CN1229440A - 含高浓度维生素b12活性的组合物的生产和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供制备含天然维生素B12的组合物的方法,其中所述方法包括以下步骤:a)获取含天然维生素B12的微生物细胞,b)使微生物细胞裂开,导致含维生素B12的细胞的至少部分可溶成分释放到包含这些细胞的液体中,c)分离裂开的细胞和含维生素B12的液体,d)制备维生素B12和至少一部***开细胞的混合物,其中混合物含有干物质浓度超过0.1%(重量/重量)的维生素B12。

Description

含高浓度维生素B12活性的组合物的生产和用途
发明领域
本发明涉及含天然维生素B12的组合物的生产。
发明背景
维生素B12是对人类和动物很重要的维生素。它可用来治疗恶性贫血和周围神经炎以及用作食品添加剂。维生素B12也是重要的增强生长的动物饲养添加剂。
术语维生素B12是用来描述类咕啉钴家族的化合物，尤其钴胺素类的化合物。最常用的这类化合物是氰钴胺素，因此术语维生素B12有时用来提及氰钴胺素。在此说明书中，术语维生素B12应属于其广义的意义，包括所有钴胺素类的类咕啉钴，特别包括分别以氰基、羟基、甲基或5′-脱氧腺苷基为特征的氰钴胺素，羟钴胺素，甲基钴胺素和5′-脱氧腺苷钴胺素。已知甲素钴胺素和5′-脱氧腺苷钴胺素在分离状态时见光不稳定并且在水溶液中容易转变为羟钴胺素。因此，几乎所有商品维生素B12制品所含的稳定氰钴胺素都不是自然界发现的维生素B12的化学形态。在本说明书中，术语天然维生素B12定义为包括自然界天然存在的维生素B12的所有化学形式，因而不包括氰钴胺素。
在工业上，几乎只使用脱氮假单胞菌和丙酸杆菌属种类通过微生物发酵生产维生素B12，然后通过化学方法将天然维生素B12转化为氰钴胺素形式，所用化学方法包括氰化作用和随后使用有机溶剂的抽提和纯化步骤(如Spalla等，1989，“维生素B12的微生物生产”，于：维生素、色素和生长因子的生物技术，E.J.Vandamme编辑，Elsevier，London，New York，第257-284页中所论述的)。化学转化步骤和所有随后的步骤使该生产方法昂贵，对操作者不安全并对环境有害。
经消化后，动物和人将氰钴胺素转化成维生素B12的一种天然形式如甲素钴胺素或5′-脱氧腺苷钴胺素，有几种生化转变需要这些天然形式的维生素B12作为辅酶(Ellenbogen，L.，于：维生素手册，营养、生化和临床方面，L.J.Machlin编辑，Marcel Dekker Inc.，New York和Basel)。此外，动物的有效生长要求动物饲料中有足量的维生素B12活性。维生素B12制品常常单独作为饲料添加剂或作为含其它维生素和其它饲料添加剂的预混合物的一部分出售。
因此应当清楚，直接供应5′-脱氧腺苷钴胺素或甲基钴胺素而不是氰钴胺素将是有益的。鉴于这两种化合物的不稳定性，它们不能以分离的形式生产，而是与合成它们的生物的生物质一起制成干燥制品。这样的制品非常适于用作动物饲料添加剂。对于生产甲基钴胺素和5′-脱氧腺苷钴胺素，最优选的是丙酸杆菌属的细菌，因为不像脱氮假单胞菌，丙酸杆菌属的细菌已从美国食品和药品管理局获得了GRAS(通常识别为安全的)身份，并且已知不产生内毒素。丙酸酐菌属种类是耐氧，不移动，无芽孢的***，其它特征在于由碳酸，乳酸和多元醇合成大量丙酸。丙酸酐菌属属于***的高“GC”亚门(T.D.Brook，M.T.Madigan，J.M.Martinko和J.Parker，于：微生物学，第7版，Prentice-Hall International Inc.，1994)。
