CN1225640A - 与霍奇金病相关的分子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明描述了与霍奇金病特异性相关的分子的鉴定和分离。还描述了该分子的应用。

Description

与霍奇金病相关的分子及其应用

相关申请

本申请是1996年5月10日申请的系列号08/644,116的部分继续申请，后者是1996年1月3日申请的系列号08/580,980的部分继续申请，而系列号08/580,980又是1995年6月7日申请的申请系列号08/479,328的部分继续申请，两者均是未决申请，并作为参考文献引用。

发明领域

本发明涉及鉴定感兴趣的分子的方法。在特别优选的实施方案中，本发明涉及鉴定与病理学状态，如癌症(黑色素瘤或肾癌等)、霍奇金病、自体免疫疾病等相关的分子。本发明还有一部分内容是作为本发明方法的结果而发现的分离的分子，如提供的肽。特别是这些分子包括含有蛋白质的分子、编码它们的分离的核酸分子，以及特异性地结合至含蛋白质的分子的抗体。为方便起见，本文描述的方法称为“血清学钓取法”。

背景和现有技术

现已相当好地确立了以某些分子的不合适的表达来鉴定许多病理学症状，如感染、癌症、自体免疫疾病等。因此，这些分子用作特定病理学或异常状态的“标记”。除了其作为诊断“靶”(即，待鉴定以诊断这些异常状态的物质)的应用外，这些分子用作可用于产生诊断和/或治疗试剂的制剂。其非限制性例子是用作癌症标记以产生对特定标记特异性的抗体。另一个非限制性例子是使用与MHC分子复合的肽以产生抗异常细胞的溶胞性T细胞。

当然，这些物质的制备需要用于产生这些物质的试剂来源。从细胞提纯是一个费力的、方法不确定的过程。而另一优选的方法是分离编码特定标记的核酸分子，接着使用分离的编码分子来表达所需分子。

至今，采用两种方法来检测例如人肿瘤中的该抗原。它们可称为遗传学方法和生化方法。遗传学方法的例子是，例如，作为参考文献引用的DePlaen等，美国科学院院刊85:2275(1988)。在该方法中，将几百组肿瘤cDNA文库的质粒转染进受体细胞，如COS细胞，或转染进试验特异性抗原表达时为抗原阴性的肿瘤细胞系变异体。生化方法举例为，例如，作为参考文献引用的Falk等，自然351:290(1991)，和Kawakami等，自然，369:69(1994)，它们以酸洗脱结合于肿瘤细胞MHC-I分子上的肽，随后进行反相高效液相色谱(R-HPLC)为基础。抗原性肽在结合到突变的细胞系空出的MHC-I分子上后被鉴定，其中该细胞系在抗原加工及诱导溶胞性T-淋巴细胞的特异性反应方面有缺陷。这些反应包括CTL增生，TNF释放和在MTT试验或⁵¹Cr释放试验中可测量的靶细胞裂解。

这两种限定抗原分子的方法具有如下缺陷：首先，它们极不方便，且耗时和昂贵；其次，它们依赖于预先限定特异性的溶胞性T细胞系(CTLs)的建立：第三，其与所述病理学或疾病过程的体内相关性尚未证实，因为不同CTL不仅可从具有不同疾病的病人中获得，而且也能从依赖于其T细胞库的健康个体中获得。

用于鉴定和限定抗原分子的两种已知的方法中固有的问题由至今这两种方法仅成功地限定了人肿瘤中的极少数新抗原这一事实得到了最好的证实。例如，参见，van der Bruggen等，科学254:1643-1647(1991)；Brichard等，实验医学杂志，178:489-495(1993)；Coulie等，实验医学杂志180:35-42(1994),Kawakami等，美国科学院院刊91:3515-3519(1994)。

因此，需要获得一种方法，它不仅可用于检测肿瘤相关性抗原，而且可用于确定与任何异常或病理学状态相联系的分子。该方法也可帮助鉴定该分子，从而使其能用于产生例如抗体，溶胞性T细胞等。

因此，本发明的目的是开发用于人组织，特别是肿瘤细胞中抗原的简单检测和分子鉴定的方法和试剂，它用于疾病的分子诊断和/或用于感染性，自体免疫和恶性疾病的免疫治疗和基因治疗。本发明在下面说明书中进行描述。

附图的简要描述

图1显示了本发明方法的原理。

图2显示了具有与1∶100稀释的病人血清反应的来自肾细胞透明癌(clear carcinoma)cDNA的阳性克隆的硝酸纤维素膜。

图3以线段图形显示了肾细胞癌、正常肾和其它人组织中克隆HOM-RCC-313的Northern印迹分析。

图4显示了编码HOM-RCC-313的基因的翻译区。也见SEQ IDNO:4。

优选实施方案的详细描述

下面的说明书描述了称为血清学钓取的方法。其中，细胞样品取自患有病理学症状的受试者。优选细胞是病理学的例子。例如，如果受试者具有黑色素瘤，则该细胞是黑色素瘤细胞。如果受试者患有神经性疾病，那么，例如该细胞优选是患病细胞的样品。这一方法是合理的，因为患病细胞最有可能是感兴趣的含蛋白质的分子，即，与感兴趣的病理学状态特异性相关的分子的最佳来源。

应注意病理学症状的代表性细胞不仅是可用于本发明方法的细胞。这对于，例如，确定与诸如细胞分化和成熟相联系的那些细胞“标记”是非常重要的。可想到的是造血干细胞的例子。同样，本发明包含，例如，特异性配体的受体分子的分离。事实上，可使用该方法测定任何感兴趣的分子的存在。

然后，使用选定的细胞制备互补DNA(即，“cDNA”)的文库。该方法是本领域的技术人员熟知的，在此不必重复。当然，它以已确定的事实为基础，即，如果该细胞表达蛋白质，那么，一定存在信使RNA(mRNA)。这些mRNA分子寿命不长且不稳定。因此用其作研究不实际。当使用cDNA时给分子带来的稳定性极有助于该方法。

一旦制备了cDNA，可用它构建载体文库。简单地说，例如，经过切割和剪接处理载体以接受cDNA分子。载体的选择可变化，本领域的技术人员对许多这种例子非常熟悉。

特别优选的是以病毒为基础的载体。在真核细胞的情况下，优选以逆转录病毒或腺病毒为基础的载体。该载体含有全部或部分病毒基因组，如长末端重复(“LTR”)，启动子(例如CMV启动子，SV40启动子，RSV启动子)，增强子等。当宿主细胞是原核细胞时，那么优选细菌病毒，即，噬菌体。该载体的例子是以，例如，入噬菌体为基础的载体。在任何情况下，载体可含有超过一种病毒的元件。

将所得的载体转染或转化进宿主细胞，该宿主细胞可以是真核或原核的。

正常情况下用于转染或转化的任何细胞可用于该方法。优选的材料包括大肠杆菌菌株，CHO细胞，如CHO-1,COS细胞，如COS-7等。同样，酵母细胞，例如，糖酵母属菌株，假单胞菌属菌株，如铜绿假单胞菌，芽孢杆菌属细胞，熟知的昆虫宿主细胞单地贪夜蛾等均可使用。

一旦受体细胞接受了载体，可培养该细胞以便表达含外源蛋白质的分子。本文使用了“含蛋白质的”，因为尽管原核细胞仅表达蛋白质，但真核细胞具有翻译后修饰蛋白质以产生例如糖蛋白、脂蛋白等的能力是熟知的。还应记住本文所用的含蛋白质也包括肽，如由MHC分子提供的肽。

下面描述的方法与上述方法独立进行，且在本发明的两个方面之间没有时序关系。

在诸如癌症和例如身体免疫疾病的病理学情况中，有一些针对与病理学相关的分子的免疫反应。该反应可包括抗体反应、B细胞增生、特异性T细胞亚群体的增生、细胞因子生产增加等。与该反应相关的分子和细胞可在受试者体液中发现，如在其血清中。免疫效应器与感兴趣的分子发生反应，不管该分子是经重组还是自体产生的。问题是需要发现它们。正如实施例所示，这以独特的方式进行。首先，体液或其它感兴趣的样品与用于转染或转化的相同宿主细胞的样品反应。在第一步中，宿主细胞不被转染或转化。其效果是去掉对宿主细胞特异性的非靶向分子的任何免疫原结合配偶体。这一步骤是必要的，因为正如上文所指出的，宿主细胞可以是受试者对其在一些位点形成免疫反应的细胞。第一步剥离去掉了这些免疫成分。

然后进行第二步剥离步骤。在该步骤中，将前面的剥离样品与用缺乏受试者cDNA的载体转染或转化的与上述相同的宿主细胞的样品反应。第二步剥离步骤的原因是由本发明人之一所做的观察且在以前的文献中未见报道。用作载体的物质，如噬菌体、病毒等是有用的，因为在天然状态下它们可感染细胞。因此，寄生在人小肠的大肠杆菌可被λ噬菌体感染。以前尚未认识到对大肠杆菌的免疫反应包括对这些感染原的反应。因此，申请人经过进行二个剥离步骤令人惊奇地获得了将干扰免疫成分消除到前所未有的程度的能力。如上所述，第一步是针对未转染或未转化的宿主细胞。第二步是针对用不带cDNA的载体转染或转化的宿主细胞，其中该载体在免疫学上相当于上文所述用于携带cDNA的载体。

