(95/5，V/V)保护。待样品冷却到室温后，就得到粒径在10nm左右的稀土粒子。

实施例4纳米粒子ZnS:Eu³⁺ 的制备

稀土纳米粒子ZnS:Eu³⁺0.25M的制备方法如下：将4.3ml的1mol/l(在0.01mol/l的溶液中)ZnSO₄和1.76ml的0.05mol/l的Eu(NO₃)₃快速注入到35.6ml的0.25mol/l组氨酸的Tris(1mol/l)溶液中，同时在溶液中通氮气，并且快速搅拌溶液20min后，加入4.4ml的1mol/l的Na₂S溶液，溶液在室温下反应60min。将0℃的无水乙醇逐滴滴加到反应液中，直到溶液中出现白色的ZnS:Eu³⁺时停止滴加乙醇；在离心机上将反应溶液离心，去掉上清液，将白色沉淀物重新溶解到1mol/l Tris溶液中，重复以上操作两次，然后将得到的固体在真空中室温过夜干燥。得到的纳米粒子直径在10nm左右。

实施例5稀土纳米粒子SrAl₂O₄ :Eu²⁺ 的包被方法一

用硅酸乙酯试剂将纳米粒子SrAl₂O₄:Eu²⁺表面包覆一层SiO₂薄膜，然后应用多种硅烷化试剂使其连接上亲水性官能团。具体方法如下：将70mg SrAl₂O₄:Eu²⁺加到50ml异丙醇中，再加入1.6ml 50％的NH₃·H₂O和1.5ml水，超声20min，使纳米粒子均匀地分散到溶液中。然后将反应液放入40℃的水浴中，并加入160μl Si(OC₂H₅)₄，反应1h后，再补加100μl 3-氨基丙基三乙基硅烷，继续反应40min。然后将纳米粒子离心，用等体积的无水乙醇洗涤三遍后，用水洗涤两遍，再用无水乙醇洗涤两遍，然后在80℃真空干燥6h，包覆完毕。

实施例6稀土纳米粒子SrAl₂O₄ :Eu²⁺ 的包被方法二

称取100mg稀土纳米粒子SrAl₂O₄:Eu²⁺加入到20ml甲苯中并加入0.1g十二烷基苯磺酸钠，用玛瑙研钵研磨后将颗粒SrAl₂O₄:Eu²⁺充分分散到甲苯中，加入400μl甲基丙烯酸和150μl三羟甲基三丙烷三丙烯酸酯和5mg过氧化苯甲酰，80℃下反应10-12小时后，离心后去除甲苯，分别用20ml无水乙醇和去离子水洗涤后，将稀土粒子分散到2ml磷酸缓冲溶液中待用。这样，稀土粒子表面包有一层聚合物膜，可以防止稀土粒子溶解于水而失去荧光。同时，表面含有羧基，可以与生物材料连接。包被前后的荧光光谱图见附图4，包被前后的荧光变化不大。

实施例7抗体免疫球蛋白IgG与表面包覆聚合物的稀土粒子偶联

取500μl实施例6中溶液加入500μl 2.4mg/ml的免疫球蛋白IgG和10mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺，室温下缓慢搅拌反应24小时。然后，4000r/min下离心5分钟，去掉上层清液，再用磷酸缓冲溶液(PBS)洗涤二次后，加入1000ml PBS待用。

实施例8制备可以固定抗体的基体以及在免疫分析方面的应用

在抗体固定于玻璃板以前，需要将玻璃表面处理。首先清洗玻璃片，将玻璃片(25mm×75mm)在洗液中浸泡2小时，用大量去离子水冲洗后N₂吹干。接着将它们再依次放入正己烷、丙酮和无水乙醇中各超声15分钟后，放在80℃的烘箱中烘5分钟后立即使用。然后玻璃表面进行硅烷化反应固定上氨基基团。将3-氨丙基三甲氧基硅烷溶于二甲苯并加入催化剂量的二异丙基乙基胺。微机械手将硅烷化试剂在玻璃片点成阵列形状，每个点大约皮升量级，大小为300μm，点与点之间的距离为800μm。最后将玻璃片80℃放置过夜，用乙酸乙酯冲洗后并晾干立即使用。最后将玻璃片固定的NH₂通过希夫碱反应变成醛基。将氨基化的玻璃浸泡到5％的戊二醛PBS中5小时，用去离子水冲洗后在氮气流下吹干。这样玻璃片表面带有醛基，可以固定抗体。

免疫分析步骤：

免抗反应采用传统的抗体-夹心式反应。免疫分析实验步骤如下所示，前五步操作步骤与酶联免疫分析步骤基本相似。

●将100μl的1.2mg/ml兔抗人免疫球蛋白IgG碳酸钠缓冲液(PH9.6A₂₈₀/1.44＝1mg IgG/ml)，均匀涂在玻璃片上，在37℃下反应2小时，注意在反应过程中不要使玻璃片上的液体变干。

●用磷酸盐洗涤液(PBS-T，PBS中含0.05％Tween20)洗涤玻璃片，每次洗涤5分钟，洗涤三次。

●将玻璃片浸到1％牛血清白蛋白的硼酸溶液中，37℃下反应1小时，此步骤对消除抗原在玻璃片上的非特异性吸附是很有必要的，最后将玻璃片用PBS-T洗涤三次后在氮气下吹干待用。