专利申请RU 2001953(抗生素酶研究技术所)提及谢氏丙酸杆菌的喷雾干燥方法，这种方法已用于生产含生物质的5′-脱氧腺基钴胺素。来自产甲烷细菌的生物质的甲基钴胺类可从Gedeon Richter公司商业购买，然而，这些制品中的维生素B12含量被发酵期间合成维生素B12的水平所限制，结果是，这些制品的维生素B12含量不超过0.1％(重量/重量)。组合物中维生素B12的浓度常规上以维生素B12的干重占组合物干重的百分率定量。
氰钴胺素的浓缩产品(即＞0.1％重量/重量)可商业购买。然而，饲料厂和预混合物制造厂不能使用这种产品，因为由于它的静电特性，在饲料厂和预混合物制造厂的加工过程中，当配制成浓度＞0.1％(重量/重量)的产品时，氰钴胺素会与其载体分离。分离是筛分，风筛或使组合物保持较长时间时的特殊问题。
本发明公开了一种方法，通过这种方法可以生产含相对高浓度(＞0.1％重量/重量)天然维生素B12的组合物。这些新的浓缩产品可用于例如动物饲料、人类食品中或用作化妆品的成分。这些新的浓缩产品的使用和运输更方便，从而可以减少费用。因为它们可以在加工过程中降低维生素B12与载体的分离，所以它们可以被饲料厂和预混合物制造厂有效地利用。这种方法容易在工业规模上操作并对环境相对有益，因为不需要使用有机溶剂或氰化作用。
发明描述
本发明提供制备含天然维生素B12的组合物的方法，该组合物含有干物质浓度超过0.1％(重量/重量)的维生素B12。此方法包括以下步骤：a)获取含天然维生素B12的微生物细胞，b)使微生物细胞裂开，导致含维生素B12的细胞的至少部分可溶成分释放到包含这些细胞的液体中，c)分离裂开的细胞和含维生素B12的液体，并且可选择地d)制备维生素B12和至少一部***开细胞的混合物。
优选地，使用已知合成维生素B12的微生物，以工业发酵方法获得含维生素B12的微生物细胞。这些微生物包括属于醋酸杆菌属，气杆菌属，土壤杆菌属，产碱菌属，节杆菌属，固氮菌属，芽孢杆菌属，梭菌属，棒杆菌属，埃希氏菌属，真杆菌属，黄杆菌属，甲烷杆菌属，甲烷八叠球菌属，分枝杆菌属，丙酸杆菌属，变形菌属，假单胞菌属，根瘤菌属，红假单胞菌属，沙门氏菌属，沙雷氏菌属，链球菌属，链霉菌属和黄单胞菌属的细菌。优选地，在本发明方法中使用的细菌对于人和/或动物消费是安全的并且不产生内或外毒素。更优选地，该细菌已从美国食品和药品管理局获得了GRAS(通常识别为安全的)身份。本发明方法中所用的最优选细菌是丙酸杆菌属细菌，优选的丙酸杆菌属种类是费氏丙酸杆菌或谢氏丙酸杆菌。
本领域技术人员应当非常了解，与许多其它微生物代谢物的生产一样，使用从设计为提高任一特定菌株所需特征的程序得到的菌株进行维生素B12的工业生产。这些程序基本上包括用诱变剂处理生产菌株并筛选表现提高了产量或其它优点的突变体。已描述了几种用于合理筛选过量生产维生素B12的突变微生物的技术〔Spalla，C.，Grein，A.，Garofo，L和Ferni，G.，维生素B12的微生物生产，于：维生素、色素和生长因子的生物技术，第257-284页(E.J.Vandamme编辑)Elsevier，London/NY，1989〕。这样的突变菌株在本发明优选方法中使用能够进一步增加所得组合物中维生素B12的浓度。
在本发明中，术语“天然维生素B12”定义为包括所有自然界天然存在的维生素B12的化学形式，不包括维生素B12的氰钴胺形式。在本发明优选的方法和组合物中，天然维生素B12包括5′-脱氧腺基钴胺素和/或甲基钴胺素。
