CN1224422C - 含有白细胞介素il－12和单纯疱疹病毒抗原的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有抗原，(例如单纯疱疹病毒抗原)和白细胞介素IL-12混合物的疫苗组合物，该疫苗组合物可吸附于矿物悬液。这些疫苗组合物调节对抗原的保护性免疫应答。

Description

含有白细胞介素IL-12和单纯疱疹病毒抗原的疫苗
发明背景
免疫***采用许多机制来攻击病原体；然而，并不是所有这些机制在免疫接种后均必定被激活。接种疫苗诱导的保护性免疫力依赖于疫苗诱导恰当的免疫应答的能力来抵抗或消灭病原体。根据病原体，这可能需要细胞介导的免疫应答和/或体液免疫应答。
辅助性T细胞在免疫应答中作用的最近范例是，它们可以根据它们产生的细胞因子分成细胞亚群，而且在这些细胞亚群中观察到的独特性细胞因子分泌决定了它们的功能。此T细胞模型包括两个主要亚群：产生IL-2和干扰素γ(IFN-γ)的TH-1细胞，它同时增强细胞和体液免疫应答；产生IL-4、IL-5和IL-10的TH-2细胞，它增强体液免疫应答。(Mosmann等，免疫学杂志。126：2348(1986))。通常理想的是增强抗原的免疫原性以在被接种的生物体内获得更强的免疫应答，并增强宿主对抗原物质的抵抗力。一类和被接种的抗原一起施用，能增强抗原的免疫原性的物质称为佐剂。例如，已证明某些淋巴因子有佐剂活性，能增强对抗原的免疫应答(Nencioni，等，免疫学杂志。139：800-804(1987)；EP285441授予Howard等)。
发明简述
本发明涉及疫苗组合物，它包括单纯疱疹病毒糖蛋白D，白细胞介素IL-12和矿物悬液的混合物。IL-12可吸附于矿物悬液或简单的与其混合。在本发明的具体实施例中，IL-12吸附于例如明矾(例如，氢氧化铝或磷酸铝)的矿物悬液，该矿物悬液是水悬液。在一具体实施例中，IL-12是人IL-12。本发明也涉及进一步含有生理学上可接受的载体的疫苗组合物。本发明还涉及包括单纯疱疹病毒糖蛋白D、佐剂剂量的白细胞介素-12、矿物悬液的混合物，以及可任选的含有生理学上可接受的载体的免疫原性组合物。
本发明的组合物调节对抗原的保护性免疫应答；即，该疫苗组合物能够在量和质上促进接种疫苗宿主的抗体应答，在量上增加细胞介导的免疫力，提供对病原体的保护性免疫应答。在本发明的一个具体实施例中，抗原是单纯疱疹病毒(HSV)抗原，例如单纯疱疹病毒I型和/或II型的衣壳糖蛋白D(gD)。
本发明还涉及制备含有与矿物悬液混合的HSV gD和IL-12的疫苗组合物的方法。特别是，IL-12吸附于矿物悬液。本发明还涉及诱导或增强被免疫者保护性免疫应答的体液和/或细胞介导的免疫力，包括对脊椎动物宿主施用有效量的疫苗组合物，该组合物包含以生理学上可接受的溶液配制的HSVgD、IL-12和矿物悬液的混合物。特别是，IL-12吸附于矿物悬液。
发明详述
糖蛋白D(gD)是单纯疱疹病毒(HSV)I型和II型的包膜糖蛋白。已证明HSV gD是动物模型中抵御初次或复发性HSV感染保护性免疫力的强诱导物。(Mishkin等，疫苗9：147-153(1991)；Landolfi等，疫苗11：407-414(1993))。
IL-12由各种各样的抗原递呈细胞产生，主要是由巨噬细胞和单核细胞产生。它是诱导原初T细胞成为TH-1细胞的关键要素。IL-12的产生或对其反应的能力在保护性TH-1类应答的发展中证明是关键性的，例如，在寄生虫感染中，最值得注意的利士曼病中就是如此(Scott，等，美国专利号No.5,571,515)。IL-12的作用由NK细胞和辅助性T细胞产生的IFN-γ所介导。IFN-γ则是诱导抗T依赖性蛋白抗原的IgG2a抗体(Finkelman和Holmes，免疫学年度综述。8：303-33(1990))和抗T非依赖性抗原的IgG3应答(Snapper等，实验医学杂志，175：1367-1371(1992))。白细胞介素-12(IL-12)，原称为自然杀伤细胞刺激因子，是一种异二聚体细胞因子(Kobayashi等，J.Exp.Med.170：827(1989))。IL-12蛋白在重组宿主细胞中的表达和分离在国际专利申请WO90/05147(1990年5月17日公开)中有所描述。
本文所描述的研究是关于IL-12在单纯疱疹病毒(HSV)疫苗中作为佐剂的应用。因此，本发明涉及含有HSV gD、IL-12和矿物悬液的混合物的疫苗组合物。在本发明的具体实施例中，IL-12吸附于例如明矾的矿物悬液(例如，氢氧化铝或磷酸铝)。这些疫苗组合物调节对HSV的保护性免疫应答；即，该疫苗组合物能诱导被接种宿主产生细胞介导的免疫力，以提供对病原性抗原的保护性免疫应答。