特别优选的是使用许多相似但不相同的程序进行各剥离步骤。例如下面的实验演示了在固相柱上吸附，然后吸附在硝酸纤维纸上的方法。至于为什么使用两种相似但不相同的方案会产生本文所述的结果，申请人不希望受任何理论的约束。在下文中应记住，本文使用的无论何处出现的“接触样品”，它不应局限于仅指一个接触步骤，而是可指一个以上的步骤，优选设计成从所研究的样品中去掉干扰结合的配偶体的不同接触方案。

应明白这些剥离步骤可完全独立于用于制备cDNA文库的步骤进行。例如，如果在第“0”天进行对抗原的试验，则可前一天，前一周等进行样品的剥离。也可贮存来自供体或受试者的剥离样品以备将来使用。

使用的样品优选是血清，但也不必如此。可如此使用含免疫原结合配偶体的任何样品。

在该方法的下一步中，将携带cDNA并表达异源性蛋白质的裂解的转染细胞与两次剥离后的样品接触。该样品应仅含对异源性蛋白质特异性的免疫成分，且应结合于其上。如果细胞裂解物已经过，例如，与活化的滤纸、固相柱等接触而固定则有助于该结合，但该固相结合不是必需的，因为本领域的技术人员将会很明确地认识到可利用许多不同形式的试验来鉴定感兴趣的分子。

一旦免疫成分结合到靶分子上，需要，但并非必需进行另一步骤。该另一步骤涉及使用第一免疫成分的一些结合配偶体，如携带可鉴定标记的抗-IgG。该标记可以是染料、酶、金粒、放射性标记或用于免疫测定的任一标准标记。

一旦完成鉴定，可去掉免疫成分，留下靶分子。然后使用本领域的任意标准方法研究靶分子。

技术人员应注意到该方法也导致结合于感兴趣的分子上的免疫成分的分离。因此，在本发明的另一方面，也可分离抗体，例如，特异性地结合感兴趣的分子的配偶体的抗体。

按本发明可鉴定和分离的另一免疫成分是溶胞性T细胞(下文称为“CTL”)，它对鉴定的分子产生的肽的复合物和与这些肽结合形成复合物的MHC分子具有特异性。普遍接受的是CTL反应涉及以循环T细胞表面的T细胞受体(“TCR”)鉴定MHC分子和肽复合物，该肽一般是大约8-12个氨基酸长，但最优选9或10个氨基酸长。TCR经过与这些复合物结合而进行反应，当被“调动”时，它是一系列的反应，包括对这些复合物特异性的CTL的增生。使用本发明的方法，加上其它步骤可生产和/或分离该CTL。

正如在下面实施例以及在一般描述中所指出的，人们可较容易地鉴定编码感兴趣的抗原的cDNA。一旦鉴定了该cDNA，可用它转染宿主细胞，该细胞或者在其表面已存在所需的MHC分子，或者已用编码这些MHC分子的DNA转染。感兴趣的分子的cDNA表达后，该分子被加工成由MHC分子提供的抗原性肽，如HLA分子。针对该复合物的CTL可从淋巴细胞，例如自体淋巴细胞获得。然后经过熟知的有限稀释技术可从效应器细胞群体获得长期的CTL克隆。一旦观察到阳性CTL反应，使用已建立的方法，例如，筛选以前鉴定的CTL克隆的特异性描述的方法，即，研究感兴趣的分子的序列以鉴定潜在的MHC结合基序，然后分析这些肽，首先分析其与相关MHC分子的结合，然后，如果是MHC-结合阳性，则分析其产生识别肽MHC复合物的CTL的能力。当然，也可从细胞中洗脱该肽并使用熟知的技术测序。

技术人员还应注意到，可将感兴趣的分子的表达与特定宿主细胞或表达它的细胞联系起来。为此，可取出表达感兴趣的分子的cDNA并测序等。本方法的这一方面是本发明的另一特征。

本发明的具体实施方案参见下面实施例。图1总体上描述了该方法。实施例1

为了建立人组织的cDNA文库，从0.5μg肾透明细胞癌获得总RNA并根据作为参考文献引用的Chomzynski,J.生化分析162:156-159(1987)来建立。用寡聚dT-纤维素从总RNA提取mRNA。以Gubler和Hoffmann，基因，25:263(1983)描述的方法使用RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ实现第一链cDNA的合成。为了适应该cDNA Klenow酶，将带有EcoRⅠ限制性酶位点的连接物使用T4 DNA连接酶连接到上述cDNA末端(Ferretti L.和Sgamerella Ⅴ.核酸研究，9:3695(1981))。用酶XhoⅠ进行限制性酶消化后，使用Sephacryl 400分离不同长度的cDNA分子并转染进入λZAPⅡ噬菌体载体(Short等，核酸研究，16:7583(1988))。重组噬菌体DNA与包装提取物连接后包装进噬菌体并用于转染大肠杆菌细菌。对文库的滴定产生1.8×10⁶个重组一级克隆。将总cDNA文库转染进大肠杆菌并扩增。扩增后cDNA文库的滴度为10¹¹噬斑形成单位/ml(pfu/ml)。这些转染的细胞用于下面的实验。实施例2

根据上文所述的本发明，经过使用人血清实现对免疫原性物质的鉴定，其中该血清完全排除了针对来自天然和裂解的λ噬菌体转染的大肠杆菌细菌的抗原的抗体。为此，该血清经吸附“剥离”，如本文所述。

大肠杆菌细菌菌株XLl-Blue在50ml LB培养基中培养过夜。达到光密度OD₆₀₀=1.0后，离心沉淀细菌，重新悬浮于5ml磷酸盐缓冲液(PBS)中，并经超声进行声处理以形成溶胞产物。将细菌溶胞产物结合到活化的Sepharose基质上，然后放入柱中并用于吸附人血清。血清流过该柱10次。

离心沉淀指数生长期的大肠杆菌XLl-Blue细菌培养物，用无重组***片段的10⁶λZAPⅡ噬菌体在0.01M硫酸镁中转染并在5ml LB培养基中培养4小时。以与未转染的细菌相同的方式使用转染细菌的溶胞产物，用上文所述的人血清再通过该柱10次。

为了完成对血清的排除，将来自裂解转染的大肠杆菌细菌的干扰抗体在琼脂板上培养(10小时，37℃)，在该培养步骤后将其蛋白质印迹到硝酸纤维素膜上。此后，将通过上述步骤已预吸附的血清转移到印迹的硝酸纤维素膜上，重复吸附过程5次。根据本发明加工的血清完全排除了针对来自大肠杆菌和噬菌体的抗原的抗体。实施例3

在这些实验中，经过下列步骤鉴定肾癌特异性抗原。大肠杆菌XLl-Blue菌株的细菌用来自所述cDNA文库的重组噬菌体转染并以每平板4-5×10³噬斑形成单位(PFU)的密度涂布在含异丙基硫代半乳糖吡喃糖苷(“IPTG”)的LB培养基中。37℃培养12小时后，将硝酸纤维素膜放在培养物的顶部，将培养物平板再培养4小时。接着在含5％奶粉的Tris缓冲盐水(TBS)中温育硝酸纤维素膜1小时。在TBS中洗涤硝酸纤维素膜3次后，将按实施例2获得的剥离的人血清在TBS/0.5％奶粉(W/V)中按1∶1000稀释并轻轻摇动温育过夜。与硝酸纤维素膜温育后，去掉血清并用于进一步试验。用血清温育后，在TBS中洗涤硝酸纤维素膜3次并与多克隆碱性磷酸酶连接的羊抗人IgG温育1小时。此后，用TBS/0.01％Tween20(v/v)重复洗涤硝酸纤维素膜。使用氯化氮蓝四唑和溴氯吲哚磷酸在TBS中进行反应。与表达的蛋白质结合的人抗体以在硝酸纤维素膜上的蓝色环形彩色沉积而变为可见。血清的有效预吸附使得在37℃膜显色几小时而没有因抗大肠杆菌和噬菌体抗原的抗体引起的背景反应损害试验的质量。

将阳性克隆定位在琼脂板上，转移进转染缓冲液中并用于第二轮的转染和亚克隆。筛选总共1.8×10⁶个重组克隆并鉴定出5个不同的阳性反应克隆。实施例4

将按实施例3获得的阳性克隆，即结合来自加工的人血清的抗体的那些克隆经过多轮重复转染并测试其与加工的人血清的反应性而亚克隆成单一克隆。通过从λZAPⅡ噬菌体载体体内切割(Hay和Short,Strategies 5:16-19,1992)克隆具有各自cDNA***片段的P-bluescript噬菌粒，并用于转染大肠杆菌SOLR细菌。以Birnboim和Doly，核酸研究通讯，7:1513(1979)的改良方法用NaOH碱裂解后从细菌中分离质粒。根据Sanger的经典方法(美国科学院院刊74:5463(1977))，使用M13-正向和M13-反向寡聚核苷酸测序重组的质粒DNA。在核酸和蛋白质数据库(Gene Bank,EMBL,Swiss Prot)中检查获得的DNA序列和所得的氨基酸序列。使用内部寡核苷酸继续cDNA***片段的测序。分析表明与数据库中登记的任何序列均无同源性。全长cDNA克隆称为SK313，用RACE方法(Frohman MA,DushMK,Martin GR，美国科学院院刊85:8998(1988))已对其进行了克隆，在该克隆的5’端见有碳酸酐酶结构域。该分子的核酸序列在SEQ ID NO:1中提供。图2显示了来自这些实验的具有阳性克隆的硝酸纤维素膜。实施例5

