CN1226283A

CN1226283A - 具有葡聚糖酶活性的重组酶

Info

Publication number: CN1226283A
Application number: CN97196832A
Authority: CN
Inventors: T·克里斯坦森; C·C·弗格尔桑; T·豪吉尔; C·约安森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1996-06-28
Filing date: 1997-06-30
Publication date: 1999-08-18
Also published as: CA2258292A1; WO1998000529A1; JP2000514289A; US6156553A; EP0910627A1; AU719536B2; AU3254597A

Abstract

本发明涉及编码具有葡聚糖酶活性的酶的克隆的DNA序列、包括所说的DNA序列的重组表达载体、丝状真菌宿主细胞、生产所说的重组葡聚糖酶的方法,以及分离并纯化的酶。本发明还涉及含有重组酶的组合物、口腔保健组合物和产品及在去除齿斑中的应用。

Description

具有葡聚糖酶活性的重组酶

发明的领域

本发明涉及编码具有葡聚糖酶活性的酶的克隆的DNA序列、包括所说的DNA序列的重组表达载体、丝状真菌宿主细胞、生产所说的重组葡聚糖酶的方法，以及分离并纯化的酶。

本发明还涉及含有重组酶的组合物、口腔保健组合物和产品及在去除齿斑中的应用。

发明的背景

葡聚糖酶是降解葡聚糖分子中α-1,6-糖苷键的α-1,6-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.11)，也称为1,6-α-D-葡聚糖6-葡聚糖水解酶。

已知葡聚糖酶具有多方面的用途，例如作为洁齿剂的成分用于预防龋齿、齿斑和/或牙石，以及用于水解甘蔗和甜菜的粗糖汁或糖浆。

已知有几类微生物能够产生葡聚糖酶，其中包括青霉属、拟青霉属、曲霉属、镰孢属、穗霉属、轮技孢属、长蠕孢属和毛壳霉属的真菌；乳杆菌属、链球菌属、纤维弧菌属、纤维粘菌属、短杆菌属、假单胞菌属、棒状杆菌属、节杆菌属和黄杆菌属的细菌，以及斯达氏脂肪酵母等酵母。

市售的用来分解粗糖汁的工业用葡聚糖酶是Novo Nordisk公司发酵拟青霉菌生产的葡聚糖酶50L。

下文综述有关葡聚糖酶及其应用的现有文献。现有技术文献

EP663443(Centro de Ingenieria Genetica y Biotechnologia)描述了衍生于Penicillium minioluteum的葡聚糖酶。可在巴斯德毕赤酵母中异源表达该葡聚糖酶。所说的重组酶的最适温度为55℃至60℃,N-糖基化百分比为13至15％,50℃半寿期大约7.6小时。

附图简要说明

图1显示质粒pCaHj483；

图2显示质粒pToC343；

图3显示质粒pToC325；

图4显示重组和野生型淡紫拟青霉(paecilomyces lilacinus)葡聚糖酶的pH变化曲线；

图5显示重组和野生型淡紫拟青霉葡聚糖酶的温度变化曲线；

图6显示重组和野生型淡紫拟青霉葡聚糖酶的温度稳定性；

图7显示37℃生长于BHI中的S.mutans、A.viscosus和F.nucleatum的混合培养物的间接Malthus标准曲线；

图8显示表达质粒pJW111，图中标出了SP387启动子和终止子，指示了限制性酶切位点及其在质粒中的相对位置。其中箭头指示bar、β-内酰胺酶(ampR)和葡聚糖酶基因的转录方向。

发明的概要

本发明的目的是提供在丝状真菌宿主细胞中异源产生的淡紫拟青霉的重组葡聚糖酶。

本发明人已首次克隆了编码具有淡紫拟青霉中的葡聚糖酶活性的完整DNA序列，并在丝状真菌宿主细胞中异源产生了该葡聚糖酶。以前只是在淡紫拟青霉中同源产生了这种酶。因此，根据现有技术，包括具有葡聚糖酶活性的酶产物是与具有其他酶活性的混合物一起产生的。能够在适当的宿主中异源产生重组葡聚糖酶是有利的，因为这样有可能提供单一成分的葡聚糖酶。此外，其有利于以工业规模提供本发明的分离并纯化的酶。

本说明书中，术语“异源”产生是指在不同于原始的供体生物的宿主生物体中表达重组酶。

术语“同源”产生是指由原生物体表达野生型酶。

已将包含于质粒pToc325中编码本发明的葡聚糖酶的SEQ ID No.1的完整DNA序列转化到大肠杆菌DH52菌株中。已将该菌侏保藏在DSM，登记号为DSM10706。下文将对其作进一步地详细描述。

经数据库序列对比检索，发现SEQ ID No:1中所示的DNA序列是新的。发现其与上面提到的于1994年8月22日按布达佩斯条约有关规定保藏于Mycotheque de l’Universite Catholigue de Louvain(MUCL)的Penicillium minioluteum(MUCL No.38929)的最高同源性为59％。EP0663443中公开了后者的DNA和氨基酸序列。

本发明的第一个方面涉及DNA构建物，该构建物包含编码具有葡聚糖酶活性的酶的DNA序列，所说的DNA序列包括：

a)SEQ ID No:1中所示DNA序列，和/或可从大肠杆菌DSM10706中得到的DNA序列的葡聚糖酶编码部分，或者

b)a)中所限定的DNA序列的类似物，该类似物

ⅰ)与SEQ ID No.1中所示的DNA序列和/或可从大肠杆菌DSM10706得到的DNA序列至少有80％同源性，或

ⅱ)与SEQ ID No.1中所示DNA序列和/或可从大肠杆菌DMS10706得到的DNA序列的同样寡核苷酸探针杂交，或

ⅲ)编码与由包括SEQ ID No.1中所示DNA序列和/或可从大肠杆菌DSM10706得到的DNA序列的DNA序列编码的多肽有80％同源性的肽，或

ⅳ)编码与抗衍生于淡紫拟青霉的和/或可从大肠杆菌DSM10706得到的DNA序列编码的纯化葡聚糖酶的抗体有免疫学反应性的多肽。

本说明书中，SEQ ID No:1中所示的DNA序列和/或可从大肠杆DSM10706得到的DNA序列的“类似物”是指编码具有葡聚糖酶活性的酶的，至少有ⅰ)-ⅳ)中所述的一种性质的任何DNA序列。

类似DNA序列-例如可以使用本文所述的方法，基于SEQ ID No:1中所示的和/或可从大肠杆菌DSM 10706得到的DNA序列的部分序列，从产生有葡聚糖酶活性的酶的其他或相关(如同一种)生物体中分离的，例如为本文所示的DNA序列的等位或种变异体，-可以基于SEQ ID No:1中所示的DNA序列的任何部分DAN序列，例如可经导入不产生与该DNA序列编码的葡聚糖有不同氨基酸序列的，但相当于欲产生该酶的宿主生物体的密码子选择的核苷酸取代，或者导入可产生不同氨基酸序列的核苷酸取代而构建的。但在后一种情况下，最好是引起小范围的氨基酸改变，即导致并不显著地影响多肽折叠或活性的保守氨基酸取代，如一般1至大约30个氨基酸的小的缺失，小的氨基或羧基末端延伸、多达大约20-25个残基的小的接头肽，或利于纯化的小的延伸，如多聚组氨酸序列段、抗原表位或结合区(参见Ford等人.，(1991)，蛋白质的表达和纯化2,95-107)。保守性取代的例子包括碱性氯基酸(如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸)。

本领域技术人员很清楚，可以在对于分子的功能很关键的区域以外进行这些取代，而仍可产生活性酶。可按照本领域已知的方法，例如位点特异性诱变法或丙氨酸扫描诱变法(Cunningham和Wells,(1989),科学244,1081-1085)鉴定那些对于本发明的DNA构建物编码的多肽的活性必不可少的，因而最好不进行取代的氨基酸。在后一种技术中，在分子的每个残基上导入突变，并试验所得突变体分子的生物学(即葡聚氨糖酶)活性，以鉴定对于分子的活性起重要作用的氨基酸残基。也可以用核磁共振、结晶学或光亲和标记等技术分析分子的晶体结构，以确定底物-酶相互作用的位点(例如参见de vos等人.，(1992)，科学255,306-312；Smith等人.，(1992)，分子生物学杂志224,899-904；Wlodaver等人.，(1992),FEBS Lett.309,59-64)。

应明确的是，SEQ ID No.1中所示的DNA序列，和/或转化到已保藏的大肠杆菌菌株DSM 10706中的DNA序列的蛋白质编码部分内的任何部分DNA序列，均可用于分离编码本发明的重组葡聚糖酶的完整DNA序列。SEQ ID No.2中显示根据SEQ ID No.1中所示的DNA序列推测的氨基酸序列。

上文ⅰ)中提到的同源性是指从第二个序列衍生第一个序列的两个序列间的同一性程度。可借助本领域已知的计算机程序，例如GCG软件包中提供的GAP来适当地确定同源性(Needleman S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物学杂志48,p.443-453)。使用带有下列DNA序列比较设置的GAP(版本8):5.0的GAP新增补偿和0.3的GAP延伸补偿，DNA序列的编码区与SEQ ID No.1中所示DNA序列或可从大肠杆菌DSM 10706所含质粒中得到的DNA序列的编码区表现有至少80％，例如至少90％，较好至少95％，特别是至少99％的相同程度。

上文ⅱ)中提到的杂交是指在如下文材料和方法部分中详细描述的某些特定条件下，类似DNA序列与如编码葡聚糖酶的DNA序列的同样探针杂交。

正常情况下，类似DNA序列是与DNA序列高度同源的，例如至少80％同源于SEQ ID No.1中所示的DNA序列或可得自大肠杆菌DSM10706所含质粒的，编码本发明的葡聚糖酶的DNA序列，例如至少90％，较好至少95％，例如至少99％同源于SEQ ID No.1中所示的DNA序列和/或可得自大肠杆菌DSM10706中所含质粒的DNA序列。

上文ⅲ)中提到的同源性是指从第二个序列衍生第一个序列的两个序列间的相同性程度。可借助本领域已知的计算机程序，例如GCG软件包中提供的GAP来适当地确定同源性(Needleman S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物学杂志48,p.443-453)。使用带有下列DNA序列比较设置的GAP(版本8):5.0的GAP新增补偿和0.3的GAP延伸补偿，DNA序列的编码区与SEQ ID No.1中所示DNA序列或可从大肠杆菌DSM 10706所含质粒中得到的DNA序列的编码区表现有至少80％，例如至少90％，较好至少95％，特别是至少99％的相同程度。