IL-12可从数种适当的来源获得。它可通过重组DNA工艺学生产；例如，将编码人IL-12的基因在宿主***中克隆并表达，使能大量生产纯化的人IL-12。在本发明中同样有用的是IL-12的生物学活性亚基或片段。另外，某些T淋巴细胞系产生高水平的IL-12，从而提供了易于得到的来源。重组人IL-12和小鼠IL-12的商品来源包括Genetics Institute，Inc.(Cambridge，MA)。
本发明的抗原，例如，HSV抗原，可用于在脊椎动物如哺乳动物宿主中诱导对该抗原的免疫应答。例如，该抗原可以是HSV gD蛋白质抗原或其保留了有刺激免疫应答能力的部分。
本发明的方法包括对哺乳动物，特别是人或其它灵长类，施用免疫有效剂量的疫苗组合物，该疫苗组合物含有抗原，例如HSV gD抗原，和辅佐剂量的IL-12以及矿物悬液的混合物。特别是，IL-12吸附于矿物悬液。在本文中所用的，IL-12的“辅佐剂量”是指从1纳克到大约20毫克的剂量，更具体的说，从100纳克到大约5毫克。本文中所用的，疫苗组合物的“免疫有效”剂量是指适合诱导免疫应答的剂量。IL-12和抗原的具体剂量由待治疗的哺乳动物的年龄、体重和医学状况所决定，同时还由施药方法所决定。本领域熟练的技术人员很容易确定合适的剂量。该疫苗组合物可任选的配制在药物学或生理学上可接受的载体，例如生理盐水、磷酸缓冲盐或多元醇，(例如甘油或丙烯醇)中施药。也可加入少量去污剂以增强疫苗稳定性。
该疫苗组合物可任选的含有另外的佐剂，例如植物油或其乳剂，表面活性物质，例如：十六烷基胺，十八烷氨基酸酯，十八烷基胺，溶血卵磷脂，二甲基-二(十八烷基溴化铵)，N，N-双十八烷基-N’-N’双(2-羟乙基-丙烷二胺)，羟甲基十六烷基甘油，以及复合多元醇；聚胺，例如：吡喃，硫酸葡聚糖，多聚IC，聚羧乙烯；肽，例如：胞壁酰二肽，二甲基甘氨酸，促吞噬肽，免疫刺激复合物，油乳剂；脂多糖，例如：MPL(3-O-去乙酰基一磷酸脂A；RIBI ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，Montana)和矿物凝胶。也可将本发明的抗原掺入脂质体，共螯合物(cochleates)，可生物降解多聚物例如聚丙交酯，聚乙交酯和聚丙交酯-共-乙交酯，或ISCOMS(免疫刺激复合物)中，以及还可使用添加的活性成分。本发明的抗原也可和细菌毒素及其减毒衍生物联用。本发明的抗原也可和其它的淋巴因子，包括，但不限于，白细胞介素-2，IFN-γ和GM-CSF联用。
疫苗可通过多种途径施用给人或动物，包括但不限于，肠胃外、动脉内、真皮内、透皮(例如通过使用缓释多聚物)，肌肉内、腹腔内、静脉内、皮下、口腔或鼻内施药途径。在这些疫苗中使用的抗原量，视抗原的特性而不同。为适合本发明疫苗，需要对采用传统载体抗原所确定的剂量范围进行判定和操作，这正好在本领域熟练技术人员的能力内。本发明的疫苗计划用于治疗未成年和成年温血动物，特别是人。通常，抗原和IL-12/铝联合物将同时施用。
IL-12的佐剂作用具有许多重要意义。IL-12的佐剂活性能增加免疫接种生物体针对抗原产生的保护性抗体的浓度。因此，有效的(亦即，保护性的)接种可用比通常所需更少量的抗原而达到。抗原所需量的减少可以使得制备困难且昂贵的抗原被更广泛的使用。另外，IL-12用作佐剂能增强免疫原性微弱或免疫原性贫乏的抗原诱导免疫应答的能力。当抗原在有效免疫通常所要求的浓度是有毒的情况下，它可提供更安全的免疫接种。通过减少抗原量，毒性反应的危险也降低了。
通常，疫苗接种方案要求在几星期或几个月的时间内施用抗原，以激发“保护性”免疫应答。保护性免疫应答是足以保护被免疫生物体抵抗疫苗针对的一种或多种特定病原体所致疾病的免疫应答。IL-12，当和抗原，(例如HSV抗原)并和矿物悬液(例如，铝)混合或吸附于其上时一起施用时，能加速保护性免疫应答的产生。这能减少接种方案起效的时间过程。在某些例子中，单剂即能产生保护性应答。本发明的疫苗组合物在治疗上也有用，可减少已感染HSV个体的症状发作次数和严重程度。
作为本文所述工作的结果，联合施用HSV亚基疫苗和吸附于铝悬液的IL-12已显示出能诱导压倒性的TH-1相关应答；这是gD亚基疫苗免疫诱导的一种新模式。如本文进一步所述，在用可溶性和磷酸铝吸附gD免疫的临床前(动物)模型中测定了能发挥作用的IL-12剂量范围。本文所述的结果也揭示了用细胞因子/糖蛋白联合或不联合铝免疫，可诱导TH-1相关抗体。疫苗和IL-12/铝联合施用对亚基疫苗的免疫应答有佐剂作用，如用ELISA和病毒中和反应测定表明，抗-gD抗体水平提高那样。
糖蛋白D(gD)是单纯疱疹病毒I和II型的一种包膜糖蛋白，已证明其为病毒感染性所需并且是体液以及细胞免疫应答的主要目标，可用作抵御人初次和复发性疱疹感染的主要候选疫苗。施用基于铝或其它目前可接受的人用免疫吸附剂配制的gD亚基疫苗在几项临床前研究中已显示能诱导TH-2辅助性T淋巴细胞激活占优势的免疫应答。然而，看来复发性疱疹疾病的终止和适当保护性免疫功能的建立需要诱导强TH-1应答。