在上述实验后，根据Chomzynski和Sacchi，分析化学，162:156(1987)的方法从各种恶性和正常人组织分离RNA。变性后，在含1％甲醛的琼脂糖凝胶上经电泳分离所有分离的RNA(Goldberg，美国科学院院刊77:5794(1980))，然后根据已知方法(Seed，核酸研究，10:1799(1982))印迹到尼龙膜上。将放射标记的鉴定克隆的cDNA***片段用于杂交。根据已知方法(Geoffrey和Berger，酶学，152:419(1987))进行杂交。使用放射自显影和Ⅹ-射线胶片证实各RNA的存在。分析证实与正常肾相比，19个肾细胞癌中有4个过度表达克隆HOM-RCC-313的mRNA。在结肠粘膜组织和在正常肾中仅发现极微弱的表达。在其它组织中的表达未能证实。实施例6为了测定抗根据本发明鉴定的抗原的抗体发生率，分析来自健康个体和肿瘤病人的血清。为此，按上方所述加工血清并排除抗来自大肠杆菌和噬菌体的抗原的抗体。为了检测抗原特异性抗体，将来自反应克隆的噬菌体与来自相同cDNA文库的非反应性噬菌体以1∶l0的比率混合，并按上文所述在人试验血清中试验与抗体的反应性。用于鉴定抗原的血清用作阳性克隆。非反应性噬菌体用作阴性对照。如果噬斑的预期百分数显示出阳性反应，则血清样品对抗原反应性抗体为阳性。在克隆HOM-RCC-313提供的肾细胞癌抗原情况下，对各种人血清的分析表明、仅来自肾细胞癌症病人的血清含反应性抗体。来自健康对照和带有其它肿瘤的病人不含该抗体。

通过用限制性酶EcoRⅠ消化从质粒DNA中切下克隆HOM-PCC-313的cDNA，并经琼脂糖凝胶电泳分离，随后从凝胶中提取。然后将它用于产生表达具有细菌蛋白质邻氨基苯甲酸合成酶的融合蛋白的载体。将精确的开放阅读框中的相关片段克隆进pATH质粒载体(Koerner，酶学方法，194:477(1991))。将该质粒转化进大肠杆菌菌株BL21中后获得蛋白质表达的诱导，如在Spindler等，病毒学杂志，49:132(1984)中所述。经SDS凝胶电泳分离表达的融合蛋白质，从凝胶上切下，洗脱并冷冻干燥。经过皮下注射溶于Freund佐剂中的100gμg冻干品使兔免疫。使用不完全Freund佐剂以2周的间隔重复免疫3次。给兔放血并获取抗血清。以上文所述的方式排除获得的抗血清中与大肠杆菌和噬菌体反应的抗体并按对人血清所述试验对肾癌抗原的反应性。以1:＞100,000的稀释度检测反应性。实施例7

使用取自患有(Ⅰ)恶性黑色素瘤，(ⅱ)星形细胞瘤和(ⅱ)霍奇金病的不同受试者的活体解剖组织进行前面实施例所述的方案。下面表1总结了其结果，包括在上文实施例1-6中详细列出的肾癌研究所获得的结果。

表1．自体血清与来自人肿瘤cDNA的重组克隆的抗体反应性。用自体病人血清筛选cDNA文库。将阳性克隆亚克隆成单克隆。用质粒引物扩增各克隆的***片段并以琼脂糖凝胶电泳分离。经过与各自的***片段交叉杂交进行Southern印迹。

肿瘤             试验的克隆     阳性克隆    不同***片段

恶性黑色素瘤      1.0×10⁶        40         10

肾细胞癌          1.8×10⁶         7          5

星形细胞瘤        1.2×10⁶        49          5

霍奇金病          1.0×10⁶        14          4

对不同***片段的分析表明黑色素瘤细胞表达已知肿瘤排斥抗原前体MAGE-1(见van der Bruggen等，科学254:1643-7(1991)，作为参考文献引用)，以及新抗原。该抗原的部分cDNA序列见SEQ IDNO:2。

当完成星形细胞瘤研究时，观察到的***片段似乎相应于以前所述的Tegt基因(Old，癌症研究，41:361-375(1981)，以参考文献引用)。

当完成霍奇金病研究时，分离出以前未知的抗原，使用标准方法在文库中鉴定了编码它的cDNA。该抗原是一种新观察到的凝集素样结构，其部分cDNA在SEQ ID NO:3中描述。还观察到如Bilbe等，EMBO J 11:2103-13(1992)所述的抗restin的抗体。它是一种与中间纤维相关联的蛋白质，其表达已证实限制霍奇金和里-斯二氏细胞以及培养的单核细胞。实施例8

对于抗实施例1-7所述的抗原的抗体的存在进行进一步的研究。表2总结了这些试验。在这些研究中，将阳性克隆的噬菌体与非反应性噬菌体混合(比例，1∶10)，然后用于转染细菌(大肠杆菌)。将病人血清的稀释物(1∶200)用于上文所述的酶联免疫吸附试验(ELISA)中，“HOM-MEL-40”指新黑色素瘤抗原(SEQ ID NO:2)，而“HOM-MEL-55”指MAGE-1(Van der Bruggen等，出处同上)。“HOM-RCC 3.1.3”是SEQ ID NO:1的肾癌抗原。“HOM-GLIO-30.2.1”指以前鉴定的星形细胞瘤相关性抗原，“HOM-HD-21”指SEQ ID NO:3的新的凝集素样抗原，“HOM-HD-397”是以前鉴定的restin抗原。

                             表2

对人肿瘤抗原的体液免疫反应。阳性克隆的噬菌体与cDNA文库的非反应性噬菌体以1∶10的比率混合并

用于转染细菌。使用1∶200稀释的病人的血清以酶联试验检测抗该克隆的IgG抗体。n.t.=未检测抗原相同          HOM-MEL-40^*    HOM-MEL-55     HOM-RCC-3.1.3^*   HOM-GLIO-30.2.1    HOM-HD-21^*   HOM-HD-397性/同源性                          MAGE-1            CAH状             tegt            凝集素样       restin黑色素瘤病人         2/11           4/11             n.t.              n.t.               n.t.         n.t.肾癌病人             0/8            0/8              2/14              0/7                0/7          5/7星形细胞瘤病人       0/10           0/10             0/11              2/13               0/11         7/11霍奇金病人           0/10           0/17             0/17              0/17               10/18        14/17健康对照             0/12           0/12             0/15              0/20               0/17         12/17

尽管以不同的比率，但仅在患有相同类型的肿瘤的病人血清中检测到仅除restin外的抗肿瘤抗原的抗体，这一事实表明肿瘤生长对于形成抗肿瘤抗原的体液反应是必需的。

在健康对照中存在restin的理由尚不清楚。可推测可能涉及对各自抗原的耐受性，因为该抗原可能具有与另一抗原相似的序列，供体可能具有癌前期细胞，或抗原可在非癌变状态下，如病毒感染，或其它炎症过程中在正常细胞中被激活。实施例9

为了测定本文所述的新鉴定的抗原的表达方式，使用各种人组织进行Northern印迹分析。

使用熟知的Chomzynski等，出处同上的异硫氰酸胍/酚/氯仿方法从组织样品(肿瘤和正常的)提取RNA。经过在***/MOPS凝胶中电泳检查RNA的完整性。然后，将含有每泳道40μg RNA的凝胶印迹到尼龙膜上。然后用SEQ ID NO:1,2或3的cDNA探测这些Northern印迹。用³²p标记的探针在42℃用甲酰胺进行杂交。滤膜在65℃下，以1xSSC,0.2％SDS洗涤并曝光16小时。这些条件是下文定义的“严格条件”。曝光后，剥离滤膜并用GAPDH再杂交。

                                           表3在各种组织(选择)中肿瘤抗原的表达方式。用来自肿瘤和正常人组织的RNA样品经过用GAPDH杂交匹配进行Northern印迹分析。在对放射自显影照片进行光密度分析后计算表达比率。将疾病组织的正常对应组织获得的信号设定为1。n.t.=未检测抗原相同性/同源性    HOM-MEL-40^*   HOM-RCC-3.1.3^*  HOM-GLIO-30.2.1   HOM-HD-21^*

                                   CAH状            Tegt            凝集素样

肾                   -               1              1.5                -

脑                   -              n.t.              1               n.t.