与上文所述特征ⅳ)有关的术语“衍生于”不仅是指由DSM 10706的菌株产生的葡聚糖酶，而且还指由分离自菌株DSM 10706的DNA序列编码的，并且在用所说的DNA序列转化的宿主生物体中产生的葡聚糖酶。可用下文“材料和方法”部分中描述的方法确定免疫学反应性。

本发明的再一个方面涉及携带本发明的DNA构建物的表达载体、含有DNA构建物或表达载体的细胞，以及生产表现有葡聚糖酶活性的酶的方法，该方法包括在允许产生该酶的条件下培养所说的细胞，并从培养物中回收酶。

本发明的再一个目的是提供富含本发明的重组葡聚糖酶的酶制剂。

另外，本发明提供一种口腔保健组合物，其进一步含有选自显示齿斑葡聚糖酶、氧化酶、过氧化物酶、卤过氧化物酶、漆酶、蛋白酶、内切葡糖苷酶、脂酶、淀粉酶、抗微生物酶的酶活性的酶及其混合物。

最后，本发明涉及本发明的重组葡聚糖酶的应用。可使用本发明的酶或含有这种酶的本发明的组合物预防龋齿，齿斑或/和牙石。发明的详细描述

克隆

可以使用基于本文公开的DNA序列制备的合成的寡核苷酸探针，从适当来源，例如下文提到的任何生物体的DNA中方便地分离编码有本发明的葡聚糖酶活性的酶的DNA序列。

例如，可以基于SEQ ID No.1中所示核苷酸序列和/或可从大肠杆菌DSM10706所含质粒中得到的核苷酸序列，或SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列或其任何适当的亚序列制备适当的寡核苷酸探针。

按照该方法设计能够编码这些作为SEQ ID No.2之一部分的肽的引物。然后使用这些引物PCR扩增待克隆的基因片段。使用这些片段作为克隆完整基因的探针。

下文实施例1和2中给出了筛选方法的更详细的说明。

或者，也可用包括下述步骤的一般方法分离编码表现葡聚糖酶活性的酶的本发明的DNA序列：

-在适当的载体中克隆淡紫拟青霉的DNA文库，

-用所说的载体转化适当的宿主，

-在适当条件下培养宿主细胞，以表达由DNA文库中的克隆编码的任何感兴趣的酶，

-经确定由这些克隆产生的酶的葡聚糖酶活性来筛选阳性克隆，并且

-从这些克隆中分离编码酶的DNA。

WO93/11249中进一步公开了该通用方法，文献内容列为本文参考文献。

例如可筛选供体生物体的DNA文库，并选择表达适当的酶活性(即根据酶水解AZCL-葡聚糖的能力而定义的葡聚糖酶活性)，以分离编码本发明的重组葡聚糖酶的DNA序列。然后可用标准方法从克隆中分离适当的DNA序列。

葡聚糖酶序列的保藏

已将包含在质粒pUC19中的，从编码本发明葡聚糖酶的淡紫拟青霉菌株中得到的完整全长度DNA序列转化到大肠杆菌DH5α菌株中。发明人已按照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的规定，将所说的细菌保藏在Deutshe Sammlung von Mikroorganismen undFellkulturen GmbH.(Mascheroder Weg 1b,D-38124 BraunschweigFederal Republic of Germamy)(DSM)。

保藏日：1996年6月7日

保***编号：NN49245=ToC 1065

DSM登记号：E.coli DSM No.10706。

Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH.是满足布达佩斯条约的国际公认保藏机构，其按条约有关条款和实施细则，特别是条约第9条的规定永久保藏样品。按照C.F.R.第37卷第1.14段和U.S.C第35卷第122段的规定，在该专利申请至由美国专利与商标局局长签署授权期间将可以得到保藏物。另外，上面提到的保藏物符合EPC第28条涉及微生物的欧洲专利申请的要求。

上述保藏物代表分离的细菌的实质上纯的培养物。在提交了主题申请的对应物或其子代的国家，可按外国专利法的要求使公众得到保藏物。但应明确的是，已保藏的菌株的可利用性并不构成实践主题发明的许可，这样将严重损害由政府机构授予的专利权。

可按标准方法从上述已保藏的菌株中分离编码表现有葡聚糖酶活性的酶的DNA序列。

微生物来源

预期可从下列丝状真菌、酵母或细菌等其他微生物中得到编码同源酶的DNA序列，即类似DNA序列。例如，DNA序列可衍生于拟青霉属的菌株如淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)，或青霉属的菌株如薄青霉或P.minioluteum，曲霉属、镰孢属、穗霉属、轮枝孢属、长蠕孢属或毛壳霉属的真菌；乳杆菌属、链球菌属、纤维弧菌属、纤维粘菌属、短杆菌属、假单胞菌属、棒状杆菌属、节杆菌属和黄杆菌属的细菌；以及斯达氏脂肪酵母等酵母。

葡聚糖酶的生产

然后可将编码葡聚糖酶的DNA序列***到重组表达载体中。可以使用能够方便地进行重组DNA操作的任何载体，对载体的选择常常取决于它将要导入的宿主细胞。

因此，载体可以是自动复制载体，即作为染色体外整体存在的，其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒。另外，载体也可以是在被导入宿主细胞后即整合到宿主细胞基因组中并与其整合的染色体一起复制的载体。

在载体中，编码葡聚糖酶的DNA序列应可操作地连接到适当的启动子和终止子序列上。启动子可以是在宿主细胞中表现有转录活性的，并可衍生于编码同源或异源于宿主细胞的蛋白质的任何DNA序列。用于分别连接编码葡聚糖酶的DNA序列、启动子及终止子的方法，以及将它们***到适当的载体中的方法都是本领域技术人员已知的(例如参见Samkbrook等人，(1989)，分子克隆，实验室手册，冷泉港，纽约)。

用编码葡聚糖酶的DNA序列转化的宿主细胞较好是丝状真菌细胞。具体地说，宿主细胞可以是曲霉属的菌株，特别是米曲霉或黑曲霉，或者是镰孢属的菌株，例如尖镰孢、禾本科镰孢的菌株(完好状况下称为玉蜀黍赤霉，以前称为玉蜀黍球壳霉，别名是粉红赤霉和粉红粘帚霉五谷变种)，或硫磺镰孢(完好状态下称为小麦赤霉，别称Fusariumtrichothecioides，杆孢状镰孢，接骨本镰孢、粉红镰孢和粉红镰孢禾谷变种)、五谷镰孢(别称F.crokkwellnse)，或毒性镰孢。

优选的宿主细胞可以是WO96/00787中所述的禾谷镰孢(得自NovoNordisk A/S)，例如以登记号禾谷镰孢ATCC20334保藏的菌株。菌株ATCC20334以前被错误地分类为禾谷镰孢(Yoder,W.和Christianson,L.,1997)。现在已基于RAPD分析和经典分类学分析证明，Quorn真菌，ATCC 20334的真实身分是毒性镰孢Nirenburg新种。

在下文实施例中，使用毒性镰孢(F.venenatum)和米曲霉作为宿主细胞举例描述葡聚糖酶的表达。

在本发明的一个优选实施方案中，宿主细胞是缺乏蛋白酶的蛋白酶-菌株。

例如可以是已删除了称为“alp”的碱性蛋白酶基因的蛋白酶缺陷型菌株米曲霉JaL125。PCT/DK97/00135(Novo Nordisk A/S)中描述了该菌株。

可以按照原生质体形成和原生质体转化，然后再按已知方式再生细胞壁的方法转化丝状真菌。EP238023(Novo Nordisk A/S)中描述了曲霉作为宿主微生物的应用(其内容列为本文参考文献)。

生产本发明的酶的方法

再一方面，本发明涉及生产本发明的酶的方法，其中在允许产生酶的条件下培养用编码酶的DNA序列转化的适当宿主细胞，并从培养物中回收所得到的酶。

用于培养被转化的宿主细胞的培养基可以是适于生长所研究的宿主细胞的任何常规培养基。所表达的葡聚糖酶可以方便地被分泌到培养基中并可用已知的方法回收，这些方法包括经离心或过滤从培养基中分离细胞，借助适当的盐例如硫酸铵沉淀培养基的蛋白质成分，然后进行离子交换层析、亲和层析等层析处理。

酶

本发明也涉及基本上具有SEQ ID No.2中所示氨基酸序列或其片段的，有葡聚糖酶活性的分离的重组酶。质谱分析显示重组葡聚糖酶的平均质量约为65.3KD。

发现重组葡聚糖酶的最适pH为3.5至5.5，此相当于野生型葡聚糖酶的最适pH(见图4)。发现在pH5.5时重组和野生型葡聚糖酶的最适温度均为60℃左右(见图2)。此外，在pH5.5和pH7时，重组和野生型葡聚糖酶是稳定的。在70℃时，只保留有很少的残留活性。

口腔保健组合物

再一个方面，本发明涉及作为口腔保健产品的成分的口腔保健组合物。

本发明的口腔保健组合物包括适当量的重组淡紫拟青霉葡聚糖酶，其相当于计算的口腔保健终产品中约含0.001KDU至1000KDU/ml，较好0.01KDU/ml至500KDU/ml，特别是0.1KDU/ml至100KDU/ml的酶活性。

根据本发明，口腔保健组合物中还可包括除葡聚糖酶活性以外的其他酶活性。预期的酶活性包括选自齿斑葡聚糖酶、氧化酶如葡萄糖氧化酶或L-氨基酸氧化酶、过氧化物酶例如WO95/10602(Novo NordiskA/S)中所述的Coprinus sp.过氧化物酶或乳过氧化物酶或卤过氧化物酶、漆酶、蛋白酶如木瓜蛋白酶或酸性蛋白酶(例如WO95/02044(NovoNordisk A/S)中所述的酸性蛋白酶)、内切葡糖苷酶、脂酶、淀粉酶、包括淀粉葡糖苷酶如AMG(Novo Nordisk A/S)、抗微生物酶及其混合物的活性。