在本发明方法中，处理含维生素B12的微生物细胞以引起细胞膜裂解或其它破裂。裂解形容微生物细胞的裂开，这样使含维生素B12的细胞的(至少部分)可溶成分释放到包含这些细胞的液体中。优选的使细胞裂开的处理是热处理，包括巴氏灭菌法或在高压灭菌器中加热；用溶细菌的酶如溶菌酶处理；机械破碎细胞，包括研磨或使用剪切力；用引起细胞裂解的化学品如去污剂或有机溶剂处理；以及这些处理方法的结合使用。裂解或其它膜破裂产生溶菌产物，溶菌产物可以分成固相和液相。
在本发明优选方法中，将至少部分固相(裂开细胞)加入含天然维生素B12的液相中，以使得到的组合物是含生物质的混合物，即优选地裂开的微生物细胞和天然维生素B12。这些组合物的维生素B12含量或浓度表达为基于组合物的干物质含量的维生素B12的重量百分比。
本发明的方法生产含干物质浓度大于0.1％(重量/重量)的维生素B12的组合物。在优选方法中，组合物含有浓度大于0.2％(重量/重量)的天然维生素B12，较优选地大于0.4％(重量/重量)，更优选地大于0.6％(重量/重量)；还更优选地大于0.8％(重量/重量)，并且最优选地大于1.0％(重量/重量)。优选地，本发明组合物的维生素B12浓度不超过10％(重量/重量)，更优选地，维生素B12的浓度不超过5％(重量/重量)。
在本发明的方法中，将含由细胞裂开产生的细胞碎片的溶菌产物的固相与含释放的维生素B12的液体分开。有一些不同的固-液分离技术，包括离心和过滤技术，可供技术人员使用以进行分离。优选的分离固体细胞碎片和含维生素B12的液体的方法是超滤。
在本发明优选方法中，在分离细胞和含维生素B12的液体后，冲洗裂开的微生物细胞并且将洗出液与维生素B12合并。优选地通过用去离子水渗滤实施冲洗，优选去离子水用于冲洗裂开的细胞。然后将含维生素B12的渗滤液与含维生素B12的液相合并。
在本发明优选方法中，进一步将含天然维生素B12的液相用于干燥处理。可以使用任何适当的干燥方法，例如喷雾干燥，流体床干燥，冷冻干燥，或真空干燥。
在本发明优选方法中，在进行裂解前冲洗含维生素B12的微生物细胞，以通过除去培养基成份来进一步增加干物质中维生素B12的浓度。优选地，优选使用去离子水通过渗滤进行所述冲洗。
另一方面，本发明提供在本发明的方法中得到的含维生素B12的组合物。优选地，在这些组合物中的大部分维生素B12活性是以天然维生素B12的形式。本发明的组合物的特征在于维生素B12以大于0.1％(重量/重量)的浓度(基于干物质)存在。在本发明优选的组合物中，维生素B12的浓度大于0.2％(重量/重量)，优选地大于0.4％(重量/重量)，较优选地大于0.6％(重量/重量)，更优选地大于0.8％(重量/重量)，最优选地大于1.0％(重量/重量)。然而，优选地，本发明的组合物的维生素B12浓度不超过10％(重量/重量)，更优选地维生素B12的浓度不超过5％(重量/重量)。本发明的组合物包含维生素B12和载体，该载体优选地包含生物质，例如整个细胞和/或细胞碎片。包含在这些组合物中的生物质优选地来自能够合成维生素B12的微生物，例如上述的细菌，其中丙酸杆菌属种类是最优选的。
本发明的组合物优选地是干燥的组合物，其中干燥定义为按重量比水含量小于15％，优选地小于10％，更优选地小于5％。
在本发明优选的干燥组合物中，维生素B12活性基本上均匀地分布于含载体和维生素B12的粉末或颗粒状粉末中。因此，有利的是这些组合物中的维生素B12不会较大程度地与组合物的其它成分分离，特别是在组合物加工过程中受到重力，筛分，风筛或静电力时，甚至在以大于0.1％(重量/重量)的浓度使用时。应当理解，此处加工包括将本发明的组合物加工成饲料和饲料预混合物。