本文所述工作的结果表明IL-12和可溶性的、吸附于AlPO4的gD联合施用可导致体液和细胞免疫应答量的增加，以及体液应答质的变化。这可由IL-12存在时，疫苗诱导了不同的IgG亚类分泌所证明。事实上，对具有有效固定补体能力的IgG2a抗体的优先诱导，是TH-1应答的一个特点。施用IL-12对免疫应答的免疫调节作用和IL-4(TH-2相关)相比，在IFN-γ(TH-1相关)分泌的比率和数量上发生的变化是明显的。
另外，特别重要的是，发现联合施用IL-12和可溶性亚基疫苗免疫的小鼠中诱导了抗原-特异性溶细胞活性。该应答模式提示IL-12的加入导致对gD亚基疫苗免疫应答特征上的基础性改变，因为在前人研究中gD亚基疫苗很少(如果有的话，)显示过能诱导溶细胞活性。
用该新配方疫苗诱导的免疫应答谱和天然病毒感染诱导的紧密相关，并和无疾病而血清反应阳性人体中观察到的免疫力模式相关。联系在一起，这些结果提示IL-12介导的免疫调节在抗单纯疱疹病毒疾病的免疫治疗性和/或预防性干涉中为建立有效的免疫应答提供了明显有益的作用。
给出以下的实施例目的是阐明本发明，但不能解释成限制本发明的范围。本文所引用的所有参考文献的内容在此纳入以备参考。
                         实施例
材料和方法
单纯疱疹病毒糖蛋白D的表达和纯化以及疫苗制备
单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD疫苗)的制备如Landolfi等(Vaccine11(4)：407-414(1993))先前所述。
实验设计
雌性Balb/C小鼠被随机编入表1描述的组中(N＝10/组)。在第0和21日，给动物股部肌肉内接种单独的或和不同剂量IL-12混合的上述gD疫苗。在免疫前和免疫后每隔7日小鼠分别取血。第28天和第35天杀死每组中的5只小鼠，收集免疫脾细胞和***洗涤液。用酶联免疫试验(EIA)分析血清和***洗涤液中对gD抗原应答的IgA和IgG亚类抗体数量。功能性抗体活性用血清中和HSV感染的能力来评估。细胞介导活性用溶细胞T淋巴细胞试验、淋巴细胞增殖分析和细胞因子分泌模式来评估。
EIA分析
各血清的HSV gD特异性抗体应答用York等(Vaccine 13：1706-1712(1995))所述的EIA定量测定。
简单来说，用纯化的gD以20纳克/孔包被96孔培养板1小时。用0.01M PBS和0.1％ Tween-20溶液将板洗涤3次，然后用PBS和1％BSA溶液封闭。室温下将板培养1小时，然后用0.01M PBS和0.1％ Tween-20洗涤3次。将以0.05MTris-缓冲盐水配制的2倍系列稀释度的血清加入双份孔中，培养1小时。用0.01M PBS和0.1％ Tween-20洗涤各孔，然后加入第二抗体。第二抗体由辣根过氧化物酶(HSP)标记的山羊抗小鼠IgG(1∶2000稀释于TBS和0.1％Tween-20)，和生物素化的山羊抗小鼠IgG1和IgG2a(400纳克/毫升以TBS和0.1％ Tween-20配制)组成。50纳克/毫升浓度的亲和素-HRP被加入IgG1和IgG2a检测孔中。1小时培养后，洗涤各孔，然后加入ABTS(2，2’-连氮-(3-乙基苯并噻唑啉)-6磺酸二铵盐)底物。产生的颜色在405纳米处定量测定OD值，滴度用终点外推法确定。
血清中和
各血清用前述(Mishkin等，Vaccine 9：147-153(1991))的微量中和试验评估HSV中和滴度。
简单的说，将Vero细胞在96孔平底培养板中培养至铺满。测试血清在56℃加热灭活30分钟，然后以培养液作2倍系列稀释，体积为0.1毫升。加入等体积的HSV1或HSV2(含大约100噬斑形成单位(PFU)的病毒)。加入10％(v/v)豚鼠补体进行补体依赖性试验。将病毒/血清/(补体)混合物在37℃(5％CO2)温和振荡培养1小时，然后直接加到Vero细胞单层上。每次试验均包括病毒(即，无血清的培养液)，培养液(即，未感染细胞)，和补体(即，无血清或补体的培养液)对照。37℃培养后，细胞用1％的甲基纤维素覆盖。37℃(5％CO2)培养平板，直至病毒对照孔中大约可数到50个噬斑(亦即，48-72小时)。计数噬斑，滴度定义为产生50％以上噬斑减少的最大血清稀释度的倒数。
淋巴细胞增殖应答
HSV-特异性淋巴细胞增殖试验的方法先前已有详述(Ishizaka等，病毒免疫学4：187-193(1991))。收集小鼠脾细胞，合并于补充的RPMI(RoswellPark Memorial Institute培养基号1640，用于淋巴细胞培养***的常用组织培养基)中。然后将0.1毫升细胞以2×105活细胞/孔置于96孔平底板中。对采用的每一种体外刺激抗原均作5个重复孔。这些孔包括培养液、Vero细胞裂解液、HSV1(105热灭活的噬斑形成单位/孔)、HSV2(105热灭活噬斑形成单位/孔)、和纯化的杆状病毒表达的HSV2重组糖蛋白D(bgD2)(20纳克/孔)。这些抗原各孔加入0.1毫升体积。