口腔保健产品

口腔保健产品可以具有任何适当的物理形式(如粉末、膏状物、凝胶、液体、软膏、片剂等)。“口腔保健产品”可定义为可用于保持或改善人和动物的口腔卫生、预防龋齿、预防齿斑和牙石形成、去除齿斑和牙石、预防和/或治疗口腔疾病等的产品。

至少在本说明书中，口腔保健产品还包括清洁牙托、假牙等的产品。

这样的口腔保健产品的实例包括牙膏、牙乳、凝胶或牙粉、洗牙水、漱口液、刷牙前或刷牙后漱洗配方、口香糖、锭剂和糖果。

牙膏和牙凝胶一般都包括研磨抛光材料、起泡剂、香味剂、润湿剂、粘结剂、增稠剂、甜味剂、增白剂/漂白剂/色斑清除剂、水，及选择性存在的酶。

包括牙斑去除液在内的漱口剂一般包括水/醇溶液、香味剂、湿润剂、甜味剂、起泡剂、着色剂及选择性存在的酶。

磨料

本发明的洁齿剂产品中也可掺入研磨抛光材料。根据本发明，所说的研磨抛光材料包括氧化铝和水合氧化铝，如α三水合氧化铝、三硅酸镁、碳酸镁、高岭土、硅铝酸盐如煅烧的硅酸铝和碳酸铝、碳酸钙、硅酸锆、以及粉末状塑料，如聚氯乙烯、聚酰胺、聚丁烯酸甲酯、聚苯乙烯、酚-甲醛树脂、蜜胺-甲醛树脂、脲-甲醛树脂、环氧树脂、粉末状聚乙烯、硅干凝胶、水凝胶和气溶胶等。适用的研磨剂还包括焦磷酸钙、非水溶性偏磷酸碱金属盐、磷酸二钙和/或其二水合物、正磷酸二钙、磷酸三钙、微粒羟磷灰石等。也可利用这些物质的混合物。

根据口腔保健产品的不同，研磨产品含量可以是0至70％(重量)，较好为1％至70％。在牙膏中，研磨材料含量一般为最终牙膏产品的10％至70％(重量)。

利用润湿剂防止水从牙膏中丢失。用于本发明的口腔保健产品中的适当的润温剂包括下列化合物及其混合物：甘油、多元醇、山梨醇、聚乙二醇(PEG)、丙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、部分氢化的水解多糖等。牙膏中润湿剂含量一般为0％至80％，较好为5％至70％(重量)。

适用的增稠剂和粘结剂的例子包括硅石、淀粉、黄蓍胶、黄原胶、爱尔兰藓提取物、海藻酸、果胶、纤维素衍生物如羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基纤维素、聚丙烯酸及其盐、聚乙烯吡咯烷酮等，其可帮助稳定牙粉产品。牙膏乳剂和凝胶中增稠剂的含量为0.1至20％(重量)，粘结剂含量为终产品的0.01至10％(重量)。

起泡剂

可使用肥皂、阴离子、阳离子、非离子、两性和/或两性离子表面活性剂作为起泡剂。这些起泡剂可占终产品重量的0％至15％，较好占0.1至13％，最好占0.25至10％。

表面活性剂

表面活性剂只是那些对本发明的酶没有失活作用的表面活性剂。表面活性剂包括脂肪醇硫酸酯、磺化单酸甘油酯或有10至20个碳原子的脂肪酸的盐、脂肪酸-白蛋白缩合产物、脂肪酸酰胺和氨基乙磺酸的盐和/或羟乙磺酸脂肪酸酯的盐。

甜味剂

适用的甜味剂包括糖精。

香味剂

常常加有少量，例如0.01％至大约5％(重量)，特别是0.1％至5％的香味剂，例如薄荷。

增白剂/漂白剂

增白剂/漂白剂包括H₂O₂，并可按终产品重量的不足5％，较好0.25至4％的量加入。

增白剂/漂白剂可以是酶，例如氧化还原酶。适用的牙齿漂白酶的例子是WO97/06775(Novo Nordisk A/S)中描述的酶。

水

通常以可使例如牙膏产生流动的量加入水。

其他添加剂

另外还可包括水溶性抗菌剂，例如二葡糖酸氯己定(Chlorhexidinedigluconate)、双辛氢啶、阿来西定、季铵抗菌化合物及水溶性来源的某些金属离子如锌、铜、银和二价锡(例如锌、铜和二价锡氯化物、及硝酸银)。

根据本发明，另外还可加入用作氟化物来源的化合物、染料/着色剂、防腐剂、维生素、pH调节剂、抗龋剂、脱敏剂等。

酶

用于本发明的口腔保健产品中的其他基本成分是酶。在活体中，酶是化学反应的生物催化剂。酶与其作用的底物结合形成中间体酶-底物复合物。然后该复合物转化成反应产物，并释放出继续发挥其特异性酶促功能的酶。

当用于清洁口腔时，酶可提供几方面的好处。蛋白酶分解唾液蛋白质，后者吸附到牙齿表面上形成菌膜，即所得齿斑的第一层。蛋白酶和脂酶一起溶解那些构成细菌细胞壁和膜的结构成分的蛋白质和脂质，从而破坏细菌。

葡聚糖酶破坏由细菌产生的、形成细菌粘附基质的有机骨架结构。蛋白酶和淀粉酶不仅防止龋斑形成，而且经过破坏与钙结合的碳水化合物-蛋白质复合物，防止矿化进而防止牙石的生成。

由本发明的口腔保健组合物生产的牙膏一般可包括下列成分(以所占最终牙膏组合物的重量百分比表示)：

研磨剂材料 10至70％

润湿剂 0至80％

增稠剂 0.1至20％

粘结剂 0.01至10％

甜味剂 0.1至5％

起泡剂 0至15％

增白剂 0至5％

酶 0.0001至20％

在本发明的一个特定实施方案中，口腔保健产品是含有下列成分的，pH范围为6.0至大约8.0的牙膏：

a)10％至70％研磨剂材料

b)0至80％润湿剂

c)0.1至20％增稠剂

d)0.01至10％粘结剂

e)0.1至15％甜味剂

f)0至5％起泡剂

g)0至5％增白剂

i)0.0001％至20％酶

ⅰ)下所述的酶包括本发明的重组葡聚糖酶，并且也可以是上文提到的可用于牙膏等产品中的其他类型的酶。

由本发明的口腔保健组合物生产的漱口液一般可包括下列成分(以所占最终漱口液组合物的重量百分比表示)：

0至20％润湿剂

0-2％表面活性剂

0-5％酶

0-20％乙醇

0-2％其他成分(例如香料、甜味剂、

氟化物等活性成分)

0-70％水

可用pH范围6-7.5的柠檬酸或磷酸钠等适当的缓冲液缓冲漱口组合物。

漱口液可以是未稀释形成的(即使用前必须进行稀释)。

制造方法

可以使用的口腔保健产品生产领域已知的方法制造本发明的口腔保健组合物和产品。

应用

根据本发明的重组葡聚糖酶和包括重组葡聚糖酶的组合物可有多种用途，包括用于人和/或动物的口腔保健产品中，以用于预防齿斑的形成或用于去除齿斑；用于水解糖汁或糖浆；用于食品、饲养和/或庞物食品中。材料和方法

材料

微生物

大肠杆菌DSM no.10706已按照国际公认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的规定保藏在Deutshe Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH.(Mascheroder weg 1b,D-38124 Braunschweig，联邦德国)(DSM)。

米曲霉JaL 125：米曲霉IFO 4177可得自日本大阪发酵研究所(Institute for Fermention,Osaka,17-25 Juso Hammachi 2-ChomeYodogawa-ku,Osaka,Japan)，其具有按一步骤基因置换法(参见G.May，“丝状真菌的应用分子遗传学”(1992),pp.1-25,Eds.J.R.Kinghorn和G.Turner；Blackie Academic and Professional)，使用米曲霉pyr G基因作为标志删除的称为“alp”的碱性蛋白酶基因(参见Murakami K.等人，(1991)，农业生物化学，55,p.2807-2811)。

镰孢霉CC1-3：镰孢霉A3/5的形态学突变体(ATCC20334)(Wiebe等人，1992，霉菌学研究96∶555-562；Wiebe等人，1991，霉菌学研究95∶1284-1288；Wiebe等人，1991，霉菌学研究96:555-562)是高度分支的，菌株变异体。菌落ATCC20334是WO96/00787中称为禾谷镰孢ATCC20334的菌株。以前错误地将菌株ATCC20334分类为禾谷镰孢(Yoder和Christianson,(1997))。基于RAPD的分析和经典分类学分析表明Quorn真菌ATCC20334实际是毒性镰孢的Nirenburg新种。

大肠杆菌DH5α

大肠杆菌菌株JM101

质粒和载体：

pCaHj483(图1)

pToC343(图2)

pToC325(图3)

pICAMG/Term(EP238 023)

pUC19(Yanish-Perron等人，(1985)，基因33,p.103-119)

pJ111：在大肠杆菌菌株JM101中构建和扩增的表达质粒(图8)。

pDM181：镰孢霉表达质粒(Jones等人，1996)是编码SP387启动子和终止子，以及赋予Bastar抗性的bar基因(Thompson等人，1987,EMBO 6(9):2519-2514)的单一载体***。已在SP387调节序列之间导入两个限制性酶切位点，SwaⅠ和PacⅠ的位点，以有利于克隆。

酶：

由淡紫拟青霉产生的葡聚糖酶L50(Novo Nordisk A/S)；

由无色杆菌(Achromobacter)产生的赖氨酰特异性蛋白酶；

NOVOZYM 234^TM(Novo Nordisk A/S)

培养基、底物和溶液：

YPG培养基：1％酵母提取物、2％细菌蛋白胨和2％葡萄糖；

YPD:10g酵母提取物、20g蛋白胨，加水至900ml。高压灭菌，加入100ml 2％葡萄糖(无菌过滤的)；

葡聚糖500(Pharmacia)

AZCL-葡聚糖(MegaZyme)

pCRⅡ(Invitrogen TA克隆试剂盒)

Britton-Robinson缓冲液

DAPI:4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(Sigma D-9542)

BHI：脑心灌注液。

Vogel’s/Basta培养基：Vogel氏盐(Vogel,H.J.,1964,Am.Nat.98:436-446)、25mM NaNO₃、5mg/ml Basta(Hoechst)、25g/L蔗糖、25g/L纯净琼脂，pH6.0。