在本发明的另一方面，本发明的组合物可用作或用于动物生长促进饲料添加剂产品。为此目的，将含维生素B12的组合物直接或以预混合物形式添加到其它饲料成分中，其中预混合物也包括其它维生素，矿物质和/或生物活性成分。如具体实例中所示，喂给动物含本发明组合物的食物可以促进其生长。
在本发明的另一方面，含维生素B12的组合物可用作或用于人类食品添加剂产品和/或掺入化妆品制品，如香波或浴液。
实施例 实验 维生素B12的检测
如美国药典，国家配方，1995，第1719-1721页，美国药典条约，Inc.，Rockville MD中详细描述的，基于乳乳杆菌ATCC 7830的生长反应，用比浊计生物分析法检测维生素B12活性。血浆中B12的浓度
使用商业购买的放射性分析试剂盒(Bio-Rad Laboratories Ltd，Hemel Hempstead，UK)测定血浆B12。在含二硫苏糖醇和氰化物的溶液中将血浆样品和维生素B12(57Co)混合。将混合物煮沸30分钟使内源结合蛋白失活并将各种形式的维生素B12转变为氰钴胺素。使混合物冷却，然后与固相的(与多聚体珠粒结合的)亲和纯化的猪内因子混合。这可以将反应混合物pH值调节和缓冲至9.35。然后将反应混合物在室温下温育60分钟。在温育期间，内源和标记的维生素基于它们相对浓度竞争有限的结合位点。然后将反应混合物于1500g离心10分钟。与固相结合蛋白结合的标记和未标记维生素以沉淀的形式集中在试管底部，未结合的维生素留在上清液中。吸出上清液并测定与沉淀相关的放射性活性。使用人血清白蛋白中的维生素B12标准品制备标准曲线。从标准曲线上可确定血浆样品中维生素B12的浓度。使用AssayZap通用分析计算机(2.32版本，Biosoft，Cambridge，UK)划出标准曲线并确定未知浓度。
血浆样品需稀释10-50倍，使之处于检测的最灵敏范围内。对照实施例1
根据本领域技术人员已知的方法，用费氏丙酸杆菌进行发酵(见例如Spalla等，1989，“维生素B12的微生物生产”，于：维生素、色素和生长因子的生物技术，E.J.Vandamme编辑，Elsevier，London，NewYork，第257-284页)。适当的费氏丙酸杆菌菌株来自美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC 6207。在发酵结束时得到含有10mg/l5’-脱氧腺苷钴胺素效价和具7.5％干物质含量的培养液。喷雾干燥该培养液得到具0.01％维生素B12浓度的产品。
为了获得更高的维生素B12浓度，进行培养液的固液分离。维生素B12在费氏丙酸杆菌细胞内，因此去除(细胞外)培养基成份和随后生物质的喷雾干燥将得到具较高维生素B12浓度的喷雾干燥产品。
在实验室规模上，以5000～6000xg的最大g力进行离心步骤。这种g力与工业规模上所用离心机的离心力相同。将1000ml等分培养液在Beckmann JM/6E离心机中于5000rpm离心10分钟。然而，在此条件下没有得到生物质和培养液的分离。
因为在工业规模上，由于经济因素，较高离心力更不受欢迎，所以我们测试使用超滤分离培养液中的液体和固体是否可行。
通过30kD AMICON旋转缠绕元件(0.09m2)使用1巴的上样压对初始浓度为每升4.5mg维生素B12(干物质中的维生素B12为0.02％)的2000ml培养液进行超滤。在这样的条件下可以使维生素B12样品浓缩5倍。平均渗透流速是30l/m2h。浓缩液中维生素B12的浓度是20mg/l，而在透过液中可检测到小于0.2mg/l的维生素B12。与超滤前的0.02％相比，以干物质含量表达的浓缩液中维生素B12的浓度是0.05％。