扁桃体               -               -                1                1

胃                   -               -              1.5                -

结肠粘膜             -              0.2             1.5                -

乳腺                 -               -              1.5                -

肾癌                 -       4/19例＞5,15/19例≤1    n.t.              -

霍奇金组织         n.t.              -               n.t.             ＞10

星形细胞瘤         n.t.      n.t.8/12例＞5,4/12为1    -

黑色素瘤            ++               -               n.t.              -正如所见的，新的与黑色素瘤相关的抗原在黑色素瘤中强烈表达，但不在其它组织中表达。碳酸酐酶样抗原在大约20％的肾细胞癌中强烈表达，但仅在正常肾组织中微弱表达。与正常脑细胞相比Tegt在8/12的星形细胞瘤组织中过度表达。与霍奇金病相关的凝集素样分子的mRNA在发病的扁桃体中比在正常扁桃体中增加大约10倍，说明过度表达可能是诱发自体B细胞反应的蛋白质的常见特征。实施例10

对HOM-MEL-40序列进行进一步研究。使用标准遗传学分析技术，HOM-MEL 40的mRNA的5’区域显示出具有酪氨酸激酶结合结构域。这表明HOM-MEL-40可能起受体的作用。RNA的3’部分与“SSX”的RNA分子相同，SSX是已知涉及滑膜肿瘤中SYT-SSX易位的一种分子。实施例11

还进行了其它的实验来研究HOM-MEL 40。标准Northern印迹显示，除睾丸外，HOM-MEL 40在正常组织中不表达。相反，其在50％的黑色素瘤，20％的***癌，20％的胃癌，26％的结肠癌，12％的肺癌和20％的乳腺和肝细胞癌中表达。也发现其存在于1/10的胃癌和1/5的甲状腺癌中。

进行了其它的Western印迹研究，表明抗HOM-MEL40的抗体存在于89个所试验的黑色素瘤病人的10个中，但在49个健康男性受试者中仅3个存在该抗体。

在其它研究中，观察到HLA-A2阳性肿瘤细胞存在来自HOM-MEL的9碱基顺序。表明用于诱导CTL的HOM-MEL 40特异性疫苗是可能的。实施例12

在前面实施例中描述的噬菌体试验对于筛选大量的血清样品是不合适的。为进行筛选，建立了标准Western印迹的改良方法。该变化以His标记的重组HOM-MEL 40为基础，如本文所述。

使用pfu聚合酶在从黑色素瘤组织制备的质粒cDNA上将HOM-MEL-40扩增20个循环以上。所用的寡核苷酸引物是：

5’-GCCAAATACTTCTCTAAGGAAGAGTGG-3’(SEQ ID NO:5)；(有意义)。

5’-TTCACTGTTGTGAACACTTGCTTTCAC-3’(SEQ ID NO:6)；(反义)。

以95℃/1分钟；60℃/1分钟；和72℃/1分钟进行聚合酶链式反应(PCR)，随后在72℃10分钟进行最后的延伸。使用本领域已知的技术凝胶纯化扩增产物，然后以符合阅读框的形式连接到SmaⅠ消化的去磷酸化的且凝胶纯化的pQE32载体上。结果在N-末端产生具有6个组氨酸分子的“尾巴”的融合蛋白质。

然后将该构建体转化进大肠杆菌SG13009(pREP4)菌株，接着在含卡那霉素和氨苄青霉素的平板上选择。挑出单个菌落并经过用2mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导以小批量表达。这样可以检查蛋白质的表达。然后对每个克隆在Ni-NTA柱上进行小批量纯化。

一个克隆鉴定为表达预期长度的蛋白质。使用熟知的技术分离并测序该克隆。其证实为HOM-MEL-40。鉴定后，进行重组蛋白质的大规模诱导。具体地说，用2mM IPTG诱导细胞并在5小时后收获。经过与8M尿素、100mM Na₂PO₄、10mM Tris-HCl(pH8)、0.01％TritonX的缓冲液混合过夜裂解细胞。离心沉淀细胞碎片，将清液上样到预先平衡的Ni-NTA树脂上。用2倍体积的上述缓冲液在pH8进行洗涤，然后用至少10倍体积的缓冲液在pH6.3洗涤。然后使用本文所述的缓冲液加250mM咪唑洗脱蛋白质。产量为每升细菌培养物15至40mgHis标记的蛋白质。

然后使用His标记的蛋白质进行Western印迹。在这些试验中，将用作内部阴性对照的5μg重组His标记的蛋白质与2XSDS样品缓冲液(0.1M Tris-HCl,pH6.8、0.2M二硫苏糖醇、4％SDS、0.2％溴酚蓝、20％甘油)混合，然后在12％SDS-PAGE中电泳。接着使用半干转移印迹尼龙膜。

用在PBS中的5％低脂肪奶封闭非特异性结合(1小时)后，用来自肿瘤病人或健康对照的1∶100稀释的血清温育膜。然后用与小鼠抗-人IgG连接的碱性磷酸酶温育印迹1小时。接着连续地用兔抗小鼠IgG(30分钟)、抗碱性磷酶酶和0.25mg/ml碱性磷酸酶温育膜。在各温育步骤后，用TBS和0.01％Tween充分洗涤膜。经过用5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(BCIP)和氮蓝器唑染色进行观察。在观察者不知道样品的背景的情况下以随机顺序(健康/黑色素瘤阳性)分析血清。所有分析以一式二份进行。

印迹显示了一种产物，以SDS-PAGE分析其分子量大约为24KD，这与根据预期氨基酸序列计算的分子量21.6KD一致。

对89个黑色素瘤样品、6个卵巢癌样品和10个肾癌样品进行了上文所述的免疫印迹。其中，11个黑色素瘤样品，1个卵巢癌样品和3个肾细胞癌样品为阳性。来自患有结肠、肺、乳腺、胃或胰腺癌的受试者的血清为阴性。还分析了总共41个健康对照，其中3个为阳性。然后使用上文所述的噬菌体测定重新测定了在Western印迹中反应的血清以及20个阴性血清样品。在11个黑色素瘤病人中有10个病人和阳性卵巢癌病人被证实具有反应性。肾细胞癌病人和健康对照为阴性，所有样品在Wertern印迹中为阴性。

有16个提供血清和肿瘤标本的黑色素瘤病人。发现肿瘤表达的HOM-MEL-40可以与在样品中的抗体反应性相比。正如在下面表中可见的，16个病人中有8个具有HOM-MEL-40阳性肿瘤，但仅3个在其血清中具有抗该抗原的抗体。在具有HOM-MEL-40阴性肿瘤的病人血清中检测不到抗体。实施例13

实施例7中观察到的结果令人感兴趣，因而进行了进一步的实验。

对各种霍奇金病细胞样品进行了上文所述的血清学分析。将使用上文所述方法鉴定的一个cDNA克隆与restin的已知cDNA序列进行了比较，发现它相应于已知cDNA的截短形式。具体地说，本文以SEQID NO:7提供的截短cDNA编码在羧基末端截短的蛋白质，导致α一螺旋杆状结构域破坏。已知该结构域对于纤丝的形成是重要的。

使用所述方案进行Northern印迹分析，该分析表明该转录子在与霍奇金病相关的组织，而不是正常组织中特异性地表达。

然后使用单细胞RT-PCR，用转录子特异性寡聚核苷酸证实这些结果。

使用以重组产生的抗原生产的多克隆抗体血清经Western印迹进行最后一组证实实验。实施例14

以参考文献引用的Rammerseetffu等，免疫遗传学41:178-228(1995)公开了结合至HLA-A2.1的许多肽，且其中一些也激发CTL增生。其中一些肽的通式为：XaaLeu(Xaa)6(Ile,Leu,Val)(SEQ IDNO:8)。筛选HOM-MEL-40推断的氨基酸序列中可能充当HLA-A2.1结合剂/CTL刺激剂的序列，发现如下序列：Arg Leu Gln Gly Ile Ser Pro Lys Ile(SEQ ID NO:9)；Arg Leu Arg Glu Arg Lys Gln Leu Val(SEQ ID NO:10)；Lys Ile Gln Lys Ala Phe Asp Asp Ile(SEQ ID NO:11)。

使用熟知的技术和Fmoc保护的氨基酸合成这些肽。然后使用Sephadex G25、接着在C-18柱上进行反相HPLC纯化肽。在如下肽结合试验中使用与抗原存在相关的转运蛋白缺陷型T2细胞(DeMars等，美国科学院院刊82:8183-8187(1985)；Slater等，免疫遗传学2l:235-241(1990))。在存在或没有100μM HOM-MEL-40肽的条件下在37℃培养5×10⁵个T2细胞样品4小时。阳性对照是来自EBV LMP2的肽：Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val(SEQ IDNO:12)及来自HIV逆转录酶的肽Ile Leu Lys Glu Pro Val Gly Val(SEQID NO:13).HLA-A2.1对T₂细胞的正调节量经过用抗-HLA-A2.1特异性单克隆抗体(即，BB7.2)标记，随后与FITC连接的羊抗小鼠抗体温育来测量。以流式细胞光度法分析该样品，以下面比率给出HLA-A2.1的正调节量：