M400Da培养基：每升含50g麦芽糖糊精、2.0gMgSO₄.7H₂O、2.0g KH₂PO₄、4.0g柠檬酸、8.0g酵母提取物、2.0g尿素、和0.5ml微量金属溶液。用5N NaOH将培养基的pH调到6.0。微量金属溶液每升含有14.3g ZnSO₄.7H₂O、25g CuSO₄.5H₂O、0.5g NiCl₂.6H₂O、13.8gFeSO₄.7H₂O、8.5g MnSO₄.H₂O和3.0g柠檬酸。

孢子形成培养基：12.1g/L NaNO₃、25g/L琥珀酸(二钠盐)1g/L葡萄糖和1×Vogel氏盐，调到pH6.0。

STC:0.8M山梨醇、25mM Tris(pH8.0)、50mM CaCl₂。

SPTC:40％PEG4000、0.8M的山梨醇、25mM Tris(pH8.0)、50mM CaCl₂。

仪器：

10KDa截止超滤盒(Alpha Minisette，购自Filtron)；

苯基-琼脂糖FF(高微细)柱(Pharmacia)；

Seitz EK1过滤板；

Q-琼脂糖FF柱(Pharmacia)；

Applied Biosystems 473A蛋白质序列分析仪；

2升Kieler发酵罐；

Olvmpus BX50型显微镜；

Malthus Flexi M2060(Malthus仪器有限公司)。

引物：8001 GA(A/G)AA(T/C)TA(T/C)GC(T/C/G/A)TA(T/C)ATGGC (SEQ ID No15)8002 GCCAT(G/A)TA(G/A/T/C)GC(A/G)TA(G/A)TT(T/C)TC (SEQ ID No16)8003 TGGAC(A/G/T/C)CA(A/G)TT(T/C)CA(A/G)TA(T/C)GC (SEQ ID No17)8004 GC(A/G)TA(T/C)TG(A/G)AA(T/C)TG(A/G/T/C)GTCC (SEQ ID No.18)8005 AA(T/C)TGGCA(A/G)AT(T/C/A)GG(A/G/T/C)GG (SEQ ID No.19)8006 CC(A/G/T/C)CC(T/A/G)TA(T/C)TGCCA(A/G)TT (SEQ ID No.20)8864 CGCGGATCCACCATGCGTTGGCCTGGTAATTTTC (SEQ ID No.23)8867 CCGCTCGAGCCTGCCTCATTCAATGCTCC (SEQ ID No.24)

方法：

葡聚糖酶活性试验

葡聚糖酶活性试验是选用碱性3.5-二硝基唾液酸(在540nm处有吸收)检测从葡聚糖分子释放出的还原糖。

条件：40℃下，2.5％葡聚糖500(Pharmacia)在0.1M醋酸钠(pH5.4)中。酶浓度约为1DU/ml。

1DU酶等于1小时内产生相当于1mg麦芽糖的还原糖的酶含量。

也可使用AZCL-葡聚糖(megaZyme)检测葡聚糖酶活性。将溶于0.1M醋酸钠(pH5.5)或50mM Britton-Robinson缓冲液中的500μl0.4％AZCL-葡聚糖溶液加到用MilliQ过滤水稀释的500μl酶样品中并于40℃保温10分钟。然后以15000g将样品离心2分钟并将200μl上清液加到微量滴定板的小孔内，于595nm检测吸光率。

淡紫拟青霉野生型葡聚糖酶的分子特征

质谱

在VG Analytical TofSpec.中，使用基质辅助的激光解吸离子化飞行时间质谱法对纯化的野生型葡聚糖酶进行质谱分析。为进行质谱分析，将2ml样品与2ml饱和的基质溶液(溶于0.1％TFA∶乙腈(70∶30)中的α-氰基-4-羟基肉桂酸)混合，并将2ml混合物点样在靶板上。在导入质谱仪中之前，蒸发除去溶剂。使样品解吸并以阈值激光能量经4次激光脉冲(337nm)使之离子化，以25KV的加速电压加速到自由场飞行管中。以1850V微通道板检测离子。

羟基磷灰石圆片(HA)制备

在压片模内，以大约5900kg(13000lbs)的压力将250mg羟基磷灰石压5分钟，制成羟基磷灰石片。然后于600℃烧结4小时，最后用无菌去离子水水合。

羟基磷灰石圆片(HA)的蚀斑包被

干燥灭菌(121℃,2bar,20分钟)处理羟基磷灰石圆片(HA)并用滤膜除菌的唾液37℃包被18小时。将HA圆片放在烧杯中的无菌架上，向覆盖圆片的烧杯内倒入含有0.2％蔗糖的脑心灌注液(BHI)。接种前立即加入无菌Na₂S(pH7.0)，使终浓度达到5g/升。将厌氧生长(BHI,37℃,24小时)的齿斑葡聚糖链球菌，粘放线菌和具核梭杆菌的1∶1∶1混合物作为约10⁶cfu/ml浓度的接种物。在轻轻搅拌下将圆片37℃厌氧温育4天。

蚀斑的Malthus方法

Malthus方法是基于Johnston等人，(1995)，微生物学方法杂志21,p.15～26和Johansem等人，(1995)，应用细菌学杂志78,p.297～303所述的方法建立的。

聚合酶链反应(PCR)

使含有Advantage cDNA PCR核心试剂盒(Clontech,Palo Alto)的成分、0.1mg pToC343和各50pmol引物o-dexSwaⅠ{GCATTTAAATATG CGT TGG CCT GGT}和o-dexPacⅠ{CGTTAAT TAA TCA TTC AAT GCT CCA GTC}的PCR反应混合物进行下列循环：95℃4分钟1次循环；(95℃1分钟，60℃1分钟，72℃2分钟)25次循环；72℃5分钟1次循环。

实施例：实施例1：野生型葡聚糖酶的纯化

步骤1：超滤

将1升葡聚糖酶50L(Novo Nordisk A/S)与8升50mM乙酸钠/HCl(pH5.4)混合。在10KDa截留超滤盒(Alpha Minisette,Filtron)上将混合物浓缩到大约0.5升。加入另外8升50mM乙酸钠/HCl(pH5.4)再次将酶溶液浓缩到大约0.5升。

步骤2：在苯基-琼脂糖FF柱上层析

将饱和硫酸铵加至终浓度为1.0M。用3％NaOH调pH至6.0并在Seitz EK1滤板上过滤酶。将EK1滤液分成两等份。

在25mM乙酸钠/HCl、1.0M(NH₄)₂SO₄,pH6.0中平衡1升苯基-琼脂糖FF(高微细)柱。将一半EKI滤液加于柱上并用5倍体积的平衡缓冲液洗以除去未结合的蛋白质。为了洗脱葡聚糖酶，在柱上加入5倍柱体积的硫酸铵梯度(1.0→0.0M)。对另一半K1滤液重复苯基-琼脂糖FF-柱洗脱步骤。收集合葡聚糖酶活性的各管洗脱物。

步骤3：在Q-琼脂糖FF柱上层析

在10KDa截留超滤盒上将合并的各管内容物浓缩到大约250ml。将超滤的酶对10mM乙酸钠/HCl(pH6.0)透析，中间更换几次缓冲液。

在20mM乙酸钠/HCl(pH6.0)中平衡1升Q-琼脂糖FF柱。将酶溶液上柱并用平衡缓冲液洗柱直到OD₂₈₀信号返回到基线。用5倍柱体积的线性NaCl梯度(0→75mM)洗脱葡聚糖酶。

分析柱上洗脱的各管中的葡聚糖酶活性，并用SDS-PAGE法分析含葡聚糖酶活性的部分。合并酶纯度达到至少90％的各管洗脱物作为纯化的葡聚糖酶。最后通过0.20μ滤膜过滤酶液。实施例2：野生型葡聚糖酶的N末端序列分析

N末端氨基酸序列分析：

在Applied Biosystems 473A蛋白质序列分析仪中进行N末端氨基酸序列分析。

为了产生肽，还原的和S-羧甲基化的葡聚糖酶，于37℃用溶于含有1.3M尿素的40mM NH₄HCO₃中的无色杆菌赖氨酰特异性蛋白酶(20mg)消化按材料和方法部分所述方法纯化的野生型葡聚糖酶(＞＞500mg)。使用Vydac C₁₈柱以反相HPLC法分离所得到的肽，其中用含有0.08％TFA的80％2-丙醇(在0.1％TFA水溶液中)的线性梯度洗脱。

再次使用Vydac C₁₈柱以反相HPLC法纯化肽，其中用含有0.08％TFA的80％乙腈(在0.1％TFA水溶液中)的线性梯度洗脱，然后进行N末端氨基酸序列分析。

测定的氨基酸序列如下所示。Xaa代表未确定的残基，Asx是尚不可能区别Asp与Asn的残基。

N末端：Asp-Gln-Gln-Asn-Gln-Ala-Leu-His-Thr-Trp-Trp-His-Glu-Lys-Ser-(SEQID No.3)

实际上对葡聚糖酶的直接N末端氨基酸测序揭示有3个彼此交错的序列。发现分别在Asp1、Gln3和Asn4处开始的序列比例为2∶1∶2。

肽1:Ser-Tyr-Val-Asn-Asp-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Ser-Glu-Glu-Pro-Arg-Asn-Ala-Leu-Leu-Ile-Phe-Ala-Ser-Pro-Phe-Ile-Pro-Gln (SEQ ID No.4).

肽2:Ser-Asp-Arg-Thr-Ser-Leu-Arg-Ile-Phe-Ser-His-Gln-Ala-Val-Ser-Asp-Ser-Gln-Ile-Trp-His-Xaa-Ile (SEQ ID NO.5)

肽3:Asn-Asp-Phe-Tyr-Thr-Val-Gly-His-Gly-Val-Val-Ser-Gly-Glu-Asn-Tyr-Ala-Tyr-Met-Ala-Asn-Thr-Ala-Lys (SEQ ID No.6)

肽4:Ile-Asn-Ala-Ala-Trp-Thr-Gln-Phe-Gln-Tyr-Ala-Lys (SEQ ID No.7)

肽5:Asp-Gly-Ser-Ala-Leu-Gly-Pro-Thr-Ser-Asn-Val-Val-Ile-Arg-Pro-Ser-Asp-Ile-Arg-Tyr-Asp-Ile-Ser-Ser-Pro-Asp (SEQ ID No.8)

肽6:Asn-Trp-Gln-Ile-Gly-Gly-Asn-Arg-Val-Asp-Gly-Ser-Asn-Trp-Gln-Val-Asn-Gln (SEQ ID No.9)

肽7:Ser-Glu-Thr-Val-Val-Pro-Ser-Ala-Ile-Ile-Gly-Ala-Ser-Pro-Tyr-Tyr-Gly-Asp-Pro (SEQ ID No.10)

肽8:Leu-Asx-Ala-Asx-Thr-His-Tyr-Val-Tyr-Phe-Glu-Pro-Gly-Thr-Tyr-Ile-Lys (SEQ ID No.11).