为了进一步增加维生素B12在干物质中的效价，接下去我们对生物质的渗滤进行测试。
用去离子水对上述实验中得到的超滤浓缩液冲洗6次，得到20mg/l浓度的维生素B12效价。在渗滤液中没有检测到维生素B12活性。随后浓缩液的喷雾干燥得到具0.06％维生素B12浓度的喷雾干燥产品。
我们从以上实验推断，以来自具5-10mg/l维生素B12效价的培养液的干物质为基础，不可能得到维生素B12浓度大于0.06％的产品。实施例2
为了防止干燥产品中存在存活的生产有机体，即存治细胞，对如实施例1所述获得的培养液于65℃进行30分钟巴氏灭菌步骤。如上所述对经处理的培养液进行超滤。
用0.2-0.4％的维生素B12浓度(按干物质)可观察到粉红色透过液。认为巴氏灭菌法引起费氏丙酸杆菌细胞(至少部分)的裂解，并使细胞内的维生素B12释放至培养基中。通过在喷雾干燥前混合透过液和经巴氏灭菌的培养液，可以获得含浓度范围为0.06％至0.3％(基于干物质)的维生素B12的干燥产品。
更详细地，将350ml经热处理的培养液在上面实施例1所述条件下超滤。浓缩液用2500ml去离子水渗滤。将澄清的粉红色透过液和渗滤液合并并与750ml经巴氏灭菌的超滤浓缩液混合。在实验室Buchi喷雾干燥器中喷雾干燥混合物，其中入口温度设在180℃，出口温度设在104℃。这样得到的喷雾干燥产品的维生素B12浓度是0.13％。实施例3
在实验工厂费氏丙酸杆菌发酵中获得1200ml含8mg/l维生素B12的培养液，并且使用20KD膜和38l/m2h的初始水流速度在DDS超滤元件M37中进行超滤。超滤期间温度保持在室温。循环流速是大约15m3/h。上样压设为约7帕。培养液浓缩了11.5倍(平均流速23l/m2/h)。在室温下用500升去离子水冲洗浓缩液直至达到约3mS/cm的传导性。
在90℃处理所得浓缩液6小时。将部分经热处理的浓缩液渗滤，得到约300升含维生素B12的透过液。残留物在4℃保存。
在真空下于40℃在玻璃蒸发器中以实验规模浓缩透过液，得到约6升浓缩液。
通过将适量的残留物和浓缩的透过液混合构成混合物，混合物在NIRO喷雾干燥器中喷雾干燥。入口空气温度设在160℃，出口温度调整在约90-95℃。在5小时操作时间内，大约45升混合物被喷雾干燥(约9kg/小时)。这产生了1307g含1100mg/kg(即0.11％)维生素B12活性的喷雾干燥物质。实验例4
在与实施例3中所述实验相似的实验中，使用改良的费氏丙酸杆菌菌株CBS 929.97进行发酵。得到的发酵培养液中的维生素B12浓度是40mg/l。超滤和渗滤基本上如实施例3所述的进行。
使用超滤，将100升40mg/l的培养液浓缩至约40升。使用渗滤，用200升去离子水冲洗浓缩液。所得到的经冲洗的浓缩液含有96.5mg/kg维生素B12活性和6.72％干物质(经冲洗的浓缩液的喷雾干燥将产生0.14％的维生素B12活性)。
随后将已冲洗的浓缩液在90℃裂解5分钟，接着通过超滤分离细胞碎片和液体。透过液的有效维生素B12浓度达到干物质的0.87％(根据52.1mg/kg维生素B12活性和0.6％干物质含量计算)。在真空于65℃预浓缩透过液后，将不同数量的透过液和浓缩液混合并干燥。所得到的干燥产物的维生素B12效价在下面给出：
浓缩液∶透过液          维生素B12活性(按干物质)
1∶1                             0.5％
3∶7                             0.65％
2∶8                             0.72％