可见这三个肽中的每一个均结合HLA-A2.1，正如FACS分析所测定的，SEQ ID NO:8显示出强得多的最强的HLA-A2.1正调节量。

如上文所示，本发明涉及测定或分离免疫反应物质的方法。本文使用的“免疫反应物质”指在产生该物质的受试者中激发某些形式的免疫反应的任何物质。这种反应可以以B细胞或T细胞反应为基础。该免疫反应物质包括蛋白质、肽、糖蛋白、脂蛋白、含肽复合物(例如，MHC/肽复合物)、抗体等。为了测定该物质，使用熟知的标准方法从受试者细胞制备cDNA文库。然后将cDNA***合适的载体，如真核细胞特异性病毒或噬菌体(即，细菌病毒)以形成转染/转化文库。然后再掺入宿主细胞。处理宿主细胞使其表达它们所接受的文库成分(克隆的cDNA)。然后，裂解宿主细胞，以便获得表达的物质用于进一步处理。

然后将裂解的物质与相信含有该免疫反应物质的免疫原性结合配偶体的“剥离”样品接触。本文使用的“免疫原性结合配偶体”指结合到靶，即免疫反应物质上的任何免疫***相关性物质。该结合配偶体包括，但不限于抗体、T细胞、细胞因子、配体、受体等，以及这些分子的截短的部分、互补核酸分子等。注意对于某些成分，如T细胞，需要包括本文所述的进一步的步骤。

经过与(ⅰ)未转染或转化的宿主细胞及(ⅱ)用不含相关cDNA的载体转染或转化的宿主细胞接触处理如上文所述的剥离样品。

剥离样品可用于鉴定表达物质的结合配偶体，因为经过本文所述的吸附步骤已去掉了会干扰所需特异性免疫学反应的许多免疫成分。

鉴定表达物质后可分离编码它的cDNA。可在诸如硝酸纤维素膜的膜上穿孔，该膜放在含宿主细胞集落的培养皿上部，然后使用免疫反应给出在固相上的位置。各集落以限制性的cDNA转染为基础，从而有利于相关cDNA的分离和鉴定。

本发明还涉及SEQ ID NO:1,2,3或7的分离的核酸分子，它编码与特定条件相关的分子。除了其作为编码物质的作用外，这些分子也可用作探针以鉴定表达相关抗原的细胞，正如所显示的，这些cDNA分子(SEQ ID NO:1,2,3和7)以翻译成抗原的mRNA为基础。

本发明还有一个部分是与SEQ ID NO:1,2,3或7之一杂交且编码相当于SEQ ID NO:1,2,3或7所编码的蛋白质的分离的核酸的核酸分子和其互补序列。本文使用的“严格条件”指至少与如下杂交条件一样严格的条件，即，使用32P标记的探针，在3.5×SSC.1×Denhard溶液，25mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)中，以50μl/cm²在65℃下杂交18小时，接着洗涤四次(每次在65℃,2×SSC,0.1％SDS洗涤1小时)，最后以1.0×SSC 0.2％SDS洗涤30分钟。该最后的洗涤可改为0.5×SSC至0.2×SSC，或甚至0.1×SSC，如果需要，可将SDS降低至0.1％以增强严格性。

本发明还包括诸如SEQ ID NOS:9,10和1l的与肿瘤抗原相联系的那些肽，它们结合HLA-A2.1分子，从而激发溶胞性T细胞进行的裂解。本发明还有一部分是具有通式Xaa Leu Xaa₇(SEQ ID NO:14)的肽，其中，第6个氨基酸残基是Ser、Lys或Phe，且第9个氨基酸残基是Val或Ile。这些分子还可极简单地用作HLA-A2.1细胞的标记，因为已经熟知，肽/MCH复合物的形成是十分专一的。本发明的其它特征对于本领域的技术人员而言是显而易见的，在此不必重复。

所用的术语和表达是对术语的描述而不是限制，在使用这些术语的表达时并不排除所示和所述特征的任何等同物或其部分，应认识到在本发明范围内可进行各种修改。(1)一般信息：

(ⅰ)申请人：迈克尔·普夫雷温德舒(Pfreundschuh,Michael)

(ⅱ)发明名称：与霍奇金病相关的分子及其用途

(ⅲ)序列数：14

(ⅳ)联系地址：

 (A)联系人：Felfe&Lynch

 (B)街道：805 Third Avenue

 (C)城市：纽约城

 (D)州：纽约

 (F)邮编：10022

(ⅴ)计算机可读形式

 (A)媒体类型：3.5寸盘，360kb

 (B)计算机：IBM

 (C)操作***：PC-DOS

 (D)软件：Wordperfect

(ⅵ)最近申请资料：

 (A)申请号：

 (B)申请日：

(ⅶ)在先申请资料：

 (A)申请号：08/644,116

 (B)申请日：1996年5月10日

 (C)分类：435

(ⅶ)最近申请资料：

 (A)申请号：08/668,128

 (B)申请日：1996年6月21日

(ⅶ)在先申请资料

 (A)申请号：08/580,980

 (B)申请日：1996年1月3日

(ⅶ)在先申请资料

 (A)申请号：08/479,328

 (B)申请日：1995年6月7日

(ⅷ)律师代理人信息：

 (A)姓名：Hanson,Norman D.