肽9:Val-Ile-His-Thr-Arg-Trp-Phe (SEQ ID No.12)

肽10:Ser-Ala-Val-Asn-Asp-Ala-Gly-Ala-Val-Ala-Ala-Asp-Glu-Val-Arg-Gln-Ser-Asg-Lys (SEQ ID No.13)

肽11:Xaa-His-Asn-Asp-Pro-Val-Ile-Gln-Met-Gly-Xaa-Lys (SEQ ID No.14).买施例3：

淡紫拟青霉葡聚糖酶的克隆

基于实施例2中所述的部分氨基酸序列克隆得自淡紫拟青霉的葡聚糖酶基因。设计能够编码肽3、4、和6的简并PCR引物。制得在两个方向上编码同一序列的引物。在用淡紫拟青霉的染色体DNA进行的PCR反应中使用6个引物的所有组合。这些反应中有些产生了编码葡聚糖酶基因的DNA片段。使用这些片段作为探针进行基因组Southern分析。杂交，然后克隆并测定6kb BamHⅠ片段。所有体外DNA操作均按已知的标准方法进行(Sambrook等人，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社(1989))。

PCR片段

合成下列引物。8001 GA(A/G)AA(T/C)TA(T/C)GC(T/C/G/A)TA(T/C)ATGGC8002 GCCAT(G/A)TA(G/A/T/C)GC(A/G)TA(G/A)TT(T/C)TC8003 TGGAC(A/G/T/C)CA(A/G)TT(T/C)CA(A/G)TA(T/C)GC8004 GC(A/G)TA(T/C)TG(A/G)AA(T/C)TG(A/G/T/C)GTCC8005 AA(T/C)TGGCA(A/G)AT(T/C/A)GG(A/G/T/C)GG8006 CC(A/G/T/C)CC(T/A/G)TA(T/C)TGCCA(A/G)TT

引物8001和8002在一个或另一个方向上编码肽3的氨基酸14-20。引物8003和8004编码肽4的氨基酸5-11，引物8005和8006编码肽6的氨基酸1-6。基本上按照Yelton等人(美国国家科学院院报，(1984),81,p.1470-1474)所述的方法制备淡紫拟青霉Li-3的染色体DNA。

以所有的引物组合，按标准方法进行PCR反应。引物组8001/8006和8003/8002产生的片段经在载体pCRⅡ(Invitrogen TA克隆试剂盒)中克隆并在Applied Biosystems DNA序列仪上测序后显示含有葡聚糖酶基因的一部分。用引物组8001/8006得到的片段约为0.9kb。对该片段的末端测序表明其为一个编码2号肽的DNA序列。

用8003/8002得到的片段约为0.6kb。测序结果表明该片段中含有编码肽5、1和8的序列。

基因组克隆

用BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ切割淡紫拟青霉的染色体DNA，并与³²P标记的PCR片段杂交以进行Southern印迹分析。两片段均与约6kb BamHⅠ片段杂交。制备克隆到pUC19中的淡紫拟青霉的约6kb BamHⅠ片段的文库。与PCR片段之一进行集落杂交以筛选文库，并分离阳性质粒pToC325(参见图2)。测足pToC325中2994bp的序列，SEQ ID NO.1和SEQ ID No.2中分别显示了DNA序列和推测的氨基酸序列。转化到E.coli DH 5α中的pToC325已作为菌株10706保藏于DSM。实施例4：重组葡聚糖酶在米曲霉中的表达

在葡聚糖酶的起始和终止密码子处导入限制性酶切位点，并借以将基因克隆到米曲霉表达载体pCaHj483中。将所得到的葡聚糖酶表达质粒转化到米曲霉菌株中。分离转化株并分析葡聚糖酶的表达。

pCaHj483的构建

从下列片段构建pCaHj483(见图1)：

a)用EcoRⅠ和XbaⅠ切割的载体pToC65(WO91/17243)。

b)携带amdS基因的构巢曲霉的27kb XbaⅠ片段(C.M.Corrick等人.，1987，基因53,63-71)。在真菌转化中使用amdS基因作为选择标记。已对amdS基因进行了修饰，使正常存在于基因中的Bam HⅠ位点受到破坏。为此，使用引物：5’-AGAAATCGGGTATCCTTTCAG-3’(见SEQ ID NO.21)导入了沉默点突变。

c)携带黑曲霉NA2启动子的0.6kb EcoRⅠ/bAMHⅠ片段，所说的启动子融合到编码构巢曲霉tpi基因之mRNA的5’未翻译端的序列的60bpDNA片段上。从质粒pNA2(EP-B-0383779,Novo NordiskA/S)中分离NA2启动子并以PCR法融合到60 bp tpi序列上。编码60bp tpi序列的引物具有下示序列：5′-GCTCCTCATGGTGGATCCCCAGTTGTGTATATAGAGGATTGAGGAAGGAAGAGAAGTGTGGATAGAGGTAAATTGAGTTGGAAACTCCAAGCATGGCATCCTTGC- 3′(See SEQ IDNo.22)

d)携带黑曲霉葡糖淀粉酶转录终止子的675bp Xba片段。从质粒pICAMG/Term(EP238023,Novo Nordisk A/S)中分离该片段。

通过pIC19R接头(BamHⅠ至XbaⅠ)将片段C的BamHⅠ位点连接到片段d上转录终止子前面的XbaⅠ位点上。

将葡聚糖酶基因克隆到pCaHj483中

使用下列引物，经PCR反应将BamHⅠ和XhoⅠ位点导入ATG的前面和葡聚糖酶基因的终止密码子之后：8864 CGCGGATCCACCATGCGTTGGCCTGGTAATTTTC (SEQ ID No.23)8867 CCGCTCGAGCCTGCCTCATTCAATGCTCC (SEQ ID No.24)

重新进行基因的序列分析以检查是否有PCR错误，并通过BamHⅠ和XhoⅠ位点克隆到表达载体pCaHj483中。所得到的葡聚糖酶表达质粒被定名为pToC343，并图示于图3中。

pToC343的米曲霉转化株

按EP 0238023中所述方法用pToC343转化米曲霉JaL125。根据其利用乙酰胺作为唯一氮源的能力选择转化体。通过在最小乙酰胺平板上的分生孢子再次重新分离后，将转化体在10ml YPD中30℃发酵培养4天。将发酵液样品加到SDS-PAGE上。用考马斯亮蓝染凝胶。转化体的培养液中可见有约65kD的带，而JaL125的培养液中则没有。

在含有麦芽糖糊精的培养基中，将产生65kD蛋白质的三个转化株置于2升Kieler发酵罐内发酵培养5天，并以酶促方法测定葡聚糖酶含量。

转化株在发酵液中产生多达11000DU/ml的葡聚糖酶，而未被转化的宿主的酶产量则不足100DU/ml。实施例5：重组葡聚糖酶的纯化

在Amicon小室(膜截留：10kD)中过滤并浓缩培养液。用MilliQ过滤的水稀释样品并将pH调至7.5。然后将样品加于用20mM磷酸钠(pH7.5)平衡的Q-Sepharose柱(Pharmacia)上，并用加在20mM磷酸钠(pH7.5)中的0至0.5M NaCl线性梯度洗脱葡聚糖酶。合并含葡聚糖酶的各管，向其中加入(NH₄)₂SO₄至1M的浓度并上样于用1M(NH₄)₂SO₄平衡的苯基-琼脂糖柱(Pharmacia)上。以1至0M(NH₄)₂SO₄的线性梯度洗脱葡聚糖酶。

经N末端蛋白质序列测定进一步证实纯化的重组葡聚糖酶的N末端氨基酸序列。实际上发现了两个N末端氨基酸序列：一个在Asp1处开始(Asp-Gln-Gln-Asn-Gln)，一个在Asn4处开始(Asn-Gln-)，两者比例为2∶3。实施例6：葡聚糖酶的分子量

根据SDS-PAGE分析结果，纯化的重组葡聚糖酶与野生型葡聚糖酶一样具有大约65kD的分子量。基质辅助的激光解吸离子化飞行时间质谱分析进一步证实了这一结果，其中测得分子量约为65kD。

野生型葡聚糖酶的质谱分析表明，其平均分子量为大约65.3kDa。实施例7：重组和野生型葡聚糖酶的pH分布曲线

在不同pH下，使酶样品与AZCL-葡聚糖在50mM Britton-Robinson缓冲液中一起保温。重组和野生型葡聚糖酶具有大约pH6的最适pH(见图4)。实施例8：重组和野生型葡聚糖酶的温度分布曲线

在0.1M乙酸钠(pH5.5)中，于不同温度下使酶样品与AZCL-葡聚糖一起保温。重组和野生型酶有相似的温度分布曲线，最适温度约为60℃(见图5)。实施例9：重组和野生型葡聚糖酶的温度稳定性

在pH5.5或pH7的50mM Britton-Robinson缓冲液中将酶样品在不同温度下预保温30分钟。用0.1M乙酸钠(pH5.5)将样品稀释10倍，然后测定残留活性。两种酶在pH5.5和pH7条件下可见有差不多的温度稳定性。葡聚糖酶在60℃是稳定的。70℃保温后观察到很少的残留活性(见图6)。实施例10：重组葡聚糖酶抗齿斑活性

使蚀斑生物膜厌氧生长于唾液包被的如材料和方法部分中所述的羟基磷灰石圆片上。该蚀斑是齿斑葡聚糖链球菌(SFAG,CBS 350.71)、粘放线菌(DSM 43329)和具核梭杆菌多形亚种(DSM 20482)的混合培养物。