然后将培养板37℃(5％CO2)培养5天。收集前5到6小时，各孔加入25微升0.5μCi 3H-胸苷的25mlRPMI液。将细胞用细胞收集器收集到玻璃纤维过滤网上，用β-平板计数器测定掺入的活性。
细胞毒T细胞活性
如前所述(York等，1995)脾细胞用于特异性CTL活性的二次刺激。在本实验中，免疫后14周收集脾细胞。制备脾细胞悬浮液，然后在室温下用0.17％NH4Cl(5ml/脾脏)处理4分钟，渗透法除去红细胞。然后洗涤细胞，计数并用台盼蓝染色排除法测定存活率。
采用原初动物的脾细胞作为抗原递呈细胞(APC)。这些细胞受到γ-辐射(2000R)然后用HSV1(NS株)和HSV2(186株)感染，感染复数(MOI)为5，37℃(5％CO2)涡旋感染1小时。洗涤细胞1次，以5×106细胞/毫升重悬浮，再培养4小时。然后暴露于短波UV辐射15分钟灭活病毒。将5毫升培养液中的APC(1毫升含5×106细胞)加至2×107效应细胞/孔。培养物再培养5天，然后用51Cr-释放试验测定溶细胞活性。
体外再次刺激后，从培养板上收集效应细胞，用台盼蓝排除法评估存活率。然后用培养液调节细胞浓度，分成200微升的三等份，以得到所要的效∶靶(E∶T)比率。然后进行双倍稀释。
收集适宜数量的A20靶细胞用于试验。这些细胞在初始1小时吸收阶段用HSV1和HSV2以10MOI感染，洗涤并再培养3小时。用作对照的未感染A20细胞用相同方法作模拟感染。3小时培养后，沉淀5×106到1×107的A20靶细胞并重悬浮于加有200μCi 51Cr的0.2毫升胎牛血清中，培养1小时(37℃，5％CO2)。用10mlRPMI洗涤细胞两次，在1ml培养液中重悬浮，稀释得到E∶T比率适宜的每份100微升的(混合细胞)。
培养效应细胞和标记靶细胞(37℃，5％CO2)4小时，此时，从每孔小心收集100μl上清液，用γ计数器测定γ放射量。用2％Tween-20处理过的标记靶细胞的三重复孔确定总释放。自发释放用仅在培养液中培养4小时的标记靶细胞三重复孔计数。特异释放百分数用以下公式计算：
如先前报告(York等，1995)采用酶联免疫斑点试验(ELISPOT)来直接计数分泌IL-4和IFN-γ的细胞。在无菌条件下，Millipore HA硝酸纤维素96孔微量滴定板用以无菌PBS配制的5微克/毫升(抗IFN-γ)或2微克/毫升(抗IL-4)浓度的100μl体积抗细胞因子MoAb包被。室温培养平板过夜，然后用无菌水洗涤4次，PBS和0.05％Tween-20洗涤3次。接着用0.2ml RPMI1640和1％ BSA封闭各孔，在5％CO2中(37℃)培养10分钟。此时，制备所需浓度的细胞悬液。
分别用PBS和含有0.05％Tween-20的PBS洗涤3次除去封闭溶液。以预先确定的浓度和稀释度(即，1×106/孔)将细胞一式三份以0.1ml体积接种入孔中。培养板在5％CO2(37℃)培养箱中培养20小时。每次用PBS，然后是PBS和0.05％Tween-20洗涤3次，除去细胞。生物素化的MoAb用PBS和0.05％Tween-20+1％ FB配制成最终浓度为0.25μg/ml的抗IFN-γ或4μg/ml的抗IL-4，在孔中加入0.1ml抗体溶液。培养板4℃湿室中培养过夜。
用PBS和0.05％Tween-20洗涤培养板3次，然后加入用PBS和0.05％Tween-20+1％FBS 1∶400稀释的过氧化物酶偶联山羊抗生物素抗体，每孔0.1ml，使斑点显影。
要使斑点可见，用PBS洗涤培养板3次，然后加入0.2ml底物。将10毫克3-氨基-9-乙基咔唑溶于一玻璃试管中的1ml二甲基甲酰胺，然后加入30ml0.1M醋酸钠缓冲液制备该底物液。即将使用前，在底物溶液中加入15微升H2O2。室温下显影斑点5-15分钟，然后加入自来水停止显影。用解剖显微镜计数斑点。
结果
EIA反应
抗gD IgG类和亚类的应答总结于表1。滴度低于50的(第一个血清稀释度)被赋值为25。在第7日，只有用活的HSV1诱导的小鼠显示出显著的总IgG滴度(表1a)。然而，接受可溶性gD和IL-12的动物血清中记录到可测量水平的活性。在第28天时，接受可溶性亚基疫苗和所有剂量IL-12的小鼠和单用可溶性疫苗相比，可见应答增强模式。在此，施用了可溶性gD和1.0微克IL-12的小鼠血清应答最大。在接种AlPO4-吸附糖蛋白的小鼠中，增强的IgG EIA应答仅在用AlPO4和gD加0.2微克IL-12免疫的动物中观察到，免疫导致大约两倍的增加。第35日，可见对可溶性gD(无AlPO4)的总IgG抗体应答呈剂量依赖性的IL-12佐剂效果。联合施用0.2、1.0和5.0微克的IL-12与gD分别导致应答增加5-，24-和215-倍。相反的，当IL-12加到AlPO4吸附的gD时，最大的应答发生在用0.2微克IL-12时。