 (B)登记号：30,946

 (C)参考/摘要号：LUD 5441-PCT

(ⅸ)电信信息：

 (A)电话：(212)688-9200

 (B)电传：(212)838-3884(2)序列鉴定号1的信息：

(ⅰ)序列特征：

 (A)长度：2679个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：双链

 (D)拓朴学：线型

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1

CGCGAAGATG CCCCGGCGCA GCCTGCACGC GGCGGCCGTG CTCCTGCTGG            50

TGATCTTAAA GGAACAGCCT TCCAGCCCGG CCCCAGTGAA CGGTTCCAAG           100

TGGACTTATT TTGGTCCTGA TGGGGAGAAT AGCTGGTCCA AGAAGTACCC           150

GTCGTGTGGG GGCCTGCTGC AGTCCCCCAT AGACCTGCAC AGTGACATCC           200

TCCAGTATGA CGCCAGCCTC ACGCCCCTCG AGTTCCAAGG CTACAATCTG           250

TCTGCCAACA AGCAGTTTCT CCTGACCAAC AATGGCCATT CAGTGAAGCT           300

GAACCTGCCC TCGGACATGC ACATCCAGGG CCTCCAGTCT CGCTACAGTG           350

CCACGCAGCT GCACCTGCAC TGGGGGAACC CGAATGACCC GCACGGCTCT           400

GAGCATACCG TCAGCGGACA GCACTTCTCC GCCGAGCTGC ACATTGTCCA           450

TTATAACTCA GACCTTTATC CTGACGACAG NACTGCCAGC AACAAGTCAG           500

AAGACCTCGC TGTCCTGGGT GCTCTCATTG AGATGGGCTC CTTCAATCCG           550

TCCTATGACA AGATCTTCAG TCACCTTCAA CATGTAAAGT ACAAAGGCCA           600

GGAAGCATTC GTCCCGGGAT TCAACATTGA AGAGCTGCTT CCGGAGAGGA           650

CCGCTGAATA TTACCGCTAC CGGGGGTCCC TGATCACACC CCCTTGCAAC           700

CCCACTGTGC TCTGGACAGT TTTCCGAAAC CCCGTGCAAA TTTCCCAGGA           750

GCAGCTGCTG GCTTTGGAGA CAGCCCTGTA CTGCACACAC ATGGACGACC           800

CTTCCCCCAG AGAAAGTATC AACAACTTCC GGCAGGTCCA GAAGTTCGAT      850

GAGAGGCTGG TATACACCTC CTTCTCCCAA GTGCAAGTCT GTACTGCGGC      900

AGGACTGAGT CTGGGCATCA TCCTCTCACT GGCCCTGGCT GGCATTCTTG      950

GCATCTGTAT TGTGGTGGTG GTGTCCATTT GGCTTTTCAG AAGGAAGAGT     1000

ATCAAAAAAG GTGATAACAA GGGAGTCATT TACAACCCAG CCACCAAGAT     1050

GGAGACTGAG GCCCACGCTT GAGGTCCCCG GAGCTCCCGG GCACATCCAG     1100

GAAGGACCTT GCTTTGGACC CTACACACTT CGGCTCTCTG GACACTTGCG     1150

ACACCTCAAG GTGTTCTCTG TAGCTCAATC TGCAAACATG CCAGGCCTCA     1200

GGGATCCTCT GCTGGGTGCC TCCTTGTCTT GGGACCATGG NCACCCCAGA     1250

GCCATCCGAT CGATGGATGG GATGCACTCT CAGACCAAGC AGCAGGAATT     1300

CAAAGCTGCT GTCTGTAATT GTGTGAGATT GTGAAGTGGT CTGAATTCTG     1350

GAATCACAAA CCAACCATGC TGGTGGGCCA TTAATGGTTG GAAAACACTT     1400

CCATCCGGGG CTTTGCCAGA GCGTGCTTTC AAGTGTCCTG GAAATTCTGC     1450

TGCTTCTCCA AGCTTTCAGA GAAGAATGTG CACTCTCTGC TTAGGTTTTG     1500

CTTGGGAAAC TCAACTTCTT TCCTCTGGAG ACGGGACATC TCCCTCTGAT     1550

TTCCTTCTGC TATGCAAAAC CTTTAATCCG CACCTTACAN ACTCGGGGAC     1600

AAATGGGGAC AGGAAGGATC AAGTTGTAGA GAGAAAAAAG AAAACAAGAG     1650

ATATACATTG TGATATATAT TAGGGACACT TTCACAGTCC TGTCCTCTGG     1700

ATCACAGACA CTGCACAGAC CTTAGGGAAA TGGCAGGTTC AAAGTTCCAC     1750

TTCTTGGTGG GGATGAGAAG GGAGAGAGAG CTAGAGGGAC AAAGAGAATG     1800

AGAAGACATG GATGATCTGG GAGAGTCTCA CTTCGGAATC AGAATTGGAA     1850

TCACATTCTG TTTATCAAGC CATAATGTAA GGACAGAATA ATACAATAAT     1900

AAGTCCAAAT CCAACCTCCT GTCAGTGGAA CAGTTATGTT TTATACTCTA     1950

CAGATTTTAC AAATANATGA GGCTGCTTCC TTGAAAANTG TGTTGNNTTG     2000

CTGTNGTCCN NTGGAGGAGA CATGAGTTCC GAGATGACCA ACTCNNGCNT     2050

TGNATNCTNG GAGGNAATAN GGCAGAACCA AAATGACTGT AGAACTTATT     2100

CTCTGTAGGC CAAATTTCAT TTCAGCCACT TCTCCAGGAT CCTACTGCCA     2150

ACCTGGAATG GAGACTTTTA TCTACTTCTC TCTCTCTGAA GATGTCAAAT     2200

CGTGGTTTAG ATCAAATATA TTTCAAGCTA TAAAAGCAGG AGGTTATCTG     2250

TGCAGGGGGC TGGCATCATG TATTTAGGGG CAAGTAATAA TGGAATGGTA     2300

CTAAGATACT CCATATTCTT CCCCGAATCA CACAGACAGT TTCTGACAGG     2350

CGCAACTCCT CCATTTTCCT CCCGCAGGTG AGAACCCTGT GGAGATGAGT     2400

CAGTGCCATG ACTGAGAAGG AACCGACCCC TAGTTGAGAG CACCTTGCAG     2450

TTCCCCGAGA ACTTTCTGAT TGCACAGTCT CATTTTGACA GCATGAAATG     2500

TCCTCTTGAA GCATAGCTTT TTAAATATCT TTTTCCTTCT ACTCCTCCCT     2550

CTGACTCTAG GAATTCTCTC TTCTGGAATC GCTTGAACCC AGGAGGCGGA     2600

GGTTGCAGTA AGCCAAGGTC ATGCCACTGC ACTCTAGCCT GGGTGACAGA     2650

GCGAGACTCC ATCTCAAAAA AAAAAAAAAA                           2679(2)序列鉴定号2的信息：

(ⅰ)序列特征：

 (A)长度：931个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：双链

 (D)拓朴学：线型

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2

ACTTTCTCTC TCTTTCGATT CTTCCATACT CAGAGTACGC ACGGTCTGAT      50

TTTCTCTTTG GATTCTTCCA AAATCAGAGT CAGACTGCTC CCGGTGCCAT     100

GAACGGAGAC GACGCCTTTG CAAGGAGACC CACGGTTGGT GCTCAAATAC     150

CAGAGAAGAT CCAAAAGGCC TTCGATGATA TTGCCAAATA CTTCTCTAAG     200

GAAGAGTGGG AAAAGATGAA AGCCTCGGAG AAAATCTTCT ATGTGTATAT     250

GAAGAGAAAG TATGAGGCTA TGACTAAACT AGGTTTCAAG GCCACCCTCC     300

CACCTTTCAT GTGTAATAAA CGGGCCGAAG ACTTCCAGGG GAATGATTTG     350

GATAATGACC CTAACCGTGG GAATCAGGTT GAACGTCCTC AGATGACTTT     400

CGGCAGGCTC CAGGGAATCT CCCCGAAGAT CATGCCCAAG AAGCCAGCAG     450

AGGAAGGAAA TGATTCGGAG GAAGTGCCAC AAGCATCTGG CCCACAAAAT     500

GATGGGAAAG AGCTGTGCCC CCCGGGAAAA CCAACTACCT CTGAGAAGAT     550

TCACGAGAGA TCTGGACCCA AAAGGGGGGA ACATGCCTGG ACCCACAGAC     600

TGCGTGAGAG AAAACAGCTG GTGATTTATG AAGAGATCAG CGACCCTGAG     650

GAAGATGACG AGTAACTCCC CTCAGGGATA CGACACATGC CCATGATGAG     700

AAGCAGAACG TGGTGACCTT TCACGAACAT GGGCATGGCT GCGGACCCCT     750

CGTCATCAGG TGCATAGCAA GTGAAAGCAA GTGTTCACAA CAGTGAAAAG     800

TTGAGCGTCA TTTTTCTTAG TGTGCCAAGA GTTCGATGTT AGCGTTTACG     850

TTGTATTTTC TTACACTGTG TCATTCTGTT AGATACTAAC ATTTCATTGA     900

TGACGAAGAC ATACTTAATC GATATTTGGT T                         931(2)序列鉴定号3的信息；

(ⅰ)序列特征：

 (A)长度：1692个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：双链

 (D)拓朴学：线型

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3

GATCCCCCGG GCTGCAGGAA TTCGGCACGA GCAAAGGACT TCCTAGTGGG            50

TGTGAAAGGC AGCGGTGGGC ACAGAGGCGG CGGAGAGATG GCCTTCAGCG           100

GTTCCCAGGC TCCCTACCTG AGTCCAGCTG TCCCCTTTTC TGGGACTATT           150

CAAGGAGGTC TCCAGGACGG ACTTCAGATC ACTGTCAATG GGACCGTTCT           200

CAGCTCCAGT GGAACCAGGT TTGCTGTGAA CTTTCAGACT GGCTTCAGTG           250

GAAATGACAT TGCCTTCCAC TTCAACCCTC GGTTTGAAGA TGGAGGGTAC           300

TTGGTGTCCA ACACGAGGCA GAACGGAAGC TGGGGGCCCG AGGAGAGGAA           350

GACACACATG CCTTNCCAGA AGGGGATGCC CTTTGACCTC TGCTTCCTGG           400

TGCAGAGCTC AGATTTCAAG GTGATGGTGA ACGGGATCCT CTTCGTGCAG           450

TACTTCACAT CTCGTCATGC CCTGTCCACC GTTGTGGACA CCATCTCCGT           500

CAATGGCTCT GTGCAGCTGT CCTACATCAG CTTCCAGCCT CCCGGCGTGT           550

GGCCTGCCAA CCCGGCTCCC ATTACCCAGA CAGNNNTCAT CCACACAGTN           600

GCAGAGCGCC CNCTGGACAG ATGTCTCTAC TCCCGCCATC CCACCTATGA           650

TGTACCCCCA CCCCGCCTAT CCGATGCCTT TCATCACCAC CATTCTGGGA           700

GGGCTGTACC CATCCAAGTC CATCCTCCTG TCAGGCACTG TNCTGCCCAG           750

TGCTCANGAG GTTCCACATC NAACCTGTGC NCTGGGAACC ACATCGCCTT           800

CCACCTGAAC CCCCGTTTTG ATGAGAATGC TGTGGTCCGC AACACCCAGA           850

TCGACAACTC CTGGGGGTCT CAGGAGCGAA GTCTGCCCCG AAAAATGCCC           900

TTCGTCCGTG GCCAGAGCTT CTCAGTGTGG ATCTTGTGTG AAGCTCACTG           950

CCTCAAGGTG GCCGTGGATG GTCAGCACCT GTTTGAATAC AACCATCGCC          1000

TGAGGAACCT GCCCACCATC AACAGACTGG AAGTGGGGGG CGACATCCAG          1050