将带有蚀斑的HA圆片转移到含有1KDU/ml重组淡紫拟青霉葡聚糖酶的乙酸盐缓冲液(pH5.5)中，并旋转2分钟(使用无菌缓冲液作为对照)。

酶处理后，用DAPI着染HA圆片或转移到Malthus小室内。

当计数活的粘附细胞时使用间接阻抗检测法(Malthus FlexiM2060,Malthus仪器有限公司)。

为了进行阻抗检测，将3ml BHI转移到间接Malthus小室的外腔中，并将0.5ml无菌KOH(0.1M)转移到内腔中。葡聚糖酶处理后用磷酸盐缓冲液轻轻淋洗带有蚀斑的HA圆片并转移至外腔内。使用与dt相关的cfu/ml的校正曲线，将Malthus中的检测时间(dt)转换成集落计数(见图7)。

使用从混合的培养物制备的一系列10倍稀释率构成校正曲线。在BHI中检测各稀释步骤的传导dt,并构成混合培养物的BHI中10倍稀释液的cfu/ml对dt的校正曲线。

也使用荧光显微镜检测从HA圆片上去除的蚀斑，酶处理后用DAPI(3mM)着染圆片，并于暗处20℃保温5分钟。用配有200W水银灯和紫外滤片的Olympus BX50型显微镜，以X100油浸荧光目镜检查DAPI着染的细胞。将结果与使用阻抗检测法得到的定量数据相比较。

葡聚糖酶处理后，以Malthus方法检测唾液处理的HA表面上活细胞的数目，并示于表1中。

然而，使用Malthus方法不可能区分开酶的杀菌活性或是酶促去掉了蚀斑。因此，须将表面上活细菌数的减少与使用DAPI染色估计的同时去除的表面蚀斑进行比较。

表1：以阻抗检测法检测的从唾液处理的羟基磷灰石中酶促蚀斑去除率(pH5.5,2分钟)

葡聚糖酶(KDU/ml)	Log 10降低(cfu/cm²)	蚀斑的去除(1％)	观察数
葡聚糖酶(KDU/ml)	Log 10降低(cfu/cm²)	蚀斑的去除(1％)	观察数	0	0	0	10
1	2.5	99	3	0	0	0	10

用量光显微镜测知，在经葡聚糖酶处理后，蚀斑被大量的去除。因此重组葡聚糖酶降低了粘附细胞的量。如此检测到的活性是根据蚀斑去除确定的，而不是对抗蚀斑中的细杀菌活性。实施例11：毒性镰孢中重组淡紫拟青霉葡聚糖酶的表达

毒性廉孢的葡聚糖酶表达质粒的构建

使用引物o-dex Swa(SEQ ID NO.25)和o-dexPac(SEQ IDNO.26)从表达质粒pToC343 PCR扩增葡聚糖酶基因(参见材料和方法)。用SwaⅠ和PacⅠ消化所得到的1860nt扩增子，并连接到已用二种同样酶切成线性的pDM181上。将构建物导入大肠杆菌并用菌落杂交法筛选所得菌落，以鉴定含有葡聚糖酶编码区的细胞。根据筛选结果选择出质粒pJW111(图8)。测定pJW111中***片段的序列证明，该片段为葡聚糖酶基因，并且该序列完全相同于pToC343中葡聚糖酶基因的序列。

毒性镰孢的转化

按下述方法将质粒pJW111导入镰孢A3/5(ATCC20334)的形态学突变体(定名为CC1-3)中：

28℃下，在孢子形成培养基中将菌株ATCC 20334 CC1-3以150rpm培养2-4天，以产生分生孢子。通过Miracloth过滤分生孢子、离心浓缩并重新悬浮于无菌水中。用10⁸分生孢子接种50ml YPG培养基，并于24℃以150rpm保温14小时。将所得的菌丝重新悬浮于20mlNOVOZYM 234溶液(2.5mg/ml，在1.0MMgSO₄中)并于28℃,80rpm消化15-45分钟。加入30ml STC并离心(1500rpm,SorvallRT 6000离心机)10分钟以沉淀原生质体。重复两次STC洗涤步骤。以每毫升约5×10⁷原生质体的浓度将其悬浮于STC∶SPTC∶DMSO(8∶2∶0.1)中。

向200ml原生质体中加入质粒DNA(2-20mg)并在冰上保温30分钟。缓慢加入2ml SPTC，然后在室温下保温20分钟。向转化反应混合物中加入50ml在40℃下熔融的覆盖层(1×Vogel氏盐、25mMNaNO₃、0.8M蔗糖、1％低熔点琼脂糖)。颠倒混合样品并分加于两个空的156mm培养皿内。24小时后向各平板内加入25ml覆盖层+10ml/ml Bastar。在室温下保温平板。

葡聚糖酶活性的表达

将16个转化体移入Vogel’s/Bastar中并在室温下培养7天。用得自Vogel’s/Bastar平板的1cm²菌丝体片接种装在125ml烧瓶中的20mlM400 Da培养基。30℃下将培养物以150rpm保温7天。离心培养物样品并检测上清液中的葡聚糖酶(按上述方法)。用葡聚糖酶活性检测法和SDS-PAGE分析法选择最好的生产转化株。在10-27％梯度Tris-甘氨酸凝胶上，葡聚糖酶在大约60kD处显示有电泳带。

N末端序列分析表明，毒性镰孢中表达的葡聚糖酶100％被正确加工成Asn-Gln-Ala-Leu-；相反，由米曲霉产生的葡聚糖酶中有40％被不正确地加工成N末端序列为Asp-Gln-Gln-Asn-Gln-Ala-Leu-的产物。序列表

(1)一般信息：

(ⅰ)申请人：

(A)名称：Novo Nordisk A/S

(B)街道：Novo Alle

(C)城市：Bagsvaerd

(E)国家：丹麦

(F)邮政编码(ZIP):DK-2880

(G)电话：+45 4444 8888

(H)传真：+45 4449 3256

(ⅱ)发明名称：具有葡聚糖酶活性的重组酶

(ⅲ)序列数：24

(ⅳ)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC可兼容

(C)操作***：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release #1.0,Version#1.30(EPO)

(2)SEQ ID NO:1的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：2993个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅵ)来源：

(C)单个分离物：淡紫拟青霉

(ⅸ)特征：

(A)名称/键：CDS

(B)定位：875…2701

(ⅸ)特征：

(A)名称/键：信号肽

(B)定位：875…958

(ⅸ)特征：

(A)名称/键：成熟肽

(B)定位：959…2701

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:GACGACCATG ACAGGTGTCG CACAACAGGA ACAATCAGGA CCCTGATACG GCCATAAGGT 60GAAACACCCC CTTGATGACA ACGGGAAGAA ACAGCTGGTC CGTATGTTCT AGACAATTCA 120AAGACACATC TTCCCCTCCC TGTCCATGAC ACTGTGGTAG GACGATGACA CCGATGCATG 180ATCATGAAAG GACAATGAAC ATGGGCGATC GATTTAGCTG ACATGAAGTG TAGCGAAGAC 240AAGTGCCTCC GTGTTTCGTA GATCGAGACC AGAGTGGTGG CAATTGCTCC GGCTCCAACC 300CGATCCAGAG ATGGGCCGAG TATAACTGAT ATGCGCCCGC TTTCGTTAGA CTGCGCATGG 360AGCTGTGGCA CATCGTCGTC CAGACCAAGG AAGACTAGCA ATGGTTTGGC CGCTGTGTGA 420GCCACGTTCG TTTTACATCC AACTGCCGCC GGCCCCCCGT GGGGTAACAA GGCGGAGGCG 480TGGGGTAACC GGGCGGTTCC CGTTCTGAGT AATACGCCTT CTGATTGTGC CAATCTGGAG 540CGGTGGTCGC TGCAGGGGGA TGGCCCTTCT AACTTCTTTC TTTTAAGCTT ATGAAACTAG 600GCCAGGTGGT GGCTGTGGCA AGTCTCAACA GCGCCATAGA TTGAATCAGA CATGGACCCC 660CCGCAACATG TGTCCCGCCC CAGAACTCCT GCGTCTTCGG TCCTCTCCCG GGAAGAGAGT 720GCGCCGTCAC CAAGGCTATA AATACTTGGG GTATGTTAGC ATAGTCTCGA AATGATATCC 780CATTTCAATC TTTACTGGTC CATCTCTAAA GGCATACACA CAGTGAGGCT GATTTTCGGC 840CATTGTCCTG TACACTTACC TGTCAAGCGG CATC ATG CGT TGG CCT GGT AAT 892

Met Arg Trp Pro Gly Asn

-28 -25TTT CTC ACT CTC GCG ACG GCG CTG CAA GCT GCT GGG AAC CTC GCC GCA 940Phe Leu Thr Leu Ala Thr Ala Leu Gln Ala Ala Gly Asn Leu Ala Ala

-20 -15 -10AGC GTC CAT CAC AGG TGT GAT CAG CAG AAT CAA GCG CTA CAC ACA TGG 988Ser Val His His Arg Cys Asp Gln Gln Asn Gln Ala Leu His Thr Trp

-5 1 5 10TGG CAC GAA AAG TCT GCT GTC AAC GAC GCG GGG GCT GTC GCA GCA GAT 1036Trp His Glu Lys Ser Ala Val Asn Asp Ala Gly Ala Val Ala Ala Asp

15 20 25GAA GTT CGC CAA TCG CGC AAG TAC GAT GTC TCT GTG TCC GTT CGC GAA 1084Glu Val Arg Gln Ser Arg Lys Tyr Asp Val Ser Val Ser Val Arg Glu

30 35 40GAA TCC AAA TTC CGG GAC TCG TTT GTC TAC GAG ACC ATC CCG CGG AAC 1132Glu Ser Lys Phe Arg Asp Ser Phe Val Tyr Glu Thr Ile Pro Arg Asn

45 50 55GGC AAC GGC AAG ATG TAC GAC CCG GCC AAT CCT GGT CAG GAA TAC AAC 1180Gly Asn Gly Lys Met Tyr Asp Pro Ala Asn Pro Gly Gln Glu Tyr Asn

60 65 70CTG GCG GAC GGG GAT GGC ATC ACC GTC GAA GAG GAC GCA AAG ATC AAC 1228Leu Ala Asp Gly Asp Gly Ile Thr Val Glu Glu Asp Ala Lys Ile Asn75 80 85 90ATG GCT TGG ACG CAG TTT CAA TAC GCC AAA GAT GTT GAA GTT CGC ATC 1276Met Ala Trp Thr Gln Phe Gln Tyr Ala Lys Asp Val Glu Val Arg Ile