除了HSV1-感染动物组，IgG1应答(表1b)在任何处理组中第7日都未见到，而在HSV1处理组中见到低水平的活性。滴度低于50的(第一个血清稀释度)被指定为25。在第28日，用AlPO4吸附，但没有IL-12的糖蛋白免疫的小鼠血清可见最大的抗gD IgG1应答。事实上，在AlPO4吸附的疫苗中加入IL-12导致该应答明显可见且呈剂量相关性降低。相反，IL-12和可溶性gD联合施用和单用亚基疫苗比较，导致IgG1应答增强。然而，无IL-12配方疫苗产生的活性水平和单用AlPO4吸附的亚基疫苗观察到的同样大。第35日，在所有组中IgG1滴度减弱。此时，接受可溶性gD和IL-12的小鼠的IgG1滴度，达到了那些用AlPO4吸附的亚基疫苗免疫后的小鼠所见的可比水平。
抗gD IgG2a应答(表1c)第7日时在HSV1引发的动物中是明显的。滴度低于50的(第一血清稀释度)被指定为25。此时也注意到用可溶性gD和0.2或5.0微克IL-12引起一中等程度应答。第28日，施用IL-12导致了IgG2a滴度显著增加。这在接受可溶性gD的动物中特别明显，比这些动物中观察到的滴度增加1000倍以上。IL-12和AlPO4吸附的疫苗的联合施用也导致gD特异性IgG2a抗体的显著增加。在这种情况下，当用0.2微克IL-12时，IgG2a抗体应答最大，提示铝结合的IL-12显著增强了生物活性。第35日，注意到总IgG应答模式和IgG2a应答模式紧密并行，表明IL-12和亚基gD疫苗联合施用导致显著佐剂效应，以及诱导了高滴度的IgG2a抗体。
                        表1a：IL-12对HSV-2 gD免疫的血浆IgG抗体应答的增强
  血浆抗-gD IgG滴度
  免疫方案   第7日   第28日   第35日
  平均值  标准偏差   平均值   标准偏差   平均值      标准偏差
  gD   25         0   29,159   10,420   9,063       2,993
  gD+0.2μgIL-12   63         21   146,651  39,157   49,813      15,456
  gD+1.0μgIL-12   34         7   210,267  67,806   217,061     88,404
  gD+5.0μgIL-12   71         36   131,628  51,401   1,949,697   1,845,964
  gD/AlPO4   25         0   95,979   23,312   62,578      34,793
  gD/AlPO4+0.2μgIL-12   25         0   212,949  44,935   179,917     116,925
  gD/AlPO4+1.0μgIL-12   25         0   82,313   52,122   69,958      47,544
  gD/AlPO4+5.0μgIL-12   25         0   32,182   29,807   28,673      24,310
  AlPO4+5.0μgIL-12   25         0   25       0   25          0
  HSV1(1×106pfu)   783        515   1,824    514   4,446       1,807
                  表1b：IL-12对HSV-2 gD免疫的血浆IgG1抗体应答的增强
  血浆抗-gD IgG1滴度
  免疫方案   第7日   第28日   第35日
  平均值  标准偏差   平均值      标准偏差   平均值    标准偏差
  gD   25         0   14,323       4,939   4,421      1,019
  gD+0.2μgIL-12   25         0   40,246       13,626   22,464     4,427
  gD+1.0μgIL-12   25         0   59,536       25,196   21,592     5,511
  gD+5.0μgIL-12   25         0   17,637       8,137   5,512      3,023
  gD/AlPO4   25         0   82,882       57,045   17,232     5,177
  gD/AlPO4+0.2μgIL-12   25         0   28,247       4,147   10,421     4,726