CTGACCATGT GCAGACATAG GCAGACATAG GCGGCTTCCT CCGGGGGCTG          1100

GGGTGTGGGG CAGTCTGGGT CCTCTCATCA TCCCCACTTC CCAGGCCCAG          1150

CCTTTCCAAC CCTGCCTGGG ATCTGGGCTT TAATGCAGAG GCCATGTCCT          1200

TGTCTGGTCC TGCTTCTGGC TACAGCCACC CTGGAACGGA GAAGGCAGCT          1250

GACGGGGATT GCCTCCTCAG CCGCAGCAGC ACCTGGGGCT CCAGCTGCTG          1300

GAATCCTACC ATCCCAGGAY GCAGGCACAG CCAGGGAGAG GGGAGGNGTG          1350

GGCAGTGAAG ATGAAGCCCC ATGCTCAGTC CCCTCCCATC CCCCACGCAG          1400

CTCCACCCCA GTCCCAAGCC ACCAGCTGTC TGCTCCTGGT GGGAGGTGGC          1450

CTCCTCAGCN CCTCCTCTCT GACCTTTAAC CTNACTCTCA CCTTGCACCG          1500

TGCACCAACC CTTCACCCCT CCTGGAAAGC AGGCCTGATG GCTTCCCACT          1550

GGCCTCCACC ACCTGACCAG AGTGTTCTCT TCAGAGGACT GGCTCCTTTC          1600

CCAGTGTCCT TAAAATAAAG AAATGAAAAT NCTTGTTGGC AAAAAAAAAA          1650

AAAAAAAAAC TCGAGGGGCN NCCCNGTACC CAATTCGCCC TA                  1692(2)序列鉴定号4的信息：

(ⅰ)序列特征：

 (A)长度：1190个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：双链

 (D)拓朴学：线型

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4

ATCTGCAGAA TTCGGCTTCG ATCTAGAACT AGTGGATCCC CCGGGCTGCA           50

GGAATTCGGC ACGAGCGGTT CCAAGTGGAC TTATTTTGGT CCTGATGGGG          100

AGAATAGCTG GTCCAAGAAG TACCCGTCGT GTGGGGGCCT GCTGCAGTCC          150

CCCATAGACC TGCACAGTGA CATCCTCCAG TATGACGCCA GCCTCACGCC          200

CCTCGAGTTC CAAGGCTACA ATCTGTCTGC CAACAAGCAG TTTCTCCTGA          250

CCAACAATGG CCATTCAGTG AAGCTGAACC TGCCCTCGGA CATGCACATC          300

CAGGGCCTCC AGTCTCGCTA CAGTGCCACG CAGCTGCACC TGCACTGGGG          350

GAACCCGAAT GACCCGCACG GCTCTGAGCA TACCGTCAGC GGACAGCACT          400

TCTCCGCCGA GCTGCACATT GTCCATTATA ACTCAGACCT TTATCCTGAC          450

GACAGNACTG CCAGCAACAA GTCAGAAGAC CTCGCTGTCC TGGGTGCTCT          500

CATTGAGATG GGCTCCTTCA ATCCGTCCTA TGACAAGATC TTCAGTCACC          550

TTCAACATGT AAAGTACAAA GGCCAGGAAG CATTCGTCCC GGGATTCAAC          600

ATTGAAGAGC TGCTTCCGGA GAGGACCGCT GAATATTACC GCTACCGGGG          650

GTCCCTGATC ACACCCCCTT GCAACCCCAC TGTGCTCTGG ACAGTTTTCC          700

GAAACCCCGT GCAAATTTCC CAGGAGCAGC TGCTGGCTTT GGAGACAGCC          750

CTGTACTGCA CACACATGGA CGACCCTTCC CCCAGAGAAA TGATCAACAA          800

CTNCCGGCAG GTCCAGAAGT TCGNTGAGAG GCTGGTATAC ACCTCCTTCT          850

CNCAAGTGCA AGTCTGTACT GCGGCAGGAC TGAGTCTGGG CATCATCCTC          900

TCACTGGCCC TGGCTGGCAT TCTTGGCATC TGTATTGTGG TGGTGGTGTC          950

CATTTGGCTT TTCAGAAGGA AGAGTANCCC CNAAAGGTGA TAACAAGGGA         1000

GTCATTTACA AGCCANCCAC CAAGATGGAG ACTGAGGCCC ACGCTTGAGG         1050

TCCCCGGAGC TCCCGGGCAC ATCCAGGAAG GACCTTGCTT TTGGACCCTA         1100

CACACTTCGG CTCTCTGGAC ACTTGCGACA CCTCAAGGTG TTCTCTGTAG         1150

CTCAATCTGC AAACATGCCA GGCCTCAGGG ATCCTCTGCT                    1190(2)序列鉴定号5的信息：

(ⅰ)序列特征：

 (A)长度：27个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：单链

 (D)拓朴学：线型

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5

GCCAAATACT TCTCTAAGGA AGAGTGG(2)序列鉴定号6的信息：

(ⅰ)序列特征：

 (A)长度：27个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：单链

 (D)拓朴学：线型

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6

 TTCACTGTTG TGAACACTTG CTTTCAC(2)序列鉴定号7的信息：

(ⅰ)序列特征：

 (A)长度：2085个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：单链

 (D)拓朴学：线型

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7G GAG CTC CAC CGC GGT GGC GGC CGC TCT AGA ACT AGT GGA TCC CCC         46Glu Leu His Arg Gly Gly Gly Arg Ser Arg Thr Ser Gly Ser Pro

               5                   10                  15GGG CTG CAG GAA TTC GGC ACG AGC TGC TGC TCA CAG AGG AGG CCC AGT      94Gly Leu Gln Glu Phe Gly Thr Ser Cys Cys Ser Gln Arg Arg Pro Ser

             20                  25                  30CGG ACA GGA CTA TTG ACT GAA ACC TCC CGT TAC GCC AGG AAG ATC TCC     142Arg Thr Gly Leu Leu Thr Glu Thr Ser Arg Tyr Ala Arg Lys Ile Ser

         35                  40                  45GGT ACC ACT GCC CTC CAG GAG GCC CTG AAG GAG AAG CAG CAG CAC ATT     190Gly Thr Thr Ala Leu Gln Glu Ala Leu Lys Glu Lys Gln Gln His Ile

     50                  55                  60GAG CAG CTG CTG GCG GAA CGG GAT CTG GAG AGG GCG GAG GTG GCC AAG     238Glu Gln Leu Leu Ala Glu Arg Asp Leu Glu Arg Ala Glu Val Ala Lys

 65                  70                  75GCC ACG AGC CAC GTG GGG GAG ATA GAG CAG GAG CTA GCT CTG GCC CGG     286Ala Thr Ser His Val Gly Glu Ile Glu Gln Glu Leu Ala Leu Ala Arg80                  85                  90                           95GAC GGA CAT GAC CAG CAT GTC CTG GAA TTG GAA GCC AAA ATG GAC CAG     334Asp Gly His Asp Gln His Val Leu Glu Leu Glu Ala Lys Met Asp Gln

             100                 105                 110CTG CGA ACA ATG GTG GAA GCT GCT GAC AGG GAG AAG GTG GAG CTT CTC     382Leu Arg Thr Met Val Glu Ala Ala Asp Arg Glu Lys Val Glu Leu Leu

         115                 120                 125AAC CAG CTT GAA GAG GAG AAA AGG AAG GTT GAG GAC CTT CAG TTC CGG     430Asn Gln Leu Glu Glu Glu Lys Arg Lys Val Glu Asp Leu Gln Phe Arg

     130                 135                 140GTT GAA GAA GAA TCA ATT ACC AAA GGT GAT CTT GAG ACG CAG ACC AAA     478Val Glu Glu Glu Ser Ile Thr Lys Gly Asp Leu Glu Thr Gln Thr Lys

     145               150               155CTG GAG CAT GCC CGC ATT AAG GAG CTT GAA CAG AGC CTG CTC TTT GAA    526Leu Glu His Ala Arg Ile Lys Glu Leu Glu Gln Ser Leu Leu Phe Glu160                 165                 170                 175AAG ACC AAA GCT GAC AAA CTC CAG AGG GAG TTA GAA GAC ACT AGG GTG    574Lys Thr Lys Ala Asp Lys Leu Gln Arg Glu Leu Glu Asp Thr Arg Val

              180                 185                 190GCT ACA GTT TCA GAA AAG TCA CGT ATA ATG GAA CTG GAG AAA GAC CTA    622Ala Thr Val Ser Glu Lys Ser Arg Ile Met Glu Leu Glu Lys Asp Leu

          195                 200                 205GCA TTG AGA GTA CAG GAA GTA GCT GAG CTC CGA AGA AGG CTA GAG TCC    670Ala Leu Arg Val Gln Glu Val Ala Glu Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ser

      210                 215                 220AAT AAG CCT GCT GGG GAT GTG GAC ATG TCA CTT TCC CTT TTG CAA GAG      718Asn Lys Pro Ala Gly Asp Val Asp Met Ser Leu Ser Leu Leu Gln Glu

225                 230                 235ATA AGC TCT TTG CAA GAA AAG TTA GAA GTC ACC CGT ACT GAC CAC CAG      766Ile Ser Ser Leu Gln Glu Lys Leu Glu Val Thr Arg Thr Asp His Gln240                 245                 250                 255AGA GAA ATA ACT TCT CTG AAG GAG CAT TTT GGA GCC CGG GAA GAA ACT      814Arg Glu Ile Thr Ser Leu Lys Glu His Phe Gly Ala Arg Glu Glu Thr

            260                 265                 270CAT CAG AAG GAG ATA AAG GCT CTG TAT ACC GCC ACG GAA AAG CTT TCC      862His Gln Lys Glu Ile Lys Ala Leu Tyr Thr Ala Thr Glu Lys Leu Ser

        275                 280                 285AAA GAG AAC GAG TCA TTG AAA AGC AAG CTG GAG CAT GCC AAC AAA GAG      910Lys Glu Asn Glu Ser Leu Lys Ser Lys Leu Glu His Ala Asn Lys Glu