95 100 105ACC TCC AAG GAT GGT TCT GCA CTG GGG CCA ACT AGC AAC GTT GTC ATC 1324Thr Ser Lys Asp Gly Ser Ala Leu Gly Pro Thr Ser Asn Val Val Ile

110 115 120CGC CCC TCG GAT ATC AGG TAC GAC ATC AGA AGC CCA GAC AGC AGC ACT 1372Arg Pro Ser Asp Ile Arg Tyr Asp Ile Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr

125 130 135GTT ATA ATC CAG GTT CCA TAC GAC CTG AGG GGC CGA CGA TTC TCC GTC 1420Val Ile Ile Gln Val Pro Tyr Asp Leu Arg Gly Arg Arg Phe Ser Val

140 145 150GAG TTC CAA AAC GAC TTA TAC GCC TAC CGC TCG AAC GGC AAA TCA TAT 1468Glu Phe Gln Asn Asp Leu Tyr Ala Tyr Arg Ser Asn Gly Lys Ser Tyr155 160 165 170GTC AAT GAC GGC GGC GTT CTC GTG AGC GAG GAA CCG CGC AAT GCG CTG 1516Val Asn Asp Gly Gly Val Leu Val Ser Glu Glu Pro Arg Asn Ala Leu

175 180 185CTT ATC TTC GCC AGT CCA TTC ATT CCC CAG GAA CTC ATC CCG TCC AAG 1564Leu Ile Phe Ala Ser Pro Phe Ile Pro Gln Glu Leu Ile Pro Ser Lys

190 195 200ACA TCA GGC GAT ACG CAA GTC CTC AAG CCG GGC AAG ATC ACC GAC AGC 1612Thr Ser Gly Asp Thr Gln Val Leu Lys Pro Gly Lys Ile Thr Asp Ser

205 210 215ACC ATT GGC GCG AAG CCG ACA CTC TAC TTT GAG GCA GGC ACC TAC TGG 1660Thr Ile Gly Ala Lys Pro Thr Leu Tyr Phe Glu Ala Gly Thr Tyr Trp

220 225 230GTA GAG AAA GAC GGC CGC CTC GGT AAA AGT CAC ATC AAG CTG AAC GCC 1708Val Glu Lys Asp Gly Arg Leu Gly Lys Ser His Ile Lys Leu Asn Ala235 240 245 250AAC ACG CAC TAC GTC TAC TTC GAG CCA GGA ACT TAT ATC AAA GGC GCC 1756Asn Thr His Tyr Val Tyr Phe Glu Pro Gly Thr Tyr Ile Lys Gly Ala

255 260 265TTT GAG TAC ACC ACT TCG AAG AAT GAC TTT TAT ACC GTC GGA CAT GGA 1804phe Glu Tyr Thr Thr Ser Lys Asn Asp Phe Tyr Thr Val Gly His Gly

270 275 280GTA GTC TCG GGC GAA AAT TAC GCA TAC ATG GCA AAC ACT GCC AAG AAC 1852Val Val Ser Gly Glu Asn Tyr Ala Tyr Met Ala Asn Thr Ala Lys Asn

285 290 295TAT GTT GCG GAA AAG AGT GAC CGG ACC AGT CTT AGG ATC TTT TCG CAC 1900Tyr Val Ala Glu Lys Ser Asp Arg Thr Ser Leu Arg Ile Phe Ser His

300 305 310CAG GCA GTT TCG GAC AGC CAG ATA TGG CAT TGC ATT GGA CCT ACC CTT 1948Gln Ala Val Ser Asp Ser Gln Ile Trp His Cys Ile Gly Pro Thr Leu315 320 325 330AAT GCA CCG CCC TTT AAT ACC GTG GAC CTG TTT CCA AAG AAC CAG ACG 1996Ash Ala Pro Pro Phe Asn Thr Val Asp Leu Phe Pro Lys Asn Gln Thr

335 340 345CCA AAC GAG GAA GAC AAC AAG GTG CGG AAC GAC ATC TCT GAC TAC AAA 2044Pro Asn Glu Glu Asp Asn Lys Val Arg Asn Asp Ile Ser Asp Tyr Lys

350 355 360CAG GTC GGC GCG TTC TAC TTC CAG ACT GAT GGG CCG CAA ATA TAC TCT 2092Gln Val Gly Ala Phe Tyr Phe Gln Thr Asp Gly Pro Gln Ile Tyr Ser

365 370 375GGA ACC GTC AAG GAC TGC TTC TGG CAT GTT AAT GAC GAC GCT ATC AAG 2140Gly Thr Val Lys Asp Cys Phe Trp His Val Asn Asp Asp Ala Ile Lys

380 385 390TTG TAC CAC TCG GAC GCG AAG GTC GAA CGG GTG ACC ATC TGG AAG TGT 2188Leu Tyr His Ser Asp Ala Lys Val Glu Arg Val Thr Ile Trp Lys Cys395 400 405 410CAC AAC GAC CCC GTT ATC CAA ATG GGC TGG AAA CCA CGT GGA GTC TCT 2236His Ash Asp Pro Val Ile Gln Met Gly Trp Lys Pro Arg Gly Val Ser

415 420 425GGA ACT ACC ATT TCT GAA CTC AAG GTC ATC CAC ACT CGA TGG TTT AAG 2284Gly Thr Thr Ile Ser Glu Leu Lys Val Ile His Thr Arg Trp Phe Lys

430 435 440AGC GAG ACG GTT GTT CCT TCC GCC ATT ATT GGA GCC TCA CCC TAC TAC 2332Ser Glu Thr Val Val Pro Ser Ala Ile Ile Gly Ala Ser Pro Tyr Tyr

445 450 455GGC GAC CCA AAG ATT GTG GAT GCG TCT AGG ACA ATG AGC GTT CGA ATT 2380Gly Asp Pro Lys Ile Val Asp Ala Ser Arg Thr Met Ser Val Arg Ile

460 465 470TCT GAC GTG ACC TGC GAA GGT CGT TGC CCT GCG CTC CTT CGG ATT GGT 2428Ser Asp Val Thr Cys Glu Gly Arg Cys Pro Ala Leu Leu Arg Ile Gly475 480 485 490CCG CTC CAG AAT TAT GAC ATG ACC ATT GAG AAC GTG AAA TTC GAT GAA 2476Pro Leu Gln Asn Tyr Asp Met Thr Ile Glu Asn Val Lys Phe Asp Glu

495 500 505CTT TTG AGG GAT GAC AAC GTC AAG CTA GGA CAG AGT CTG GTT GGT ATG 2524Leu Leu Arg Asp Asp Asn Val Lys Leu Gly Gln Ser Leu Val Gly Met

510 515 520AGG ATC AGC GAC CAA GAG GAC GCC TAC ATA CCC GGC CAA GAA AAG CTC 2572Arg Ile Ser Asp Gln Glu Asp Ala Tyr Ile Pro Gly Gln Glu Lys Leu

525 530 535AAG CTA GGG ATA CAT ATC AAG AAT TGG CAG ATT GGG GGC AAC AGA GTG 2620Lys Leu Gly Ile His Ile Lys Asn Trp Gln Ile Gly Gly Asn Arg Val

540 545 550GAT GGA TCA AAC TGG CAA GTC AAC CAA CTT GGG CAG TTG AAC ATC CAC 2668Asp Gly Ser Asn Trp Gln Val Asn Gln Leu Gly Gln Leu Asn Ile His555 560 565 570CCC GAT TAT TGG GGT GAC TGG AGC ATT GAA TGA GGCAGGCTAC CAGAGGATAC 2721Pro Asp Tyr Trp Gly Asp Trp Ser Ile Glu *

575 580GTGTGTTTCC GTGTTGGCGC ACTTCCAAAC CCATCACGCC GACTGTTTCA ATTCTTCGCA 2781TCCAGAAGGA TGCTGCGGCG TCTGCCGCAA TCTGTATGTC CTACTTCAAT GGAGAAATGA 2841TTATCGAAAA ACCAGACCTC ACCAAAGAAA GTGCACGTGG TTAACTAGGG ACATGAGATG 2901CCCGACACTG TAGACTCTGC TCATCAAGAT AATCCTTCTT GCACAGCGCT GATAACGTGA 2961TGGCGCCCAG TACGTGTAGG GGCATCCGAG TC 2993(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：609个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Met Arg Trp Pro Gly Asn Phe Leu Thr Leu Ala Thr Ala Leu Gln Ala-28 -25 -20 -15Ala Gly Asn Leu Ala Ala Ser Val His His Arg Cys Asp Gln Gln Asn

-10 -5 1Gln Ala Leu His Thr Trp Trp His Glu Lys Ser Ala Val Asn Asp Ala5 10 15 20Gly Ala Val Ala Ala Asp Glu Val Arg Gln Ser Arg Lys Tyr Asp Val

25 30 35Ser Val Ser Val Arg Glu Glu Ser Lys Phe Arg Asp Ser Phe Val Tyr

40 45 50Glu Thr Ile Pro Arg Asn Gly Asn Gly Lys Met Tyr Asp Pro Ala Asn

55 60 65Pro Gly Gln Glu Tyr Asn Leu Ala Asp Gly Asp Gly Ile Thr Val Glu

70 75 80Glu Asp Ala Lys Ile Asn Met Ala Trp Thr Gln Phe Gln Tyr Ala Lys85 90 95 100Asp Val Glu Val Arg Ile Thr Ser Lys Asp Gly Ser Ala Leu Gly Pro

105 110 115Thr Ser Asn Val Val Ile Arg Pro Ser Asp Ile Arg Tyr Asp Ile Arg

120 125 130Ser Pro Asp Ser Ser Thr Val Ile Ile Gln Val Pro Tyr Asp Leu Arg

135 140 145Gly Arg Arg Phe Ser Val Glu Phe Gln Asn Asp Leu Tyr Ala Tyr Arg

150 155 160Ser Asn Gly Lys Ser Tyr Val Asn Asp Gly Gly Val Leu Val Ser Glu165 170 175 180Glu Pro Arg Asn Ala Leu Leu Ile Phe Ala Ser Pro Phe Ile Pro Gln