8∶2                             0.29％
1997年7月10日已将费氏丙酸杆菌CBS 929.97保藏在真菌菌种保藏中心，Baarn，The Netherlands。实施例5天然维生素B12在动物饲料中的应用
用小鸡进行试验，比较天然维生素B12和氰钴胺素的效力。将1日龄雄性小鸡随机分到笼中。每个笼中放8只动物。将笼子放在人工加热、通风和照明的鸡舍中。在1日和14日龄时接种抗New Castele病的疫苗。动物从第1天开始不限量地接受实验食物，前10天以碎屑形式，以后以块状形式。水可以自由得到。实验持续了28天。在第28天时，将动物称重，确定饲料消费量并抽取血样。血样从每笼随机挑选的4只小鸡中抽取。血样收集在已加肝素的试管中。将试管离心并将血浆冷冻(-18℃)直到进行维生素B12分析。如上所述在实验条件下进行分析(血浆B12的浓度)。
在此实验中包括3个处理：I.没有加维生素B12的基本食物II.添加了氰钴胺素(30ppb活性物质)的基本食物III.添加了天然维生素B12(300ppb活性物质)的基本食物。
每个处理重复5次。
表1列出了基本食物的成分，表2为结果。表1  基本食物的成分(％)
玉米 55
木薯淀粉 1
豆粉 30
大豆，经热处理 5
羽粉 1
豆油 2
动物脂肪 3
维生素*，矿物质，氨基酸 3
所计算的含量：
代谢能量 13.3MJ/kg
粗蛋白 22.0％
赖氨酸(总量) 1.27％
蛋氨酸+半胱氨酸(总量) 0.95％
*：无维生素B12表2：氰钴胺和天然维生素B12对1至28日龄动物的平均生长、饲料摄入和饲料转化率及第28日血浆维生素B12含量的影响。
生长(g) 饲料摄入(g) 饲料转化率 血浆维生素B12(mg/l)
基本食物   1139     1738     1.53     14
+氰钴胺素   1264     1782     1.41     32
+天然维生素B12   1261     1771     1.40     41
实施例6维生素B12活性与载体的分离
活性化合物与载体的分离可能由颗粒形状，密度和体积密度，流动性，粘附和静电特征，含水量和吸湿性引起。在预混合物和复合物饲料的生产期间和随后的运输和贮存期间可能发生这种分离过程。
这种分离在预混合物中尤为关键，其中预混合物包含诸如维生素和微量元素的微量成分和诸如矿物质和载体的大量成分。
将现有商品氰钴胺素制品(从Rhone Poulenc获得，商标名为MicrovietB12)的反混合特性与如实施例4所述制备的天然维生素B12制品进行比较。
石灰岩在现有商品氰钴胺素制品中用作载体。
如图1所示，试验物质通过振动槽从贮存容器中流出形成堆。
从中心抽取3个样品并混合。用来自堆底的样品重复此程序。如上所述分析样品的维生素B12活性并与最初的均匀混合物比较。如下计算样品与最初均匀混合物的偏差。
基底偏差(％)＝{(基底浓度-最初混合物浓度)/最初混合物浓度}×100
中心偏差(％)＝{(中心浓度-最初混合物浓度)/最初混合物浓度}×100
表3中列出了氰钴胺素和本发明的天然维生素B12组合物的堆底和堆中心偏差的比较。表3
试验物质 分离试验(％)堆底 分离试验(％)堆中心
氰钴胺素0.1％     ＜+10     -10
氰钴胺素1％     +56     -78
天然维生素B12(0.9％)     +8     -12

Claims (22)

1.一种制备天然维生素B12的方法，该方法包括：
(a)在一定条件下培养微生物细胞使之在细胞内合成天然维生素B12；并且