    290                 295                 300AAC TCA GAT GTG ATA GCT CTA TGG AAG TCC AAA CTG GAG ACT GCC ATC      958Asn Ser Asp Val Ile Ala Leu Trp Lys Ser Lys Leu Glu Thr Ala Ile

305                 310                 315GCA TCC CAC CAG CAG GCG ATG GAA GAA CTG AAG GTA TCT TTC AGC AAA     1006Ala Ser His Gln Gln Ala Met Glu Glu Leu Lys Val Ser Phe Ser Lys320                 325                 330                 335GGG CTT GGA ACA GAG ACG GCA GAA TTT GCT GAA CTA AAA ACA CAA ATA     1054Gly Leu Gly Thr Glu Thr Ala Glu Phe Ala Glu Leu Lys Thr Gln Ile

            340                 345                 350GAG AAA ATG AGA CTA GAT TAC CAA CAC GAA ATA GAA AAT TTG CAG AAT     1102Glu Lys Met Arg Leu Asp Tyr Gln His Glu Ile Glu Asn Leu Gln Ash

        355                 360                 365CAA CAA GAC TCT GAA CGG GCT GCC CAT GCT AAA GAG ATG GAA GCC TTG     1150Gln Gln Asp Ser Glu Arg Ala Ala His Ala Lys Glu Met Glu Ala Leu

    370                 375                 380AGG GCT AAA CTG ATG AAA GTT ATT AAA GAA AAG GAA AAC AGT CTG GAA     1198Arg Ala Lys Leu Met Lys Val Ile Lys Glu Lys Glu Ash Ser Leu Glu

385                 390                 395GCC ATC AGG TCG AAA CTG GAC AAA GCA GAA GAC CAG CAT CTC GTA GAA     1246Ala Ile Arg Ser Lys Leu Asp Lys Ala Glu Asp Gln His Leu Val Glu400                 405                 410                 415ATG GAA GAC ACG TTA AAC AAA TTA CAG GAA GCT GAA ATA AAG GTA AAG     1294Met Glu Asp Thr Leu Asn Lys Leu Gln Glu Ala Glu Ile Lys Val Lys

            420                 425                 430GAG CTA GAG GTA CTG CAA GCC AAA TGC AAT GAA CAA ACC AAG GTT ATT     1342Glu Leu Glu Val Leu Gln Ala Lys Cys Asn Glu Gln Thr Lys Val Ile

        435                 440                 445GAT AAT TTT ACA TCA CAG CTC AAG GCT ACT GAA GAA AAG CTC TTG GAT     1390Asp Asn Phe Thr Ser Gln Leu Lys Ala Thr Glu Glu Lys Leu Leu Asp

    450                 455                 460CTT GAT GCA CTT CGG AAA GCC AGT TCC GAA GGT AAA TCG GAA ATG AAG     1438Leu Asp Ala Leu Arg Lys Ala Ser Ser Glu Gly Lys Ser Glu Met Lys

465                 470                 475AAA CTT AGA CAG CAG CTT GAG GCA GCT GAG AAA CAG ATT AAA CAT TTA    1486Lys Leu Arg Gln Gln Leu Glu Ala Ala Glu Lys Gln Ile Lys His Leu480                 485                 490                 495GAG ATT GAA AAG AAT GCT GAA AGT AGC AAG GCT AGT AGC ATT ACC AGA    1534Glu Ile Glu Lys Asn Ala Glu Ser Ser Lys Ala Ser Ser Ile Thr Arg

            500                 505                 510GAG CTC CAG GGG AGA GAG CTA AAG CTT ACT AAC CTT CAG GAA AAT TTG    1582Glu Leu Gln Gly Arg Glu Leu Lys Leu Thr Asn Leu Gln Glu Ash Leu

        515                 520                 525AGT GAA GTC AGT CAA GTG AAA GAG ACT TTG GAA AAA GAA CTT CAG ATT    l630Ser Glu Val Ser Gln Val Lys Glu Thr Leu Glu Lys Glu Leu Gln Ile

    530                 535                 540TTG AAA GAA AAG TTT GCT GAA GCT TCA GAG GAG GCA GTC TCT GTT CAG    1678Leu Lys Glu Lys Phe Ala Glu Ala Ser Glu Glu Ala Val Ser Val Gln

545                 550                 560AGA AGT ATG CAA GAA ACT GTA AAT AAG TTA CAC CAA AAG GAG GAA CAG    1726Arg Ser Met Gln Glu Thr Val Asn Lys Leu His Gln Lys Glu Glu Gln565                 570                 575                 580TTT AAC ATG CTG TCT TCT GAC TTG GAG AAG CTG AGA GAA AAC TTA GCA    1774Phe Asn Met Leu Ser Ser Asp Leu Glu Lys Leu Arg Glu Asn Leu Ala

            585                 590                 595GAT ATG GAG GCA AAA TTT AGA GAG AAA GAT GAG AGA GAA GAG CAG CTG    1822Asp Met Glu Ala Lys Phe Arg Glu Lys Asp Glu Arg Glu Glu Gln Leu

        600                 605                 610ATA AAG GCA AAG GAA AAA CTG GAA AAT GAC ATT GCA GAA ATA ATG AAG    1870Ile Lys Ala Lys Glu Lys Leu Glu Asn Asp Ile Ala Glu Ile Met Lys

    615                 620                 625ATG TCA GGA GAT AAC TCT TCT CAG CTG ACA AAA ATG AAC GAT GAA TTA    1918Met Ser Gly Asp Asn Ser Ser Gln Leu Thr Lys Met Asn Asp Glu Leu

630                 635                 640CGT CTG AAA GAA AGA GAT GTA GAA GAA TTA CAG CTA AAA CTT ACA AAG    1966Arg Leu Lys Glu Arg Asp Val Glu Glu Leu Gln Leu Lys Leu Thr Lys645                 650                 655                 660GCT AAT GAA AAT GCA AGT TTT CTG CAA AAA AGT ATT GAG GAC ATG ACT    2014Ala Asn Glu Asn Ala Ser Phe Leu Gln Lys Ser Ile Glu Asp Met Thr

            665                 670                 675GTC AAA GCT GAA CAG AGC CAG CAA GAA GCA GCT AAA AAG CAT GGA AAT    2062Val Lys Ala Glu Gln Ser Gln Gln Glu Ala Ala Lys Lys His Gly Asn

        680                 685                 690TAAGCACCCA CCACTGCCCT GGG                                          2085(2)序列鉴定号8的信息：

(ⅰ)序列特征：

 (A)长度：9个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (D)拓朴学：线型

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8

Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa(2)序列鉴定号9的信息：

(ⅰ)序列特征：

 (A)长度：9个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (D)拓朴学：线型

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9Arg Leu Gln Gly Ile Ser Pro Lys Ile(2)序列鉴定号10的信息：

(ⅰ)序列特征：

 (A)长度：9个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (D)拓朴学：线型

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10Arg Leu Arg Glu Arg Lys Gln Leu Val(2)序列鉴定号11的信息：

(ⅰ)序列特征：

 (A)长度：9个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (D)拓朴学：线型

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11

Lys Ile Gln Lys Ala Phe Asp Asp lle(2)序列鉴定号12的信息：

(ⅰ)序列特征：

 (A)长度：9个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (D)拓朴学：线型

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12

Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val(2)序列鉴定号13的信息：

(ⅰ)序列特征：

 (A)长度：8个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (D)拓朴学：线型

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:13

Ile Leu Lys Glu Pro Val Gly Val(2)序列鉴定号14的信息：

(ⅰ)序列特征：

 (A)长度：9个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (D)拓朴学：线型

(ⅸ)特点：第六个氨基酸为Ser,Lys或Phe；第九个氨基酸为Val或Ile。

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:14

Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

Claims (14)

1、由SEQ ID NO:7的核苷酸序列组成的分离的核酸分子。

2、分离的核酸分子，它编码由SEQ ID NO:7编码的蛋白质，且在严格条件下与SEQ ID NO:7的核苷酸序列杂交。

3、表达载体，它含有与启动子有效连接的权利要求1的分离的核酸分子。

4、表达载体，它含有与启动子有效连接的权利要求2的分离的核酸分子。

5、转化或转染的细胞，它含有权利要求1的分离的核酸分子。

6、转化或转染的细胞，它含有权利要求2的分离的核酸分子。

7、转化或转染的细胞，它含有权利要求3的表达载体。

8、转化或转染的细胞，它含有权利要求4的表达载体。

9、筛选霍奇金病的方法，包含将细胞样品与权利要求2的分离的核酸分子接触并测定所说的分离的核酸分子与作为可能的霍奇金病征兆的靶分子的杂交。

10、权利要求9的方法，其中所说的分离的核酸分子由SEQ IDNO:7组成。

11、由权利要求2的分离的核酸分子编码的分离的蛋白质。

12、与权利要求11的分离的蛋白质特异性结合的抗体。

13、权利要求12的抗体，其中所说的抗体是单克隆抗体。

14、筛选霍奇金病的方法，包含将细胞样品与权利要求11的抗体接触并测定所说的抗体与作为可能的霍奇金病征兆的靶分子的结合。

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