  gD/AlPO4+1.0μgIL-12   25         0   1,604        734   5,426      3,588
  gD/AlPO4+5.0μgIL-12   25         0   1,345        1,206   3,957      24,310
  AlPO4+5.0μgIL-12   25         0   25           0   25         0
  HSV1(1×106pfu)   43         17   180          53   209        1,807
                 表1c：IL-12对HSV-2 gD免疫的血浆IgG2a抗体应答的增强
  血浆抗-gD IgG2a滴度
  免疫方案   第7日   第28日   第35日
  平均值  标准偏差   平均值    标准偏差   平均值     标准偏差
  gD   25          0   25          0   152          127
  gD+0.2μgIL-12   32          7   36,807      12,926   6,009        1,846
  gD+1.0μgIL-12   25          0   49,034      18,983   33,547       11,290
  gD+5.0μgIL-12   36          11   39,943      22,448   67,681       53,732
  gD/AlPO4   25          0   522         330   30           5
  gD/AlPO4+0.2μgIL-12   25          0   48,321      19,366   47,153       40,467
  gD/AlPO4+1.0μgIL-12   25          0   22,400      12,011   7,715        3,418
gD/AlPO4+5.0μgIL-12 25          0 5,801       5,288 2,669        1,195
  AlPO4+5.0μgIL-12   25          0   25          0   25           0
  HSV1(1×106pfu)   746         603   659         227   668          283
分泌性抗体应答
用IL-12配制的gD免疫后，测定了***分泌物的抗体活性。在一些处理组中观察到抗-gD IgA(表2a)。最大滴度发生在接种可溶性gD和1.0微克IL-12的小鼠分泌物中。该组在第28日也显示出抗gD IgG的最高滴度(表2b)。在施用AlPO4吸附的gD和0.2微克IL-12的小鼠中见到相对强的IgG滴度。滴度低于5的(第一个血清稀释度)被指定为3。第35日，任何一组的***冲洗液中都没有显著的gD特异性IgA。然而，用可溶性或AlPO4吸附的gD加上5.0微克IL-12免疫的动物***洗液显示出显著的抗原特异性IgG滴度。
        表2a：对配制有IL-12的gD的粘膜抗HSV-2 IgA应答
  ***洗液抗gD IgA滴度
  免疫方案   第28日   第35日
  平均值  标准偏差   平均值  标准偏差
  gD   6.2       3.2   3.0       0
  gD+0.2μgIL-12   9.4       7.7   3.0       0
  gD+1.0μgIL-12   25.0      7.7   4.0       1.0
  gD+5.0μgIL-12   3.0       0   4.0       1.0
  gD/AlPO4   9.8       6.8   3.2       0.2
  gD/AlPO4+0.2μgIL-12   3.0       0   3.0       0
  gD/AlPO4+1.0μgIL-12   3.0       0   3.0       0
  gD/AlPO4+5.0μgIL-12   3.0       0   3.0       0
  AlPO4+5.0μgIL-12   6.2       3.2   3.0       0
  HSV1(1×106pfu)   4.6       1.6   3.0       0
            表2b：对配制有IL-12的gD的粘膜抗HSV-2 IgG应答
  ***洗液抗gD IgG滴度
  免疫方案   第28日   第35日
  平均值    标准偏差   平均值   标准偏差
  gD   12.2        9.2   5.6        2.6