(b)裂解或破裂已合成天然维生素B12的微生物细胞的外膜以便释放维生素B12。
2.根据权利要求1所述的方法，其中裂解产生溶菌产物，并且分离溶菌产物的固相和液相，液相包含天然维生素B12。
3.根据权利要求2所述的方法，进一步包括冲洗溶菌产物的固相并将洗出液和溶菌产物液相混合。
4.根据权利要求3所述的方法，其中溶菌产物固相的冲洗通过渗滤实施。
5.根据权利要求2至4中任何一项所述的方法，进一步包括将至少部分溶菌产物的固相添加到含天然维生素B12的液相中。
6.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，进一步包括在裂解前冲洗微生物细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其中裂解前微生物细胞的冲洗通过渗滤实施。
8.根据权利要求2至7中任何一项所述的方法，进一步包括干燥含天然维生素B12的液相。
9.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其中微生物细胞是来自1个或多个以下菌属的细胞：醋酸杆菌属，气杆菌属，土壤杆菌属，产碱菌属，节杆菌属，固氮菌属，芽孢杆菌属，梭菌属，棒杆菌属，埃希氏菌属，真杆菌属，黄杆菌属，甲烷杆菌属，甲烷八叠球菌属，分枝杆菌属，丙酸杆菌属，变形菌属，假单胞菌属，根瘤菌属，红假单胞菌属，沙门氏菌属，沙雷氏菌属，链球菌属，链霉菌属和黄单胞菌属。
10.根据权利要求9所述的方法，其中微生物细胞是细菌属丙酸杆菌属的细胞。
11.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其中裂解由热处理、巴氏灭菌法、用溶菌酶处理、机械破碎或化学处理单独或相互结合引起。
12.根据权利要求2至11中任何一项所述的方法，其中溶菌产物的固相和液相的分离通过超滤或微量过滤实施。
13.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其中天然维生素B12是5′-脱氧腺苷钴胺素或甲基钴胺素。
14.基于组合物的干物质含量以超过0.1％的重量比含有天然维生素B12的组合物。
15.根据权利要求13所述的组合物，可通过权利要求1至13中任何一项所述的方法得到。
16.根据权利要求14或15所述的组合物是干燥的组合物，其中天然维生素B12基本上均匀分布于整个组合物中，并且当受到筛分、风筛、重力或静电力影响时，维生素B12不与其它成分分离。
17.根据权利要求14至16中任何一项所述的组合物，包含生物质。
18.根据权利要求16所述的组合物，其中生物质来自单个或混合两个或多个如下细菌属的细菌：醋酸杆菌属，气杆菌属，土壤杆菌属，产碱菌属，节杆菌属，固氮菌属，芽孢杆菌属，梭菌属，棒杆菌属，埃希氏菌属，真杆菌属，黄杆菌属，甲烷杆菌属，甲烷八叠球菌属，分枝杆菌属，丙酸杆菌属，变形菌属，假单胞菌属，根瘤菌属，红假单胞菌属，沙门氏菌属，沙雷氏菌属，链球菌属，链霉菌属和黄单胞菌属。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中细菌属是丙酸杆菌属。
20.根据权利要求14至19中任何一项所述的组合物，其中天然维生素B12是5′-脱氧腺苷钴胺素或甲基钴胺素。
21.根据权利要求14至20中任何一项所述的组合物在食品添加剂生产中的用途。
22.根据权利要求14至20中任何一项所述的组合物在化妆制品生产中的用途。
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