●人免疫球蛋白IgG，羊免疫球蛋白IgG为待测抗原，将100μl的待测抗原溶液涂在玻璃片上，37℃下反应1小时。

●用PBS-T洗涤三次，每次5分钟，用N₂吹干玻璃片吹干待用。

●将荧光标记的免抗人免疫球蛋白IgG 100μl涂在玻璃片上，37℃下反应2小时后，用PBS-T洗涤二次，再用去离子水洗涤一次，用氮气来吹干玻璃片，然后用Scanner Array 4000荧光成像。用激光器为激发光源，Scanner Array 4000扫描玻璃片得到的稀土微粒的荧光图像，见附图4，其荧光强度是经Array 4000软件处理过的，是一个相对强度。

随着抗原浓度的增加，荧光强度也随着增加，见附图5，说明抗体标记上稀土颗后，其特异性识别抗原的能力没有消失。

Claims (12)

1、一种用于标记生物材料的稀土纳米粒子，该粒子的粒径在3nm-400nm之间，它能与所说的生物材料相连接，而且在激发时能够发出荧光，其特征在于，所说粒子的成分是选自下列各复合物质中的一种或数种：SrAl₂O₄：Eu²⁺；SrAl₂O₄：Eu²⁺+Dy³⁺；Y₂O₃：Eu³⁺：CaS：Eu³⁺；CaS：Eu³⁺+X，其中X＝Tm³⁺、Y³⁺或Al³⁺；ZnS：Y，其中Y＝Eu²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Ag⁺和/或Au⁺；Gd₂O₃：Eu³⁺；La₂O₃：Eu³⁺；或Gd₃(PO₄)₂：Eu³⁺。

2、如权利要求1所说的稀土纳米粒子，其特征在于，所说的稀土粒子的表面被包被上一层聚合物膜或无机物膜。

3、如权利要求2所说的稀土纳米粒子，其特征在于，所说的包被后的稀土纳米粒子的粒径在5-100nm之间。

4、如权利要求2所说的稀土纳米粒子，其特征在于，所说的稀土粒子的表面被包被上一层聚合物膜，且该聚合物膜的表面带有如下的功能基团：氨基、羧基、羟基、醛基和/或环氧基。

5、如权利要求4所说的稀土纳米粒子，其特征在于，所说的稀土纳米粒子表面上包被的聚合物膜或无机物膜中含有一种或多种包覆单体以及一种或多种功能化试剂的聚合物，其中所说的包覆单体包括丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸-2-羟乙酯、丙烯酸-2-羟乙酯、乙二醇单环氧丙烯酸酯、乙二醇单丙烯酸酯、三乙二醇二丙烯酸酯、乙二醇二丙烯酸酯和苯乙烯；所说的功能化试剂包括丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯醛、丙烯酰胺、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-醛基丙基三乙氧基硅烷、3-巯基丙基三乙氧基硅烷、甲基丙烯酸-2-羟乙酯、丙烯酸-2-羟乙酯、甲基丙烯酸-2-胺乙酯、乙二醇双还氧单丙烯酸酯和3-环氧基丙基三乙基硅烷。

6、如权利要求5所说的稀土纳米粒子，其特征在于，在所说的稀土粒子的表面上包被的聚合物膜或无机物膜中还含有磷酸双-(二羟甲基丙烷二丙烯酸酯)、磷酸双-(甲基丙烯酸2-羟乙酯)和/或磷酸双-(季戊四醇三丙烯酸酯)。

7、一种制备用于标记生物材料的稀土纳米粒子的方法，它包括如下步骤：

(1)制备粒径在3-400nm之间的稀土纳米粒子；

(2)将步骤(1)制备的稀土纳米粒子加入到有机溶剂甲苯、二甲苯或四氢呋喃中；

(3)在步骤(2)所得的混合物中加入包覆单体、功能化试剂、聚合引发剂和偶联剂，进行悬浮聚合，使得稀土表面包被一层聚合物膜。

8、如权利要求7所说的方法，其特征在于，在步骤(2)中还加入表面活性剂，使得稀土纳米粒子充分分散在有机溶剂中。

9、如权利要求7或8所说的方法，其特征在于，在步骤(3)的聚合反应中加入磷酸双-(三羟甲基丙烷二丙烯酸酯)、磷酸双-(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或磷酸双-(季戊四醇三丙烯酸酯)作偶联剂。

10、一种制备用于标记生物材料的稀土纳米粒子的方法，它包括如下步骤：

(1)制备粒径在3-400nm之间的稀土纳米粒子；

(2)将步骤(1)制得的稀土纳米粒子加入到硅酸烷基酯中，并使硅酸烷基酯发生水解，在稀土纳米粒子的表面上形成二氧化硅膜；

(3)在步骤(2)所得的物质中加入有机硅烷，使得所说二氧化硅膜功能化。

11、一种制备用于标记生物材料的稀土纳米粒子的方法，它包括如下步骤：

(1)制备粒径在3-400nm之间的稀土纳米粒子；

(2)将步骤(1)制得的稀土纳米粒子加入到氨基葡聚糖、聚甲基丙烯酸或磷脂溶液中，使其吸附在稀土纳米粒子表面上并形成包被层。

12、如权利要求1～6之一所说的稀土纳米粒子在标记生物材料方面的用途。

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