  gD+0.2μgIL-12   7.4         3.0   5.0        0.9
  gD+1.0μgIL-12   521.2       134.9   8.6        3.2
  gD+5.0μgIL-12   15.0        12.0   61.6       28.5
  gD/AlPO4   13.2        3.6   18.6       3.4
  gD/AlPO4+0.2μgIL-12   165.41      143.1   3.0        0
  gD/AlPO4+1.0μgIL-12   12.2        9.2   3.0        0
  gD/AlPO4+5.0μgIL-12   50.8        6.2   123.4      59.0
  AlPO4+5.0μgIL-12   3.0         0   3.0        0
  HSV1(1×106pfu)   3.0         0   3.0        0
血清HSV-2中和滴度
补体增强的中和性抗体滴度(表3)在接受可溶性gD和IL-12的小鼠血清中呈剂量依赖性方式增加。这些滴度分别在该细胞因子水平为0.2，1.0和5.0微克时呈5-，15-，和50-倍增加。滴度低于10的(第一个血清稀释度)被指定为5。就ELISA测定的抗gD应答而言，由铝吸附的gD诱导的最大病毒中和应答是用0.2微克IL-12诱导的。
     表3：IL-12对gD免疫的血浆中和抗体应答的增强
  免疫方案   血浆HSV-2中和滴度
  平均值    标准偏差
  gD   22.5        11.1
  gD+0.2μgIL-12   111.2       29.0
  gD+1.0μgIL-12   353.4       116.2
  gD+5.0μgIL-12   1,125.8     852.4
  gD/AlPO4   81.0        40.9
  gD/AlPO4+0.2μgIL-12   294.8       213.7
  gD/AlPO4+1.0μgIL-12   17.9        7.0
  gD/AlPO4+5.0μgIL-12   8.5         2.2
  ALPO4+5.0μgIL-12   5.0         0
  HSV1(1×106pfu)   100.8       52.2
淋巴细胞增殖反应
对回忆抗原的体外母细胞形成反应总结在表4中。回忆抗原是宿主在先前遇到过的抗原；在本例中，免疫小鼠的回忆抗原是gD。使用关于HSV-1和HSV-2的该术语推测和病毒表达的gD有高度的交叉反应性。未观察到任何一组显示出对Vero细胞对照抗原的高水平非特异性作用。对HSV-1抗原的异源应答在用可溶性和AlPO4吸附的gD和1.0微克IL-12免疫的小鼠收获的细胞中最大。体外用HSV2和gD2抗原刺激也记录到相似模式的应答。有趣的是，用HSV-1诱导的小鼠脾细胞在本实验中显示出对HSV-2gD的应答性。
               表4：gD/IL-12淋巴细胞增殖反应
  免疫方案   对体外刺激的刺激指数
  Vero       HSV1     HSV2      gD2
  gD   0.73       0.32     1.79      2.39
  gD+0.2μgIL-12   1.77       1.31     11.54     6.14
  gD+1.0μgIL-12   0.51       29.18    17.42     2.59
  gD+5.0μgIL-12   0.60       3.78     7.97      1.58
  gD/AlPO4   1.08       0.67     4.19      5.87
  gD/AlPO4+0.2μgIL-12   1.13       4.44     3.14      1.67
  gD/AlPO4+1.0μgIL-12   0.68       16.54    33.87     17.79
  gD/AlPO4+5.0μgIL-12   1.25       4.2      4.42      1.71
  AlPO4+5.0μgIL-12   0.91       1.64     1.96      2.28
  HSV1(1×106pfu)   0.94       2.71     9.15      1.36
细胞因子应答
评价了用1.0微克剂量IL-12(免疫)的所选小鼠组的细胞因子分泌情况，并总结于表5。和单用可溶性gD或用AlPO4吸附的gD免疫组比较，加入IL-12导致IFN-γ分泌比IL-4显著增加。
                表5：细胞因子分泌情况