185 190 195Glu Leu Ile Pro Ser Lys Thr Ser Gly Asp Thr Gln Val Leu Lys Pro

200 205 210Gly Lys Ile Thr Asp Ser Thr Ile Gly Ala Lys Pro Thr Leu Tyr Phe

215 220 225Glu Ala Gly Thr Tyr Trp Val Glu Lys Asp Gly Arg Leu Gly Lys Ser

230 235 240His Ile Lys Leu Asn Ala Asn Thr His Tyr Val Tyr Phe Glu Pro Gly245 250 255 260Thr Tyr Ile Lys Gly Ala Phe Glu Tyr Thr Thr Ser Lys Asn Asp Phe

265 270 275Tyr Thr Val Gly His Gly Val Val Ser Gly Glu Asn Tyr Ala Tyr Met

280 285 290Ala Asn Thr Ala Lys Asn Tyr Val Ala Glu Lys Ser Asp Arg Thr Ser

295 300 305Leu Arg Ile Phe Ser His Gln Ala Val Ser Asp Ser Gln Ile Trp His

310 315 320Cys Ile Gly Pro Thr Leu Asn Ala Pro Pro Phe Asn Thr Val Asp Leu325 330 335 340Phe Pro Lys Asn Gln Thr Pro Asn Glu Glu Asp Asn Lys Val Arg Asn

345 350 355Asp Ile Ser Asp Tyr Lys Gln Val Gly Ala Phe Tyr Phe Gln Thr Asp

360 365 370Gly Pro Gln Ile Tyr Ser Gly Thr Val Lys Asp Cys Phe Trp His Val

375 380 385Asn Asp Asp Ala Ile Lys Leu Tyr His Ser Asp Ala Lys Val Glu Arg

390 395 400Val Thr Ile Trp Lys Cys His Asn Asp Pro Val Ile Gln Met Gly Trp405 410 415 420Lys Pro Arg Gly Val Ser Gly Thr Thr Ile Ser Glu Leu Lys Val Ile

425 430 435His Thr Arg Trp Phe Lys Ser Glu Thr Val Val Pro Ser Ala Ile Ile

440 445 450Gly Ala Ser Pro Tyr Tyr Gly Asp Pro Lys Ile Val Asp Ala Ser Arg

455 460 465Thr Met Ser Val Arg Ile Ser Asp Val Thr Cys Glu Gly Arg Cys Pro

470 475 480Ala Leu Leu Arg Ile Gly Pro Leu Gln Asn Tyr Asp Met Thr Ile Glu485 490 495 500Asn Val Lys Phe Asp Glu Leu Leu Arg Asp Asp Asn Val Lys Leu Gly

505 510 515Gln Ser Leu Val Gly Met Arg Ile Ser Asp Gln Glu Asp Ala Tyr Ile

520 525 530Pro Gly Gln Glu Lys Leu Lys Leu Gly Ile His Ile Lys Asn Trp Gln

535 540 545Ile Gly Gly Asn Arg Val Asp Gly Ser Asn Trp Gln Val Asn Gln Leu

550 555 560Gly Gln Leu Asn Ile His Pro Asp Tyr Trp Gly Asp Trp Ser Ile Glu565 570 575 580(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：15个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅴ)片段类型：N末端(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:Asp Gln Gln Asn Gln Ala Leu His Thr Trp Trp His Glu Lys Ser1 5 10 15(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：28个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽1(ⅴ)片段类型：N末端(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:Ser Tyr Val Asn Asp Gly Gly Val Leu Val Ser Glu Glu Pro Arg Asn1 5 10 15Ala Leu Leu ILe Phe Ala Ser Pro Phe Ile Pro Gln20 25(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：23个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽2(ⅴ)片段类型：N末端(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:Ser Asp Arg Thr Ser Leu Arg Ile Phe Ser His Gln Ala Val Ser Asp Ser Gln1 5 10 15Ile Trp His Xaa Ile20(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：24个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽3(ⅴ)片段类型：N末端(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:Asn Asp Phe Tyr Thr Val Gly His Gly Val Val Ser Gly Glu Asn Tyr1 5 10 15Ala Tyr Met Ala Asn Thr Ala Lys20(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：12个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽4(ⅴ)片段类型：N末端(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:Ile Asn Ala Ala Trp Thr Gln Phe Gln Tyr Ala Lys1 5 10(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅱ)序列特征：(A)长度：26个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽5(ⅴ)片段类型：N末端(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8:Asp Gly Ser Ala Leu Gly Pro Thr Ser Asn Val Val Ile Arg Pro Ser1 5 10 15Asp Ile Arg Tyr Asp Ile Ser Ser Pro Asp20 25(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：18个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽6(ⅴ)片段类型：N末端(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9:Asn Trp Gln Ile Gly Gly Asn Arg Val Asp Gly Ser Asn Trp Gln Val Asn Gln1 5 10 15(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：19个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽7(ⅴ)片段类型：N末端(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10:Ser Glu Thr Val Val Pro Ser Ala Ile Ile Gly Ala Ser Pro Tyr Tyr1 5 10 15Gly Asp Pro(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：17个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽8(ⅴ)片段类型：N末端(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11:Leu Asx Ala Asx Thr His Tyr Val Tyr Phe Glu Pro Gly Thr Tyr Ile LysI 5 10 15(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：7个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽9(ⅴ)片段类型：N末端(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12:(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：19个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽10(ⅴ)片段类型：N末端(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:13:Ser Ala Val Asn Asp Ala Gly Ala Val Ala Ala Asp Glu Val Arg Gln1 5 10 15Ser Asg Lys(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：12个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽11(ⅴ)片段类型：N末端(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:14:Xaa His Asn Asp Pro Val Ile Gln Met Gly Xaa Lys1 5 10(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：20个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc=“引物8001”(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:15:GA(A/G)AA(T/C)TA(T/C)G C(T/C/G/A)TA(T/C)ATGGC 20(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：19个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc=“引物8002”GCCAT(G/A)TA(G/A/T/C)GC (A/G)TA(G/A)TT(T/C)TC 19(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：20个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc=“引物8003”TGGAC(A/G/T/C)CA(A/G)T T(T/C)CA(A/G)TA(T/C)GC 20(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：19个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc=“引物8004”GC(A/G)TA(T/C)TG(A/G)A A(T/C)TG(A/G/T/C)GTCC 19(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：17个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc=“引物8005”AA(T/C)TGGCA(A/G)A T(T/C/A)GG(A/G/T/C)GG 17(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：17个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc=“引物8006”CC(A/G/T/C)CC(T/A/G)TA(T/C)T GCCA(A/G)TT 17(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：21个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc=“引物”AGAAATCGGG TATCCTTTCA G 21(2)SEQ ID NO:22的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：105个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc=“引物”GCTCCTCATG GTGGATCCCC AGTTGTGTAT ATAGAGGATT GAGGAAGGAA GAGAAGTGTG 60GATAGAGGTA AATTGAGTTG GAAACTCCAA GCATGGCATC CTTGC 105(2)SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：34个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc=“引物8864”CGCGGATCCA CCATGCGTTG GCCTGGTAAT TTTC 34(2)SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：29个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc=“引物8867”CCGCTCGAGC CTGCCTCATT CAATGCTCC 29(2)SEQ ID NO:25的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：25个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc=“引物o-dexSwaⅠ”GCATTTAAAT ATG CGT TGG CCT GGT 25(2)SEQ ID NO:26的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：28个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc=“引物o-dexPacⅠ”CGTTAAT TAA TCA TTC AAT GCT CCA GTC 28

Claims

1．DNA构建物，该构建物包含编码显示葡聚糖酶活性的酶的DNA序列，所说的DNA序列包括：

b)a)中所限定的DNA序列的类似物，该类似物

2．根据权利要求1的DNA构建物，其中DNA序列可得自真菌微生物，例如丝状真菌或酵母。

3．根据权利要求2的DNA构建物，其中DNA序列可得自拟青霉属，例如淡紫拟青霉的菌株，可得自青霉属，例如薄青霉或P.mimoluteum的菌株。

4．根据权利要求3的DNA构建物，其中DNA序列是从淡紫拟青霉的核酸文库中分离的或基于该文库产生的。

5．含有根据权利要求1至4中任一项的DNA构建物的重组表达载体。

6．含有根据权利要求1至4中任一项的DNA构建物或根据权利要求5的重组表达载体的细胞。

7．根据权利要求6的细胞，其为丝状真菌。

8．根据权利要求7的细胞，其中细胞属于曲霉属的菌株，特别是黑曲霉或米曲霉的菌株，或镰孢属的菌株，例如尖镰孢、禾木科镰孢、硫磺镰孢、五谷镰孢或毒性镰孢的菌株，或青霉属的菌株，例如薄青霉或P.minioluteum的菌株，或拟青霉属例如淡紫拟青霉的菌株。

9．生产表现有葡聚糖酶活性的重组酶的方法，该方法包括在允许表达根据权利要求1至4中任一项的DNA构建物或根据权利要求5的表达载体的条件下，在适当的培养基中培养根据权利要求6至8中任一项的宿主细胞，并从培养物中回收酶。

10．具有由权利要求1至4中任一项的DNA构建物编码的葡聚糖酶活性的重组酶。

11．按照权利要求9的方法生产的重组酶。

12．含有根据权利要求10或11的重组葡聚糖酶的组合物。

13．含有根据权利要求10或11的酶，或根据权利要求12的组合物，并进一步含有常规用于口腔保键产品中的成分的口腔保健产品。

14．根据权利要求13的口腔保健产品是洁齿剂，例如牙膏、牙粉或漱口液。

15．根据权利要求13和14任一项的口腔保健产品进一步包含选自齿斑葡聚糖酶、氧化酶、过氧化物酶、卤过氧化物酶、漆酶、蛋白酶、内切葡糖苷酶、脂酶、淀粉酶、抗微生物酶和其混合物的酶活性。

16．根据权利要求10或11的重组葡聚糖酶或根据权利要求12的组合物或根据权利要求13和14的口腔保健产品用于预防齿斑形成或去除齿斑。

17．根据权利要求10或11的重组葡聚糖酶或根据要求12的组合物用于水解糖汁或糖浆。

18．根据权利要求10或11的重组葡聚糖酶或根据要求12的组合物或根据权利要求13和14的口腔保健组合物用于动物的口腔保健产品中。

19．根据权利要求10和11的重组葡聚糖酶或权利要求12的组合物用于食物、饲料和/或宠物食品中。