  免疫方案   SFC/106培养细胞
  IL-4    IFN-γ   IFN-γ/IL-4
  5μg gD5μg gD+1μgIL-125μg gD/AlPO45μg gD/AlPO4+1μgIL-12AlPO4+1μgIL-12HSV1原初   35        45         1.2885        215        2.5340        35         0.8860        185        3.0850        85         1.70495       545        1.1030        65         1.85
溶细胞活性
用gD加上1.0微克IL-12，或对照疫苗免疫动物的CTL应答总结于表6。E∶T比率在25∶1到3∶1范围时，HSV-1诱导的小鼠产生相对均一的溶细胞活性。用可溶性gD加1.0微克IL-12免疫的小鼠获得的免疫细胞培养物中观察到可比较水平的杀伤。在其它疫苗组或对照组脾细胞中未见显著的溶细胞活性。
                         表6：CTL活性
  免疫   以下E∶T比率时的净细胞裂解
  25∶1       12∶1        6∶1      3∶1
  gDgD+1μgIL-12gD/AlPO4gD/AlPO4+1μgIL-12AlPO4+1μgIL-12HSV1原初   4.9          -1.0        7.2       9.329.3         7.6         23.6      18.110.1         7.6         9.7       3.17.1          5.6         6.5       5.515.1         -3.4        2.4       -4.724.6         36.9        32.1      26.1-0.3         3.7         -         4.0
等效例
本领域中熟练技术人员使用常规实验方法将会认识，或能够确定，本文所述的本发明具体实施例的许多等效例。这些等效例应包括在本申请的权利要求中。

Claims (17)

1.一种疫苗组合物的用途，所述疫苗组合物包含选自单纯疱疹病毒I型糖蛋白D，单纯疱疹病毒II型的糖蛋白D，和其组合的单纯疱疹病毒抗原，辅佐剂量的白细胞介素IL-12和明矾的水悬浮液的混合物，其特征在于，该疫苗组合物用于制备药物，以诱导对单纯疱疹病毒抗原免疫应答。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该组合物还含有生理学上可接受的载体。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于：白细胞介素IL-12吸附于明矾的水悬浮液。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于：白细胞介素IL-12是人白细胞介素IL-12。
5.如权利要求3所述的用途，其特征在于：明矾是氢氧化铝或磷酸铝。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于：白细胞介素-12的辅佐剂量是1纳克到20毫克。
7.一种免疫原性组合物，其特征在于：它包括选自单纯疱疹病毒I型糖蛋白D，单纯疱疹病毒II型的糖蛋白D，和其组合的单纯疱疹病毒抗原，辅佐剂量的白细胞介素IL-12和明矾的水悬浮液的混合物。
8.如权利要求7所述的免疫原性组合物，其特征在于，该组合物还含有生理学上可接受的载体。
9.如权利要求7所述的免疫原性组合物，其特征在于：白细胞介素IL-12吸附于明矾的水悬浮液。
10.如权利要求7所述的免疫原性组合物，其特征在于：白细胞介素IL-12是人白细胞介素IL-12。
11.如权利要求9所述的免疫原性组合物，其特征在于：明矾是氢氧化铝或磷酸铝。
12.如权利要求7所述的免疫原性组合物，其特征在于：白细胞介素-12的辅佐剂量是1纳克到20毫克。
13.如权利要求7所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物是疫苗组合物。
14.如权利要求13所述的免疫原性组合物，其特征在于：白细胞介素IL-12吸附于明矾的水悬浮液。
15.如权利要求13所述的免疫原性组合物，其特征在于：白细胞介素IL-12是人白细胞介素IL-12。
16.如权利要求14所述的免疫原性组合物，其特征在于：明矾是氢氧化铝或磷酸铝。
17.如权利要求13所述的免疫原性组合物，其特征在于：白细胞介素-12的辅佐剂量是1纳克到20毫克。
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